JP2002333447A - ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 被験者に苦痛を与えず、特別の装置を必要と
せずに、安価にヘリコバクター・ピロリの感染が診断で
き、交差反応性がなく特異性に優れ、優れた感度を有す
る検査方法を提供する。 【解決手段】 消化管排泄物中に存在するヘリコバクタ
ー・ピロリのネイティブなカタラーゼを、ヘリコバクタ
ー・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクロ
ーナル抗体を用いて検出することにより、ヘリコバクタ
ー・ピロリへの感染を判定する検査方法であって、前記
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２
Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２８）により産生されたモ
ノクローナル抗体である検査方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘリコバクター・
ピロリへの感染を判定する検査方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏ
ｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）はヒトの胃粘膜に見られ
る細菌である。ヘリコバクター・ピロリへの感染率は、
社会経済状態と密接に関連しており、発展途上国ほど感
染率が高く、先進国ほど感染率が低くなる傾向がある。
しかしながら、日本人の感染率は先進国の中でも際立っ
て高く、４０歳以上では８０％の人が感染しているとも
言われている。近年、ヘリコバクター・ピロリが胃潰
瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎、更には胃癌等のさまざま
な胃、十二指腸疾患の原因となりうることが明らかにさ
れてきた。

【０００３】ヘリコバクター・ピロリを除菌することに
より、これらの疾患に罹患する危険性を低減できること
が明らかになり、このため、ヘリコバクター・ピロリの
除菌対象疾患について国際的な議論がなされた。現在で
は胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃悪性リンパ腫、早期胃癌切
除後胃等が除菌の適応対象疾患として認知されている。

【０００４】ヘリコバクター・ピロリの除菌療法が胃、
十二指腸疾患の新しい治療法として認知されるのに伴
い、我が国でも日本消化器病学会により治験ガイドライ
ンが作成され、ヘリコバクター・ピロリ感染の存在診断
と除菌判定法が示された（日本消化器病学会雑誌、９６
巻、１９９−２０７、１９９９年）。上記治験ガイドラ
インでは、存在診断は侵襲的検査法である胃部生検組織
の培養、鏡検、ウレアーゼ試験にて行い、除菌判定は胃
部生検組織の培養と鏡検及び非侵襲的検査法である尿素
呼気試験を必須とすることが示されている。また、被験
者が小児である等の特殊な場合、血中抗ヘリコバクター
・ピロリ抗体検査と存在診断とを併用して判定を行うこ
とが示されている。

【０００５】しかし、これらのヘリコバクター・ピロリ
感染の検査法には以下の問題点がある。侵襲的検査法
は、胃内視鏡の挿入及び生検等により被験者が多大な苦
痛を強いられることとなる。非侵襲的検査法では、被験
者の苦痛は大幅に改善されるが、尿素呼気試験では、検
査前の絶食が必要である。また、尿素呼気試験は、マス
スペクトルや赤外分光高度計等の装置が必要であり、特
定の施設でしか実施できず、コストも高くなるという欠
点がある。抗体検査は、除菌後も血中抗体価が長期にわ
たり高値であるので、除菌判定には適さない。従ってこ
れらの検査に代わる、非侵襲的で且つヘリコバクター・
ピロリ感染を直接、特異的に精度良く検出できる検査方
法が望まれている。

【０００６】従来、消化管感染菌の直接検査法として消
化管排泄物、特に糞便からの感染菌の選択培地を用いた
分離培養が行われてきた。しかし、ヘリコバクター・ピ
ロリに関しては数多くの試みにも拘らず、糞便から分離
培養された報告はほとんどない。その理由として、ヘリ
コバクター・ピロリはｉｎ ｖｉｔｒｏで、低温、栄養
欠乏、酸素欠乏等のように環境条件が悪化すると、通常
のらせん状体から培養不能な球状体へ形態変化すること
から、下部消化管においても分離培養不能な球状体に変
化していることが考えられる。

【０００７】一方、抗原抗体反応に基づく免疫学的方法
による糞便からのヘリコバクター・ピロリの直接検出に
関して、ヘリコバクター・ピロリに対するポリクローナ
ル抗体を用いたイムノアッセイにより糞便等の排泄物検
体中のヘリコバクター・ピロリを検出する方法が報告さ
れている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３３
巻、２１６２−２１６５、１９９５年、特開平１０−１
０１２８号公報（特許第３０４３９９９号））。

