JP2010175355A

JP2010175355A - 自動分析装置

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Publication number: JP2010175355A
Application number: JP2009017465A
Authority: JP
Inventors: Mitsuhiro Saito; 充弘斉藤
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2009-01-29
Filing date: 2009-01-29
Publication date: 2010-08-12
Also published as: US8741218B2; WO2010086942A1; CN102301238A; DE112009004291T5; US20110293473A1; DE112009004291B4; DE112009004291B8

Abstract

【課題】血液，血清，血漿あるいは体液を試料あるいは検体とし、ホルモン，腫瘍マーカ，感染症病原体マーカ，感染抗体等の微量物質の計測分析を行うために、タンパク質の分析項目ごとに分析対象のタンパク質に結合する抗体あるいは抗原に、放射性同位元素，蛍光色素，発光色素，酵素等を結合した標識抗原，標識抗体、あるいはトレーサー等を用いる分析方法において、ノイズ発生の小さくバックグラウンドの低い高感度の分析が可能とすること。
【解決手段】蛍光測定法あるいは発光測定法による分析法あるいは装置において試料の抗原抗体反応に基づく分析測定を行う時、試料の性状あるいは試料に含まれる物質濃度の高低に関わらず、干渉光等非特異的な蛍光あるいは発光を検出あるいは測定することをなくすか効果的に除外し、高感度の分析測定を行う。
【選択図】図１

Description

本発明は、血液，血清あるいは血漿を試料あるいは検体とし、抗原抗体反応を利用し血中微量物質の分析を行うとき、反応の有無および反応量を知る目的で抗原あるいは抗体に結合する蛍光体あるいは発光体を用いる抗原あるいは抗体の分析方法に関する。

血液，血清，血漿あるいは体液を試料あるいは検体とし、ホルモン，腫瘍マーカ，感染症病原体マーカ，感染抗体等の微量物質の計測分析を行うとき、タンパク質の分析項目ごとに、抗原抗体結合反応に基づく結合により、試料あるいは検体中のタンパク質等を定性的あるいは定量的に検出する方法が一般的になされている。この場合、分析対象のタンパク質に結合する抗体あるいは抗原は、放射性同位元素，蛍光色素，発光色素，酵素，希土類錯体，金属イオン等を結合され、標識抗原，標識抗体、あるいはトレーサー等と呼称されている。

同様に、試料あるいは検体中の病原体，薬物代謝マーカ等のＤＮＡあるいはＲＮＡを計測分析しようとするとき分析対象物のＤＮＡあるいはＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖あるいはＲＮＡ鎖をハイブリダイズさせ分析対象物を検出する。このとき、相補的なＤＮＡ鎖あるいはＲＮＡ鎖は直接あるいは間接に蛍光体あるいは発光体に標識される。

免疫学的分析法は抗原とそれに結合する抗体が抗原抗体結合を生成させることを基にした生体物質の特異的測定方法である。その測定原理により、溶液内沈降反応法，担体による凝集反応法，標識抗体法がある。溶液内沈降反応法は溶液内で抗原抗体結合により生じる凝集物を光学的に測定し定量する方法であり、免疫比濁法，免疫比ろう法などが知られている。担体による凝集反応法は抗体を固相したラテックスなどの担体と試料溶液（抗原）を抗原抗体結合させ、生じた担体の凝集を光学的あるいは画像的に測定して定量する方法であり、ラテックス比濁法，ラテックス比ろう法，粒子カウント，画像処理などにより見かけの粒子径あるいは透過光の減少増加を測定するものである。標識抗体法は各種標識物質で標識した抗体を用いて抗原抗体結合をさせ、標識抗体と反応した成分だけを測定する方法であり、その標識物質により、ラジオイッムノアッセイ，エンザイムイムノアッセイ，蛍光イムノアッセイ，化学発光イムノアッセイ，電気化学発光イムノアッセイなどが知られる。

