JP2008082897A - 血漿回収方法及び器具並びに血液簡易検査方法及び器具 - Google Patents

Abstract

【課題】小型且つ簡単な構造の器具で、少量の血液量で血漿と血球とを短時間で簡便且つ精度良く分離して血漿を回収でき、しかも分離助剤等の薬剤を一切使用する必要がない。
【解決手段】血漿回収器具１０は、内部に厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間１４を有すると共に、マイクロ空間１４に連通する血液充填口２０と血漿回収口２２とを備えた容器１２と、血液充填口２０を介して容器１２のマイクロ空間１４に血液Ａを充填する注射器１６と、容器１２を鉛直方向に対して所定の傾斜角になるように傾斜させる傾斜手段１９と、血漿回収口２２から血漿Ｂを吸引して回収するシリンジポンプ１８と、を備えている。
【選択図】 図１

Description

本発明は、血漿回収方法及び器具並びに血液簡易検査方法及び器具に係り、特に血液検査の前処理として、血液中の血漿と血球とを短時間で分離することにより、血漿のみを効率的に回収する技術、及び血漿分離から血液検査までを１つの器具によって簡易的に行う技術に関する。

血液検査を行う場合、真空採血管により数ｍＬの血液を測定項目に応じて採取し、真空採血管を各種の自動分析機にセットする。自動分析装置は大型であり、病院によっては装置をもたず検査センターに依頼して血液を検査することも多々ある。そのため、検査結果が出るまでに時間を要しているのが現状である。緊急を要する検査を行う場合は、検査装置のある施設へ出向く必要があり、高齢者、病人にとっては検査自体が身体的に負担となる。また、血液検査をもっと気軽に、頻繁に行う環境が出来れば、病気に対する予防が進み、生活の質を高めることが出来る。

ところで、血液検査に使用する血液は光学的に分析される場合が多く、血液中の固形物、例えば赤血球が内包するヘモグロビンの持つ色素が比色測定を妨害することが知られている。この為、高精度の検査結果を得るためには、血液検査の前処理として、血液から血球を分離した血漿（血清も含むものとする）のみを検体とする処理が必要になる。この場合、大がかりな血漿回収装置を備えた大病院や検査センターに限らず、血液検査を実施するその場で、血液から血球を分離除去して血漿のみを簡単に回収できるようにするには、装置を簡単な検査器具のように小型化し、且つ血漿回収方法を簡便化することが重要である。また、血液検査を受ける患者の身体的、心理的負担を減らすためには、少量の採血量で検査できることが必要である。

このような背景から、血漿回収方法及び装置としては、次のことが要求されている。

（１）血漿回収操作を小型な器具で、簡便に且つ少量の血液量で行うことができること。例えば、血液採取を容易にし、誰でもどこでも検査できるようにするためには、ランセットにより採取できる血液量を多くても数十μＬ程度まで少なくする必要がある。

（２）生血は時間がたつと変化し、検査には使用できなくなるため、血漿回収までの時間、即ち血漿と血球とを分離する分離時間をできるだけ短くできること。

（３）分離助剤等の薬剤は検査精度を低下する懸念があり、使用しないこと。

従来の血漿回収装置又は器具としては次のものがある。

特許文献１は、遠心分離法によって血漿と血球を分離する方法であり、分離に長い時間がかかるという問題があるだけでなく、血球分離後に血液検査装置に血漿を入れ替える手間がある。特許文献２は、遠心分離法における装置の大型化を改良したものであり、マイクロチップ内に血液を導入し、マイクロチップごと遠心分離機にかける方法を提案しているが、装置が高速回転部を必須とするために、装置の小型化には限度がある。

特許文献３は、膜分離法によって血漿と血球を分離する方法であり、極微量の血液を採取し分離することができるが、この方法を実現するためには採取した血液の希釈や、微小な容器内から検査すべき血漿を抜き取る操作があり、操作が煩雑になる。また、膜分離法は膜自体に保水力があるため、検体の一部を損失し易いだけでなく、加圧により血液をフィルター内に押し出す必要があるため、目詰まりが生じたり、溶血したりするという問題がある。

特許文献４は、遠心分離や膜分離以外の方法であり、血液を導入する基板表面上に陽イオン交換物質と陰イオン交換物質とを交互に積層することにより、基盤表面上を陽イオンに帯電させ、陰イオンに帯電している赤血球（血球の一部）を電気的に捕捉する方法である。しかし、この方法はコーティング作業が繁雑になるという問題があるだけでなく、血漿中の成分が静電的に吸着する恐れが十分考えられる。

また、特許文献５も遠心分離や膜分離以外の方法であり、微量血液に凝集剤（分離助剤）を混和し、生成した凝集塊を流路構造で沈降させることによって、血液の固形成分と液体成分を分離する方法である。しかし、この方法は、流路が複雑な形状を持つことや、凝集作用が現れるまで時間がかかるという問題があるだけでなく、凝集剤による血液検査への悪影響が懸念される。