【０００８】しかし、ポリクローナル抗体は、一般に交
差反応性があり、特異性が劣るうえ、抗血清のロット毎
に抗体価や特異性が変動する欠点があるので、ポリクロ
ーナル抗体を用いた診断薬の製造は、本質的に品質管理
が難しいという問題点がある。現実に、特許第３０４３
９９９号の特許権者であるメリディアン社により製造さ
れたポリクローナル抗体を用いた糞便中ヘリコバクター
・ピロリ抗原検出キット「ＨｐＳＡ」に関しては、偽陰
性の出現や特異性の低さが問題となっている（Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｔｒｉｂｕｎｅ、４−５、１９９９年６月３日
号；Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、９４
巻、１８３０−１８３３、１９９９年）。

【０００９】特開平１０−１０１２８号公報には、ヘリ
コバクター・ピロリは菌株の変異を起こすので、単一の
抗原のみとしか反応できないモノクローナル抗体は、ヘ
リコバクター・ピロリの検出には不適であり、逆に、多
様な抗原やエピトープに対応し得る点で、ポリクローナ
ル抗体の方がヘリコバクター・ピロリの検出には適して
いると記載されている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、被験者に苦痛を与えず、特別の装置を必要とせず
に、安価にヘリコバクター・ピロリの感染が診断でき、
交差反応性がなく特異性に優れ、優れた感度を有する検
査方法を提供することを目的とするものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、消化管排泄物
中に存在するヘリコバクター・ピロリのネイティブなカ
タラーゼを、ヘリコバクター・ピロリのネイティブなカ
タラーゼに対するモノクローナル抗体を用いて検出する
ことにより、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定す
る検査方法であって、前記モノクローナル抗体は、ハイ
ブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２９）及び
／又はハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１８３２
８）により産生されたモノクローナル抗体である検査方
法である。以下に本発明を詳述する。

【００１２】従来、ヘリコバクター・ピロリの菌体は下
部消化管では破砕された状態にあり、そのタンパク質は
消化管中でタンパク質分解酵素により分解されてしまう
と考えられていた。しかしながら、本発明者は、上記課
題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、驚くべきこ
とに、ヘリコバクター・ピロリ感染者の糞便中にはヘリ
コバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼが存在
していることを見出し、これがヘリコバクター・ピロリ
への感染を判定するための指標になり得ることに想到
し、本発明を完成するに至った。

【００１３】本発明の検査方法は、消化管排泄物中に存
在するヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラ
ーゼを検出するものである。上記消化管排泄物としては
特に限定されないが、採取が容易で被験者への負担が少
ない点で、糞便が検体として好適に用いられる。

【００１４】上記Ｎａｔｉｖｅなカタラーゼとは、ほぼ
生理的な条件でとっている固有の構造を保持しているカ
タラーゼを指し、全てのサブユニットを有し、かつ、活
性を有しているカタラーゼであるが、本発明においては
ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２９）
及び／又はハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１
８３２８）により産生されたモノクローナル抗体が認識
するエピトープが保持されているものであれば特に限定
されずに検出することができる。

【００１５】本発明の検査方法では、ヘリコバクター・
ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼに対するモノクロー
ナル抗体が用いられる。本発明で用いられるモノクロー
ナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭＰ−１
８３２９）により産生されたモノクローナル抗体（以
下、モノクローナル抗体３１Ａ３ともいう）及びハイブ
リドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２８）により
産生されたモノクローナル抗体（以下、モノクローナル
抗体８２Ａ３ともいう）であり、モノクローナル抗体３
１Ａ３及びモノクローナル抗体８２Ａ３には、これらの
分解物であるＦ（ａｂ′）_２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ等も含
まれる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が
併用されてもよい。

【００１６】本発明で用いられるモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８
３２９）及びハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−
１８３２８）は、平成１３年５月１０日に独立行政法人
産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城
県つくば市東１丁目１番１号中央第６）に寄託されたも
のである。ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１
８３２９）及びハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ
−１８３２８）の製造方法は実施例１において示すとお
りである。

