JP2011504591A - 信号対ノイズ比を増すための手段および方法を備える、統合型分離および検出カートリッジ - Google Patents

信号対ノイズ比を増すための手段および方法を備える、統合型分離および検出カートリッジ Download PDF

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Abstract

【課題】少量サンプルにおいて標的分析対象の有無を、高い信頼度で効率的に検出すること可能とする、手動デバイスおよび方法を開発すること。
【解決手段】本発明は、200 μl未満の容量を持つ液体サンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイスおよび方法に関し、ここに、該デバイスは、毛細管チャンネルの形状を持つ反応チェンバー、分析対象を含むサンプル導入のためのサンプル流入口(1)を含む第1部分(3)；標的分析対象の検出手段(14)、廃棄産物放出のための放出口(4b)；および洗浄液および反応混合物導入のための溶液流入口(8)を含む第2部分（5、6）；および、固定された分析対象を、チェンバーの第1部分から第2部分へ、および逆方向へ移動させるための手段を含み、第1部分と第2部分は隔てられるが、その隔離が、他の液体サンプル試料が、チェンバーの第2部分に入ることがないように、かつ、光が、チェンバーの第1部分から、チェンバーの第2部分の検出器部分に送られることがないように行われることを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、液体サンプルにおける標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイス、およびその使用に関する。
本発明はさらに、200 μl未満から成るサンプルにおける標的分析対象の有無を定量的に検出するための方法に関する。
本発明はさらに、本発明によるデバイスおよび磁気粒子を含む部品のキットに関する。
ここ数年、生物学的、環境的、および工業的液体において、注目する標的分析対象の有無を速やかに検出するために、数多くの単純化試験システムが設計されている。それらの内もっとも単純な形式のものでは、これらのアッセイシステムおよびデバイスは、通常、その標的分析対象と反応して視覚的反応を与える試験試薬と、該試験試薬を流通させる吸収紙または膜の組み合わせを含む。
この接触は種々の方法で行うことが可能である。もっとも一般的には、試験試薬を含む、例えば、多孔性ポリエチレンまたはポリプロピレンなどの多孔性または吸収性部材、または膜の中を、または該多孔性または吸収性部材の一部の中を、毛管作用によって、水性サンプルを横断させる。別の場合では、試験試薬は、試験デバイスの外部であらかじめ混合され、次いで、デバイスの吸収部材に添加されて最終的に信号を発生する。
多くの市販のデバイスおよびアッセイシステムはさらに洗浄ステップを含む。このステップでは、免疫吸収ゾーンが洗浄されて、非特異的信号発生器が取り除かれるので、適切なゾーンにおける信号に関して多孔部材を調べることによって、サンプル中の標的分析対象の有無または量を決定することが可能となる。
従来技術によるアッセイデバイスおよびシステムは、サンプルおよび試薬の担体として吸収膜を使用するという制限を含むが、それらの制限に加えてさらに、アッセイデバイスは、一般に、数多くの工程を含み、この内、実験結果を左右するパイペッティング工程は、検査室環境では比較的熟練したユーザーによって実行されなければならない。したがって、デバイス中の試薬の流れを制御するだけでなく、デバイス中の特定チェンバーにおける試薬の流れをも制御する、一工程アッセイおよびシステムが求められる。さらに、実験結果を左右するパイペッティングデバイスを要せず、完全に定量的な方法を実行するアッセイデバイスが求められる。
今日、多くの標的分析対象は、中央研究所に設置される大型装置（免疫分析器）を用いて測定される。その主な理由の一つは、今日では、高感度、再現可能、定量的免疫およびDNAアッセイにおいて実験結果を左右するパラメータを満足させることができる、小型の、手動装置が存在しないからである。
したがって、本発明の目的は、少量サンプルにおける標的分析対象の有無を、高い信頼度で効率的に検出すること可能とする、手動デバイスおよび方法を開発することである。
少量サンプルにおいて分析対象の有無を定量的に検出する場合の、主要な一問題点は、少量の分析対象検出の信頼性および再現性を大きく妨げる、背景信号を排除または抑制することである。
したがって、本発明のもう一つの目的は、少量の液体サンプルにおける標的分析対象の有無を定量的に検出するためのもので、そこでは、非特異的背景信号が抑制または排除されるデバイス、および方法を開発することである。
WO2007/110779 Aは、サンプルが試薬と接触させられる第1部分、および、検出のために分析対象が運ばれる第2検出器部分を含む、毛細管形状の反応チェンバーを含むデバイスを記載する。しかしながら驚くべきことに、この配置の欠点は、著明な背景信号が検出されることで、これが、高信頼度の、再現性の高い信号（分析対象）の検出を妨げる。背景信号の存在は特に驚くべきことである。なぜなら、分析対象は、汚染性の物質を全く運ぶことなく、反応部分から検出部分へ輸送されるからである。したがって、本発明人らは、背景信号の排除がこのように際立った重大性を持つものであることを予想していなかった。
従来、当該技術分野は、信号検出の向上を目指してきた。しかしながら、本発明に導く実験開発において、本発明人らは、少量サンプルにおける分析対象の有無を定量的に検出するための、高感度で、再現性が高く、完全に定量的なアッセイの実現において、実験結果を左右する、より重大なパラメータは、背景ノイズを下げることによって信号対ノイズ比を増すことであることを発見した。
本発明人らの直面した、この驚くべき課題は、反応部分と検出部分を分離するに際し、隔離を、液体サンプル材料が、チェンバーの第2部分に入ることがないように、かつ、光が、チェンバーの第1部分から、チェンバーの第2部分の検出部分に送られることがないように行うことによって解決された。
