CN104968417B - 颗粒和细胞的高效率分离和操作 - Google Patents

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Abstract

一种用于处理流体样本中的颗粒的装置，该装置包含带有基底表面的基底。表面声波(SAW)发生器在基底表面的SAW区域内生成SAW。SAW的方向与压力波节点对齐。配置通道来接收流体样本，流体样本的流向与SAW方向成斜角。

Description

颗粒和细胞的高效率分离和操作
所涉及的相关申请
本专利申请要求2012年8月1日提交的第61/678,214号美国临时专利申请的优先权，其全部内容合并于此。
所涉及的政府支持
本发明来自于美国政府支持，包括美国国立卫生研究院项目(No.OD007209)和美国国家科学基金会项目(No.ECCS-0801922)。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本发明涉及到颗粒或细胞操控的方法和装置，比如分离和聚焦，以及颗粒或细胞检测和特征化的方法和装置。
背景技术
对许多基础生物医学研究，比如癌细胞检测和药物筛选来说，悬浮颗粒和细胞的高效分离是至关重要的。到目前为止，生命科学实验室内最常见的细胞分离法为离心法，它能够分离存在尺寸和密度差异的细胞。高质量细胞分离的另一种工业和临床标准是FACS(激发荧光细胞分离器)。FACS技术在鞘流模式下执行，在此模式下，细胞被聚集在缓冲液的中心，然后通过激光束以实现高速、精确的光学检测。细胞可被光信号触发的下游电场分离。在过去数年中，芯片实验室技术中的根本性进展已经推动了新的细胞分离方法的发展。例子包括磁性、液力、光 学晶格、电泳/介电泳(DEP)和声学方法。
磁性法以使用磁标记目标细胞作为开始。然后，向样本施加一个外部磁场，使被标记的细胞与其余细胞发生分离。磁性方法所需的标记步骤通常会增加成本和处理时间，并可能对目标细胞产生负面影响。液力方法通常导致通道内的高流速(基于惯性力的方法)或不对称障碍(确定性横向位移)。这些方法允许连续操作，无需额外的标记或外力。但是，通道内的通道障碍可能对细胞施加高机械应力，并导致低的通过量。光学晶格方法提供了一种独一无二的分离方法，它能够分离具有不同光学属性的颗粒。但是，这种方法有两个潜在的缺点：1)潜在的激光诱发的加温、纯态氧的形成和生物材料中的多光子吸收可能对细胞和其它生物目标造成生理损害；2)这种方法依赖于复杂、可能昂贵的光学装置，这些装置难以维护和小型化。基于电泳/介电泳的方法严格依赖于颗粒极性化和介质导电性，因电流导致的加温和/或直流电场相互作用，其利用的电场力可能对细胞生理机能造成不利影响。
基于声学的颗粒操作方法是目前良好的备选方法。与其它光学、电学或磁性方法相比，基于声学的方法对生物目标创伤相对要小，并且对大部分的微颗粒均有效，无论它们具有何种光学、电气或磁性属性。得到充分发展的体声波(BAW)声动力分选富集已经证明了基于微流控芯片中的尺寸和密度、不对目标颗粒或细胞进行任何标记的细胞分离方法。但是，这种BAW方法需要具有良好声反射属性的通道材料(比如硅和玻璃)。在微流控应用中广泛使用的软聚合物材料，比如PDMS，通常不具有这些属性。此外，用于生成BAW的换能器体积庞大，阻碍了系统的集成和小型化。
发明内容
本发明提供了一种基于表面声波方法的独特设计。部分版本展现出了高的分离效率，其分离效率达到98％或更高。进行了细胞生存能力、繁殖和凋亡试验，来确认本设备良好的生物相容性。
分离流体样本中颗粒的一种示范性装置包括基底、一个或多个用于在基底内生成表面声波(SAW)的换能器和配置用于接收包括一种或多种颗粒的流体样本的通道。流体样本可能是样本流体流，在经过通道的颗粒操作部分后，样本流体流可能含有聚焦、分离或其它分选方式的颗粒流。通道方向或流方向与SAW的方向成斜角。SAW可能是表面声学驻波(SSAW)。
本发明的例子为使用标准软光刻技术制作的单层平面的微流控装置上的成角度或倾斜的表面声波对微米/纳米颗粒和细胞进行高效分离提供了一种新颖的方法和装置。系统包括具有多种应用的低成本、高效率和便携式分离系统，比如血液/细胞/颗粒分离、细胞/颗粒介质交换，和细胞/颗粒富集。
通道有颗粒操作部分，在该部分通道与基底的SAW区域接近，比如延伸到SAW区域。可在基底上使用图案材料来界定SAW区域。可在基底附近使用有形元件形成通道，比如模制聚合物有形元件。通道的颗粒操作部分在生成表面声波时在流体样本内进行颗粒操作。流体样本可能包括流体内的悬浮颗粒，比如水介质。