【００１７】モノクローナル抗体３１Ａ３とモノクロー
ナル抗体８２Ａ３とは、ヘリコバクター・ピロリのＮａ
ｔｉｖｅなカタラーゼを抗原とするものである。

【００１８】本発明者らが、モノクローナル抗体３１Ａ
３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３をそれぞれ用い
てヘリコバクター・ピロリの菌体破砕物に対して抗体固
定アフィニティークロマトグラフィーを行ったところ、
ヘリコバクター・ピロリの菌体破砕物に含まれていた２
７０ｋＤａの分子量を有するタンパク質が検出された。
このタンパク質に対してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行ったところ５９ｋＤａの分子量を有する
単一のバンドが検出された。また、このタンパク質のＮ
末端のアミノ酸配列を調べたところヘリコバクター・ピ
ロリのカタラーゼのアミノ酸配列と一致した。ヘリコバ
クター・ピロリのカタラーゼは２００ｋＤａの分子量を
有し、５０ｋＤａの分子量を有するサブユニットが４個
集合した４量体の構造を有することが知られている
（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１），１
３７，５７−６１）。

【００１９】以上の結果より、モノクローナル抗体３１
Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３が検出したタ
ンパク質は４個のサブユニットを有するヘリコバクター
・ピロリのカタラーゼであると同定され、上記の各モノ
クローナル抗体は、４個のサブユニットを有するカタラ
ーゼを認識するものであることが明らかとなった。

【００２０】上記抗体固定アフィニティークロマトグラ
フィーで検出されたカタラーゼの活性を測定したとこ
ろ、活性を有しており、このカタラーゼがいわゆるＮａ
ｔｉｖｅな酵素であったことも判明した。モノクローナ
ル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３は
いずれも、解離したカタラーゼのサブユニットとは反応
しなかった。

【００２１】ヘリコバクター・ピロリの菌体中の総タン
パク質のうちカタラーゼの占める割合は、Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１），１３７，５７−６
１に記載されたカタラーゼの精製過程における比活性の
上昇度から概算して、重量換算でたかだか０．５％であ
る。この点に鑑みると、モノクローナル抗体３１Ａ３、
及び、モノクローナル抗体８２Ａ３が、４個のサブユニ
ットを有するカタラーゼを認識するものであったという
ことは驚くべきことであり、到底予見しえない事項であ
った。

【００２２】カタラーゼは異なる種の間でも極めてよく
保存されており、ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼ
も他の細菌のカタラーゼと相同性が高いことが知られて
いる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９６），１７８
（２３），６９６０−６９６７）。しかしながら、モノ
クローナル抗体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８
２Ａ３は、ヘリコバクター・ピロリ以外の細菌のカタラ
ーゼとは全く反応しなかった。

【００２３】一方、ヘリコバクター・ピロリには多様な
変異株が存在することが知られているが（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６），２
０，８３３−８４２）、驚くべきことに、実施例３に示
すとおり、モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノク
ローナル抗体８２Ａ３は、いずれのヘリコバクター・ピ
ロリに対しても良好に反応した。

【００２４】モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノ
クローナル抗体８２Ａ３がヘリコバクター・ピロリの多
様な変異株に対して良好に反応することに鑑みると、こ
れらのモノクローナル抗体が認識するエピトープは変異
株同士のカタラーゼの間で極めてよく保存されている部
位であると思われる。

【００２５】以下に詳述するように、モノクローナル抗
体３１Ａ３、及び、モノクローナル抗体８２Ａ３は、糞
便を検体として、極めて高い精度でヘリコバクター・ピ
ロリへの感染の有無を判定することができるものであ
る。

【００２６】モノクローナル抗体３１Ａ３、及び、モノ
クローナル抗体８２Ａ３を用いて、糞便を検体として免
疫学的測定を行ったところ、上記の各モノクローナル抗
体はヘリコバクター・ピロリに感染している被験者の糞
便のみと反応した。これにより、ヘリコバクター・ピロ
リに感染している被験者の糞便中には、４個のサブユニ
ットを有するヘリコバクター・ピロリのカタラーゼが存
在していることが明らかになった。糞便中に存在するヘ
リコバクター・ピロリのカタラーゼがサブユニットごと
に解離したものではなく、４個のサブユニットを保有す
るものであるということは今まで全く知られておらず、
このことは、通常タンパク質は消化管中でタンパク質分
解酵素により分解されてしまうことに鑑みても全く驚く
べきことである。