さらに、標的分析対象と追跡／捕捉抗体との間の効率的混合過程だけでなく、背景ノイズを下げるための効率的洗浄過程も同様に好ましい。さらに、標的分析対象と、追跡／捕捉抗体の間の大きな反応面も好ましいことが見出された。さらに好ましい特性としては、効率的増幅試薬、例えば、HRPまたはALP酵素に接合されるトレーサー抗体、および、温度調節アッセイ使用の可能性もある。
本発明人らは、微量液体と磁気粒子技術を特定配合において組み合わせることによって、決定的重要パラメータを満足させることが可能であり、同様にして、200 μl未満のサンプルを分析することが可能な、比較的小型の手動装置（500グラム未満）を取得することが可能であることを見出した。
したがって、本発明の、ある好ましい局面では、本発明は、液体サンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイスであって、200 μl未満の容量を持つ毛細管チャンネルの形状を持つ反応チェンバーを含み、該反応チェンバーが：
a. 分析対象を含むサンプル導入のためのサンプル流入口(21)を含む第1部分(3)、および、廃棄産物放出のための放出口(4b)；
b. 標的分析対象の検出手段(14)、および、洗浄液および反応混合物導入のための溶液流入口(8)を含む第2部分（5、6）；および、
c. 固定された分析対象を、チェンバーの第1部分から第2部分へ、および逆方向へ移動させるための手段；
を含み、
第1部分と、第2部分は隔てられるが、その隔離が、チェンバーの第1部分の液体サンプル試料が、チェンバーの第2部分に入ることがないように、かつ、光が、チェンバーの第1部分から、チェンバーの第2部分の検出器部分に送られることがないように行われることを特徴とする、デバイスに関する。
さらに別の局面では、本発明は、サンプルにおける標的対象物の有無の定量的検出における、本発明によるデバイスの使用に関する。
さらに別の局面では、本発明は、200 μl未満の液体から成るサンプルにおいて標的分析対象物の有無を定量的に検出するための方法であって、下記の工程：
a)分析対象を含み、200 μl未満の液体から成る液体サンプルを準備すること；
b)該液体サンプルをチェンバーの第1反応部分に供給すること、ここに、該チェンバーは、第1反応部分および第2検出部分を含み、かつ、この二つの部分は、液体サンプルが、第2検出部分に入りそれと接触することがないように物理的に隔離され；
c)チェンバーの第1反応部分中のサンプルを、該分析対象を捕捉することが可能な固定基質と接触させること；
d)捕捉された分析対象を含む固定基質を固定すること；
e)捕捉分析対象を含む固定基質を、必要に応じてチェンバーの第2部分に移送すること；
f)捕捉分析対象を含む固定基質を洗浄液によって洗浄すること；
g)該洗浄液を廃棄すること；
h)工程e)が実行されない場合、捕捉分析対象を含む固定基質を、チェンバーの第2部分の検出器部分に移送すること；および、
i)通例の検出手段を用いて標的分析対象の有無を検出すること、
を含む、方法に関する。
一局面において、本発明は、200 μl未満の液体から成るサンプルにおいて標的分析対象物の有無を定量的に検出するための方法であって、下記の工程：
a)分析対象を含み、200 μl未満の液体から成る液体サンプルを準備すること；
b)該液体サンプルをチェンバーの第1反応部分に供給すること、ここに、該チェンバーは、第1反応部分および第2検出部分を含み、この二つの部分は、液体サンプル試料が、第2検出部分に入りそれと接触することがないように、かつ、光が、チェンバーの第1部分からチェンバーの第2部分の検出器部分に送られることがないように物理的に隔離され；
c)チェンバーの第1反応部分中のサンプルを、該分析対象を捕捉することが可能な固定基質と接触させること；
d)捕捉された分析対象を含む固定基質を固定すること；
e)捕捉分析対象を含む固定基質を、チェンバーの第2部分に移送すること；
f)捕捉分析対象を含む固定基質を再び可動化し、洗浄液によって洗浄すること；
g)捕捉分析対象を含む固定基質を固定すること；
h)必要に応じて洗浄液を廃棄すること；
i)必要に応じて捕捉分析対象を含む固定基質を再び可動化し、工程f)からh)を繰り返すこと；
j)捕捉分析対象を含む固定基質を、チェンバーの第2部分の検出器部分に移送すること；および、
k)通例の検出手段を用いて標的分析対象の有無を検出すること、
を含む、方法に関する。
さらに別の局面では、本発明は、本発明によるデバイスと磁気材料とを含む部品のキットに関する。
本発明は、図面を参照しながら下記に詳細に説明される。
サンプルデバイスであって、第1部分(3)および第2部分(5,6)を有する微小流チャンネル、印加ゾーン(1)、隔離チェンバー(2)、第1毛細管チャンネル(3)、収集チェンバー(4a)、廃棄物流出口(4b)、洗浄チェンバー(5)、検出チェンバー(6)、洗浄チェンバーに配される磁気粒子（双峰性サイズ分布を有する）(7)（第1部分と第2部分の間を移送することが可能）、洗浄液および検出液のための流入チャンネル(8)、隔離チェンバーと第1毛細管チャンネルの間の物理障壁（10（垂直）、10'（傾斜））、第1毛細管チャンネル(3)における毛細管微小チャンネル(11)、第1毛細管チャンネルのコロナ処理部(12）（灰色の陰影によって表される）、および、検出器ユニット(14)を含むサンプルデバイスの模式図を示す。アッセイの開始時、磁気粒子は、第1部分(3)に置かれる。 三次元描画によって、図1のものと同じ原理を示す。 隔離デバイスであって、微小流チャンネル(3)、印加ウェル(1')、隔離チェンバー(2)、第1毛細管チャンネル(3)、隔離チェンバーと第1毛細管チャンネルの間の物理的障壁(10')、親水性フィルター材料(17)、およびプレフィルター(15)を含む隔離デバイスの模式側面図を示す。 図4aは、統合型分離／検出デバイスであって、微小流チャンネル(3,5,6)、印加ウェル(1)、隔離チェンバー(2)および親水性フィルター(17)、第1毛細管チャンネル(3)、第1毛細管チャンネルにおける血清／血漿(18)、洗浄チェンバー(5)および検出器チェンバー(6)における信号液(19)、第1毛細管チャンネル(3)と洗浄チェンバー(5)の間の接合部における光捕捉方式A(20)、および検出ユニット(14)を含むデバイスの模式側面図を示す。 