在某些例子中，基底为压电基底，并使用基底支撑的换能器生成SAW。可使用一对表面声波发生器(SAW发生器)生成表面声学驻波(SSAW)，其中每个发生器都可以是一个叉指型换能器(IDT)。SAW发生器可以在基底上相互隔开，并把基底的SAW区置于SAW与表面相互作用的位置。在某些例子中，使用了一对SAW发生器，并把通道的颗粒操作区域置于SAW发生器之间，比如与基底的SAW区域耦合，这样SAW便在流体样本中生成压力。
示范性装置包括微流控设备，用作微通道的通道有至少一个横截面尺寸(比如宽度或高度)小于10mm，部分版本小于1mm，比如在1微米和500微米之间，颗粒可能是细胞、生物分子、聚合物小球、红血球和白血球等血液成分、血小板、蛋白质等微颗粒和类似物质。
一种装置可以是颗粒特征化装置，它进一步包括颗粒特征化设 备，由颗粒特征化设备对所操作的颗粒进行特征化。颗粒特征化可包括计数、分选、检测(包括一个或多个颗粒种类的选择性检测)，或其它方式的颗粒特征化，并可以包括基于生物流体成分的存在性或属性进行的人体疾病诊断。例子包括血液、唾液、尿液和其它生物流体的特征化，包括生物流体内颗粒的操作。一种颗粒特征化装置可以包括一个对被操作颗粒提供入射辐射束的辐射源，和/或从颗粒接收散射或其它形式的辐射的传感器。颗粒特征化装置的例子包括血细胞计数器(比如流式细胞仪)、荧光颗粒检测器、荧光分光计、激发荧光颗粒分离器、其它颗粒分离器、颗粒计数器、荧光分光计、生物标志检测器或基因分析仪。颗粒可以为细胞(比如人体细胞)、生物分子、其它生物颗粒或任何其它类型的目标颗粒。
在包含颗粒的流体样本中进行颗粒操作的示范性方法，包括把流体样本引入基底附近的通道中，并在基底上生成与通道方向成斜角的SAW或SSAW。SAW是沿基底的表面蔓延的声波，表面可以同样接触到流体样本。SAW可以相互影响形成SSAW。术语“声学”并不限制SAW的频率，频率可能超过1GHz。被操作的颗粒可能是液体中增强颗粒浓度区域内的颗粒。
SAW在流体内形成压力，使颗粒在流体样本内聚焦。可沿流体通道引导样本流体，而流体通道由内有SAW生成的基底支撑。可使用SAW来实现样本流体中颗粒的三维操作，颗粒的操作方向与基底平行或垂直。
使用表面声学驻波(SSAW)来开发一种新颖的芯片微米/纳米颗粒操作技术。示范性方法和装置高效、简便、快速、无稀释，并且适用于几乎任何类型的颗粒，同时包括带电和不带电微颗粒。示范性方法可配合流式细胞计、细胞分选/计数、芯片细胞操作、组织工程学、再生医学、非人类动物诊断和许多其它应用使用。
由一种示范性装置，比如微流控设备，来接收包括颗粒的样本流。装置包括基底、引入样本的通道(比如流体通道)和一个或多个表面声 波(SAW)发生器。SAW发生器可以是叉指型换能器(IDT，有时被称为叉指式换能器)，它由压电基底上的交叉梳状电极组成。通道可能从一对IDT之间通过。IDT和通道可能同时由相同的压电基底支撑。可操作SAW发生器，在靠近(可能是紧挨)流体通道的操作部分的基底部分生成SAW或SSASW。比如，可由基底来支撑流体通道，比如，由包含与基底连接的聚合物或其它材料的结构形成。
流体通道有一个颗粒操作区域，位于存在SAW的基底部分。比如，流体通道可能从具有表面声学驻波(SSAW)的基底部分通过，通过SSAW的作用对流体通道内的颗粒进行操作。基底可以是总体为平面的基底，比如铁电和/或压电基底。表面声波发生器可以包括铁电或压电基底支撑的叉指型电极。可使用两个或更多个SAW发生器在基底生成SSAW，比如使用SAW之间的干涉效应。
操作样本内的颗粒的方法，比如聚焦、分离或分选，可以是一种三维颗粒操作方法，包括生成表面声学驻波(SSAW)、由SSAW形成的用于在样本内操作颗粒的压力波。样本可以是从通道流过的样本流，通道具有一个颗粒操作区域，位于存在SSAW的基底部分的上方。
用于对流体样本内的颗粒进行三维颗粒操作的装置包括具有基底表面的基底，表面声波发生器，可在基底表面的SAW区域内操作，生成表面声波(SAW，比如SSAW)，配置用于接收流体样本的通道，通道具有靠近基底SAW区域的颗粒操作部分，颗粒操纵部分在生成SAW时操纵流体样本内颗粒。基底表面可以形成通道的壁，基底的SAW区域可以形成通道的颗粒操作部分的壁。
附图说明
图1是本发明中颗粒操作装置的俯视示意图；
图2是显示SSAW与通道内颗粒的相互作用的横截面示意图；
图3A-3C说明在与流体方向分别成15、30和45度斜角布置的 SSAW下，两种不同颗粒类型的轨迹；
图4A-4C说明在具有三种不同输入功率电平的SSAW下，颗粒的轨迹。
图5是与图1相似的工作区域以点划线表示的示意图。
图5A说明在SAW发生器关闭的情况下，图5的工作区域内的流体内的两种颗粒类型的轨迹。
图5B说明在SAW发生器打开的情况下，图5的工作区域内的流体内的两种颗粒类型的轨迹。
图5C是与图5A相似的出口区域以点划线表示的示意图。
图5D说明在SAW发生器关闭的情况下，图5C的出口区域内的流体内的两种颗粒类型的轨迹。