【００２７】また、ヘリコバクター・ピロリの感染者の
糞便を試料として、モノクローナル抗体３１Ａ３、及
び、モノクローナル抗体８２Ａ３を固定したカラムを作
製し、アフィニティークロマトグラフィーを行い、その
溶出画分について、ＥＬＩＳＡとカタラーゼ活性測定を
行ったところ、カタラーゼ活性と抗原性とは一致した。

【００２８】以上のことから、ヘリコバクター・ピロリ
の感染者の糞便中には４個のサブユニットを有し、カタ
ラーゼ活性も有するＮａｔｉｖｅなカタラーゼが含まれ
ることがわかった。ヘリコバクター・ピロリのカタラー
ゼが消化管内で消化されずに、活性を有するＮａｔｉｖ
ｅな酵素として排出され、糞便中に存在していたという
ことは全く予想できないことであった。

【００２９】モノクローナル抗体３１Ａ３及びモノクロ
ーナル抗体８２Ａ３を大量に調製する方法としては特に
限定されず、例えば、あらかじめプリスタンを投与した
マウスの腹腔にハイブリドーマを移植して、回収した腹
水から得る方法等を挙げることができる。腹水中のモノ
クローナル抗体は、プロテインＡやプロテインＧカラム
等を使用する公知の方法等により精製することができ
る。

【００３０】本発明で用いられるハイブリドーマ３１Ａ
３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２９）、ハイブリドーマ８２
Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２８）、モノクローナル抗
体３１Ａ３及びモノクローナル抗体８２Ａ３もまた、本
発明の１つである。

【００３１】本発明の検査方法としては、例えば、酵素
免疫測定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法
（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグ
ラフィー法等を挙げることができる。上記の各種検査方
法は、競合法やサンドイッチ法等により、標識剤で標識
された抗原又は抗体を用い、目的とする抗原又は抗体を
測定することができるものである。上記の各種検査方法
のなかでも、ＥＬＩＳＡ法及びイムノクロマトグラフィ
ー法が好ましい。

【００３２】上記競合法は、例えば、検体中のヘリコバ
クター・ピロリのカタラーゼと、既知の量の標識された
ヘリコバクター・ピロリのカタラーゼとの、モノクロー
ナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ
３に対する結合の量的な競合反応によるものである。上
記で例示した競合法においては、ヘリコバクター・ピロ
リのカタラーゼを含む検体液に、担体上に保持された一
定量の抗体を加え、更に標識剤で標識した一定量のヘリ
コバクター・ピロリのカタラーゼを加える。その後、担
体上に保持された標識剤又は担体上に保持されなかった
標識剤の活性を測定する。この際、抗体と標識された抗
原の添加はほぼ同時に行うことが好ましい。

【００３３】上記サンドイッチ法は、例えば、固相化さ
れたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクロー
ナル抗体８２Ａ３と、標識剤で標識されたこれらのモノ
クローナル抗体とで、検体中のヘリコバクター・ピロリ
のカタラーゼをサンドイッチするものであり、酵素等の
標識剤に対する基質等を加え発色等させることにより、
検体中のヘリコバクター・ピロリのカタラーゼを検出す
るものである。

【００３４】上記標識剤としては、^１２５Ｉ等の放射性
同位元素（以下、ＲＩと記す）、酵素、酵素基質、発光
物質、蛍光物質、ビオチン、着色物質等を挙げることが
できる。これら標識剤と抗原又は抗体との結合には、マ
レイミド法［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６），７
９，２３３］、活性化ビオチン法［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．（１９７８），１００，３５８５］、疎水
結合法等が用いられる。

【００３５】上記酵素としては、例えば、ペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ等を挙げることができる。
この際用いる基質としては、選択した酵素に適したもの
を選べばよく、例えば、ＡＢＴＳ、ルミノール−Ｈ_２Ｏ
_２、ｏ−フェニレンジアミン−Ｈ_２Ｏ_２（ペルオキシダ
ーゼ用）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、メチルウ
ンベリフェリルホスフェート、３−（２'−スピロアダ
マンタン）−４−メトキシ−４−（３"−ホスホリルオ
キシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（アルカリホス
ファターゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トース、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトー
ス（β−ガラクトシダーゼ用）等を挙げることができ
る。

