JP2005292092A - 能動流路及びこれを用いた血球分離構造物 - Google Patents

Abstract

【課題】より構成を簡素化しながら微量な流体の操作を可能とし、血液に凝集剤、場合によっては凝集促進剤を混和し、生成した凝集塊を流路構造で沈降させることによって、血液の固形成分と液体成分を分離する。
【解決手段】外部に駆動源を用いず、流体を操作する駆動力を有する流路を提案すると共に、血液の血球成分を溶血がない凝集剤等によって凝集させ、流路に設けた減速堤、沈降段差、斜め上方流路、断面積が徐々に小さくなる流路等の構造によって、血液の固形成分と液体成分を簡易に、高速で、安価に分離する。
【選択図】図１

Description

本発明は、流体に能動的な作用を行う能動流路、及びこれを用いた血液の固形成分（血球）と液体成分（血漿）を簡易に分離する方法に関するものである。

今般、電気泳動チップ、血液成分測定用チップ等、チップ上の装置におけるマイクロ流路の利用が盛んであり、特開２００３−８３９５８号公報には、微小針状の穿刺具を具えた血液成分検査システムが開示されている。特開２００３−８３９５８号は、遠心分離手法を組み合わせる必要があり、確かに遠心力を用いることで、液体の移動を制御可能とすることができるが時間がかかってしまうと共に、遠心分離の為の構成が必要となる。
他方、特開２００１−２８１２３３号公報には。流路の組み合わせに液量の定量を実現する能動流路が示されている。

特表平５−５１０４８４号公報 特開２００１−２８１２３３号公報 特開２００３−８３９５８号公報

ところで、流路を用いて流体を操作する手法は、上述した公報に示すように複数の流路を組み合わせて、流体の合成、分離、定量を行うものに留まるものであり、別途フィルタや、遠心分離器を組み入れる必要があるが、
血液の固形成分と液体成分を分離する場合に、遠心分離法では遠心装置が必要であり、分離時間も長くなる。また、フィルター分離法では、加圧が必要となり、状況によっては溶血の問題がある。
解決しようとする問題点は、簡易に高速で安価に血液の固形成分と液体成分を分離できない点であり、より小型、携帯化され、微量で、各種の測定検査が可能なチップタイプの流体処理装置が希求されている現状では、上述の課題は大きい。

本発明は、流体の進行方向が細い流路、前記流路の両側面、底面のそれぞれ一方又は他方に連続した突起を有する能動流路により、流体そのものに流れを与えると共に、当該突起が、流体の流れを、一時的に停止させたり、減速させる等の能動的な制御をすることが可能な流路を実現した。
本発明における流体とは、好ましくは粒子を含むものであって、血液、尿、汗、精液、いわゆる間質液等が例示されるが生体関連流体に限るものではない。
本発明における流体の進行方向が細い流路とは、進行方向の所定の部位、即ち、定量したり加工したりする操作領域に到達した当該流路進行方向端部の断面積が、当該流路の液体入力部位の断面積に比べて、１〜９９％小さい状態であればよく、そこまでの流路の側面は、テーパ状を有していたり、進行方向端部近傍のみ断面積が小さい状態であっても良い。
流路の進行方向端部の断面積は、例えば０．０００５ｍｍ²〜０．００１ｍｍ²であり、入力側端部の断面積は、例えば０．１ｍｍ²〜２．５ｍｍ²が示される。
更に、本発明は、凝集剤と凝集促進剤により血液の固形成分と液体成分を大きく分離した後に、流路に設けられた構造によって、簡易に高速で安価に血液の固形成分と液体成分を分離することを最も主要な特徴とする。

