CN205720248U - 一种荧光检测装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供了一种荧光检测装置，包括样本抽取机构、磁微球汇集机构和荧光检测机构；所述的样本抽取机构包括吸液针头、石英管和吸液泵，所述吸液针头连接石英管，石英管连接吸液泵；所述的磁微球汇集机构为恒流源供电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁铁的一端朝向石英管；所述的时间分辨荧光检测机构包括激发光光源、光电转换器、激发光路和收集光路，所述激发光光源的光线通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁铁朝向石英管的位置相同，所述的收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的光电转换器对应收集光路。

Description

一种荧光检测装置

技术领域

本实用新型属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种荧光检测装置。

背景技术

荧光检测技术在医学和生物学中的应用已有近70年的历史，它与免疫检测技术相接合形成荧光免疫技术，并随着免疫技术的发展和应用，成为微生物学、免疫学、病理学、免疫组织化学和基因组化学中最常用、最有效的一种检测技术。

随着临床医学和科技进步，荧光免疫技术又发展出多种实用检测技术，如电化学荧光免疫分析（ECLI）、化学发光免疫分析（CLIA）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）等荧光免疫分析技术。这些技术均是通过对标记物（示踪探针）检测来确定被检测物，标记物通过免疫反应法、化学反应法、生化反应法、链霉亲和素和生物素等包被技术，制作成具有较高特异性的探针，探针通过相应的反应与目标物质结合；检测仪器通过对示踪探针的检测，测定出目标物质的浓度。另一方面包被技术也在发展，从传统的包被酶标板改为用磁微球作为免疫反应的载体，通过控制磁场抓取磁微球，可大大提高包被物量，增加检测灵敏度，减少反应时间，方便反应过程中的清洗，实验自动化操作，提高系统灵活性和工作效率，如目前比较流行的化学发光免疫分析仪。

目前，无论是使用磁微球作为免疫反应载体的设备，如：免疫荧光分析仪、化学发光荧光分析仪；还是用96孔板作为免疫反应载体的装置，如：酶标仪或时间分辨免疫分析仪，反应过程中需要进行若干次的样品池清洗，最后的荧光检测，均在反应池中进行，也就是检测整个反应池荧光标记物含量。以上这种常规的荧光标记检测技术，都存在一个无法克服的问题就是：由于反应过程经过了清洗步骤，无法保证每次试验时反应池中磁微球的数量不发生变化。也就是说，在检测过程中，清洗次数不同或清洗误差会影响检测结果，具有以下缺陷：

1、未清洗干净时，很多杂质存在的瞬时荧光对荧光标记物荧光的特异性构成干扰。

2、检测磁微球以低浓度分布在样本溶液中，容易被样本溶液中的干扰物质影响，导致检测误差。

实用新型内容

为解决上述技术问题，本实用新型提供了一种时间分辨荧光检测装置及其检测方法。将样品池中的磁微球分成等量的若干份，并对磁微球进行汇集后再完成荧光标记物检测。

本实用新型为了实现上述发明目的，采用如下技术方案：

一种时间分辨荧光检测装置，包括样本抽取机构、磁微球汇集机构和时间分辨荧光检测机构；所述的样本抽取机构包括吸液针头、石英管和吸液泵，所述吸液针头连接石英管，石英管连接吸液泵；所述的磁微球汇集机构为恒流源供电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁铁的一端朝向石英管；所述的时间分辨荧光检测机构包括激发光光源、光电转换器、激发光路和收集光路，所述激发光光源的光线通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁铁朝向石英管的位置相同，所述的收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的光电转换器对应收集光路。

本实用新型的检测装置通过电磁铁对磁微球的磁力作用，将磁微球聚集在石英管的检测区域，使磁微球在局部区域的浓度提高了成千倍，荧光标记物的荧光强度则可提高上万倍，而背景干扰荧光没有相应的提高，从而提高系统的抗干扰能力和灵敏度高。

本实用新型所述石英管为中空透明管，其内径为0.1-10mm。能够限制磁微球向外延聚集，使有限的空间内磁微球分布均匀且数量稳定，并且确保在磁微球汇集点处，获得更高的磁微球总数与液体容积的占比，这样可大大提高系统信噪比。