图5E说明在SAW发生器打开的情况下，图5C的出口区域内的流体内的两种颗粒类型的轨迹。
图6是展示有关本发明的分离效率的实验数据的图形。
图7是与图1相似的工作区域以点划线表示的示意图。
图7A说明在存在SSAW的情况下，图7的工作区域内的流体内的两种颗粒类型的轨迹。
图7B是与图7相似的出口区域以点划线表示的示意图。
图7C说明在存在SSAW的情况下，图7B的出口区域内的流体内的两种颗粒类型的轨迹。
图8是与图1相似的工作区域以点划线表示的示意图。
图8A说明在存在SSAW的情况下，图8的工作区域内的流体内的两种颗粒类型的轨迹。
图8B是与图8相似的出口区域以点划线表示的示意图。
图8C说明在存在SSAW的情况下，图8B的出口区域内的流体内的两种颗粒类型的轨迹。
具体实施方式
示范性装置和方法使用一种新颖的声学操作技术。这种技术使用表面声波(SAW)，特别是表面声学驻波(SSAW)，这种技术能快速、有效的操作颗粒。例子包括用于操控微流控通道内的微颗粒的装置和方法。例子的方法简单、快速、无稀释，并可用于聚焦几乎任何微颗粒，包括带电和不带电颗粒。颗粒操作设备的透明性使其与生物和医学中使用的多数光学特征化工具兼容，从而允许使用荧光和/或其它光学技术进行颗粒特征化。可使用表面声波(比如SSAW)来操作任意颗粒，比如微米/纳米颗粒，以及比如流体中的颗粒聚焦、颗粒分选或分离。本公布内容全篇引用了表面声波(SAW)。应理解，表面声学驻波(SSAW)是SAW的一种类型，也是某些实施方式的首选类型。但是，某些版本可能使用其它类型的SAW，本发明并不局限于SSAW。在描述中，某些版本可能使用了SSAW，但更多的版本可能使用其它类型的SAW。另一种类型的SAW的一个例子是表面声学行波(TSAW)。
基于SAW的技术把基底表面上的多数声学能量局部化，使沿传播线路发生的损耗极少，进而降低能量消耗和提高驻波的均匀性。SAW技术与标准的软光刻技术兼容，可在广泛的芯片生物/生化应用中使用。在实验性例子中，配合微流控设备使用了表面声学驻波(SSAW)操作技术，该设备使用由标准软光刻技术制成的PDMS通道，SSAW的引导方向与流体通道延伸方向和流体通道成斜角或倾角。
本发明的例子为使用标准软光刻技术制作的单层平面的微流控设备上成角度或倾斜的表面声波对微米/纳米颗粒和细胞进行高效分离提供了一种新颖的方法。与现有的技术(比如基于体声波的分离、基于磁场的分离和电动分离)相比，本技术提供了较高的效率，大幅简化了设备构造，降低了侵袭性和减少了成本。系统包括可用于多种应用的低 成本、高效率和便携式分离系统，比如血液成分分离、细胞分离、颗粒分离、细胞/颗粒介质交换、细胞富集和其它颗粒富集。可采取物理方式把部分种类或特征的颗粒，比如细胞，从共同的流中分离出来，以获得按种类或部分特征分选的多条输出流。如本文的例子所示，除非另有定义，颗粒可以为生物细胞，但是，术语“细胞”在某些时候被单独用于强调生物应用。
迄今为止，已经开发了多种能够在微流控系统中分离颗粒和细胞的方法，比如离心法、磁力、液体动力、介电泳(DEP)和体声波(BAW)。可通过表面声学驻波(SSAW)形成的声动力在微流控通道中分离颗粒，并达到85％的分离效率。基于本发明的颗粒分离技术的一种成角度或倾斜的叉指式换能器(TIDT)，已经证明可达到98％或更高的出色的分离效率。
图1中的10显示了一种用于操作颗粒的示范性装置。在一对相互隔离的表面声波发生器14和16之间定义了通道12。发生器14和16一起定义了SSAW发生器。在图释的例子中，发生器14和16为叉指型换能器(IDT)。发生器14和16产生的表面声波相互作用，在之间形成SSAW。在图1中，一般以18表示SSAWS。其波节点以20、22和24处的实线表示，波腹点以26和28处的虚线表示。中心波节点位于22的位置。可把SAW区域视为发生器14和16之间产生SSAW的区域。通道从SAW区域内通过。
图2是沿中心波节点22提取的横截面示意图。通道12定义在通道壁30内。在本描述中，术语“通道”可以是指通路或封闭结构。所示颗粒32朝向波腹点22的方向。
包含颗粒的流体沿着通道12按F所指的流向流动。该方向同样可被视为通道方向。SSAW可以说具有一个SSAW方向，该方向与图1中的线条22一致。也就是说，SSAW方向与总体上为线形的SSAW波腹点和波节点对齐。如图所示，SSAW方向与流向或通道方向F成斜角。SSAW方向与流向和通道方向F既不平行也不垂直。对本领域技术人员 来说，倾斜的定义是指0和90度之间以及90和180度之间的角，不包括0、90或180。本领域技术人员明白，除SSAW以外的SAW同样具有波节点和波腹点，即使它们具有与所示不同的位置并且可能随时间移动。但是，它们仍然以一个角度出现，相对于流向或通道方向F。