本発明における血球を凝集するステップとは、例えば、血球に化学的または物理的に反応する高分子等で凝集塊をつくることである。
血球凝集剤は、例えば、凝集成分と、凝固促進成分の組み合わせが、血液を溶解せず、しかも素早く凝集させる点で好適である。
凝集塊の大きさは、より大きい方が好ましいが、例えば０．１ｍｍ〜２ｍｍの直径になるような粒子塊が好ましい。
本発明における血球の凝集を促進するステップとは、例えば、血球と凝集剤の反応を化学的または物理的に速め、さらには凝集塊を引き締めることである。
本発明における血液の進行を減速するステップとは、例えば、流路の両側の壁面に突起を設けることによって、流路の断面積を減少させることによって、一時的に進行速度を低下させることである。
本発明における分離した血漿を自動的に進行させるステップとは、例えば、流路の断面積を徐々に小さくすることによって、分離液が断面積の小さい方向に自動的に進む性質を利用した構造のことである。
尚、進行の為又は進行を助けるために、濾紙や、多孔質セラミックス等の多孔質材を配置することで、多孔質材が具えた吸引能力により、進行を促進させることができる。この多孔質材は、上述の他、不織布、スポンジ等が例示される。
本発明における調整手段は、少なくとも流体中の不要成分を、凝集したり、固化したり、増幅させたり、増加させたりして、後段の能動流路の一部で、捕捉、変形、変質可能な状態に処理することであり、そのための手段であれば、特に前述に限るものではない。
又、能動流路は、側面突起、底面突起の配置にかぎらず、調整手段で得られる不要成分の特化した流体から、底面部に設ける窪み、特別の荷電領域、疎水領域等、様々な物理的手法により、捕捉、変質、変形できるものであれば良くこれに限るものではない。
本発明における分別的に処理するとは、例えば調整成分の一部又は全部を捕捉してしまうことや、変形させてしまうこと、変質させてしまうこと、篩にかけること等、少なくとも後段で不要な成分が除去されるか、不要でない量まで減少させるか、不要でない物に変換、変質、又は後段の一部を迂回させてしまうこと等を示すものであるが、少なくとも目的に対し不要な状態を形成しない処理であれば特に限定されるものではない。

本発明は、流体の処理に併せた速さの流れが制御可能となり、途中に測定系、操作系を組み込むことができる。
又、血液に凝集剤等を混和して分離流路に投入するだけで、高速に簡易に安価に血液の固形成分と液体成分を分離できるという利点がある。

本発明は、進行方向が細い流路に両側面に幅０．０１〜１ｍｍの突起を１乃至複数個を設けることで、突起部において流体の流れが、一時的に停止するような力を受けることから、流体の流れる速さを遅くすることができる。
この側面突起の数を多くすることで、任意の流体の速さを実現する。
更に進行方向が細い流路の底面に幅０．０１〜０．１ｍｍの突起を１乃至複数個を設けたりした流路により、不要な粒子を、当該底面突起により補足可能であり、
更に側面突起と底面突起を組み合わせることにより、側面突起で、速さが遅くなった流体により粒子を底面に留まらせ、底面突起で補足し、流体内の粒子分離を実現できる。
流路に投入した血液の固形成分と液体成分を分離し、分離した液体成分を流路の断面積を徐々に小さくしていくことによって、自動的にその先の構造に進行させられるので、簡易に高速で安価な分離構造が実現された。
本発明における固形成分とは、例えば赤血球、白血球、血小板等であり、液体成分とは、血清、血漿等が例示できる。
本発明では、血球分離のため、血球凝集剤を用いて、より比重の大きい粒子塊を形成することが好ましい。

血液の血球を凝集させる凝集剤は、血液の性質に影響を与えず、高速で凝集させる高分子材料等が適しているが、例としては以下の成分例示される。
凝集成分とは、ポリカチオン等の水系溶媒中でプラスに帯電するものであればよい。例えば、ポリーＬ−;リジン、ポリーＬ−;アルギニン、ポリアクリルアミド、ポリーＬ−;オルニチン、ポチエチレンイミン及びそれらとの共重合体などが示されるが、これらに限るものではない。またポリエチレングリコール、アカ゛ロース、でんぷん、PVA、ポリビニルピロリドン、イオン交換樹脂等を高分子中に含んでいてもよい。特に陰イオン交換樹脂等を導入することもある。

血球の凝集を促進する促進剤は、凝集時間を速め、凝集塊を引き締め血液の液体成分をより多くする材料が適しているが、例としては以下の成分が例示される。

凝固促進成分は、少なくとも疎水性材であればよく、好ましくは脂質鎖のような鎖状疎水性物質、例えばオレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α−;リノレン酸、アラキドン酸、エンコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ジヒドロキシステアリン酸、セレブロン酸、リシノール酸、ヒドロキシネルボン酸、ヒドノカルプス酸、ショールムーグリン酸、ゴルリン酸、ラクトバシル酸、イタコン酸、トリコサン二酸、クロトン酸、ミリストレイン酸、等の脂肪酸から誘導される、オレイル基、ステアリル基、パルミチル基、エルカエル基、ネルボネル基、リノーレル基、α−;リノレレル基、アラキドエル基、エンコサペンタエル基、ドコサペンタエル基、その他上記脂肪酸から誘導される誘導基を有するものが例示される。
この中でも、ポリＬリジンとオレイル基の組み合わせが、細胞を溶解することなく速く安定した凝集を行う点で本発明には好適である。