図4bは、統合型分離／検出デバイスであって、微小流チャンネル(3,5,6)、印加ウェル(1)、隔離チェンバー(2)および親水性フィルター(17)、第1毛細管チャンネル(3)、第1毛細管チャンネルにおける血清／血漿(18)、洗浄チェンバー(5)および検出器チェンバー(6)における信号液(19)、第1毛細管チャンネル(3)と洗浄チェンバー(5)の間の接合部における光捕捉方式B(20')（チェンバーの第1部分から第2部分への経路上に曲線部を導入し、その導入が、第1部分からの流出点と、第2部分の流入点が異なるレベルとなるようにすることによる）、および検出器ユニット(14)を含むデバイスの模式側面図を示す。 図1と同じではあるが、より多くの特徴を含む三次元描画によって同じ原理を図示する。統合型分離／検出デバイスであって、三つの区画(3,5,6)を有する微小流チャンネル、印加ウェル(1')、隔離チェンバー(2)、第1毛細管チャンネル(3)、廃棄物流出口を備える収集チェンバー(4)、洗浄チェンバー(5)、検出チェンバー(6)、洗浄チェンバーにおける磁気粒子部位(7)、洗浄液および検出液のための流入チャンネル(8)、隔離チェンバーと第1毛細管チャンネルの間の物理障壁(10,10')、第1毛細管チャンネル(3)における毛細管微小チャンネル(11)、検出器ユニット(14)、検出液Aのための第1区画(9)、検出液(B)のための第2区画(15)、洗浄液区画(16)、および血液蓋(12a)を含むデバイス。 統合型分離／検出デバイスであって、印加ウェル(1)、ろ過域(2)、血漿流入口(21)、吸収性障壁および毛細管ストップ(22)に接続される第1部分チャンネル(3)を含むデバイスの平面図を示す。洗浄液(23)を備える水泡容器は、チャンネル(25)に接続されるチャンネル(24)を通じて微小流システムに接続され、チャンネル(26)および(6)を通じて検出域に連絡する。洗浄チャンネル(5)は、収集チェンバー（図7の4a）（毛細管ストップ(22)で）で終わり、そこにおいて、二つの側方チャンネル(27)に接続され、これらのチャンネルは、廃棄物容器（図示せず）で終わる。洗浄チャンネルには、検出域（ウィンドウ）(6,14)がある。水泡(28)は、チャンネル(30)に接続され、水泡(29)は、チャンネル(31)に接続される。チャンネル(30)および(31)は、チャンネル(32)に接続され、後者のチャンネルは、チャンネル(33)に接続され、その際、チャンネル(30)および(31)からの信号液はチャンネル(33)に達し、残余の信号液はチャンネル(34)に入り、これらは、ポイント(26)において血漿チャンネルに接続される、チャンネル(35)において混ぜ合わされる。 図6に記載される通りの、毛細管ストップ(22)、収集チェンバー4a、二つの側方チャンネル(27)の区域の模式平面図、および第1角度(36')を示す。 （実施例1によるアッセイ使用による）0 pg/ml - 16,000 pg/ml BNPの測定におけるセンサーデータを示す。「新型PMT」が、実施例に言及されるPMTである。
〔定義〕
本発明の背景においては、「毛細管チャンネル」とは、流体が通過することが可能な、細長いチューブまたはチャンネルを意味する。好ましくは、本発明による毛細管チャンネルの直径は、10 mm未満である。さらに好ましくは、本発明による毛細管チャンネルの直径は、5 mm未満、例えば、4 mm未満、または3 mm未満、場合によっては2 mm未満である。もっとも好ましい局面では、毛細管チャンネルは、1 mm以下の直径を有する。
微小流システムは感度がきわめて低く、信頼性、再現性の高い信号を発生するには大量の分析対象を必要とするため、信号検出はしばしば困難に見舞われる。これまで、より高感度で、洗練された検出手段を開発するために大きな努力が払われてきた。一方、驚くべきことに、非特異的信号（ノイズ）レベルの一掃または抑制のためには、それよりも僅かなことしか行われてこなかった。本発明人らは、驚くべきことに、システムノイズを抑制するという単純な施策が、該システムの再現性および感度を目覚しく改善することを見出した。
一般に、本発明の発明概念は、微小流システムにおいて、分析対象を結合し、固定する工程と、該分析対象を検出する工程との物理的隔離と見なしてもよいかもしれない。好ましくは、非分析対象分子由来の信号（背景信号）は全て、デバイスの第1部分（または、方法の第1工程）に残留されるか、または好ましくは廃棄され、一方、デバイスの第2部分（方法の後続工程）において、分析対象由来の信号が、背景信号最小の状態下に検出される。
したがって、一局面では、本発明は、200 μ未満の容量を持つ液体サンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイスであって、一つ以上の毛細管チャンネルの形状を持つ反応チェンバーを含むデバイスにおいて、該反応チェンバーが：
a. 200 μl未満の容量を持つ毛細管チャンネル、分析対象を含むサンプル導入のためのサンプル流入口(21)、および、廃棄産物放出のための放出口(4b)を含む第1部分(3)；
b. 標的分析対象の検出手段(14)、および、洗浄液および反応混合物導入のための溶液流入口(8)を含む第2部分(5,6)；および、
c. 固定された分析対象を、チェンバーの第1部分から第2部分へ、および逆方向へ移動させるための手段、
を含み、
第1部分と、第2部分は隔てられるが、その隔離が、他の液体サンプル試料が、チェンバーの第2部分に入ることがないように、かつ、光が、チェンバーの第1部分から、チェンバーの第2部分の検出部分に送られることがないように行われる、ことを特徴とするデバイスに関する。他のサンプル試料とは、分析対象を除くサンプル試料を意味する。
反応チェンバーは、いくつかの区画または部分を含んでもよい。さらに各部分は、そこにおいて特異的反応が行われる筈の、さらに細かい部分または区画に分割されてもよい。反応チェンバーを、分析対象と結合するための第1部分と、該分析対象を検出するための第2部分とに分離することによって、背景信号の著明な低下の実現が可能となると考えられる。