【００３６】上記測定は、４〜４０℃で１分〜１８時間
反応させ、生じた発色、蛍光量、発光量又は着色量を測
定することにより行うことができ、他にも、４〜４０℃
の範囲で加温しながら行ういわゆるレート法を採用して
もよい。

【００３７】上記抗原又は抗体への放射標識は、市販さ
れているボルトンハンター試薬により容易に行うことが
できる。例えば、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に
溶かした抗原又は抗体溶液にボルトンハンター試薬を加
え１〜２時間後に、Ｇ−２５の脱塩カラム等を用いて未
反応のボルトンハンター試薬を除去することにより実施
することができる。この他、クロラミンＴ法やヨードジ
ン法等を採用することにより容易に^１２５Ｉによる放射
標識を行うことができる。

【００３８】上記発光物質としては、例えば、イソルミ
ノールやアクリジンエステル等を挙げることができ、上
記蛍光物質としては、例えば、フルオレセインやローダ
ミン等を挙げることができる。この際、標識の方法は活
性化エステル法やイソシアネート法を採用することによ
り容易に行うことができる（「酵素免疫測定法」医学書
院、１９８７年）。上記着色物質としては、例えば、着
色ラテックス粒子、金コロイド等を挙げることができ
る。

【００３９】本発明の検査方法として、上記競合法を実
施するには、例えば、未知量のヘリコバクター・ピロリ
のカタラーゼを含有する検体を、公知の手段で物理的又
は化学的にモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノ
クローナル抗体８２Ａ３を結合させた固相に加えて反応
させる。また、同時に標識剤で標識したヘリコバクター
・ピロリのカタラーゼの一定量を加えて反応させる。

【００４０】本発明の検査方法として、上記サンドイッ
チ法を実施するには、例えば、未知量のヘリコバクター
・ピロリのカタラーゼを含有する検体を、公知の手段で
物理的又は化学的にモノクローナル抗体３１Ａ３及び／
又はモノクローナル抗体８２Ａ３を結合させた固相に加
えて反応させる。その後標識剤で標識したモノクローナ
ル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３
を加えて反応させる。

【００４１】次いで、いずれの方法においても、必要な
場合には固相をよく洗浄した後で、固相上に結合してい
る標識剤の活性を測定する。上記標識剤がＲＩである場
合、ウェル・カウンター又は液体シンチレーション・カ
ウンターを用いて測定する。標識剤が酵素である場合、
基質を加えて放置し、比色法又は蛍光法により酵素活性
を測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質、着色物質で
あっても、それぞれ公知の方法に従って測定する。

【００４２】本発明の検査方法は、モノクローナル抗体
３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用い
るものであるので、ヘリコバクター・ピロリのカタラー
ゼに特異的に存在するエピトープを認識することがで
き、他の物質を、交差反応を原因として誤って検出して
しまうことがなく、特異性が極めて高い測定を行うこと
ができるという極めて優れた特色を有する。

【００４３】本発明の検査方法を実施するためには、モ
ノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗
体８２Ａ３を構成成分とする検査試薬を用いることがで
きる。このような検査試薬もまた、本発明の１つであ
る。上記検査試薬において用いられるモノクローナル抗
体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３とし
ては、それらの分解物であるＦ（ａｂ′）_２、Ｆａ
ｂ′、Ｆａｂ等であってもよい。これらは単独で用いら
れてもよく、２種以上が併用されてもよい。

【００４４】上記検査試薬では、モノクローナル抗体３
１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３はあらか
じめ固相化されていてもよく、また、モノクローナル抗
体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３はあ
らかじめ上記標識剤で標識されていてもよい。

【００４５】上記検査試薬において用いる固相としては
特に限定されず、例えば、ポリスチレン等のポリマー、
ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノク
ロマトグラフィー用濾紙、グラスフィルター等の不溶性
担体を挙げることができる。

【００４６】上記検査試薬は、消化管排泄物中に存在す
るヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼ
を、ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラー
ゼに対するモノクローナル抗体を用いて検出することに
より、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定する検査
キットの１構成品として用いられてもよい。このような
検査キットもまた、本発明の１つである。上記検査キッ
トに含まれる他の成分としては特に限定されず、例え
ば、標識に用いる酵素、その基質、放射性同位元素、発
光物質、蛍光物質、着色物質、緩衝液、プレート等を挙
げることができ、これらとしては上述のものを用いるこ
とができる。