基于SSAW的分离设备的一个例子，是由聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控通道30构成，该通道位于沉积在压电基底34上的一对相同的IDT之间。在图1中，微流控通道有三个入口36、38和40，两个出口42和44。中心入口38引入包含待操作颗粒的流体样本，以及引入缓冲流的两个侧部入口。在实验安排中，一对IDT 14和16为并排沉积布置，并与使用的通道方向和流向成一定的斜角，比如15°、30°和45°，但也可采用其它斜角。向每个IDT施加一个RF信号，以生成两条同等的SAW。在PDMS微通道30所连接到的IDT之间，这两条SAW按相反的方向传播，并相互干扰形成SAW驻波(SSAW)。这种SSAW在基底34的表面产生平行分布的压力波节点和波腹点。根据微颗粒的弹性属性，由压力分布产生的声辐射力推动悬浮颗粒向SSAW场内的压力波节点或波腹点移动。图2显示了颗粒是如何被推向压力波节点的。通过中心入口通道38注入颗粒，并在进入SSAW场之前由来自侧部入口36和40的两条侧流进行流体动力聚焦。SSAW场内的颗粒承受横向声辐射力、曳力、重力和浮力。重力和浮力量级相似，但方向相反，几乎平衡。可通过检查曳力和声辐射力来特征化通道内颗粒的行为。
主要的声辐射力(Fr)和曳力(Fd)可表示为：
Fd＝-6πητν), (3)
其中，po、λ、Vp、ρp、ρm、βΡ、βm、η、r和v分别是声压、波长、颗粒体积、颗粒密度、介质密度、颗粒压缩率、介质压缩率、介质粘度、颗粒半径和相对速度。等式(2)表述了声音反差系数，它决定了颗粒 是向压力波节点还是波腹点移动：在为正值时，颗粒将向压力波节点聚拢；当为负值时，将向压力波腹点聚拢。据信，多数颗粒和细胞的 为正值，并向SSAW场内的压力波节点移动；泡沫和脂类的通常为负值，并向压力波腹点移动。等式(1)和(3)表明，声辐射力与颗粒/细胞的体积成正比例，而曳力与颗粒的半径成正比例。承受较大声力的大颗粒将被限制在压力波节点内，并沿通道的宽度方向作大的横向位移，进而重新定位。图1显示，较大颗粒会重新定位，以与压力波节点22对齐。这些较大的颗粒被收集在上部出口通道42中。对小颗粒来说，作用在它们身上的力不足以把它们限制在压力波节点内。因此，它们被曳力保持在中心流内，并被收集在图2所示的底部出口通道44中。
图3A-3C说明在存在SSAW的情况下15μm和7μm聚苯乙烯颗粒所采取的轨迹，SSAW被设置为分别与流向呈15、30和45度斜角。在各个图中，46处的类实线代表较大颗粒，而48表示较小颗粒的流。
在与大SSAW波幅对应的高输入功率下，声辐射力占据主导，并把颗粒轨迹限制在有角度的压力波节点内，比如图1中的22，在通道的宽度方向上实现了大距离的移动。而低输入功率导致颗粒被小声辐射力和曳力主导，从而导致小的横向距离移动。如图4A-4C所示，对～2mm/s的流速下不同SSAW波幅下15μm颗粒的轨迹进行了实验性的记录。图4A表述的输入功率为27dBm；图4B表述的输入功率为23dBm；图4C表述的输入功率为15dBm。因为声辐射力取决于体积、压缩率和密度等机械性能，可通过本文描述的声学设备来区别和分离在这些属性中存在差异的颗粒。
本发明的一种实施方式使用聚苯乙烯珠进行测试。如图5-5E所示，记录了在SAW工作区域和通道出口的位置，以分析颗粒的分布。图5显示的设备50的工作区域以52处的点划线表示。在通道内注入10μm和2μm颗粒的混合物，并由两条侧流通过流体动力聚焦在中心。图5C显示的设备的出口区域位于54的位置。如图5A和5D所示，在发生器被关闭时，小颗粒和大颗粒一起沿流体流动，并通过下部输出通道流 出。在发生器被打开时，进入工作区域52的颗粒受到声辐射力，声辐射力把它们推向与流动方向成30°的角的线形压力波节点。如图5B所示，在流速为6.5mm/s，输入功率为16-23dBm时，声辐射力把大颗粒推向压力波节点，并把它们限制在有角度的线性波节点沿线内，直到这些颗粒从工作区域离开。而小颗粒因受到的声辐射力不足，保持在原流体内。图5B和5E显示，大颗粒被从混合物流中抽出，并通过上部出口通道分离，而小颗粒的轨迹未受较大影响，被收集在下部出口的通道内。分析从每条出口通道内收集的大小颗粒的比率以评估本方法。使用记录的视频来统计颗粒的数量。如图6所示，大颗粒中的98％移向上部出口的通道，而小颗粒中的100％保持在下部出口的通道内。
要进一步检验本技术的分辨能力，在一种含水缓冲液中混合直径为9.9μm和7.3μm的荧光聚苯乙烯珠。把这些珠子混合物注入设备中，并设定为以～1.5mm/s的速度流动。小珠和大珠在进入SSAW工作区域前被混合。大珠在通过工作区域时从小珠流中剥离。在出口通道附近扫描荧光密度剖面，以指示珠的分布情况。结果显示垂直方向上不一致的速度分布造成两个小珠高峰。这是因层流中的流体动力作用引起。实验性结果显示，本方法实现的分离分辨能力为30％，好于其它大多数方法。