ある好ましい局面では、分析されるサンプルは、200 μl未満の容量を有することが好ましい。さらに好ましい局面では、分析されるサンプルは、150 μl未満の容量を有し、さらに好ましくは100 μl未満、さらに好ましくは90 μl未満、例えば、80 μl未満、70 μl未満、または場合によっては60 μl未満の容量を有する。さらに好ましい局面では、分析されるサンプルは、50 μl未満の容量、さらに好ましくは45 μl未満、さらに好ましくは40 μl未満、例えば、35 μl未満、30 μl未満、または場合によっては25 μl未満の容量を有する。
ある好ましい局面では、毛細管チャンネルの第1部分は、100 μl未満の容量を有する。さらに好ましい局面では、毛細管チャンネルの第1部分は、90 μl未満の容量を有し、さらに好ましくは80 μl未満、さらに好ましくは70 μl未満、例えば、60 μl未満、50 μl未満、または場合によっては40 μl未満の容量を有する。さらに好ましい局面では、毛細管チャンネルの第1部分は、30 μl未満の容量を有し、さらに好ましくは25 μl未満、さらに好ましくは20 μl未満、例えば、15 μl未満、10 μl未満、または場合によっては5 μl未満の容量を有する。同様の好ましい容量は、反応チェンバーの第2部分にも当てはまる。反応チェンバーは、第1部分および第2部分を含む。好ましい局面では、第1部分および第2部分は共に毛細管チャンネルから構成される。第1および第2部分は、例えば、収集チェンバー、すなわち、それから残留サンプル試料および添加試薬が収集され、後に排出される収集チェンバーによって隔てられてもよい。このような収集チェンバー、およびその容量は、反応チェンバーの一部、およびその好ましい容量と理解してはならない。
本発明のある好ましい局面では、チェンバーの第1部分から第2部分へ、およびその逆方向へ、固定化分析対象を移送するための手段は、外部の磁力発生源である。このものは、チェンバーに磁場を印加することが可能であり、かつ、必要に応じてチェンバーの辺縁にそって移動することが可能である。
本発明の一局面では、第1および第2部分は、収集チェンバー(4a)によって隔てられる。この収集チェンバーは、第1と第2部分を隔てるが、その際その隔離は、第1および第2部分の間で積極的に輸送される分析対象分子以外の液体サンプル試料が、チェンバーの第2部分に浸入することがないように行われてもよい。収集チェンバーはさらに、洗浄液および残留サンプル試料などの廃棄産物、および、必要に応じて残留サンプル試料の流出口として使用されてもよい。第1および第2部分の間に収集チェンバーを設置することによって、該収集チェンバーの、チェンバーの第1（必要に応じて）および第2両部分から出る試料の流出口としての使用が実現される。
本発明のある好ましい局面では、固定化分析対象を含む磁気粒子をもっとも効率的に移動させるために、必要に応じて、磁場は、チェンバーの頂上辺縁にそって動かされる。
本発明のある好ましい局面では、第1および第2部分は隔てられるが、その際、隔離は、信号（例えば、光）の相当部分が、チェンバーの第1部分から、チェンバーの第2部分の検出部分に送られることがないように行われる。相当部分とは、50%を超えるパーセント、例えば、75%、または場合によっては90%、または場合によっては99%を超えるパーゼントを意味する。これは、第1部分からの流出点と、第2部分への流入点を異なるレベルに設置することによって実現してもよい。例えば、チェンバーの第1部分から第2部分への経路に曲線部(20')を導入し、その導入を、チェンバーの第1部分からの信号（光線の形状を取る）が、第2チェンバーの検出部分に侵入することがないように行うことによって実現される。もう一つの可能性は、チェンバーの第2部分に曲線部を導入するに際し、その導入を、検出部が、分析対象の、チェンバーの第2部分への流入点と直線的に揃うことがないように行うことである。好ましい可能性は、二つの部分の間に光不透過の障壁(20)を設けることであって、設置は、光の相当部分が、第2部分から第1部分に入ることを阻止されるように行われる。もちろん、この障壁は、第1および第2部分からの、分析対象（例えば、磁気粒子を介する）の移送を妨げてはならない。
本発明による、もう一つのきわめて好ましい解決策は、チェンバーの第1部分におけるサンプル試料（例えば、光）の存在によって発生される残留信号（ノイズ）を棄却することであり、これを、液体サンプル試料を、それが固定基質に接触した後（または場合によっては、該固定基質をチェンバーの検出部分に移送した後）、該試料が導入された方向とは反対の方向に向かって、毛細管チャンネルから、チェンバーの第1部分から遠ざかるように差し向けることによって行う。反跳流は、チェンバーの第1部分に設けた放出口を通じて、チェンバーの検出部から遠ざかるように外部に差し向けてもよいし、あるいは、該反跳流は、サンプル流入口を通じて元に戻るように差し向けてもよい。したがって、この局面では、サンプル流入口、および廃棄産物放出のための放出口は同じになる。
これは、分析対象が固定基質に固定された後、液体、例えば、洗浄液の流れを、チェンバーの検出部分からチェンバーの反応部分に差し向けることによって実現される。これによって、洗浄液の流れは、液体サンプルの流れを（分析対象の固定後）、流入口または放出口を通じて元に戻るように差し向けるため、背景信号の著明な低下がもたらされる。
しかしながら、背景信号の抑制という課題に対するこの解決策は、別の課題を引き起こすことが観察された。通常、本発明のデバイスにおいて液体サンプル試料の導入は気泡を産出し、これは、固定基質の移送を妨げる。好ましくは、固定基質は、液体相の中を横断しなければならず、したがって、デバイスの反応部分からデバイスの検出部分までの、固定基質の流通経路内における気泡の形成および捕捉は避けなければならない。
したがって、収集チェンバーが、チェンバーの第1反応部分と、第2検出部分との間に設置されることはきわめて好ましい。したがって、この収集チェンバーは、廃棄産物および捕捉された気泡を収集するのに役立つ。しかしながら、液体サンプル試料の流れを、流入口を通じて元に戻るように差し向けるためには、収集チェンバーの流動抵抗は、それが廃棄物および空気によって満たされている場合、チェンバーの第1部分の流動抵抗よりも大きくなければならない。