また、従来は、血球を分離した血漿を、別な場所にて血液検査を行うことが通常であるが、これは時間のロスでもあるだけでなく、検体のロスでもある。そのため、血球分離と同時に同じ場所で血液検査を行う方法が望まれている。
特開２００３−８３９５８号公報 特開２００６−５２９５０号公報 特開２００３−２７０２３９号公報 特開２０００−１７１４６１号公報 特開２００５−２９２０９２号公報

上記したように、従来の血漿回収方法や装置は、一長一短があり、上記した（１）〜（３）の要求を満足するものではない。

また、単に、血液検査の前処理として血漿を回収するにとどまらず、血漿分離から血液検査までを１つの簡易検査器具で簡単に精度良く検査できれば、血漿の回収と血液検査とを別の場所で行う必要がない。これにより、血液検査をもっと気軽に、頻繁に行う環境を整えることができ、病気に対する予防が進む。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、小型且つ簡単な構造の器具で、少量の血液量で血漿と血球とを短時間で簡便且つ精度良く分離して血漿を回収でき、しかも分離助剤等の薬剤を一切使用する必要がない血漿回収方法及び器具を提供することを目的とする。

更に、本発明は、血漿分離から血液検査までを１つの簡易検査器具で簡単に精度良く検査することができる血液簡易検査方法及び器具を提供することを目的とする。

本発明の請求項１は前記目的を達成するために、血液から血球を分離して血漿を回収する血漿回収方法において、厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間を有する容器に血液を充填する充填工程と、前記充填工程の前又は後に、前記容器を鉛直方向に対して３０〜６０°の傾斜角になるように傾斜させる傾斜工程と、前記傾斜した容器内の血液を所定時間静置して、該血液を重力により血漿と血球とに固液分離する固液分離工程と、固液分離された血漿を前記容器から吸引して回収する回収工程と、を備えたことを特徴とする血漿回収方法を提供する。

尚、「容器を鉛直方向に対して傾斜させる」とは、容器を鉛直方向（重力方向）に立設させた状態から、容器をマイクロ空間の厚み方向に倒して傾斜させる場合と、容器を寝かせた状態から、容器をマイクロ空間の厚み方向に起こして傾斜させる場合と、の両方を意味する。ここで挙げた容器とは、いわゆる試験管のように幅に対して長さが長い形状のものを指している。

本発明の請求項１は、固液分離におけるボイコット効果を、厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間に適用することで、重力による自然沈降でありながら、血漿と血球とを極めて短時間で分離できるようにしたものである。

即ち、充填工程では、厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間を有する容器に血液を充填する。ここで、マイクロ空間の厚みを５０μｍ〜２ｍｍとしたのは、傾斜工程において容器を３０〜６０°に傾斜させた際に、厚みが５０μｍ未満ではボイコット効果が発揮されにくく、また厚みが２ｍｍを超えると血球の沈降距離が大きくなり過ぎて短時間での血球沈降を実現できない。従って、マイクロ空間の厚みと容器の傾斜角とは相対的な関係にあるので、予め実験等を行って、上記厚み範囲内及び上記傾斜角範囲内において、適切な厚みと傾斜角とを組み合わせることが好ましい。

そして、固液分離工程において、マイクロ空間内に血液を所定時間静置して、該血液を重力により血漿と血球とに固液分離する。ここで、重力方向に対する容器の立設方向により、マイクロ空間内部の血球の振る舞いが変わることについて述べておく。鉛直に立設した容器内の血球は、重力方向、つまり鉛直方向に移動する。同時に血漿は重力とは逆方向に移動し、血球と血漿とが正面衝突することになるので、血球は沈降し難い状況になる。

これに対して、本発明における固液分離工程では、傾斜された容器内のマイクロ空間では、血球が重力方向に沈降し、血漿がマイクロ空間の厚み方向の上部上面に沿って上昇する。これにより、血球の沈降方向と血漿の上昇方向が正反対になることを回避できる。そのため、お互いの流れが干渉しづらくなり、結果として血漿と血球とを短時間で分離できる。しかも空間のサイズはマイクロメートルであるため、空間を傾斜させることで血球の実質的な沈降距離を顕著に短くできる。

このように、ボイコット効果をマイクロ空間に利用することで、少量の血液量で極めて短時間で血漿と血球との分離が可能になる。分離後の回収であるが、固液分離された血漿を容器から吸引して回収する。これにより、小型且つ簡単な構造の器具で、少量の血液量で血漿と血球とを短時間で簡便且つ精度良く分離して血漿を回収でき、しかも分離助剤等の薬剤を一切使用する必要がない。

マイクロ空間の厚みのより好ましい範囲は、１００μｍ〜５００μｍｌである。また、傾斜角の特に好まし値は４５°である。

請求項２は請求項１において、前記固液分離工程では、前記血液の温度を１１〜４０℃の範囲に保持することを特徴とする。

血液は粘度が高く血球が沈降しにくいので、血液の温度を１１〜４０℃の範囲に保持することで、血液の粘度を下げて血球の沈降速度を向上できる。ちなみに、４０℃を超えると、血液の品質に悪影響があり、１１℃未満では沈降速度を向上させる効果が小さい。