优选地，所述石英管的内径和外径均为方形。

本实用新型所述的吸液泵为蠕动泵或空气喷射泵，对液体流动石英管产生压差，促使液体从反应池中流过石英管，并且流速可控。

本实用新型所述的激发光路和收集光路由聚集透镜和滤光片构成。

本实用新型时间分辨荧光检测装置的检测方法：

步骤如下：

1）将吸液针头下端浸入反应池中待检测样本溶液，吸液泵对液体产生压差，促使反应池里的液体在石英管中流动；所述待检测样本溶液中含结合了被检测物和荧光标记物的磁微球；

2）打开恒流源，电磁铁产生磁场，将流过石英管液体中的磁微球驻留在电磁铁前端，使磁微球在石英管内的汇集数量不断增加，形成汇集点；

3）待磁微球汇集一段时间后，启动激发光光源，光线通过激发光路聚焦在石英管内汇集点的磁微球上，第一收集光路收集磁微球结合的荧光标记物的荧光信号，并通过第一光电转换器转换为电信号，进行荧光标记物含量检测，关闭恒流源；

重复上述步骤1）-3），分批次获得抽取液体中汇集磁微球的检测结果，并进行统计，完成对整个反应池中荧光标记物的含量检测。

本实用新型所述磁微球的粒径在0.1um-20um之间，作为荧光标记物的载体。

荧光标记物为反应试验的示踪物质，包被有能与检测目标物相结合的物质，荧光标记物具有在特定波长激发光照射下激发出长寿命荧光的特异性。

本实用新型所述磁微球的检测目标物包括：免疫蛋白、激素、生物酶、药物、微量元素、肿瘤标记物、基因、DNA和RNA、微生物及其代谢物等。

本实用新型的有益效果在于：

1．通过电磁铁将磁微球聚集在检测区域，使磁微球在检测区域的浓度提高了成千倍，荧光标记物的荧光强度则可提高上万倍，而溶液中的杂质所产生的背景干扰信号不会被增强，有效消减由于清洗不彻底对检测结果带来的干扰。

2．常规反应试验清洗的目的是减少杂质，提高荧光标记物与背景信号占比；本发明的检测方法，通过提高磁微球密度，提高荧光标记物与背景信号占比，来提高实验精度，特别适用于免清洗的反应体系检测荧光标记物含量。

附图说明

图1是本实用新型荧光检测装置的结构示意图。

图2是本实用新型荧光检测装置检测状态的结构示意图。

图3是本实用新型装置在焦点处垂直液体流动方向的剖面图。

附图标记：1、石英管，2、磁微球，3、激发光光源，5、光电转换器，6、电磁铁恒流源，7、汇集点，8、电磁铁，9、激发光路，10、收集光路，12、反应池，13、吸液针头，14、吸液泵。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本实用新型的实质性内容作进一步详细的描述。

实施例1

如图1、图2和图3所示，一种荧光检测装置，包括样本抽取机构、磁微球汇集机构和荧光检测机构；所述的样本抽取机构包括吸液针头13、石英管1和吸液泵14，所述吸液针头13连接石英管1，石英管1连接吸液泵14；所述的磁微球汇集机构为恒流源6供电线圈缠绕的电磁铁8，所述电磁铁8的一端朝向石英管1；所述的荧光检测机构包括激发光光源3、光电转换器5、激发光路9和收集光路10，所述激发光光源3的光线通过激发光路9聚焦在石英管1上，且该汇集点7与电磁铁朝向石英管的位置相同，所述的收集光路10对应该汇集点7的位置设置，所述的光电转换器5对应收集光路10。

实施例2

本实施例在实施例1的基础上：

所述石英管1为中空透明管，其内径为0.1mm。

实施例3

本实施例在实施例1的基础上：

所述石英管1为中空透明管，其内径为10mm，其内径和外径均为方形。

所述的吸液泵为蠕动泵。

实施例4

本实施例在实施例1的基础上：

所述石英管1为中空透明管，其内径为1mm，其内径和外径均为方形。

所述的吸液泵为空气喷射泵。

所述的激发光路和收集光路由聚集透镜和滤光片构成。

实施例5

本实施例在实施例1的基础上：

所述石英管1为中空透明管，其内径为2mm，其内径和外径均为方形。

所述的吸液泵为蠕动泵。

所述的激发光路和收集光路由聚集透镜和滤光片构成。

本实用新型所述荧光检测装置的检测方法：

步骤如下：

1）将吸液针头下端浸入反应池中待检测样本溶液，吸液泵对液体产生压差，促使反应池里的液体在石英管中流动；所述待检测样本溶液中含结合了被检测物和荧光标记物的磁微球；

2）打开恒流源，电磁铁产生磁场，将流过石英管液体中的磁微球驻留在电磁铁前端，使磁微球在石英管内的汇集数量不断增加，形成汇集点；

3）待磁微球汇集一段时间后，启动激发光光源，光线通过激发光路聚焦在石英管内汇集点的磁微球上，第一收集光路收集磁微球结合的荧光标记物的荧光信号，并通过第一光电转换器转换为电信号，进行荧光标记物含量检测，关闭恒流源；