したがって、好ましい局面では、本発明によるデバイスはさらに、第1部分と第2部分を分離する、廃棄産物を放出するための収集チェンバーを含む。好ましくは、この廃棄産物を放出するための収集チェンバーは、廃棄産物（単数または複数）で満たされている場合、反応チェンバーの第1部分の流動抵抗よりも高い流動抵抗を有する。
固定基質の移送を妨げる気泡の捕捉を避けるためには、収集チェンバーは、毛細管チャンネルに接続される近位端を含む、第1側方チャンネル(27)を含むことが好ましく、その際、近位端における第1側方チャンネルは、第1部分の毛細管チャンネルに対し第1角度(36')を形成し、該第1角度は90度よりも小さい。
好ましくは、第1側方チャンネルは、満たされた場合、第1部分の毛細管チャンネルの流動抵抗よりも高い流動抵抗を有する。
第1部分の毛細管チャンネルに対する第1角度は重要である。なぜなら、90度よりも小さい第1角度を用いることによって、気泡は、第1部分の液体サンプルと、第2部分から廃棄される液体廃棄産物との間の液体接触を離れ、側方チャンネルを通じた外部への移動が実現されるからである。
好ましい局面では、デバイスは、第1側方チャンネル(27)および第2側方チャンネル(27)を含み、その際、第1および第2の両側方チャンネルとも、収集チェンバーに接続される近位端を含み、近位端における第1側方チャンネルおよび第2側方チャンネルは、第1部分の毛細管チャンネルに対し第1角度(36')を形成し、該第1角度は90度よりも小さい。
好ましくは、第1(27)側方チャンネルおよび第2(27)側方チャンネルは、充填された場合、この部分の毛細管チャンネルの流動抵抗よりも高い流動抵抗を持ち、好ましくは、第1(27)と第2(27)側方チャンネルの流動対抗はほぼ等しい。
第1チャンネルおよび第2チャンネルが、収集チェンバーの別々の側面に配置され、かつ、第1(27)と第2(27)側方チャンネルの流動抵抗がほぼ等しい場合、最適結果が得られる。
好ましい局面では、第1角度は、90度よりも低く、例えば、85度よりも低く、さらに80度よりも低く、またはさらに75度よりも低く、例えば、70度よりも低い。好ましくは、第1角度は、1度よりも高く、例えば、5度よりも高い。一局面では、第1角度は、1と85度の間、または25と75度の間、または40と70度の間、または約60度である。
好ましくは、本発明は、遮光要素の使用と、分析対象の固定基質に対する固定後、流入口に通じる液体サンプル試料流の帰還指令とを組み合わせる。
好ましくは、反応チェンバー、または、反応チェンバーの少なくとも第2部分の内面の表面構造および内面の色は、それぞれ、無反射および／または光吸収性である。本発明の一局面では、この無反射および／または光吸収性表面は、表面を曇らせるか、および／または暗黒化することによって実現される。ある好ましい局面では、暗黒化は、黒色化である。もっとも好ましくは、反応チェンバーの内面の色は黒である。
本発明のある好ましい局面では、標的分析対象の検出手段は、表面音波(SAW)検出器、分光光度計、蛍光光度計、CCDセンサーチップ（単数または複数）、CCOSセンサーチップ（単数または複数）、PMT検出器（単数または複数）、または、適切なものであればいずれのものであってもよい光検出器の中から選ばれる。
一局面では、毛細管チャンネルの第1部分は、デバイスに一体化されるフィルター機構に接続される。好ましくは、サンプル（例えば、血清または血漿）流入口は、フィルターデバイスを通過する。
ある好ましい局面では、反応チェンバー内部、または、少なくとも反応チェンバーの第1部分内部の幅および高さは、それぞれ、0.1 - 5 mmおよび0.05 - 2 mmである。より好ましくは、反応チェンバー内部、または、少なくとも反応チェンバーの第1部分内部の幅および高さは、それぞれ、0.25 - 2 mmおよび0.2 - 1 mmである。
ある好ましい局面では、反応チェンバーの長さは、2 - 30 mm、より好ましくは5 - 20 mmである。
本発明によるデバイスは、サンプルにおける標的分析対象物の有無を定量的に検出するために使用されてもよい。好ましくは、サンプルは血液から得られる。一局面では、サンプルは血清である。一局面では、サンプルは血漿である。血漿は、分析される血液サンプルに抗凝固剤を与えることによって取得することが可能である。好ましい抗凝固剤は、K3-EDTA、クエン酸塩、およびヘパリンから成る群から選ばれてもよい。
本発明のある好ましい局面では、サンプルはヒト由来ものである。
別局面において、本発明は、200 μl未満の液体から成るサンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するための方法であって、下記の工程：
a)200 μl未満の液体から成る液体サンプルを含む分析対象を準備すること；
b)該液体サンプルを反応チェンバーに供給すること、該チェンバーは、第1反応部分および第2検出部分を含み、この二つの部分は、液体サンプル試料が、第2検出部分に入りそれと接触することがないように物理的に隔離され；
c)チェンバーの第1反応部分のサンプルを、該分析対象を捕捉することが可能な固定基質と接触させること；
d)捕捉された分析対象を含む固定基質を固定すること；
e)捕捉分析対象を含む固定基質を、チェンバーの第2部分に移送すること；
f)捕捉分析対象を含む固定基質を再び可動化し、洗浄液によって洗浄すること；
g)捕捉分析対象を含む固定基質を固定すること；
h)必要に応じて洗浄液を廃棄すること；
i)必要に応じて捕捉分析対象を含む固定基質を再び可動化し、工程f)からh)を繰り返すこと；
j)捕捉分析対象を含む固定基質を、チェンバーの第2部分の検出器部分に移送すること；および、
k)通例の検出手段を用いて標的分析対象の有無を検出すること、
を含む、方法に関する。
1区画において分析対象を結合させる工程a)-d)と、第2区画において分析対象を洗浄、検出する工程e)-k)とを分離することによって、背景信号の著明な減少が観察された。