請求項３は請求項１又は２において、前記固液分離工程では、前記静置する所定時間を３〜５分の範囲にすることを特徴とする。

請求項３は、固液分離工程での、血漿と血球との分離時間を具体的に示したものであり、３分以上静置すれば血漿と血球とを分離することができ、多少安全をみても５分静置すれば十分である。

本発明の請求項４は前記目的を達成するために、血液を簡易的に検査する血液簡易検査方法において、厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間を有する容器に血液を充填する充填工程と、前記充填する前又は後に、前記容器を鉛直方向に対して３０〜６０°の傾斜角になるように傾斜させる傾斜工程と、前記傾斜した容器内の血液を所定時間静置して、該血液を重力により血漿と血球とに固液分離する固液分離工程と、前記固液分離した血漿中の被検査物質と、前記マイクロ空間の厚み方向の対向面のうち前記傾斜した状態における上面上部側に予め固着されている検査試薬と、を接触させて検査する検査工程と、を備えたことを特徴とする血液簡易検査方法を提供する。

本発明の請求項４は、ボイコット効果をマイクロ空間に適用することによって、血漿と血球との分離時間を短縮できるだけでなく、血漿の上昇流がマイクロ空間の上面に沿って流れることを利用したものである。即ち、マイクロ空間の上面上部側に予め検査試薬を固着しておけば、血漿中の被検査物質（成分）と、検査試薬との接触効率が良くなるので、マイクロ空間のような単なる空間において、血漿分離から血液検査までを一貫して精度良く行うことができる。

請求項５は請求項４において、前記血漿中の被検査物質は抗原であると共に、前記検査試薬は抗体であり、前記検査工程において、抗原抗体反応を行わせることにより検査することを特徴とする。

請求項５は、本発明における好ましい態様を示したものであり、抗原抗体反応による血液検査を簡易且つ高精度に行うことができる。

尚、本発明の血液簡易検査方法においても、固液分離工程では、血液の温度を１１〜４０℃の範囲に保持することが好ましい。また、固液分離工程では、静置する所定時間を３〜５分の範囲にすることが好ましい。

本発明の請求項６は前記目的を達成するために、血液から血球を分離して血漿を回収する血漿回収器具において、内部に厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間を有すると共に、前記マイクロ空間に連通する血液充填口と血漿回収口とを備えた容器と、前記血液充填口を介して前記容器のマイクロ空間に血液を充填する充填手段と、前記容器を鉛直方向に対して所定の傾斜角になるように傾斜させる傾斜手段と、前記血漿回収口から血漿を吸引して回収する吸引手段と、を備えたことを特徴とする血漿回収器具を提供する。

請求項６は、本発明を装置として構成したものであり、本発明の血漿回収器具を使用すれば、小型且つ簡単な構造の器具で、少量の血液量で血漿と血球とを短時間で簡便且つ精度良く分離して血漿を回収でき、しかも分離助剤等の薬剤を一切使用する必要がない。

請求項７は請求項６において、前記傾斜角は３０〜６０°の範囲であることを特徴とする。

請求項７は、ボイコット効果をマイクロ空間に適用した際の容器の好適な傾斜角を示したものであり、傾斜角は３０〜６０°の範囲が好ましく、特に好ましい傾斜角度は４５°である。

請求項８は請求項６又は７において、前記マイクロ空間の厚みをＤ、長さをＬとしたときに、Ｌ／Ｄで表されるアスペクト比が５〜５０の範囲であることを特徴とする。

請求項８は、マイクロ空間の厚みＤに対する長さＬの好適なアスペクト比を示したもので、血球の沈降速度はアスペクト比が５〜５０の範囲で正比例する傾向にある。

請求項９は請求項６〜８の何れか１において、前記容器は透明であることを特徴とする。

容器を透明にすれば、血漿と血球との分離終了時点を目視で認識できるだけでなく、血球の沈降や血漿の上昇流の状況を目視で認識できるので、容器を適切な傾斜角に調整することができる。

請求項１０は請求項６〜８の何れか１において、前記容器の材質は、樹脂、石英ガラス、パイレックスガラスの何れかであることを特徴とする。

請求項１０は、容器の材質として特に好適なものを示したものである。

請求項１１は請求項６〜１０の何れか１において、前記容器を加熱する加熱手段を設けたことを特徴とする。

血液は粘度が高く血球が沈降しにくいので、血液を加熱手段で加熱（好ましくは１１〜４０℃）することで、血液の粘度を下げて血球の沈降速度を向上できる。ちなみに、４０℃を超えると、血液の品質に悪影響があり、１１℃未満では沈降速度を向上させる効果が小さい。

本発明の請求項１２は前記目的を達成するために、血液を簡易的に検査する血液簡易検査器具において、内部に厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間を有し、該マイクロ空間の前記厚み方向で対向する対向面のうちの片面側に検査試薬が固着されると共に、前記マイクロ空間に連通する血液充填口と空気抜き口とを有する容器と、前記血液充填口から前記容器のマイクロ空間に血液を充填する充填手段と、前記容器を鉛直方向に対して所定の傾斜角で且つ前記検査試薬を固着した前記片面側が上面になるように傾斜させる傾斜手段と、を備えたことを特徴とする血液簡易検査器具を提供する。