重复上述步骤1）-3），分批次获得抽取液体中汇集磁微球的检测结果，并进行统计，完成对整个反应池中荧光标记物的含量检测。

实施例6

一种荧光检测装置，包括样本抽取机构、磁微球汇集机构和荧光检测机构，其中：

样本抽取机构包括吸液针头13、石英管1、吸液泵14；所述吸液针头13下端浸入反应池12中待检测样本溶液液面以下，上端经过软管连接石英管1，石英管下端连接吸液泵14，吸液泵14为蠕动泵或空气喷射泵，对液体流动管路产生压差，促使液体从反应池12中流过石英管1，并且流速可控，吸液泵14出口连接废液收集瓶，废液瓶和连接软管。

磁微球汇集机构包括电磁铁8、恒流源6；所述电磁铁8设置在控制石英管1中部,打开恒流源6后电磁铁8产生的磁力，将流过石英管1液体中的磁微球2驻留在电磁铁8前端，在磁力恒定和液体流速恒定的情况下，磁微球2在石英管内的汇集数量不断增加，形成高密度汇集点7。

荧光检测机构包括激发光光源3和荧光检测装置；所述激发光光源3光线被光路9聚焦在石英管1内汇集点7的磁微球2上，荧光标记物在激发光3照射下产生特异性的长寿命荧光；荧光检测装置设置在石英管1侧面，收集光路10用于收集荧光标记物荧光，再通过光电转换器5转换为电信号。

所述石英管1为方形或圆形细长中空液流管路，内径为0.1到10mm之间。

基于上述装置的检测方法是：将反应池12中的液体经过针头13连续抽入石英管1，石英管1中部设有电磁铁8，随着液体的连续流动，越来越多的磁微球2聚集在电磁铁8的前端；磁微球2聚集到一定时间后数量基本稳定，关闭吸液泵，启动光源3照射磁微球2设定时间后关闭，经延迟设定时间后，启动光电转换器5，获得磁微球2所结合的荧光标记物的时间分辨荧光强度电信号。

通过分批次抽取液体、汇集磁微球2、检测荧光标记物的荧光，对2到1000次检测结果进行统计，实现对整个反应池12中荧光标记物含量检测。

通过以下实施例，对本实用新型荧光检测装置定量测定样品溶液中目标检测物含量的方法进行详细的说明。

实施例7

双抗体夹心法定量检测TSH(促甲状腺激素)的检测

1、把抗人TSH的β-亚单元单克隆抗体包被磁微球上

将20mg粒径5μm、表面带羧基的磁微球（购自Thermo Scientific公司）用磁铁分离上清液，然后把上清液移走，除去缓冲液中的叠氮钠3次，用0.1MMES缓冲液（pH6.8～7.2）悬浮，稀释到5ml；在搅拌下加入5mg碳二亚胺（EDC）和5mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，搅拌溶解，室温反应25分钟；把活化后的磁微球用磁铁分离上清液，然后把上清液移走，除去多余的EDC和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐。用50mM硼酸缓冲液（pH8.2～9）清洗，之后用硼酸缓冲液悬浮到3毫升。

加入1mg用50mM硼酸缓冲液（pH8.2～9）透析过的抗人TSH的β-亚单元单克隆抗体，搅拌均匀，室温反应16到24小时；反应结束后用磁铁分离上清液，把上清液移走，加封闭液(含有5g/L的BSA（牛血清白蛋白）、50mM pH8.5的Tris（三羟甲基氨基甲烷醋酸盐）缓冲液封闭8小时左右，用磁铁分离上清液，把上清液移走，然后用稀释液（含有5g/L的BSA、5g/L 的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、0.2%叠氮钠的pH8.0的Tris缓冲液50mM）溶解沉淀，制成标识微球试剂。4℃冷藏保存。

2、把在抗人-TSH的α-亚单元单克隆抗体标记在荧光标记物上

首先把1mg抗人-TSH的α-亚单元单克隆抗体pH7.0的0.05M磷酸缓冲溶液，2～8℃透析四次。取出加入0.2mg的二硫苏糖醇（DTT）还原20分钟，再加入0.4mg的穴状化合物（时间分辨荧光标记物），和0.01mg的乙二胺四乙酸（EDTA）低温反应24小时。

用Sephadex G-50柱层析分离标记了穴状化合物的单抗和没在标记的单抗，用蛋白仪区分不同分子量的蛋白，同时检定标记到单抗的穴状化合物的比例，制备得到荧光标记试剂，4℃冷藏保存。该试剂分辨荧光标记物能在340nm波长光源的激发下，发出610nm荧光，并且寿命为2ms以上。