免疫学的分析法で指摘される問題点については、以下に列挙する。
１．異好抗体による影響：抗体にモノクローナル抗体を使用する系では試料中にＨＡＭＡ（human anti-mouse antibody）が存在すると標識抗体と固相抗体を架橋して偽陽性を起こす。
２．ブロッキング剤等との非特異的反応：試薬中に含まれるブロッキング剤や保護タンパクと試料中の試料中の物質が反応して偽陽性を起こす。
３．標識酵素との非特異的反応：試料中に標識酵素と結合する物質が存在するとバックグラウンドが上昇する。
４．プロゾーン現象あるいはhigh dose huck：抗原濃度が測定レンジ以上の場合あるいは標識抗体濃度が装置の測定レンジを大きく上回る場合に偽陰性になる。抗原過剰域では抗原抗体複合体は可溶性となり、異常低値を示すことがある。
５．溶血の影響：試料の溶血が強いと判定の発色に影響し判定が難しい。
６．試料が便，尿などの場合：新鮮なものを使用する。強度の混濁尿や血球を含む試料は不適である。
７．試料の性状による影響：試料の粘性、特にタンパク濃度が高い場合（Ｍタンパク，クリオグロブリン陽性検体）等は反応速度が遅く、偽陰性となる。希釈試料を用い再試験する。乳び血清や免疫複合体の存在で非特異的散乱が発生することがある。
８．交差反応による偽陽性と偽陰性：リコンビナント抗原を使用する系で認められる。また、ＦＳＨ，ＴＳＨ，ＬＨでは交差反応により偽陽性になる。
９．使用薬物（アトロピン，カフェイン，アセトアミドフェノール，アセチルサリチル酸，アスコルビン酸など）の影響：尿中ｈＣＧ測定系では影響を受けて偽陽性となる。
１０．測定感度の試薬間格差：規定の判定時間では陰性であるが、時間を経ると陽性反応が出現する症例がある。

バーソンおよびヤーロウが放射性同位元素を抗原や抗体に標識して、ラジオイムノアッセイを完成させてから多くの年月が経過した。その感度の良さおよび特異性の高さから現在でも有用な方法として用いられている。一方で、この間に、酵素免疫測定法，蛍光免疫測定法，発光免疫測定法等、開発改良がなされている。

酵素免疫測定法は、放射性同位元素の代わりに、酵素を抗原や抗体に標識した方法で、酵素が持つ基質に対する触媒活性の高さから高感度な測定が可能となっている。

抗原抗体反応最終産物に励起光をパルス照射し、反応容器等から発生する蛍光が消光する時間が経過してから、この物質の蛍光を測定する時間分解蛍光測定法が開発された。近年、ユーロピウム錯体あるいはサマリウム錯体の蛍光消光時間の比較的長いものあるいは増感剤を必要としないものが開発され、この手法がさらに有効なものとなっている。

発光免疫測定法においては、イソルミノールあるいはアクリジニウムエステルを標識し発光量を測定する手法や、標識物質は酵素であるが基質に発光反応が得られるものを用いるペルオキシダーゼとルミノールとの組み合わせ、あるいは、リン酸基が外れると発光するＡＭＰＰＤ等の基質とアルカリホスファターゼとの組み合わせ、または、標識物質としてルシフェラーゼを用い、基質にルシフェリンを使用する組み合わせによる測定系が構築されている。

標識抗原，標識抗体，標識ＤＮＡ，標識ＲＮＡ、あるいはトレーサー等においては、蛍光体あるいは発光体を単体で被標識体に結合させることがなされるが、蛍光量あるいは発光量を大きくする目的で、数多くの蛍光体あるいは発光体を１個の被標識体に結合させる試みがなされている。複数の蛍光体あるいは発光体を複合体として、あるいはウシ血清アルブミン、ストレプトアビジンあるいはその他のタンパク質との複合体として、あるいは微小粒子表面に結合し、これを標識体として被標識体と結合させることがなされる。微小粒子は直径２マイクロメートル（μｍ）前後のゼラチン，ラテックスあるいはポリスチレンの粒子が用いられるのが一般的であり、蛍光体あるいは発光体の担体とされる。近年、さらに、微小な直径１００ナノメートル（ｎｍ）前後の粒子も開発されつつある。また、担体への蛍光体あるいは発光体の結合あるいは固相は、微小粒子と蛍光体あるいは発光体を緩衝液中で混合し電気的結合により結合されることが多い。

抗原抗体反応あるいは遺伝子検出法の場となる反応面はプラスチック，ガラス材の平板あるいは粒子が一般的であり、酸化鉄を内封する磁性粒子も用いられる。また、固相表面積の増大のため、フィルター，繊維織，多層紙，多孔性膜が使用されることがある。