ある好ましい局面では、本発明はさらに、分析対象を、該分析対象に結合することが可能な生物学的マーカーと接触させる工程を含む。この生物学的マーカーは、例えば、酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ビオチンまたはアルカリフォスファターゼ(ALP)を備える抗体であってもよい。このようにすると、分析対象は、検出用信号を増すためにより検出可能となる。本発明による方法の好ましい局面では、分析対象を、該分析対象に結合することが可能な生物学的マーカーに接触させる工程a')は、工程e)の前に実行される。このようにすると、本法の検出部分における未結合生物学的マーカーの存在は著明に抑えられる。本発明のある好ましい局面では、生物学的マーカーは、信号を増幅することが可能な基質と反応することが可能である。したがって、本発明の一局面では、方法はさらに、捕捉分析対象を含む固定基質を、生物学的マーカーと反応することが可能な物質と接触させる工程f')を含む。
本発明の好ましいある局面では、生物学的マーカーは、化合物、モノクロナール、オリゴクロナール、およびポリクロナール抗体、抗原、受容体、リガンド、酵素、タンパク質、ペプチド、および核酸から選ばれる一つ（またはそれ以上）である。好ましくは、生物学的マーカーは、光吸収、蛍光発射、りん光発射、またはルミネセンス発射の特性を有する群から選ばれる一つ以上である。
ある好ましい局面では、固定基質は磁気材料を含む。ある好ましい局面では、工程e)は、磁気源を、第1反応チェンバーの外部辺縁にそって、第2検出チェンバーの方に向けて動かすことによって実行される。
一局面では、固定基質はマイクロスチックを含む。マイクロスチックとは、微小流システムにおいて固相酵素免疫測定法(ELISA)のために使用することが可能な、プラスチックまたはステンレススチール製の、機械工作されるか、または金型成形されるペグである。それらは、反応性表面として使用されるようにプラスチックでコートすることが可能なステムから成る。このマイクロスチックは、特に検出法が蛍光に基づく場合は、磁気粒子の代わりに使用することが可能である。なぜなら、一般に、磁気粒子は、400 - 800 nm区域に広範な自己蛍光を持つからである。マイクロスチックの場合、広範なコーティング材料（ポリカーボネート、ニトロセルロースなど）の選択が可能であり、ユーザーは、固相表面の品質および標準化に関してより自由に制御することが可能になる。
しかしながら、ある好ましい局面では、固定基質は磁気材料を含む。好ましくは、磁気材料は、磁気粒子、磁気ナノ粒子、および超常磁性ナノ粒子を含む群から選ばれる。
さらに、驚くべきことに、非単峰性サイズ分布、例えば、双峰性サイズ分布を持つ磁気粒子を用いると、洗浄効率および時間においてより効率的な性能が得られることが観察された。したがって、本発明の好ましい実施態様では、磁気材料は、少なくとも双峰性サイズ分布を有する。本発明の別の局面では、磁気材料は、3峰性サイズ分布を有する。
本発明のある好ましい局面では、前記通例検出手段は、表面音波(SAW)検出器、分光光度計、蛍光光度計、CCDセンサーチップ（単数または複数）、CCOSセンサーチップ（単数または複数）、PMT検出器（単数または複数）、または、適切なものであればいずれのものであってもよい光検出器の中から選ばれる。
本発明による方法は、サンプルにおける標的分析対象物の有無を定量的に検出するために使用されてもよい。好ましくは、サンプルは血液から得られる。一局面では、サンプルは血清である。一局面では、サンプルは血漿である。血漿は、分析される血液サンプルに抗凝固剤を与えることによって取得してもよい。好ましい抗凝固剤は、K3-EDTA、クエン酸塩、およびヘパリンから成る群から選ばれてもよい。本発明のある好ましい局面では、サンプルはヒト由来のものである。
一局面では、本発明は、上に定義した通りのデバイス、および本発明による磁気材料を含む部品のキットに関する。好ましくは、このキットは、サンプルにおける標的対象の有無の検出に使用される。
統合型分離および検出デバイスにおけるアッセイサイクル
本実施例の目的は、下記を具体的に説明することである：
1. 例としての分析対象、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)に関する測定原理
2. 検出限界
3. 検出範囲
4. 種々のBNP濃度におけるCV値
5. 血液サンプルにおけるBNPの測定。
試料
標準：範囲0 pg/ml - 16,000 pg/mlのBNPを、本実施例の方法を用いて測定した。
サンプル：健康な志願者から得た4つの異なる血液サンプル、および心不全患者から得た4つの異なる血液サンプルを、本実施例の方法を用いて測定した。
抗体：BNP捕捉性モノクロナール抗体でコートした磁気粒子（MP)。トレーサー抗体は、HRP標識モノクロナールBNP抗体である。トレーサー抗体は、血液分離フィルターの中に直接置いた。
血液安定化剤：EDTAを、毛細管チャンネルまたは血液サンプルのいずれかに添加する。
洗浄液：TBS + 0.05 wt.vol% Twen および、0.05 wt.vol% BSA
検出液：Pierce SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate （下記の工程17にしたがって、水泡Aからの1容量部の信号液、および水泡Bからの1容量部の信号液から構成される）。
検出器：PMT検出器(Hamamatsu)
アッセイ温度：19℃
機械系および電子系：機械部品、電子制御装置、およびソフトウェアは全て、出願企業によって企業内で製造された。
アッセイ手順
（分離および検出デバイスを、図6に示される通りに使用）
1. 36 - 50 μlのサンプルまたは標準を、ろ過区域(2)に印加した。
2. 分離後、4.6 μlの血漿が、血漿流入口(21)を通じて血漿チャンネルに入った、毛管力がサンプルを反応チェンバー内に引き込む。
3. 血漿は血漿チャンネル(3)に進入し、光吸収性障壁および毛細管ストップ(22)まで駆け上る。
4. 血漿チャンネル（磁気粒子によってコートされる）において、磁気粒子は、血漿チャンネル(3)に進入する血漿に溶解した。