【００４７】上記検査キットの形態としては特に限定さ
れないが、迅速かつ簡便に診断を行うためには検査キッ
トの構成成分が一体となった一体型の検査キットである
ことが好ましい。上記一体型の検査キットとしては特に
限定されず、例えば、カセット型、カートリッジ型等を
挙げることができる。

【００４８】上記カセット型の態様としては、例えば、
イムノクロマトグラフィー法を用い、反応カセット内に
メンブレンが収納されており、そのメンブレン上の一端
（下流側）にはモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又は
モノクローナル抗体８２Ａ３が固相化されており、メン
ブレン上の逆の一端（上流側）には、展開液が装着され
ており、その近傍の下流側には、上記標識剤の基質が添
加されたパッドが配置されており、メンブレンの中間部
には上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ
３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が添加された
パッドが配置されている態様等を挙げることができる。

【００４９】上記に例示したカセット型の態様を有する
検査キットを使用する場合、上記標識剤で標識されたモ
ノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗
体８２Ａ３が添加されたパッド上に検体を添加し、検体
に含まれるヘリコバクター・ピロリのカタラーゼと上記
標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／
又はモノクローナル抗体８２Ａ３との結合体を形成した
後、上記展開液を展開させると、形成された結合体はモ
ノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗
体８２Ａ３が固相化されている箇所まで移送され、そこ
でヘリコバクター・ピロリのカタラーゼと上記標識剤で
標識されたモノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノ
クローナル抗体８２Ａ３と固相化されたモノクローナル
抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３と
の複合体が形成される。次いで、上記標識剤と上記基質
が反応し、発色等する。この発色等を感知することによ
って、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定すること
ができる。

【００５０】検体を充分な量の展開液で希釈してからメ
ンブレン上に滴下する態様を採用する場合は、あらかじ
めメンブレン上に展開液を装着しておかなくともよい。
また、上記標識剤として着色ラテックス粒子等の着色物
質を用いる場合は、基質は不要であり、モノクローナル
抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が
固相化されている箇所で上記複合体が形成されたか否か
は、着色物質による着色により判断される。

【００５１】上記カートリッジ型の態様としては、例え
ば、反応が上記競合法である場合には、複数のウェルを
有するカートリッジであり、（ａ）モノクローナル抗体
３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３が収納
されたウェル、（ｂ）上記標識剤で標識されたヘリコバ
クター・ピロリ等を含む液状試薬（例：バッファー溶
液）が収納されたウェル、（ｃ）上記標識剤の基質を含
む液状試薬（例：バッファー溶液）が収納されたウェ
ル、が一体的に形成されてなるカートリッジ等を挙げる
ことができ、反応がサンドイッチ法である場合には、複
数のウェルを有するカートリッジであり、（ａ）モノク
ローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８
２Ａ３が固相化された不溶性担体が収納されたウェル、
（ｂ）上記標識剤で標識されたモノクローナル抗体３１
Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を含む液状
試薬（例：バッファー溶液）が収納されたウェル、
（ｃ）上記標識剤の基質を含む液状試薬（例：バッファ
ー溶液）が収納されたウェル、が一体的に形成されてな
るカートリッジ等を挙げることができる。

【００５２】上記に例示したカートリッジ型の検査キッ
トを使用する場合は、通常、競合法やサンドイッチ法を
実施する際と同様に、反応及び測定を行うことができ
る。上記検査キットは、上記競合法と上記サンドイッチ
法のいずれの方法を実施するものであってもよいが、上
記サンドイッチ法を実施するものであることが好まし
い。上記サンドイッチ法は、感度が高く、反応時間が短
くてすみ、精度に優れるという利点を有する。上記サン
ドイッチ法としてイムノクロマトグラフィー法を用いる
と、試験操作が簡便で、結果の判定も目視で容易に行う
ことのできるキットを作製することができる。また、Ｅ
ＬＩＳＡとして上記サンドイッチ法を用いると、測定対
象物質の量に依存して酵素反応生成物が生じるので、ヘ
リコバクター・ピロリへの感染が陽性である場合の発色
等を目視で確認できるような系の設定が容易である。