反応面を有する個体が粒子である場合、これらは反応容器に入れられ試料あるいは検体、あるいは試薬と混合されるが、これら容器には、石英等の透明な鉱石とその人工石，ガラス、あるいはポリカーボネート材，ポリスチレン材，ポリビニル材等の化合品のセルあるいはマイクロタイタープレートなどが用いられる。

臨床検査免疫・血清分析項目を測定する方法は、抗原抗体反応を利用して蛍光体あるいは発光体を有する抗体あるいは抗原を標識体として反応を検知する手法が多い。このとき、色素，蛍光色素あるいは燐光色素等蛍光体あるいは発光体においては、これら物質を直接抗体あるいは抗原に標識しても抗原抗体反応が検出される。しかしながら、標識担体とされるものに複数の物質を結合し蛍光体あるいは発光体と担体との複合体を形成させ、これを抗原あるいは抗体に結合し標識抗体，抗原を作製するのであれば、１分子の抗原あるいは抗体に結合する蛍光体あるいは標識体の数が増加し、より強いシグナルを発生させることができる。ウシ血清アルブミン，キーホールリンペットヘモシアニンなどタンパク質，ポリスチレン，ポリプロピレンなどのプラスチック粒子，フェライト，シリカ，ゼラチンなどのその他の重合物、あるいは、ポリビニルアルコールなどの鎖状炭素化合物を用いる場合、これらが標識担体にあたる。

複数の蛍光体あるいは発光体をリポソーム，脂質膜あるいは中空プラスチックに内封し、これによりシグナルを増幅することもできる。この場合、リポソーム、脂質膜あるいは中空プラスチックが担体に相当する。

この担体は蛍光体あるいは発光体との複合体が形成され標識体として使用される。標識体は保存時に巨大な凝集塊を形成させることがある。また、複合体形成により熱安定性が著しく低下し容易に反応容器あるいは反応固相体に吸着しやすくなり、非特異的なバックグラウンドを大きくする要因ともなる。同様に、担体と標識物質との性状から、さらには、溶液中に含まれる成分から、物質の発色あるいは発光，蛍光が減縮される消光あるいはクエンチングが起こる。さらに、抗原，抗体に標識した場合、標識体分子が大きいため、抗原抗体反応を著しく低下させることにもなる。

蛍光法あるいは発光法による抗原抗体反応において、標識抗体あるいは標識抗原に結合される蛍光物質，発光物質あるいは酵素は、抗体あるいは抗原に１対１で結合されるのではなく、複数分子の蛍光物質，発光物質あるいは酵素が、抗体あるいは抗原１分子に結合されるのが一般的である。これによりシグナルを増幅して取り出そうとするものである。

蛍光物質，発光物質あるいは酵素は他のタンパク質あるいは支持体に複数結合され、これらのタンパク質あるいは支持体は、蛍光物質などの担体とされる。この担体は、以下の要件を備えていることが重要である。

１．担体は、分子量が低いながら表面積の大きいものがよく、比重は使用する緩衝液に近いものがよい。
２．担体は蛍光物質などを固相しやすく、かつ、蛍光物質などの蛍光発光性能を低減しないものがよい。
３．蛍光物質などの担体への標識の後においては、担体は反応容器あるいは他の粒子に吸着し難いものがよい。
４．担体は微小かつ光学的に励起光を遮らないサイズのものがよく、同様に、蛍光あるいは発光が光電子増倍管などに検出されるのを阻害しないものが良い。波長より短い物体がある場合、これによる光の遮断を受けることはないとされる。担体が使用する光の波長より短い場合、光は担体を通過しない場合においても減弱されることなくこれを通過する。また、担体による散乱がなく、ノイズの発生は最少となる。
５．さらに、担体は無色透明であり、励起光の通過を妨げないものがよい。また、励起光の照射により非特異的な蛍光，発光を発生しないものがよい。
６．担体は親水性が高く、分散性の高いものがよい。同様に、蛍光物質などの標識の後において親水性，分散性を高く維持されやすいものがよい。