図１に本発明の一実施例を示した。
図１は、上面から見た図であって、蓋１０Ｈをしていない状態であり、図１（b）及び図１（c）に蓋をした状態で、それぞれＸ−Ｘ‘方向の断面図、Ｙ−Ｙ’方向の断面図を示した。
１１は、血球沈殿室であり、おおよそ１０ｍｍ³位の大きさを有し、上部に投入孔２２を有する。１２は、流路であり、血液成分の進行方向に対してその側面が１〜５度の傾斜ａを有している。流路１２と血球沈殿室１１の接続面の幅ｃは、１〜４ｍｍ位であり、流路１２と吸い取り部１３との接続面の幅ｄは、０．１〜１ｍｍ位である。
１３は、吸い取り部であり、血液成分の進行を補助するための吸い取り紙、濾紙等の多孔質成分が収容されている。
１４は、遮断部であり、上方へ血液成分が溢れるような形で、流路１２へ血液成分を進行させようとするものである。
遮断部１４は、血液成分の斜め上方流路を形成することになるが、血球沈殿室１１の上方に設けられ、角度は平行以上あればよい。

１５及び１７は、減速堤であり、幅ｅは、０．０１〜０．１ｍｍであって、流路の断面積を部分的に小さくすることによって、一時的に血液の進行速度を低下させるためのものである。減速堤１５，１７は、少なくとも１箇所以上あればよい。
１６及び１８は、沈降段差であり、高さｂは、０．０１〜０．１ｍｍに設定されており、流路の底面に設けられた凸状の構造で、未凝集の血球を補足するためのものである。沈降段差１６、１８は、少なくとも１箇所以上あればよい。
１９は、採取流路であり、定量秤取室２０と、流路１２を接続するためのものである。
２０は、定量秤取室であり、生化学検査等を行なう反応室で、その定められた室内面積によって液体成分が定量される。室内の濡れ性の程度、液体成分が導入される。定量秤取室２０は、目的によって複数室設ける場合もある。
２１は、脱気孔であり、定量秤取室２０内に液体成分を導入するために脱気する孔である。
２２は、投入孔であり、凝集剤、希釈液、全血液等を投入する孔であって、場合により遮蔽用蓋を設ける様な構成を有する。
尚、血球沈殿室１１，流路１２などは、表面を親水処理する場合もある。
これらのの領域は、大きさ４×２×３mmのチップ状の基盤１０に凹部として形成されることが好ましく。その上から蓋１０Ｈを接着剤、超音波溶着等により接合されることが好ましい。
当該基盤１０は、その材質を ＰＤＭＳ、ポリプロピレン、ＰＥＴ、ポリカーボネート等により形成され、蓋１０Ｈも同様の材質により形成されることが好ましいが、これに限るものではない。尚、基盤１０上の流路面、操作領域面、等には必要に応じプラズマ処理が施される場合もある。

図２に動作を示し説明する。
まず、図２（ａ）で示すように投入孔２２より全血５〜２０ｍｌ、血液凝集剤５〜２０ｍｌを投入するＫ。その投与量は、遮断部１４の斜め方向に削られた面を越える程度にまで充填される。全血液と血液凝集液は、それぞれ単独で供給する場合もある。
投入された全血及び血液凝集剤の混合液Ｌは、赤血球、白血球、血小板を凝集させ、沈殿させる一方Ｎ１溢れ出た混合液であって、血球等が除かれた混合成分は、流路１２へ、流入する（図２（ｂ））。
流路１２は、進行方向に対して、テーパーがあり、先細りのため、毛管力が強く作用すると共に、吸い取り部１３の吸い取り力の合成力Ｖにより、混合成分は、流路１２を進行しようとする。
この時、血球凝集作用は、ある程度時間がかかるため、遮断部１４を越えて流路１２に流入してしまうことから、 血球等の凝集沈降を促すために、減速堤１５において、血液の進行速度を減速させる。即ち、減速堤１５では、流路１２に減速堤が突出しており、流路の断面積が減少するために、一時的に進行速度が低下する（図２（ｃ））。その際の速度低下率は、おおよそ１０％〜９０％であるが、突出量などで、変化する。