为了进一步探索新方法的多种用途，基于压缩率的不同进行颗粒分离。HL-60是一种人体早幼粒细胞白血病细胞系，直径为～15μm。HI-60细胞(密度为～1.075kg m-3，压缩率为～4*10-10Pa-1)与15μm聚苯乙烯珠(密度为1.05kg m-3，压缩率为～2.16*10-10Pa-1)相混合。这些颗粒具有相似的尺寸和密度，但压缩率不同。图7-7C显示了不同压缩率的颗粒的分离。图7和7B显示了一种示范性设备60，其工作区域位于62的位置，出口区域位于64位置。图7A和7C分别显示了工作区域和出口区域中的分离情况。在SSAW工作区域内，聚苯乙烯珠(黑色圆圈)被从HL-60细胞(虚线圆圈)中抽出，最终被上部出口通道收集。
为了证明本发明的设备在生物应用中的能力，进行了一次实验性的分离，从人体血液中分离人体白血病癌细胞。使用PBS(磷酸盐缓冲 盐水)缓冲液对人体红血细胞(从Zen-bio购买)稀释100倍，并与HL-60(人体早幼粒细胞白血病细胞)相混合。血细胞与HL-60的比率接近1比1。图8-8C展示的叠加图像显示了细胞分离过程，其中，HL-60有选择性的从红血细胞中移出，并收集到上部出口的通道。图8和8B显示了一种示范性设备70，其工作区域位于72处，出口区域位于74处。图8A和8C分别显示了工作区域和出口区域中的分离情况。为了评估分离效率，收集每条出口通道的细胞，然后使用商业标准的流式细胞计(CoulterFC 500)进行特征化。作为比较，也通过流式细胞计对混合物样本进行计数。结果显示，来自上部出口通道82％的细胞为HL-60，来自下部出口通道81％为红血球。
因循环肿瘤细胞(CTCs)在癌症预测、治疗监测和转移研究方面的潜在价值，近些年来它吸引了越来越多的研究注意力。在转移癌症的患者的血液中，为了检测、特征化、监测非血液学肿瘤，罕见的CTC是一种潜在的获取源。因CTC浓度低，在每109个血液细胞中仅有一个细胞，CTCs的分离是一项极大的技术挑战。
为了证明本发明对CTC的适用性，发明人研究了肿瘤细胞从人体血液的分离。在研究中，使用RBC Lysis Buffer(eBioscience)来对1mL的人体全血进行溶解，所测得的白血细胞(WBC)浓度为2-4*106/mL。之后，这种经红血球溶解的血液样本与lOOuL肿瘤细胞(6*106/mL)相混合，来获得10％的肿瘤细胞浓度。在此，MCF-7细胞(人体乳癌细胞系)被用作肿瘤细胞模型。混合后的样本被通过注射泵投入基于SSAW的CTC分离设备中。因为肿瘤细胞通常远大于白血细胞，在细胞进入SSAW工作区域时，肿瘤细胞被从WBCs中分离出来。CTC细胞和白细胞最终被收集到不同的出口，用于连续的特征化。使用EpCAM、CD45表面标记(绿色)和核染剂(DAPI，蓝色)来研究被分离的CTC的纯度。MCF-7等上皮细胞肿瘤细胞对EpCAM呈阳性(红色)，对CD45呈阴性，对DAPI(蓝色)呈阳性，而白细胞对EpCAM呈阴性，对CD45呈阳性，对DAPI(蓝色)呈阳性。为评估使用本发明设备进行的肿瘤细胞分离的表现，研究了肿瘤细胞分离的恢复率和纯 度。细胞分离的恢复率(％)和纯度(％)被分别定义为隔离肿瘤细胞数量与加入的肿瘤细胞数量的百分比，以及隔离肿瘤数量与收集到的总细胞数量的百分比。MCF-7细胞系被用作CTC模型，初步结果所展示的纯度高达98％，远高于当前的商业方法的百分比，Cellsearch(0.1％)，并且要高于其它代表当前技术发展水平的无标记CTC分离方法(80％-90％)。
因为在收集CTC后将开展进一步的CTC细胞生理学研究，新CTC隔离设备的生物相容性非常重要。因此，要求隔离流程对细胞的生理学影响(如果有)最小。为了证明本发明设备的生物相容性，在暴露在操作功率水平(25dbm，或2W/cm2)下的SAW场内执行了细胞生存能力、凋亡和繁殖的测定。分别使用WST-1细胞生存能力试验(Roche)、BrdU CellProliferation ELISA(Roche)和Calcein AM和SYTOX Orange(Invitrogen)来测试细胞生存能力、繁殖和凋亡。在25dBM(2W/cm2)的输入功率下，以2uL/min的流速把MCF-7细胞投入分离设备中。然后，在从出口收集到细胞后立即执行细胞试验。结果显示，在细胞生存能力、凋亡和繁殖方面没有发现显著的变化。这些积极的结果表明，本发明的SAW设备是从血液中隔离CTC进行连续研究，并且不影响细胞生理学属性的理想选择。