5. アッセイインキュベーション時間の間、外部の磁気駆動機構を用いて、血漿チャンネル(3)においてMPをゆっくりと前後に移動させる。
6. アッセイインキュベーション時間後、外部磁気駆動機構を用いて、全てのMPを
毛細管ストップ位置(22)の近傍で、濃縮、固定する。
7. 洗浄液を含む水泡(23)を破裂させ、洗浄液を、チャンネル(25)に接続されるチャンネル(24)を通じて微小流システムに、次いで、(26)および(6)を通じて検出域に進入させる。
8. 洗浄液はさらに、洗浄チャンネル(5)を通じて流れ、最終的に毛細管ストップ(22)に到達し、そこにおいて、洗浄液は、血漿の前線に接触し、側方チャンネル(27)を持つ収集チェンバーを通じて直接廃棄物容器（図示せず）に向かって進む。
9. MPは、外部の磁気駆動機構を用いて、毛細管ストップ(22)障壁を通じて洗浄チャンネル(5)の中に移動させる。
10. MPは、外部の磁気駆動機構を用いて洗浄チャンネル(5)においてゆっくりと前後に動かす。
11． MPは、外部の磁気駆動機構によって、洗浄チャンネル(5)の中央において濃縮、固定される。
12． 洗浄液含有水泡(23)を通じて、より多くの洗浄液が注入される。
13． 収集チェンバーおよび側方チャンネル(27)には（血漿チャンネルに比べて）より高い圧が存在するために、新たに注入された洗浄液は、比較的低圧の血漿チャンネル(3)中に進入し、血漿を、さらに後方、血液ろ過域(2)の方に押し戻す。
14． 工程10および11を繰り返すことによって、続けて洗浄サイクルを実行してもよい。
15． 外部磁気駆動機構は、MPを検出域（ウィンドウ）(6,14)に移動させ、そこにおいて、MPは、検出ウィンドウ(6,14)の中心の上方に固定される。
16． 洗浄液は、下記のようにして、水泡(28)および(29)中の光発生液によって置換される。
17． 信号液水泡A(28)および信号液水泡B(29)は、チャンネル(31)に接続されるチャンネル(30)を通じて1:1で混合されて(32)に送り込まれる。
18． 最初の60 μlの混合液は、チャンネル(32)を通じて、チャンネル(33)を満たす。
19． チャンネル(33)の末端において圧が増加すると、信号（光）発生液は、チャンネル(34)を通じて混合ユニットの中に入る。
20． 二つの溶液は、混合ユニット(35)において混ぜ合わされる。
21． 三次元(x,y,z)混合ユニットにおいて7混合サイクルを経過した後、信号（光）発生液は、検出域(6,14)に進入し、さらに洗浄チャンネル(5)に進み、毛細管ストップ(22)に到達し、そこにおいて、信号発生液は、対称的廃棄チャンネル(27)と血漿チャンネル(3)の間の圧差のために--工程13参照--洗浄液と交換された血漿前線に到達する。
22． 検出域の中心の上にMPを固定する（工程15）外部磁気駆動機構は、素早くろ過域(2)の方に移動させられ、そのため、検出ウィンドウ(6,14)上にMPの集合が実現される。
23． PMT検出器は、フォトン計数によってMPから発射される光をカウントする。
結果
標準曲線は、0 - 10,000 pg/mlの正当な測定範囲において、範囲0 - 2000 pg/mlについて直線性を示す（図8）。
予期した通り、健康な志願者および心不全患者から得た血液サンプルの結果から、健康な志願者のBNP濃度は、範囲の低レベル末端にあるが、患者のBNP濃度は、それよりも5-10倍高いことが明らかになった。
表１：全血サンプルの測定結果
Figure 2011504591
結論
結果から、本分離／検出デバイスにとって下記の最重要機能特性が達成されることが明らかになった。
＊比較的低い検出限界：5 pg/ml未満
＊測定範囲：0から10,000 pg/ml
＊精度：CVは、中等／高レベル範囲では5%未満、下限では15%未満
＊1回の所要時間：15分未満
＊サンプル試料
＋ヒト全血、場合によって指先から直接採取したもの。
＋EDTA安定化血
＋遠心による単離血漿
前述の実施例に基づけば、5 pg/mlを下回る濃度領域で十分に小さいCV値下に、かつ、0 - 2000 pg/mlに直線性範囲を持ちながら、<5 pg/mlから>10,000 pg/mlの検出範囲に亘って分析対象BNPを検出することが可能であると結論することが可能である。

Claims (26)

  1. 200 μl未満の容量を持つ液体サンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するためのデバイスであって、下記：
    a. 200 μl未満の容量を持つ毛細管チャンネル(3)、分析対象を含むサンプルの導入のためのサンプル流入口(21)、および廃棄産物放出のための放出口(4b)を含む第1部分；
    b. 該標的分析対象の検出手段(14)、および、洗浄液および反応混合物導入のための溶液流入口(8)を含む第2部分（5, 6）；および、
    c. 固定された分析対象を、チェンバーの第1部分から第2部分へ、および逆方向へ移送するための手段、
    を含む反応チェンバーを含み、
    第1部分と第2部分は隔てられるが、その隔離が、液体サンプル試料が、チェンバーの第2部分に入ることがないように、かつ、光が、チェンバーの第1部分から、チェンバーの第2部分の検出器部分に送られることがないように行われることを特徴とする、デバイス。
  2. 光が、チェンバー(20)の第1部分の末端における光不透過性障壁または傾斜によって、チェンバーの第1部分から、チェンバーの第2部分の検出器部分に送られることがないように阻止されることを特徴とする、請求項1に記載のデバイス。
  3. 第1部分の出口点、および第2部分の進入点を異なるレベル(20')に設置することによって、光が、チェンバーの第1部分からチェンバーの第2部分の検出器部分に送られることがないように阻止することを特徴とする、請求項1または2に記載のデバイス。
  4. 液体サンプル試料が前記固定基質に接触した後、該液体サンプル試料の流れを、該固定基質に接触する前の、該液体サンプルの流動方向とは反対の方向に差し向けることによって、光が、チェンバーの第1部分から前記検出器部分に送られることがないように阻止することを特徴とする、請求項1-3のいずれか1項に記載のデバイス。