請求項１２は、本発明を装置として構成したもので、本発明の血液簡易検査器具を用いれば、血漿分離から血液検査までを１つの簡易検査器具で簡単に精度良く検査することができる。

請求項１３は請求項１２において、前記検査試薬は抗体であり、前記血液の成分である血漿中の抗原を検査することを特徴とする。

本発明における好ましい態様を示したものであり、抗原抗体反応による血液検査を簡易且つ高精度に行うことができる。

尚、本発明の血液簡易検査器具においても、容器の傾斜角は３０〜６０°の範囲であることが好ましくい。また、マイクロ空間の厚みをＤ、長さをＬとしたときに、Ｌ／Ｄで表されるアスペクト比が５〜５０の範囲であることが好ましい。更には、容器は透明であることが好ましいく、例えばアクリル等の透明樹脂、石英ガラス、パイレックスガラス等を使用できる。また、容器を加熱する加熱手段を設けて、固液分離される血液の温度を１１〜４０℃の範囲に保持することが好ましい。また、固液分離では、静置する所定時間を３〜５分の範囲にすることが好ましい。

以上説明したように、本発明の血漿回収方法及び器具によれば、小型且つ簡単な構造の器具で、少量の血液量で血漿と血球とを短時間で簡便且つ精度良く分離して血漿を回収でき、しかも分離助剤等の薬剤を一切使用する必要がない。

また、本発明の血液簡易検査方法及び器具によれば、血漿分離から血液検査までを１つの簡易検査器具で簡単に精度良く検査することができる。

以下、添付図面に従って、本発明に係る血漿回収方法及び器具並びに血液簡易検査方法及び器具の好ましい実施の形態について詳説する。

（血漿回収方法及び器具）
図１は、本発明の血漿回収器具１０の一態様を示す概念図である。

図１に示すように、本発明の血漿回収器具１０は、主として、容器１２と、容器１２内に形成されたマイクロ空間１４に血液を充填する充填手段１６と、マイクロ空間１４で血漿と血球とに分離された血漿（上澄液）を吸引する吸引手段１８と、容器１２を傾斜させる傾斜手段１９（図２参照）と、で構成される。

容器１２の内部には、厚みＤが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間が形成される。厚みＤの好ましい範囲は１００μｍ〜５００μｍの範囲である。また、容器１２の長さＬは、厚みＤとの関係で設定されることが好ましく、マイクロ空間１４の厚みをＤ、長さをＬとしたときに、Ｌ／Ｄで表されるアスペクト比が５〜５０の範囲になるように長さＬを設定する。例えば、マイクロ空間１４の厚みＤを５０μｍとした場合には、長さＬを２５０μｍ〜２．５ｍｍのとし、マイクロ空間１４の厚みＤを２ｍｍとした場合には、長さＬを１０ｍｍ〜１００ｍｍの長さとする。従って、血液検査に必要な血漿量に応じてマイクロ空間１４の大きさを前記条件に合うように設定すればよい。マイクロ空間１４の幅Ｗは特に限定されないが、厚みＤと同程度の範囲であることが好ましい。図１では、マイクロ空間１４の幅Ｗを厚みの約２倍程度に形成している。

容器１２の長さ方向一端側には、血液Ａを充填する血液充填口２０が形成され、容器１２の上面側には血漿回収口２２が形成される。ここで、直方体のマイクロ空間１４を形成する各面（６面）のうち、血液充填口２０側の面を天面１４Ａ、反対側を底面１４Ｂとすると共に、血漿回収口２２側の面を上面１４Ｃ、反対側を下面１４Ｄとする。そして、血液充填口２０には注入管２４が連結されると共に、血漿回収口２２には該血漿回収口２２と同じ間口の回収流路２８Ａが形成された回収流路部材２８を介して吸引管３０が連結される。この場合、マイクロ空間１４の幅Ｗを、例えば厚みＤと同じ程度に細くする場合には、回収流路部材２８を介さないで吸引管３０に連結することができる。しかし、マイクロ空間１４の幅Ｗを広くする場合には、回収流路部材２８を介することで、後記する固液分離でマイクロ空間１４の上面上部に溜まった血漿Ｂ（図２参照）をマイクロ空間１４の幅方向において均等に吸引することができる。

また、回収流路部材２８を設ける場合には、マイクロ空間１４に充填された血液Ａが回収流路２８Ａまで入り込むと、血球Ｃの実質的な沈降距離が長くなるのでよくない。従って、例えば、回収流路２８Ａの厚みＥを薄くして血液Ａの表面張力で血液Ａが回収流路２８Ａまで入り込まないようにしたり、回収流路２８Ａの内面を疎水化処理して血液Ａを弾くことで血液Ａが回収流路２８Ａまで入り込まないようする工夫を行うとよい。

血液Ａをマイクロ空間１４に充填する充填手段１６としては、例えば図１に示すように、注射器１６を好適に使用することができる。即ち、血液Ａを内部に保有する注射器１６の針１６Ａを注入管２４に挿入し、ピストン１６Ｂを押し込んで注射器１６内の血液をマイクロ空間１４に注入する。