測定が終始溶液状態で行われる方法として均一測定法（ホモジニアス法）が行われていたが、高感度測定が求められるに従い、抗原と抗体とを反応させ反応に関与しなかった遊離の標識抗体（または抗原）を洗浄操作により分離（Ｂ／Ｆ分離）したのち抗原抗体複合体を測定する方法、すなわち不均一測定法（ヘテロジニアス法）が広く利用されている。今日、蛍光色素とそのクエンチャー（消光色素）との組み合わせ、あるいは第１の蛍光物質から第２の蛍光物質へのエネルギー転移により励起により第２の物質の蛍光を検出するＦＲＥＴ法，酸素チャンネリングを適用するＬＯＣＩ法，金コロイド粒子の近接と凝集による異なる発色を測定する金粒子法等の開発により、高感度でのホモジニアス法が可能となってきた。

特許文献１には基板上に第１の金属粒子と第２の金属粒子とを互いに相互作用を生じさせない間隔を開けて配置し、第１の金属粒子と第１の金属粒子に結合された第１の物質とを有し第２の物質に結合された第２の金属粒子を基板に供給し、第１の物質と第２の物質との結合を介して第１の金属粒子と第２の金属粒子が結合し互いに相互作用を生じさせることにより第１の物質と第２の物質との結合を観察する方法が示された。特許文献２には、蛍光性でない色素を結合した被検体（抗原）との被検体色素複合体と被検体色素複合体に対する抗体であって被検体および色素の両者をエピトープとして認識する抗体と、被検体色素複合体と抗体との抗原抗体反応に基づく蛍光強度を測定することにより被検体の量を定量する方法が示された。

いずれの方法においても、特殊な金属粒子，基板，色素あるいは２つのエピトープを認識する抗体を準備する必要がある、系作製において特殊な技術を要するなど高感度を実現しながら特異的な反応を測定するには実用には遠く、もう一段の開発が必要である。

特開２００３−１４７６５号公報特開２００７−１７１２１３号公報

上記従来の技術は、測定が終始溶液状態で行われる方法として高感度測定を実現する均一測定法（ホモジニアス法）が求められるに従い、蛍光色素とそのクエンチャー（消光色素）との組み合わせ、あるいは第１の蛍光物質から第２の蛍光物質へのエネルギー転移により励起により第２の物質の蛍光を検出するＦＲＥＴ法，酸素チャンネリングを適用するＬＯＣＩ法，金コロイド粒子の近接と凝集による異なる発色を測定する金粒子法等の開発により、高感度でのホモジニアス法が可能をなってきた。

抗原抗体反応に基づく分析を不安定にする要因として異好抗体による影響，ブロッキング剤等との非特異的反応による偽陽性，標識酵素との非特異的反応によるバックグラウンド上昇，プロゾーン現象あるいはhigh dose huckの場合に偽陰性，高タンパク試料，乳び血清等試料の性状による影響による偽陰性あるいは偽陽性，リコンビナント抗原を用いる場合の交差反応による偽陽性と偽陰性，ＦＳＨ，ＴＳＨ，ＬＨでは交差反応により偽陽性、測定感度の試薬間格差による判定結果の不安定等があげられる。

また、干渉を示す蛍光あるいは発光は、生来、試料中に測定対象物が含まれていないにもかかわらず、あたかも試料中に測定対象物があるかのように分析測定が為され、誤った判断が為される可能性のある事を示し、さらには測定装置の最小検出限界を著しく低下させることにもなる。

この発明の目的は、蛍光測定法あるいは発光測定法による分析法あるいは装置において試料の抗原抗体反応に基づく分析測定を行う時、試料の性状あるいは試料に含まれる物質濃度の高低に関わらず、干渉光等非特異的な蛍光あるいは発光を検出あるいは測定することをなくすか効果的に除外し、高感度の分析測定を行おうとするものである。

また、この発明の目的は、蛍光測定法あるいは発光測定法による分析法あるいは装置において試料の抗原抗体反応に基づく分析測定を行う時、試料に含まれる被分析物質濃度の高低を、干渉光等非特異的な蛍光あるいは発光を検出あるいは測定することをなくすか効果的に除外し、迅速に分析測定を行おうとするものである。

さらには、この発明の目的は、蛍光測定法あるいは発光測定法による分析法あるいは装置において試料の抗原抗体反応に基づく分析測定を行う時、試料の性状あるいは試料に含まれる被分析物質以外の物質濃度の高低を効果的に推測し、抗原抗体反応に基づき被分析物質濃度を迅速かつ高感度に定量測定しようとするものである。