采用枸橼酸葡萄糖(ACD)作为抗凝血剂的新鲜人体全血从Zen-bio处购得。为溶解红血细胞，1ml的全血中加入10ml的1X RBCLysis Buffer(eBioscience)，在室温下孵育10-15分钟，然后以400x g的力离心分离，在PBS中再重新悬浮，并使用血细胞计数器进行细胞计数，以确定全血细胞(WBC)浓度。然后，按所需的比例把培养好的MCF7乳癌细胞加入制备好的WBC悬浮液中。把这种制备好的样本注入本发明的SSAW设备用于MCF7的分离。
在分离后，收集来自CTC出口的细胞，并以4％的多聚甲醛(Santa CruzBiotechnology公司)固定5分钟，之后在PBS中以0.2％的Triton X-100(Sigma-Aldrich)使其具有渗透性。然后使用DAPI(核染色)、 FITC共轭抗CD45抗体(WBC染色)(Invitrogen)和Phycoerythrin(PE)共轭抗EpCAM抗体(MCF7染色)(eBioscience)对这些固定的细胞进行染色。通过落射荧光成像对这些染色的细胞进行分析。
本发明提供了一种使用表面声学驻波的独特细胞分离微流控设备。可使用本设备有效和连续的分离不同尺寸和压缩率的颗粒。发明人已经成功证明了1)不同尺寸的聚苯乙烯珠，2)具有相同尺寸和不同压缩率的珠和细胞，3)来自人体红血球的白血病细胞和4)来自人体全血、被作为CTCs模型的人体乳癌细胞的芯片上的连续分离。执行了一系列的细胞生存能力、繁殖和凋亡试验来证明本发明方法优良的生物相容性。此外，本发明的SSAW设备简单、成本低、小型化，并可通过标准的微细加工来制造，能方便的集成到其它芯片实验室技术中。
本发明的例子为使用标准软光刻术制作的单层平面的微流控设备上的倾斜的成角度表面声波对微米/纳米颗粒和细胞进行高效分离提供了一种新颖的装置和方法。与现有的技术(比如基于体声波的分离、基于磁场的分离和电动分离)相比，本技术提供了较高的效率，大幅简化了设备构造，降低了侵袭性和减少了成本。新系统的例子包括具有多种用途的低成本、高效率和便携式分离系统，比如血液/细胞/颗粒分离、细胞/颗粒介质交换和细胞/颗粒富集。
用于操作(分选、分离或以其它方式操作)流体样本中的颗粒的一种示范性装置包括具有基底表面的基底，以及IDT等声学换能器，可操作声学换能器以在基底表面的区域内生成例如表面声学驻波(SSAW)等。配置通道来接收流体样本。比如，通道可能是配置用于接收具有流向的流体样本的流体通道。流向可以与SSAW方向成斜角，比如与流向的平行或垂直方向成至少5度角。比如，与流向的平行或垂直方向成至少10度角。比如，SSAW和通道方向之间的角度可能在5°和85°之间，比如在10°和80°之间，比如在10°和70°之间。这些角度范围仅作示范，不具有限制性。SSAW发生器可包括一对相互隔开的表面声波发生器，并且每台表面声波发生器可能是由基底支撑的叉指型电极的叉指型换 能器(IDT)。基底可以是或包括压电基底。由一对换能器生成的SAW可能相互平行但方向相反，以形成位于换能器之间、倾斜于流体通道的SSAW。流体通道在换能器之间通过，并靠近它们之间生成的SSAW。对不同的颗粒类型采用不同的压力，以在SSAW区域的下游形成多种输出颗粒流。然后可使用多种出口通道收集这些输出颗粒流，由每条出口通道收集特定类型的颗粒流。
一种示范性装置可能是一台微流控设备。通道是微通道，具有至少一个小于1mm的横截面尺寸。颗粒为一个横截面尺寸小于100微米的微颗粒。一种装置可以进一步包括一种颗粒特征化设备，可操作该设备来特征化被操作的颗粒。
一种示范性装置可以是或进一步包括一个血细胞计数器、荧光颗粒检测器、颗粒分离器、荧光分光计、基因分析仪、色谱仪、基于电泳的检测器、生物标志检测器、血液分馏器或血浆分馏器。示范性装置包括用于医疗用途的便携式、医疗点微流控诊断装置。可通过改进后的临床标志物的检测，比如蛋白质成分等血液成分的检测，使用血液分离来帮助诊断疾病。
一种用于操作流体样本中的颗粒，比如分离具有不同特征的颗粒的装置，包括基底和通道，基底支撑一对相互隔开的表面声波换能器，通过配置表面声波换能器，可在换能器之间的SSAW基底区域内生成表面声学驻波(SSAW)，通道配置用于接收包括颗粒的流体，通道具有SSAW区域，在SSAW区域内，通道具有SSAW通道区域，通道从其中紧邻或靠近SSAW基底区域的位置通过。基底可形成通道的壁，或由通道与SSAW基底区域内的基底相连。SSAW的SSAW方向与通道方向成斜角。在本文中，SSAW方向是与SSAW的线形波节平行的方向。在流体样本被引入通道中并生成SSAW时，可操作装置来分选流体样本中的颗粒。生成与在发生器之间的线条垂直的压力波节点和波腹点。根据颗粒属性，可选择性的把颗粒导向波节点或波腹点。可通过流向、SSAW与通道之间的角度、流速和/或其它控制参数来控制颗粒流的物理分离。 物理分离可与一对输出通道相配合，使导向压力波节点的颗粒通过出口通道离开，未被导向波节点或导向波腹点的颗粒从其它出口通道离开。