また、血漿Ｂを回収するための吸引手段１８としては、例えば、図１に示すように、吸引圧力制御を兼ね備えた連続流動方式のシリンジポンプ１８を好適に使用することができる。これにより、吸引圧力及び吸引流量を任意に制御することができる。即ち、シリンジポンプ１８の先端口１８Ａを吸引管３０に接続すると共に、回収チューブ３２を図示しない血液検査装置に接続する。これにより、マイクロ空間１４において分離された血漿（上澄液）を回収流路部材２８を介して血液検査装置に直接送液することができる。

また、容器１２を傾斜させる傾斜手段１９としては、例えば図２に示したものを使用できる。図２に示すように、傾斜手段１９は、基台１９Ａの上面中央部に、揺動機構部１９Ｂを介して支持部材１９Ｃを矢印ａ−ｂ方向に揺動自在に支持することにより構成される。また、支持部材１９Ｃは、断面凹状に形成され、この凹部に容器１２の下側部分が着脱自在に嵌め込まれる。揺動機構部１９Ｂとしては、支持部材１９Ｃに支持された容器１２が所定の傾斜角で動かないように維持される機構であれば何れでもよい。

上記したマイクロ空間１４を有する容器１２や回収流路２８Ａを有する回収流路部材２８を製作するには微細加工技術が好適に使用される。微細加工技術としては、例えば次のようなものがある。
(1) Ｘ線リソグラフィと電気メッキを組み合わせたＬＩＧＡ技術
(2) ＥＰＯＮ ＳＵ８を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法
(3) 機械的マイクロ切削加工（ドリル径がマイクロオーダのドリルを高速回転するマイクロドリル加工等）
(4) Ｄｅｅｐ ＲＩＥによるシリコンの高アスペクト比加工法
(5) Ｈｏｔ Ｅｍｂｏｓｓ加工法
(6) 光造形法
(7) レーザー加工法
(8) イオンビーム法
容器１２や回収流路部材２８を製作するための材料としては、耐熱、耐圧及び耐溶剤性、加工容易性等の要求に応じて、金属、ガラス、セラミックス、プラスチック、シリコン、及びテフロン（登録商標）等の樹脂を好適に使用でき、特に、ポリスチレン樹脂、ＰＭＭＡ樹脂、石英ガラス、パイレックスガラスが好ましい。また、容器１２は、後記する血漿回収方法で説明するように、血漿Ｂと血球Ｃとの分離状態を視覚により認識できることが好ましく、透明な材料で製作することが好ましい。

また、容器１２を加熱する加熱手段（図示せず）を設けることが好ましい。加熱手段としては、金属抵抗線やPolysilicon などのヒータ構造を容器１２に作り込む方法などがある。金属抵抗線やPolysilicon などのヒータ構造の場合には、加熱についてはこれを使用し、冷却については自然冷却でサーマルサイクルを行うことで温度を制御する。この場合の温度のセンシングについては、金属抵抗線の場合には同じ抵抗線をもう一つ作り込んでおき、その抵抗値の変化に基づいて温度検出を行い、Polysilicon の場合には、熱電対を用いて温度検出を行う方法が一般的に採用されている。また、近年においては、ペルチェ素子を用いた温度制御機能を容器１２に組み込むことで、血液の温度制御を精度良く行うこともできる。何れにしても、温度制御そのものは、従来からの温度制御技術でもペルチェ素子に代表される新規な温度制御技術でも可能であり、容器１２の材料等に応じた加熱・冷却機構と温度センシング機構の選択、ならびに外部制御系の構成を組み合わせて最適な方法を選択することができる。

次に上記の如く構成された血漿回収器具１０を用いて本発明の血漿回収方法の手順を、図１〜図３を用いて説明する。

本発明の血漿回収方法は、主として、厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間１４を有する容器１２に血液Ａを充填する充填工程と、容器１２を鉛直方向（重力方向）に対して３０〜６０°の傾斜角になるように傾斜させる傾斜工程と、傾斜した容器１２内の血液を所定時間静置して、該血液Ａを重力により血漿Ｂと血球Ｃとに固液分離する固液分離工程と、固液分離された血漿Ｂを容器１２から吸引して回収する回収工程と、により構成される。

先ず、図２（Ａ）に示すように、充填工程において、傾斜手段１９に保持された容器１２を立設させた状態にする。そして、図１の注射器１６を使用して容器１２内のマイクロ空間１４に血液Ａを充填する。この場合、吸引管３０は大気に開放させて空気抜きとして使用する。

次に、図２（Ｂ）に示すように、傾斜工程において、容器１２を鉛直方向（重力方向）に対して３０〜６０°の傾斜角、好ましくは４５°の傾斜角になるように傾斜させる。この場合、回収流路部材２８が設けられた容器１２の上面側（マイクロ空間１４の上面１４Ｃ側と同義）が上になるように傾斜させる。尚、容器１２の傾斜動作は、血液Ａを容器１２に充填する前でもよく、後でもよい。また、充填工程では、容器１２を立設した状態で充填することに限定されるものではなく、容器１２を寝かせた状態で充填してから、３０〜６０°の傾斜角になるように起き上がらせてもよい。