【００５３】上記検査キットは、除菌治療前に感染の有
無を調べるために用いられてもよく、除菌治療後にその
成否の判定を行うために用いられてもよい。上記検査キ
ットは、モノクローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノク
ローナル抗体８２Ａ３を用いるためロット毎の差がな
く、検出感度が高く、偽陰性や偽陽性の問題を生じな
い。

【００５４】本発明によれば、ヘリコバクター・ピロリ
のＮａｔｉｖｅなカタラーゼを抗原とするモノクローナ
ル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３
を用いることによって、検体中の他の物質による影響を
排除できるので、極めて高感度かつ特異的に、ヘリコバ
クター・ピロリの存在を検出することができる。また、
ヘリコバクター・ピロリのＮａｔｉｖｅなカタラーゼに
対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマが樹立さ
れたことにより、同一のモノクローナル抗体を半永久的
に製造することが可能となる。モノクローナル抗体３１
Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８２Ａ３を用いた検
査キットは、消化管排泄物を検体とするので、被験者に
苦痛を与えることなく、簡便かつ効率よくヘリコバクタ
ー・ピロリ感染を検出することができる。また、モノク
ローナル抗体３１Ａ３及び／又はモノクローナル抗体８
２Ａ３を用いた検査キットは、１種のみのモノクローナ
ル抗体を用いる場合であっても、極めて優れた精度を呈
し、ロット毎の差がなく、安定しているので、常に特異
的かつ精度良くヘリコバクター・ピロリ感染を検出する
ことができる。また、本発明の検査キットは、測定が簡
便であり、医療現場で非常に有用である。

【００５５】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００５６】（実施例１） ［モノクローナル抗体の作製］ （１）ヘリコバクター・ピロリ球状菌体懸濁液（免疫
原）の調製 ５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョ
ン寒天培地（ディフコ社製）上にヘリコバクター・ピロ
リ（ＡＴＣＣ４３５０４）を筋状に画線した。このプレ
ートを３７℃微好気性環境下にて３〜４日培養後、更に
３７℃嫌気性環境下にて７日間インキュベートし、球状
化させた。得られたコロニーを白金耳等でかきとり、リ
ン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に懸濁した。４℃にて、
１００００×ｇで１０分間遠心分離したヘリコバクター
・ピロリの菌体を０．５％ホルマリンに懸濁し、４℃に
て４日間放置して不活化した。その後、ＰＢＳに懸濁
し、４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離する
操作を３回繰り返し、上記菌体を洗浄した後、ＰＢＳに
懸濁した。

【００５７】（２）ヘリコバクター・ピロリ球状菌体破
砕物（免疫原）の調製 （１）で得られた菌体懸濁液を、超音波破砕機（セイコ
ー電子工業社製、Ｍｏｄｅｌ ７２５０）を用いて、ｏ
ｕｔｐｕｔ ３、５０％ ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅの条件
にて１０分間超音波処理して菌体を破砕した。

【００５８】（３）免疫及び細胞融合 （１）、（２）にて調製した免疫原（ヘリコバクター・
ピロリ球状菌体懸濁液又はヘリコバクター・ピロリ球状
菌体破砕物）とＦｒｅｕｎｄのコンプリートアジュバン
ト（カルビオケム社製）を当量混合し、オイルエマルジ
ョンとした。これをＢＡＬＢ／ｃＡマウス（日本クレア
社製、６週齢、雌）の背部皮下に０．２ｍＬずつ投与し
た。初回免疫後７日目と１４日目に追加免疫を行い、更
に細胞融合３日前に上記免疫原を０．２ｍＬずつ腹腔内
に投与した。最終免疫から３日目のマウス脾細胞を摘出
し、骨髄腫細胞（Ｐ３ｘ６３．Ａｇ８．６５３株、ＲＣ
Ｂ０１４６、理研ジーンバンク）と１０：１の割合で混
合し、５０％ポリエチレングリコール４０００を用いて
融合した後、ＨＡＴ培地（ギブコ社製）によりハイブリ
ドーマを選択培養した。