本発明において、蛍光測定法あるいは発光測定法による分析法あるいは装置において試料の抗原抗体反応に基づく分析測定を行う時、試料の性状あるいは試料に含まれる物質濃度の高低に関わらず、干渉光等非特異的な蛍光あるいは発光を検出あるいは測定することをなくすか効果的に除外し、高感度の分析測定を行うことができる。

また、本発明においては、蛍光測定法あるいは発光測定法による分析法あるいは装置において試料の抗原抗体反応に基づく分析測定を行う時、試料に含まれる被分析物質濃度の高低を、干渉光等非特異的な蛍光あるいは発光を検出あるいは測定することをなくすか効果的に除外し、迅速に分析測定を行ことができる。

さらには、本発明においては、蛍光測定法あるいは発光測定法による分析法あるいは装置において試料の抗原抗体反応に基づく分析測定を行う時、試料の性状あるいは試料に含まれる被分析物質以外の物質濃度の高低を効果的に推測し、抗原抗体反応に基づき被分析物質濃度を迅速かつ高感度に定量測定することができる。

（１）本発明によれば、蛍光測定法あるいは発光測定法による分析法あるいは装置において試料の抗原抗体反応に基づく分析測定を行う時、試料に含まれる被分析物質濃度の高低を、干渉光等非特異的な蛍光あるいは発光を検出あるいは測定することをなくすか効果的に除外し、迅速に分析測定を行ことができる。
（２）さらには、本発明によれば、蛍光測定法あるいは発光測定法による分析法あるいは装置において試料の抗原抗体反応に基づく分析測定を行う時、試料の性状あるいは試料に含まれる被分析物質以外の物質濃度の高低を効果的に推測し、抗原抗体反応に基づき被分析物質濃度を迅速かつ高感度に定量測定することができる。

分析装置の概観例。抗原抗体反応の例。反応容器から規定時間に反応液を採取し順次発光あるいは蛍光測定を進める場合の模式図。反応容器内の反応液を採取せずに規定時間ごとの発光あるいは蛍光測定を進める場合の参考模式図。反応経時曲線例（１）。低値サンプルを用いた場合の反応経時曲線例（２）。高値サンプルを用いた場合の反応経時曲線例（３）。

以下、図面を用いて本発明の実施例を説明する。

図１を参照して、免疫分析ユニット１０３の構成例につき説明する。図１において、免疫分析ユニットにより分析可能な分析項目に対応する試薬液が収容されている試薬容器２０１は、試薬位置づけ装置としての回転動作可能な試薬ディスク２０２上に複数個配列されている。恒温に維持された反応ディスク２０３は回転動作可能であり、反応ディスク２０３上には円周に沿って複数の反応位置があり、そこに反応容器保管位置２１９からの反応容器２０５が納められる。反応ディスク２０３は回転動作により反応容器２０５を反応容器設置位置２０４から試料吐出位置２２１，試薬添加位置２２２および反応液吸引位置２１２へと移送する。試料分注ピペッタ２０６は使い捨ての分注チップ２１０を結合している結合管を試料吸引位置２０７の上部から試料吐出位置２２１の上部まで水平方向に移動でき、また、それぞれの位置で上下移動も可能となっている。サンプルの吸引に先立ちチップ結合位置２１８にて試料分注ピペッタ２０６のチップ結合管の先端に使い捨ての分注チップ２１０を装着する。

試薬分注ピペッタ２０８は試薬ディスク２０２上の試薬吸引位置２０９の上部から試薬添加位置２２２の上部までの間を移動でき、また、それぞれの位置で上下移動も可能となっている。シッパ２１１は反応液吸引位置２１２の上部，緩衝液吸引位置２１３の上部，フローセル用の洗浄液吸引位置２１４の上部の間を移動でき、それぞれの位置で上下動も可能である。また、シッパ２１１はチューブを介して検出ユニット２１５内のフローセルまで、反応液を送る機能を持っている。把持部をｘ方向及びｙ方向に移動し得るチップ及び反応容器移送機構２１６は、使い捨ての分注チップ２１０をチップ保管位置２１７からチップ結合位置２１８へ、使い捨ての反応容器２０５を反応容器保管位置２１９から反応容器設置位置２０４へ、と移送する。試薬分注ピペッタ２０８およびシッパ２１１は、それぞれに対応する各洗浄位置でノズルの外壁が水で洗浄される。