次に、図２（Ｂ）〜図２（Ｃ）の固液分離工程では、容器１２を傾斜させた状態で固液分離工程を行うことにより、マイクロ空間１４においてボイコット効果が生じる。即ち、図３（Ａ）に示すように、血球Ｃが重力方向に沈降する一方、血漿Ｂがマイクロ空間１４の上面１４Ｃ（容器上面側の内壁面）に沿って上昇する。この結果、マイクロ空間１４には、マイクロ空間１４の上面１４Ｃに沿って上昇した上昇流がマイクロ空間１４の下面１４Ｄに沿って下降流として下降する血漿Ｂの環状流（図３（Ａ）の点線矢印）が形成される。これにより、血球Ｃの沈降と血漿Ｂの上昇流とが正面衝突することがないので、血漿と血球とを短時間で速やかに分離することができる。更には、容器１２を傾斜させることで、図３（Ａ）から分かるように、血球Ｃの沈降距離Ｈを顕著に短くすることができる。そして、沈降距離Ｈを沈降してマイクロ空間の下面１４Ｄに衝突した血球Ｃは血漿Ｂの環状流にのってマイクロ空間１４の底面１４Ｂ方向に運ばれる。

この結果、図２（Ｃ）に示すように、血漿Ｂと血球Ｃとを短時間で精度良く分離できる。具体的には、傾斜されたマイクロ空間１４に血液Ａを３〜５分程度静置することで、該血液Ａを重力により血漿Ｂと血球Ｃとに固液分離することができる。この固液分離工程では、容器１２を１１〜４０℃に保温して、血液Ａの粘度を下げることが好ましい。これにより、血球Ｃの沈降速度を一層速くすることができる。

一方、容器１２を立設した状態で固液分離工程を行うと、図３（Ｂ）に示すように、血球Ｃの沈降と血漿Ｂの上昇流とがまともに正面衝突し、血球Ｃの沈降速度が顕著に遅くなる。しかも、マイクロ空間１４の長さＬに相当する沈降距離を沈降することになるので、極めて長い分離時間を必要とする。

ボイコット効果については、雑誌「Nature」（Boycott A.E., Sedimentation of blood corpuscles, Nature(London）, 104, 532.1920発行）及び雑誌「バイオレオロジー」（米田出版、貝原眞、坂西明郎、1999年6月4日初版発行）に詳しく紹介されている。

固液分離工程が終了したら、図１に示すように、吸引管３０にシリンジポンプ１８を接続して、上澄液としての血漿Ｂのみを回収する回収工程を行う。即ち、シリンジポンプ１８の吸引力は、マイクロ空間１４と回収流路２８Ａとの境界線における血漿Ｂの表面張力を破ることができ、且つ回収流路２８Ａの疎水性による血漿の流れ込み防止力を破ることができる程度でよい。例えば、マイクロ空間１４の血漿Ｂが回収流路２８Ａに１ｍｍ／秒以下の流速で流れ込むように吸引力を発揮させることが好ましい。吸引力を大きくし過ぎると、せっかく沈降した血球Ｃが舞い上がってしまい、回収される血漿Ｂに混入してしまう恐れがある。回収した血漿Ｂはシリンジポンプ１８の回収チューブ３２を介して血液検査装置に送液される。

このように、ボイコット効果をマイクロ空間１４に利用することで、少量の血液量で極めて短時間で血漿Ｂと血球Ｃとの分離が可能になる。これにより、小型且つ簡単な構造の器具で、少量の血液量で血漿と血球とを短時間で簡便且つ精度良く分離して血漿Ｂを回収でき、しかも分離助剤等の薬剤を一切使用する必要がない。

（血液簡易検査方法及び器具）
図４は、本発明の血液簡易検査器具４０の一態様を示す概念図である。

図４に示すように、血液簡易検査器具４０の基本的な構成は、上述した血漿回収器具１０と同様であるが、マイクロ空間１４の上面１４Ｃ上部側に検査試薬４２が予め固着されている点が相違する。尚、マイクロ空間１４の上面１４Ｃ下部側は血漿Ｂ中に血球Ｃが混在する確率が大きいため、マイクロ空間１４の上面１４Ｃ上部側のみに検査試薬４２を固着させることが好ましいが、上面１４Ｃの略全体に検査試薬４２を固着してもよい。

血液簡易検査器具４０の外観的な形状も、基本的には図１の血漿回収器具１０と同様であるが、図１から吸引手段１８を削除し、また回収流路２８Ａ及び吸引管３０を空気抜き口とする点で相違する。

検査試薬４２としては抗体を好適に使用することができ、これによりマイクロ空間１４の上面１４Ｃ上部に固着させた抗体に、血漿Ｂ中の抗原を反応させて、いわゆる酵素免疫反応（ＥＬＩＳＡ）による検査を行うことができる。