  5. 前記反応チェンバーの内面の表面構造および色が、それぞれ、無反射および／または光吸収性であることを特徴とする、請求項1-4のいずれか1項に記載のデバイス。
  6. 標的分析対象の前記検出手段が、表面音波(SAW)検出器、分光光度計、蛍光光度計、CCDセンサーチップ（単数または複数）、CCOSセンサーチップ（単数または複数）、PMT検出器（単数または複数）、または、任意の適切な光検出器の中から選ばれることを特徴とする、請求項1-5のいずれか1項に記載のデバイス。
  7. 前記第1(3)および第2部分(5,6)を分離する、廃棄産物放出のための収集チェンバー(4a)をさらに含むことを特徴とする、請求項1-6のいずれか1項に記載のデバイス。
  8. 廃棄産物を放出するための前記収集チェンバーは、廃棄産物（単数または複数）で満たされている場合、前記反応チェンバーの第1部分の流動抵抗よりも高い流動抵抗を有することを特徴とする、請求項7に記載のデバイス。
  9. 前記収集チェンバーが、第1部分(3)の毛細管チャンネルの流動抵抗よりも高い流動抵抗を持つ第1側方チャンネル(27)を含み、該第1側方チャンネルは、該収集チャンネルに接続される近位端を含み、その際、該近位端における第1側方チャンネルは、第1部分の毛細管チャンネルに対し第1角度(36')を形成し、該第1角度は90度よりも小さいことを特徴とする、請求項7または8に記載のデバイス。
  10. 第1側方チャンネル(27)および第2側方チャンネル(27)をさらに含み、その際、第1側方チャンネルおよび第2側方チャンネルは、合わせて、第1部分(3)の毛細管チャンネルの流動抵抗よりも高い流動抵抗を有し、第1および第2側方チャンネルは共に、前記収集チェンバーに接続される近位端を含み、該近位端において第1側方チャンネルおよび第2側方チャンネルは、第1部分の毛細管チャンネルに対し第1角度(36')を形成し、該第1角度は90度よりも小さいことを特徴とする、請求項7または8に記載のデバイス。
  11. 第1チャンネル(27)および第2チャンネル(27)が、前記収集チェンバー(4a)の別々の側面に配置されることを特徴とする、請求項10に記載のデバイス。
  12. 前記第1角度(36')が、1と85度の間、または25と75度の間、または40と70度の間、または約60度であることを特徴とする、請求項9-11のいずれか1項に記載のデバイス。
  13. 液体サンプルにおける標的分析対象の有無を定量的に検出するための、請求項1-12のいずれか1項に記載のデバイスの使用。
  14. 前記サンプルが血清であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
  15. 前記サンプルが血漿であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
  16. 200 μl未満の液体から成るサンプルにおいて標的分析対象の有無を定量的に検出するための方法であって、下記の工程：
    a)分析対象を含み、200 μl未満の液体から成る液体サンプルを準備すること；
    b)該液体サンプルをチェンバーの第1反応部分に供給すること、該チェンバーは、第1反応部分(3)および第2検出部分(5,6)を含み、この二つの部分は、液体サンプル試料が、第2検出部分に入りそれと接触することがないように物理的に隔離され；
    c)チェンバーの第1反応部分のサンプルを、該分析対象を捕捉することが可能な固定基質と接触させること；
    d)捕捉された分析対象を含む該固定基質を固定すること；
    e)該捕捉分析対象を含む該固定基質を、必要に応じて該チェンバーの第2部分に移送すること；
    f)該捕捉分析対象を含む該固定基質を洗浄液によって洗浄すること；
    g)該洗浄液を廃棄すること；
    h)工程e)が実行されなかった場合、該捕捉分析対象を含む該固定基質を、該チェンバーの第2部分の検出器部分(6)に移送すること；および、
    i)通例の検出手段(14)を用いて標的分析対象の有無を検出すること、
    を含む、前記方法。
  17. 液体サンプル試料が前記固定基質に接触した後、該液体サンプル試料の流れを、該固定基質に接触する前の、導入される該液体サンプルの流動方向とは反対の方向に差し向ける工程をさらに含むことを特徴とする、請求項16に記載の方法。
  18. 工程e)またはh)の固定基質の移送前に、残留気泡を廃棄する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項16または17に記載の方法。
  19. 前記固定基質が、磁気粒子、磁気ナノ粒子、および超常磁性ナノ粒子を含む群から選ばれる磁気材料を含むことを特徴とする、請求項16-18のいずれか1項に記載の方法。
  20. 前記磁気材料が、少なくとも双峰性サイズ分布を有することを特徴とする、請求項19に記載の方法。
  21. 前記磁気材料が、少なくとも3峰性サイズ分布を有することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
  22. 前記通例検出手段が、表面音波(SAW)検出器、分光光度計、蛍光光度計、CCDセンサーチップ（単数または複数）、CCOSセンサーチップ（単数または複数）、PMT検出器（単数または複数）、または、任意の適切な光検出器の中から選ばれることを特徴とする、請求項16-21のいずれか1項に記載の方法。
  23. 前記サンプルが血清であることを特徴とする、請求項16-22のいずれか1項に記載の方法。
  24. 前記サンプルが血漿であることを特徴とする、請求項16-22のいずれか1項に記載の方法。
  25. 請求項1-12のいずれか1項に記載のデバイス、および、請求項19-21のいずれか1項に定義される磁気材料を含む部品のキット。
  26. 請求項13-15のいずれか1項に記載の使用のための、請求項25に記載のキット。
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