次に免疫分析ユニット１０３における処理の流れを説明する。まずチップ及び反応容器移送機構２１６は使い捨ての分注チップ２１０をチップ結合位置２１８へ、次いで反応容器２０５を反応容器設置位置２０４へと移送する。試料容器１０８を保持しているラック１０７は分析すべきサンプルの入った試料容器１０８が試料吸引位置２０７に位置づけられるようにサブライン１１３上を搬送される。同時に試薬ディスク２０２はその分析に用いる試薬の入った試薬容器２０１が試薬吸引位置２０９に位置づけられるように回転する。同時に試薬分注ピペッタ２０８は、試薬吸引位置２０９の上部へ移動する。試薬吸引位置２０９で試薬分注ピペッタ２０８は下降し、ピペットノズル内に試薬を吸引する。次いで、試薬分注ピペッタ２０８は上昇し、ノズル洗浄位置へと移動する。ピペットノズルがノズル洗浄位置の上部へくると、洗浄槽から洗浄水が吹き出し、ピペットノズルの先端を洗浄する。

一方、試料分注ピペッタ２０６は試料吸引位置２０７の上部へ分注チップ２１０を移動し、ラック１０７上の試料容器１０８内に下降し、所定量のサンプルを吸引する。サンプル吸引後に分注チップは上昇し、試料吐出位置２２１まで移動する。そして、分注チップを下降して、分注チップ内に吸入保持していたサンプルを反応容器２０５内に吐出す。サンプルを吐出した後、試料分注ピペッタ２０６により分注チップを上昇してチップ廃棄位置２２０まで移動する。チップ廃棄位置２２０において試料分注ピペッタ２０６は結合管から使い捨て分注チップ２１０を除去して廃棄する。

反応に要する所定時間が経過した後、シッパ２１１は吸入用ノズルを緩衝液吸引位置２１３の上部に移動し、ノズルを下降し、ノズルを通してフローセルの方へ緩衝液を吸引する。その後、シッパ２１１のノズルの先端部をノズル洗浄位置で洗浄する。

次に、反応ディスク２０３は、反応容器２０５を反応液吸引位置２１２へ移送する。シッパ２１１は反応液吸引位置２１２において、ノズルを通してフローセルの方へ反応液を吸引する。反応液を吸引後、シッパ２１１はノズルを緩衝液吸引位置２１３へ移動し、緩衝液を吸引する。吸引された緩衝液と反応液はチューブを通じて検出ユニット２１５内のフローセルまで送られ、測定が行われる。それから、シッパ２１１はノズルを洗浄液吸引位置２１４に移動し、フローセル用の洗浄液を吸引し、その洗浄液により検出ユニット２１５内のフローセル内を洗浄する。

次に、図２を参照して分析ユニット１０４の構成例を説明する。図２において生化学分析ユニット１０４は、多数の試薬容器３１０を保持する試薬ディスク３０１Ａ，３１０Ｂと試薬分注ピペッタ３０２Ａ，３０２Ｂを備えた試薬供給系と、試料分注ピペッタ３０３を備えたサンプル供給系と、多数の反応容器３０４を保持する反応ディスク３０５を備えた反応部と、多波長光度計３０６とアナログ／デジタルコンバータ３０７を備えた測定系とを備える。

図２において、試料容器１０８を保持するラック１０７は搬送部１０２からサブライン１１５上の試料吸引位置３０８に搬送される。試料分注ピペッタ３０３は、試料容器１０８内のサンプルをピペットノズル４０１内に所定量吸引し、反応容器３０４の中に吐出する。

サンプル液が吐出分注された反応容器３０４は、恒温槽３０９により保温されている反応ディスク３０５の回転により第一試薬添加位置まで移動される。この時、試薬ディスク３０１Ａも回転動作によって試薬添加位置に来るサンプルの分析項目に該当する試薬容器３１０を試薬吸引位置に位置づけるように移動する。

そして、第一試薬添加位置まで移動された反応容器３０４には、試薬分注ピペッタ３０２Ａのピペットノズルに吸引された所定の第一試薬が加えられる。第一試薬の添加後の反応容器３０４は攪拌装置３１１の位置まで移動され、最初の攪拌が行われる。第二試薬の添加が必要な分析項目の場合は、さらに試薬分薬ピペット３０２Ｂにより第二試薬が添加され、内容物が撹拌される。