ＥＬＩＳＡの１つであるサンドイッチ法とは、検査対象の抗原に対する抗体を固定化し、蛍光や色素、あるいは放射性物質、酵素等で標識された第２抗体を用いた抗原抗体反応による簡便な検査手法である。直接、抗原を標識しなくてよいため、手軽に、且つ高感度に反応検出を行うことができる。尚、検査試薬４２としては、抗体に限定するものではなく、血漿中の成分と反応して何らかの検査を行える試薬であれば何でもよい。

マイクロ空間１４の上面１４Ｃ上部側に検査試薬４２を固着する方法としては、例えばインクジェット装置のノズルから検査試薬４２を噴出させてマイクロ空間１４の上面１４Ｃ上部に吹き付けることで固着する方法を好適に採用できる。但し、この固着方法に限定されるものではない。

次に、上記の如く構成された血液簡易検査器具４０を使用した本発明の血液簡易検査方法の手順を説明する。

血液Ａの充填工程から固液分離工程までは、上述した血漿回収方法と同様である。この固液分離工程と並行して検査工程が行われる。即ち、図３（Ａ）で既に説明したように、マイクロ空間１４に血漿Ｂの上昇流が形成される。これにより、血球Ｃの沈降と血漿Ｂの上昇流とを衝突させることなく、血漿Ｂと血球Ｃとを分離することができると共に、図４に示すように、血漿Ｂの上昇流（図４の点線矢印）はマイクロ空間１４の上面１４Ｃに沿って流れ、上面１４Ｃ上部に固着された検査試薬４２と効率的に接触して反応する。

このように、ボイコット効果をマイクロ空間１４に適用することで、血漿Ｂの上昇流がマイクロ空間１４の上面１４Ｃに沿って流れることにより、血漿Ｂへの攪拌効果が発揮され、血漿Ｂ中の成分がマイクロ空間１４の上面に接触する確率を飛躍的に向上させる効果を奏する。従って、マイクロ空間１４の上面１４Ｃ上部に予め検査試薬４２を固着しておけば、血漿Ｂ中の被検査物質（成分）と、検査試薬４２との接触効率が良くなるので、マイクロ空間１４のような単なる空間において、血漿分離から血液検査までを一貫して精度良く行うことができる。

次に、本発明の具体的な実施例として、図４に示した血液簡易検査器具４０を使用して、血漿Ｂ中の抗原をＥＬＩＳＡ法で検査する血液簡易検査方法を説明する。

ポリスチレンの材質で製作された容器１２内には、厚みが２００μｍ、幅が４００μｍの断面で、長さが２ｃｍのマイクロ空間１４が形成される。そして、マイクロ空間１４の上面１４Ｃ上部側に、予め一次抗体としてマウス抗ヒトＩｇＧを固着した。固着方法は、インクジェット装置のインク噴出ノズルから一次抗体をマイクロ空間１４の上面１４Ｃ上部に吹き付ける方法で行った。

次に、非特異吸着抑制用ＢＳＡバッファー（１％ウシ胎仔血清添加リン酸緩衝生理食塩水）をマイクロ空間１４に導入して一次抗体が固定された表面以外をＢＳＡで覆うために、３７℃で１０分間反応させる。その後、マイクロ空間１４を、リン酸バッファー（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄した後、１．５μＬの血液（ヘマトクリット値５０％)をマイクロ空間１４に充填する。

次に、図４に示すように、容器１２を鉛直方向（重力方向）に対して、４５度傾けて静置する。尚、使用した血液Ａは凝固防止のため、血液Ａと３．８％クエン酸ナトリウムとが４：１の体積比になるように混和してある。更に、この血液に標識２次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を５分間、室温にて反応させ、予めＩｇＧ抗原と標識２次抗体とを反応させておく。

この結果、マイクロ空間１４において、次第に血球Ｃが沈降し、容器１２を傾斜させてから３分後には、透明な血漿Ｂの相である血漿相及び血球Ｃの集合体である血球相が明確に現れ出す。この段階で、血漿中の標識２次抗体と結合したＩｇＧは、一次抗体と反応して、表面に固定される。

次に、洗浄バッファー（0.05％Tween20添加リン酸緩衝生理食塩水 ）にてマイクロ空間１４内の洗浄を行い、一度マイクロ空間１４内を満たした血液を、全て洗い出す。このとき、血球はなるべく残らないように洗い出す。

次に、発色基質液（2,2'-azino-bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate] (ＡＢＴＳ)、ＡＢＴＳを クエン酸/リン酸混合バッファー（0.05Ｍ クエン酸水溶液に0.05M リン酸水素ナトリウム水溶液をｐＨ4.0になるまで加えた溶液に溶解し、0.7mg/mLの濃度としたもの ）の１．５μＬをマイクロ空間１４に加える。反応中は遮光する。ＡＢＴＳは、標識酵素であるペルオキシダーゼとの反応により、青緑色を呈する。この反応を１０分間行い、その後、反応停止液 (0.01％アジ化ナトリウム液)で反応停止後、ＥＬＩＳＡ検出装置でマイクロ空間１４の上面１４Ｃ上部、即ち血漿の溜まっていた領域を、４０５ｎｍの発光強度で測定した。