一种示范性设备包括一对由压电基底支撑的叉指型换能器(IDTs，又叫叉指型换能器)。一个IDT可以包含两个互锁的梳状电极。电极由基底支撑的金属或其它导电涂层提供。压电基底可以包括铁电材料，比如铌酸锂，IDT可以被沉积在铌酸锂基底上。
通过位于两个IDT之间的通道引入颗粒悬浮物(比如微颗粒和/或纳米颗粒悬浮物)。通道可以在PDMS等聚合物中形成。比如，通道可能在基底上使用模塑聚合物元件形成，并可以是微通道。模塑聚合物元件可以还包括切断器(不与基底接触的区域)，以界定基底的SSAW区域。向每个IDT施加一个射频信号，然后生成向通道传播的SAW。SAWs的干扰导致基底上SSAW的形成。
一种示范性颗粒操作装置包括基底、至少一表面声波(SAW)发生器，可操作它在基底内生成表面声学驻波(SSAW；配置用于接收包含颗粒的流体样本的通道，通道有一个颗粒操作区域，位于生成SSAW的基底部分内。根据本发明的实施方式的方法和装置可以进一步包括颗粒特征化，比如对被操作的颗粒流或静态流体样本中的被操作颗粒进行辐射。
在另一个例子中，符合本发明的颗粒操作装置或方法利用了其它形式的声波，比如体声波，此时波与通道和/或流向成斜角。在本文讨论的任何实施方式中，可以其它类型的声波代替所描述的表面声波。
颗粒特征化可包括用于颗粒检测、颗粒分析、颗粒计数和综合这些方式的装置和方法。比如，可使用一个辐射源来指向流体介质内的被操作颗粒。通过整合颗粒操作的分析方法和装置，能够改进该方法和装置的颗粒特征化。颗粒可悬浮在流体介质内，流体介质可以是流经通道的样本流体。
比如，通过整合微流控设备和单个微颗粒检测技术，能够改进微 颗粒特征化。本发明的例子包括用于流式细胞计的装置和方法，以及用于计数、分析和分选样本流体中的微颗粒的装置。微颗粒可定义为尺寸小于1mm的颗粒，特别是小于500微米的颗粒，更是小于100微米的颗粒。微颗粒可包括细胞、分子、生物分子和类似物体。
本发明的例子包括经过改进的流式细胞计和其它细胞特征化设备、经过改进的分子检测设备、其它分析物特征化设备、分析物分选设备、基因分析设备和类似设备。可使用SAW(SSAW或传播的SAW)来实现动态颗粒分离和随后的分选。颗粒可以是分子(比如聚合物、巨分子或生物分子)、生物结构(比如细胞，比如血细胞)、颗粒(任何类型)、胶束、来自宿主流体的不同密度的液滴和类似物质。
根据本发明的装置和方法可用于多种用途。装置和方法可用于不同成分具有不同尺寸或密度或机械属性的几乎所有应用。部分非限制性示例包括：分离血液样本中的不同成分(红血细胞、白血细胞、血小板、血浆等)、从血液样本中分离循环肿瘤细胞、从血液样本中分离循环内皮细胞、从血液样本中分离蛋白生物标志结合的颗粒、从血液样本中分离微泡/外来体结合的粒子、从母体血液样本中分离胎儿有核红细胞(基于尺寸和变形能力)、基于尺寸差异的干细胞隔离和从血液样本中进行细菌富集。本领域技术人员能够清楚其它应用。
一种装置可以是平面微流控设备。通道可以有与基底平行和接近的下壁、相对的侧壁和上壁。通道宽度和/或高度可能在100nm–1mm的范围内，比如在1微米-500微米的范围内。其它尺寸同样可能存在。
压电基底可能含铌酸锂、钽酸锂晶体、锆钛酸铅、聚偏二氟乙烯(PVdF)或其它含氟聚合物等聚合物、石英或其它材料。IDT同样可成为传感器系统的组成部分，比如使用时间闸控或监控传动信号属性。在某些例子中，基底可作为流体通道的壁，或流体通道的壁与基底相连。
本规范中提及的专利、专利申请或出版物通过引用结合到本文中，与每份单独的文件专门、分别通过引用结合到本文中具有相同的效 果。特别是，于2009年12月4日提交的第12/631,059号申请的全部内容通过引起被结合到本文中。
本发明不仅限于上述的说明性示例。示例不对发明范围构成限制。本文描述的方法、装置、结构和类似为示范目的，不对发明构成限制。本领域技术人员将对上述和其它用途进行修改。发明范围由权利要求的(包括所有同等项目)范围定义。

Claims (17)

1.一种用于分选流体样本内的颗粒的装置，其特征在于，所述装置包括：
基底，具有基底表面；
表面声波(SAW)发生器，通过操作能在所述基底表面的SAW区域内生成SAW，
所述SAW具有与大致呈线性的压力波节点对齐的SAW方向，
流体样本通道，配置用于接收流体样本，所述流体样本有流向；
所述流向与所述SAW方向成斜角；
多个出口通道，配置用于分别收集来自流体样本通道中样品流的多种输出颗粒流。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，