3、免疫反应样品制备

取TSH浓度为0.09IU/ml的标准样品3份各50μl，分别加入3个塑料管式样品反应池12中，并标记物A、B和C 。

向上述3个样品池中分别加入取步骤1制备的磁微球试剂20μl(固含量为万分之二)，利用电磁场振荡，样品中的TSH抗原与磁微球的包被抗人TSH的β-亚单元单克隆抗体免疫反应，并附着在磁微球表面，样品溶液中的抗原越多，则在标识微球表面聚集得越多。反应30分钟后，利用磁场进行分离，移去上清液多余的样本，再加入200μl清洗液，磁场分散，再利用磁场进行分离，反复清洗5次，最后加入稀释液。

按上述步骤分别对样品池B和C进行重复清洗6次、7次。

向上述3个样品池中分别加入步骤2制备的标记物试剂50μl，荧光标记物会通过标记的抗人-TSH的α-亚单元单克隆抗体与附着在磁微球上的TSH抗原结合，形成磁微球-目标物-标记物的复合物，约30分钟后，利用磁场进行分离，移去上清液多余的荧光标记物，再加入200μl清洗液，磁场分散，再利用磁场进行分离，反复清洗5次，最后一次加入稀释液。

按上述步骤分别对样品池B和C进行重复清洗6次、7次。

理论上清洗次数越多溶液中的杂质越少，背景干扰越低，但导致磁微球数量丢失的可能性越大。

4、荧光检测

用本实用新型装置对样品进行检测，装置中激发光光源3为340nm光电二极管，其供电电流为80mA，从上方照射，并将焦距对准反应池12中心，时间分辨荧光光路10的滤光片为610nm光窄带通过，光电转换器5为滨松公司光电倍增管R4220P，转换的电信号经过发大和滤波后，并进入模数转换为数字信号。

首先取上述A样品反应池，加入荧光增强液后，将吸液针头13下端浸入反应池12中液面以下，开启吸液泵14，使液体流动管路产生压差，促使液体从反应池12中样品液体不断流过石英管1，并且流速稳定可控，吸液泵14出口连接废液收集瓶，废液瓶和连接软管，未在视图中画出；

如图2，打开恒流源6，使电磁铁8受电产生磁力，石英管1内流动的液体中的磁微球2在电磁铁8磁力作用下，渐渐汇集在石英管1内壁，越积越多并形成汇集点7，经过设定的35秒后，汇集点7聚集的磁微球2达到稳定的数量，关闭吸液泵14；同时，开启汇集点7上方激发光源3，经过50微秒时间的照射后关闭，汇集点7的磁微球2所结合的荧光标记物，在390nm光照射下被激发出610nm波长的荧光，经汇集点7侧面的时间分辨荧光收集光路10和光电转换器5，荧光信号被转换为电信号；激发光源3关闭200微秒延时时间后，检测并记录时间分辨荧光信号。

完成一次检测后，关闭电磁铁8，磁微球随液体流走，然后再次开启，重复30次上述汇集磁微球2，检测记录荧光强度过程，最后进行统计获得平均光强值，完成对样本A中的目标物的检测。

清洗吸液针头13和液路管道内壁，防止交叉污染。按上述同样方法依次对样品B和C进行检测，得到检测结果如下。

表1 TSH定量微球检测荧光结果

5、使用常规检测仪的检测结果

进行上述1-3步操作，最后把反应物移入酶标板内，对整个反应池检测荧光，使用苏州新波的Anytest2000检测仪，检测A、B和C反应池的荧光信号，结果如下：

表2 TSH反应池检测荧光结果

本实施例的实验数据说明，相比TSH反应池荧光检测的常规方法，通过采用定量微球的检测方法不仅减少了清洗过程中磁微球丢失所引入误差，而且减少了由于清洗不彻底引入的背景干扰，更适合应用于全自动、快速、高灵敏度、高精度和高通量检测。

Claims (5)

1.一种荧光检测装置，其特征在于：包括样本抽取机构、磁微球汇集机构和荧光检测机构；所述的样本抽取机构包括吸液针头、石英管和吸液泵，所述吸液针头连接石英管，石英管连接吸液泵；所述的磁微球汇集机构为恒流源供电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁铁的一端朝向石英管；所述的荧光检测机构包括激发光光源、光电转换器、激发光路和收集光路，所述激发光光源的光线通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁铁朝向石英管的位置相同，所述的收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的光电转换器对应收集光路。

2.根据权利要求1所述的一种荧光检测装置，其特征在于：所述石英管为中空透明管，其内径为0.1-10mm。

3.根据权利要求2所述的一种荧光检测装置，其特征在于：所述石英管的内径和外径均为方形。

4.根据权利要求1所述的一种荧光检测装置，其特征在于：所述的吸液泵为蠕动泵或空气喷射泵。

5.根据权利要求1所述的一种荧光检测装置，其特征在于：所述的激发光路和收集光路由聚集透镜和滤光片构成。