その結果を、予め作成した検量線（発光強度とＩｇＧ量の関係）から読み取ったところ、最大１ｎｇ／ｍＬのＩｇＧを検出できた。なお、発光強度を測定する領域は検量線を作成した領域と同じにすることが必要である。また、バックグラウンド強度の測定は、ＡＢＴＳを含まないクエン酸/リン酸混合バッファーをマイクロ空間１４に満たして行った。

このように、本発明の血液簡易検査器具４０を使用すれば、マイクロ空間１４のような微小空間において、血漿分離から血液検査までを数ステップのプロセスで精度良く行うことができる。

本発明の血漿回収器具の一例を示す概念図 本発明の血漿回収方法の手順を説明する説明図 ボイコット効果を説明する説明図 本発明の血液簡易検査器具の一例を示す概念図

符号の説明

１０…血漿回収器具、１２…容器、１４…マイクロ空間、１６…充填手段（例えば注射器）、１８…吸引手段（例えばシリンジポンプ）、１９…傾斜手段、２０…血液充填口、２２…血漿回収口、２４…注入管、２８…回収流路部材、３０…吸引管、３２…回収チューブ、４０…血液簡易検査器具、４２…検査試薬

Claims (13)

1. 血液から血球を分離して血漿を回収する血漿回収方法において、
   厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間を有する容器に血液を充填する充填工程と、
   前記充填工程の前又は後に、前記容器を鉛直方向に対して３０〜６０°の傾斜角になるように傾斜させる傾斜工程と、
   前記傾斜した容器内の血液を所定時間静置して、該血液を重力により血漿と血球とに固液分離する固液分離工程と、
   固液分離された血漿を前記容器から吸引して回収する回収工程と、を備えたことを特徴とする血漿回収方法。
2. 前記固液分離工程では、前記血液の温度を１１〜４０℃の範囲に保持することを特徴とする請求項１の血漿回収方法。
3. 前記固液分離工程では、前記静置する所定時間を３〜５分の範囲にすることを特徴とする請求項１又は２の血漿回収方法。
4. 血液を簡易的に検査する血液簡易検査方法において、
   厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間を有する容器に血液を充填する充填工程と、
   前記充填する前又は後に、前記容器を鉛直方向に対して３０〜６０°の傾斜角になるように傾斜させる傾斜工程と、
   前記傾斜した容器内の血液を所定時間静置して、該血液を重力により血漿と血球とに固液分離する固液分離工程と、
   前記固液分離した血漿中の被検査物質と、前記マイクロ空間の厚み方向の対向面のうち前記傾斜した状態における上面上部側に予め固着されている検査試薬とを接触させて検査する検査工程と、を備えたことを特徴とする血液簡易検査方法。
5. 前記血漿中の被検査物質は抗原であると共に、前記検査試薬は抗体であり、前記検査工程において、抗原抗体反応を行わせることにより検査することを特徴とする請求項４の血液簡易検査方法。
6. 血液から血球を分離して血漿を回収する血漿回収器具において、
   内部に厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間を有すると共に、前記マイクロ空間に連通する血液充填口と血漿回収口とを備えた容器と、
   前記血液充填口を介して前記容器のマイクロ空間に血液を充填する充填手段と、
   前記容器を鉛直方向に対して所定の傾斜角になるように傾斜させる傾斜手段と、
   前記血漿回収口から血漿を吸引して回収する吸引手段と、
   を備えたことを特徴とする血漿回収器具。
7. 前記傾斜角は３０〜６０°の範囲であることを特徴とする請求項６の血漿回収器具。
8. 前記マイクロ空間の厚みをＤ、長さをＬとしたときに、Ｌ／Ｄで表されるアスペクト比が５〜５０の範囲であることを特徴とする請求項６又は７の血漿回収器具。
9. 前記容器は透明であることを特徴とする請求項６〜８の何れか１の血漿回収器具。
10. 前記容器の材質は、樹脂、石英ガラス、パイレックスガラスの何れかであることを特徴とする６〜９の何れか１の血漿回収器具。
11. 前記容器を加熱する加熱手段を設けたことを特徴とする請求項６〜１０の何れか１の血漿回収器具。
12. 血液を簡易的に検査する血液簡易検査器具において、
    内部に厚みが５０μｍ〜２ｍｍと極めて薄い直方体形状のマイクロ空間を有し、該マイクロ空間の前記厚み方向で対向する対向面のうちの片面側に検査試薬が固着されると共に、前記マイクロ空間に連通する血液充填口と空気抜き口とを有する容器と、
    前記血液充填口から前記容器のマイクロ空間に血液を充填する充填手段と、
    前記容器を鉛直方向に対して所定の傾斜角で且つ前記検査試薬を固着した前記片面側が上面になるように傾斜させる傾斜手段と、を備えたことを特徴とする血液簡易検査器具。
13. 前記検査試薬は抗体であり、前記血液の成分である血漿中の抗原を検査することを特徴とする請求項１２の血液簡易検査器具。

Images