所述SAW发生器包括一对相互隔开的表面声波发生器，每个所述表面声波发生器为包括以基底为支撑的叉指型电极的叉指型换能器。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，
所述基底为压电基底。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，
所述装置为微流控设备；
所述流体样本通道为至少有一个横截面尺寸小于1mm微通道；
所述颗粒为横截面尺寸小于100微米的微颗粒。
5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，
所述SAW发生器为能够操作、在所述SAW区域内生成SSAW的表面声学驻波(SSAW)发生器。
6.一种用于分选流体样本中的颗粒的装置，其特征在于，所述装置包括：
基底；
第一表面声波发生器；
第二表面声波发生器；
通过配置，所述第一和第二表面声波发生器能够在所述基底的表面声波(SAW)区域内生成表面声波(SAW)，所述SAW具有与大致呈线性的压力波节点对齐的SAW方向；以及
配置用于接收包含颗粒的流体样本的流体样本通道，所述流体样本通道具有靠近所述基底SAW区域的分选部分，所述流体样本通道具有通道方向；
配置多个出口通道，以分别收集来自流体样本通道中样品流的多种输出颗粒流；
其中，所述SAW方向被布置为与所述流体样本通道方向成斜角；
其中，在所述流体样本被引入所述流体样本通道时，所述装置能够操作来分选所述流体样本中的颗粒形成多种输出颗粒流，并生成所述SAW。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，
所述SAW发生器为能够操作、在所述SAW区域内生成SSAW的表面声学驻波(SSAW)发生器。
8.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，
所述基底为压电基底；并且
所述第一和第二表面声波发生器各自包含由所述基底支撑的电极。
9.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，
所述基底形成所述流体样本通道的壁。
10.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，
所述装置为微流控设备；
所述流体样本通道为微通道；以及
所述微通道的至少一个横截面尺寸小于1mm。
11.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，
所述流体样本通道为经配置后能接收流体样本的流体通道。
12.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，
所述颗粒为直径小于100微米的微颗粒。
13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，
所述微颗粒包括生物分子或细胞。
14.一种在含不同的类型的颗粒的流体样本中分选不同的类型的颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括：
提供分选流体样本中的颗粒的装置，所述装置包括：
基底，具有基底表面；
表面声波(SAW)发生器，通过操作能在所述基底表面的SAW区域内生成SAW，
所述SAW具有与大致呈线性的压力波节点对齐的SAW方向，
流体样本通道，配置用于接收流体样本，所述流体样本具有流向；
所述流向与所述SAW方向成斜角；
多个出口通道；
把流体样本引入到所述流体样本通道中；以及
在所述基底中生成SAW；
使不同的类型的颗粒分别形成多种输出颗粒流；
使多种输出颗粒流分别进入多种出口通道。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，
所述生成SAW的步骤，包括：生成表面声学驻波(SSAW)。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，
所述流体样本是沿所述流体样本通道引导的样本流；
所述流体样本通道受所述基底的支撑；
所述流体样本通道是微流控设备内的微通道；以及
所述方法进一步为颗粒特征化、颗粒聚焦、颗粒分离、颗粒分馏或颗粒挑选的方法。
17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，
所述流体样本包括由压力引向压力波节点的第一颗粒类型，以及未由压力引向压力波节点的第二颗粒类型，以生成所述第一颗粒类型的第一流和所述第二颗粒类型的第二流。
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