サンプルと試薬の混合された反応液を含む反応容器３０４は、光源からの光束を横切るように移送され、反応容器を透過した光が多波長光度計３０６に入射する。そして、反応容器３０４の内容物である反応液の吸光度が多波長光度計３０６により検知される。検知された吸光度信号は、アナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）コンバータ３０７及びインターフェイスを介してコンピュータからなる制御部３１２に供給され、サンプル中の測定対象の分析項目の濃度に変換される。分析測定が終了した反応容器３０４は、反応容器洗浄機構（図示せず）の位置まで移動され、反応容器洗浄機構により、反応容器内の反応液が排出された後に水で洗浄され、次の分析に供される。

以下に連続測定あるいは複数回の測定を可能とする手法を記載する。

図３においては、１つの反応容器から反応液を順次採取し、これを用いて発光値測定を行うことを示す。各発光量測定時において一定量の反応液を採取し発光測定を行うものであるが、容器内に残った反応液は反応が継続され最終回の発光測定時までインキュベータ内に保持される。反応液採取時は容器をインキュベータ内において実施しても良いしインキュベータから取り出して液採取を行っても良い。インキュベーション中の反応液の組成に偏りが生じる場合、液採取に際しては反応液を攪拌混合した後採取することが望ましい。

反応容器内での反応液を採取することなく経時的あるいは規定時間ごとの発光測定を行う場合の例を図４に示す。容器には開口部が設けられこれを通してサンプルあるいは試薬が容器に分注される。一方で容器の一部あるいは全部に測定対象物を捕捉する抗体，抗原あるいは他の物質が固相された部位があり、この箇所で反応が進行する。あるいは反応液中に固相粒子等がありこの粒子上で反応が進行する場合、必ずしも容器に固相箇所を設ける必要はない。図４では発光測定時に容器を傾けることにより固相個所が反応液から分離され、この箇所にて蛍光測定を行うことを示している。反応液中には固相箇所での反応に至っていない蛍光色素標識抗体等未反応の蛍光標識物質があり得、これらを含む液を用いて発光あるいは蛍光測定を行う場合、未反応の標識物質から生じる発光あるいは蛍光のため測定時のバックグラウンドが上昇する。このため、より感度の高い測定を実現しようとする場合の障害ともなり得、これらのバックグラウンドを極力除く手法をとることが望ましい。この発光測定と再び容器を元に戻して固相箇所を反応液に付け反応を継続させることを繰り返し行うことにより反応曲線を得ることができ、実施例３に示されるより迅速かつ正確な測定対象物の分析ができる。

発光測定回数は多ければ多いほうが良くリアルタイム測定を行うことが望まれるが、最終回の測定に加え１回でも途中の測定値を得るならばより迅速，正確さらにはリテストを実施しないですむよう確実な分析がなされ、疾病診断に大きなメリットを及ぼすことがわかる。

抗原抗体反応の経時シグナル曲線の例を図５に示す。一般的に発光値あるいはシグナルは反応の経過にともない増大するが、一定時間を経過すると発光値の増加は小さなものとなる。この時点で反応終了とし、発光値を測定しこの値から当該の被検体中の抗原あるいは抗体が含まれていると判断するか、含まれていないと判断させる。このときの基準値あるいは境界値をカットオフ値と称し、これを上回る発光値が得られた場合は陽性、下回る場合は陰性と判定される（定性測定）。このカットオフ値付近をグレーゾーンとし、ここでは判定不可とし再測定を求める場合もある。また、発光値を検量線と照らし合わせ測定対象物の量を定量的に記載する場合もある（定量測定）。図５の例においては反応時間１５分時に抗原抗体反応を終了させ発光値を計測し、カットオフ値を上回るか下回るかの定性測定、あるいは発光値を検量線に照らし合わせ測定対象物がどれだけ含まれるかの読値を得る。Ａはカットオフ値を上回らず陰性と判定され、Ｂ，ＣおよびＤは陽性と判定される。あるいは、検量線から読値を得て診断に供される。