この速度低下により、凝集剤による血球等成分の凝集沈殿反応が進み、重い凝集物N2は、沈殿段差１６の部分に沈殿する。
沈殿段差１６を越えて次の減速堤１７に血液成分Ｍ１が到達すると、減速堤１５と同様、血液成分Ｍ１の進行は、減速し、より血球等成分の沈殿して凝集N2が促進され、次の沈殿段差１８の隅に凝集物N2が沈殿する（図２（ｃ））。この様に凝集剤と血液の混合液の流路進行が減速堤により遅くなるために、凝集反応が進み、沈殿室から溢れ出た血球等の凝集物N2を各沈降段差１６，１８で補足する為、血球等成分が除去され、血漿、血清のみに近い血液成分Ｍ２が、採取流路１９を介して、定量秤取室２０へ到達すると共に余分な血液成分Ｍ２は、吸い取り部１３に収容される（図２（ｄ））。
定量秤取室２０には、試薬等が予め収容されており、血液成分が流入すると、混合して発色する。この発色試料を、外部から計測する。その際、定量秤取室２０の底部、上部が透光性部材で形成されることが好ましい。
この減速堤の数は、遮断部１４を超えて、流路１２へ流入する血球等を分離沈殿除去する必要分だけあればよいが、これに限らず適宜決定されればよい。

（凝集剤＋促進剤の調製法）
ポリ−Ｌ−リジン（分子量30000〜70000、シグマ社製）とオレイン酸N−ハイドロキシスクシンイミド（シグマ社製）をＤＭＳＯ（シグマ社製）溶媒中で１：１のモル比になるように混合し、室温で1時間反応させた。その後ＰＢＳにより370μＭの濃度になるように調製した。

血液15マイクロリットル（μＬ）に凝集剤15μＬを加え、スライドグラス上に滴下した。そのまま室温で2分間静置した後、写真を撮影した。（図３）
写真は左から、ＰＢＳ添加、凝集剤＋促進剤添加、凝集剤のみ添加である。
凝集剤、凝集剤＋促進剤を添加した場合は、添加後数秒ですでに凝固作用が顕著に見られ、血球凝集塊と血漿の分離が観察された。凝集剤添加の場合は分離した血漿中に未凝集の血球が観察されたが、凝集剤＋促進剤を添加した場合は未凝集の血球はほとんど観察されなかった。
凝集剤はポリ−Ｌ−リジン（分子量30000〜70000、ＳＩＧＭＡ社製）、促進剤はオレイル基（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。

本発明は、流体駆動能を有し、しかも、流体の速度を制御可能とした能動流体により、より少量の検体の成分測定を簡単な構成でおこなうことを可能とし、
当該能動流路を用いた造物は、在宅で微量な血液を滴下するだけで、血液の生化学検査や免疫検査、がんの診断や感染症の診断等に適している。簡易に、高速で、安価に使用できる本構造物は、産業上で利用可能である。

本発明の一実施例を示した図である。 本発明の動作を説明するための図である。 本発明の動作を説明するための図である。

符号の説明

１０ 基盤
１０Ｈ 蓋
１１ 血球沈殿室
１２ 流路
１３ 吸い取り部
１４ 遮断部
１５、１７ 減速堤
１６，１８ 沈降段差
１９ 採取流路
２０ 定量秤取室
２１ 脱気孔
２２ 投入孔

Claims (13)

1. 流路の両側面に連続した側面突起を有する能動流路。
2. 流路の底面に進行方向に対し角度をもって配置された底面突起を有する能動流路。
3. 流路の両側面に連続した側面突起と底面突起を交互に配置した能動流路。
4. 前記流路の進行方向が狭い請求項１乃至３に記載の能動流路。
5. 血液中の血球を凝集するステップ、凝集した血球を沈降させるステップ、沈降させるために血液の進行速度を減速させるステップ、底面の段差で凝集した血球を補足するステップ、上澄みの血漿のみを採取するステップ、分離した血漿を自動的に進行させるステップよりなる血球分離構造物。
   
6. 前記構造物の血球凝集方法が、凝集剤である請求項５に記載の血球分離構造物。
   
7. 前記構造物の血球沈降方法が、凝集促進剤である請求項５に記載の血球分離構造物。
   
8. 前記構造物の血球の沈降を効率化させるために血液の進行を減速させる方法が、流路壁面に設けられた突起状の減速構造体である請求項５に記載の血球分離構造物。
   
9. 前記構造物の凝集した血球を補足する方法が、底面に設けられた凸状の段差である請求項５に記載の血球分離構造物。
   
10. 前記構造物の上澄みの血漿のみを採取する方法が、斜め上方に設けられた流路である請求項５に記載の血球分離構造物。
11. 前記構造物の分離した血漿を自動的に進行させる方法が、流路の断面積を徐々に小さくする構造である請求項５に記載の血球分離構造物。
12. 凝集剤と凝固促進成分からなる血球凝集剤。
13. 流体成分における不要成分の物理量を調整して調整成分とする調整手段、前記調整された流体成分内の調整成分を分別的に処理する能動流路を有する分離構造物。
    

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