従来の１５分あるいは反応終了時に反応を終了させ発光値を１回採取する方法に比較した、経時的に発光値を複数回得る場合の利点を例示した。初回あるいは５分時の発光値測定を行うことによりＣおよびＤの試料ではカットオフ値を上回っており、Ｃ，Ｄの試料では陽性と判定されることがわかる。一方、ＡおよびＢの試料では発光値測定あるいは測光は連続して行えることが望ましいが、反応過程の中で２回あるいは複数回行えることで、その利点は大きくなる。

以下に陰性あるいは弱陽性試料について経時的に発光値を得る場合を示す。１５分時においてＥは陰性であり、ＦとＧは陽性と判定される。Ｇにおいては１０分時においても陽性と判定され最終時である１５分時を待つことなく、早期の結果判定が可能となった。Ｆにおいては１５分時に陽性であることが判定できるが、５分時と１０分時の測定を合わせ１５分時には陽性となることが推定もでき、早期の予想を出すことは可能である。また、１５分時の結果は５分時と１０分時の結果からの裏打ちできるものであり、最終判定結果はより確実なものとなった。

次に比較的測定対象物が中程度から多量に含まれる場合を図６に示す。Ｈ，Ｉ，Ｇはいずれも５分時に陽性と判定され試験開始後早期に判定結果を知ることができた。この結果はより迅速に医師に伝えることができ、たとえば患者が心臓病を患い心梗塞等の迅速な処置が必要な場合、より早期の的確な医療開始により一命を取りとめる可能性は高くなる。

抗原抗体反応あるいはその分析装置においては、ゾーン現象，プロゾーン，ポストゾーンあるいはhigh dose huckと呼ばれる測定対象物が多く含まれる場合、あるいは蛍光色素等の標識物が多い、さらには抗原抗体反応の補足抗体と標識抗体の比率のバランスが悪い場合等において実際はサンプル中の測定対象物が多量であるにもかかわらず小さな発光値を示し極端な場合、陰性と判定される可能性がある例もある。こうした場合、反応初期の発光値を知ることで陽性判定が可能でありここでの発光値が測定対象物量を最終測定時より的確に反映していることがある。図７においては、１５分時の最終測定時はその発光測定値はＨ＝Ｊ＞Ｉと読み取れ検量線からもＨ＝Ｊ＞Ｉと読み取れＨのサンプルにはＩのサンプルよりも多くの測定対象物が含まれ高値のサンプルであると判定される。しかしながら、５分時あるいは１０分時の発光値を見るとＪ＞Ｉ＞Ｈと読み取れＪのサンプルに最も多くの測定対象物が含まれることがわかった。

１０３免疫分析ユニット
２０１試薬容器
２０２試薬ディスク
２０３反応ディスク
２０５反応容器
２０６試料分注ピペッタ
２０８試薬分注ピペッタ
２１０分注チップ
２１１シッパ

Claims

発光標識を測定対象物に直接あるいは間接的に結合するための反応容器と、該発光標識が結合された測定対象物から発する光を検出する測定機構と、を備えた自動分析装置において、
前記反応容器内の前記発光標識が結合された測定対象物を時系列に複数回、前記測定機構に移動させる移動機構を備えたことを特徴とする自動分析装置。
請求項１記載の自動分析装置において、
前記測定機構により、時系列に測定した結果に基づき、抗原抗体反応を経時的に算出する算出機構を備えたことを特徴とする自動分析装置。
請求項１記載の自動分析装置において、
担体上にて蛍光体あるいは発光体を標識した抗原，抗体あるいは被標識体を結合した抗原抗体結合物を生成させ、反応容器内の担体上にない抗原抗体結合の未生成の蛍光体あるいは発光体を除去する除去機構を備えたことを特徴とする自動分析装置。
請求項１〜３のいずれかに記載の自動分析装置において、
前記移動機構は、前記反応容器内の反応液を経時的に一部ずつ採取することを特徴とする自動分析装置。
請求項１〜３のいずれかに記載の自動分析装置において、
反応容器内あるいは表面にある抗原抗体結合の生成される担体を一部に集合させ、単体の集合部とそれ以外の反応溶液部において蛍光体あるいは発光体の濃度を変化させることにより抗原抗体反応量を定量測定し、これを反応の開始時から複数回にわたり検出することにより、抗原抗体反応を順次定量測定することを特徴とする自動分析装置。