【００５９】（４）ハイブリドーマの選択 細胞融合後１２日目に培養上清中の抗体活性をＥＬＩＳ
Ａにより測定した。免疫原１０μｇ／ｍＬを固相化した
９６穴ＥＬＩＳＡプレート（コースター社製）の各穴に
融合細胞の培養上清液２００μＬを添加し、３７℃で１
時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ（洗
浄液）で洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ
（Ｃａｐｐｅｌ社製、１：２００００）２００μＬを添
加した。３７℃で１時間反応後、上記洗浄液で洗浄し
た。洗浄後、基質液（０．１Ｍ ｏ−フェニレンジアミ
ンと０．０１２％過酸化水素水）を各穴に２００μＬず
つ添加し、室温で１５分反応させた。反応後、各穴に
３．５Ｎ硫酸を５０μＬずつ添加し酵素反応を停止し、
４９２ｎｍにおける吸光値を測定した。吸光値が０．１
５以上を示した、上記免疫原に反応する抗体を産生する
ハイブリドーマクローンを選択した。各クローンを限界
希釈法により２回クローニングを行った。クローニング
後のハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃＡマウスに移植した
結果、腹水として回収できるモノクローナル抗体を産生
したハイブリドーマは３２クローンであった。

【００６０】（実施例２） ［サンドイッチＥＬＩＳＡによる消化管排泄物中のヘリ
コバクター・ピロリを特異的に認識するモノクローナル
抗体の選択］ （１）モノクローナル抗体固相化プレートの作製 ３２クローンの腹水各１ｍＬをＰＢＳで２倍に希釈し、
飽和硫酸アンモニウム２ｍＬを滴下して４℃で４時間放
置した。その後、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離
し、沈査をＰＢＳ２ｍＬに浮遊し透析を行った。これら
のモノクローナル抗体を以下の方法により９６穴ＥＬＩ
ＳＡプレートに固相化した。即ち、各モノクローナル抗
体を５μｇ／ｍＬに希釈した後、９６穴ＥＬＩＳＡプレ
ートの各穴に０．２ｍＬ加え、４℃で一夜放置した後、
ＰＢＳで洗浄した。洗浄後、１％スキムミルク−ＰＢＳ
を各穴に０．２５ｍＬ加え、４℃で１時間放置してマス
キングを行った。マスキング後、上記洗浄液で洗浄し
た。

【００６１】（２）ビオチン標識モノクローナル抗体の
作製 （１）にて調製した３２クローンのモノクローナル抗体
３ｍｇとビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエス
テル（ザイメッド社製）１０ｍｇを混合し、０．１Ｍ炭
酸水素ナトリウム（ｐＨ８）中、室温で、３時間攪拌し
ながら反応させた。反応液をＰＢＳ ５Ｌに対して４℃
で一夜透析し、ビオチン標識モノクローナル抗体を得
た。

【００６２】（３）消化管排泄物中のヘリコバクター・
ピロリを特異的に認識するモノクローナル抗体の選択 尿素呼気試験によりヘリコバクター・ピロリ陽性者及び
陰性者と判定された各１名の糞便検体２５０ｍｇを０．
１％スキムミルク−ＰＢＳ ０．５ｍＬに懸濁後、３０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を集め、糞便抽
出液とした。糞便抽出液０．２ｍＬを（１）にて調製し
た各モノクローナル抗体固相化プレートの各穴に添加し
た。３７℃で１時間放置後、上記洗浄液にて５回洗浄
し、（２）にて調製した各ビオチン標識モノクローナル
抗体０．２ｍＬを添加した。３７℃で１時間放置後、上
記洗浄液にて洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識アビジン
０．２ｍＬ（ザイメッド社製）を添加した。３７℃で１
時間放置後、上記洗浄液にて洗浄後、基質液（０．１Ｍ
ｏ−フェニレンジアミンと０．０１２％過酸化水素
水）を各穴に０．２ｍＬずつ添加し、室温で１０分反応
させた。反応後、各穴に３．５Ｎ硫酸を５０μＬずつ添
加し酵素反応を停止し、４９２ｎｍにおける吸光値を測
定した。結果を表１に示した。

【００６３】

【表１】

【００６４】表１に示した通り、２種のモノクローナル
抗体３１Ａ３、８２Ａ３を単独又は組合わせたサンドイ
ッチＥＬＩＳＡは、ヘリコバクター・ピロリ感染者の糞
便検体に対して高い反応性を示すことがわかった。各モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはそれぞれ
３１Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２９）、８２Ａ３（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１８３２８）として独立行政法人産業技術
総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば
市東１丁目１番１号中央第６）に寄託されている。尚、
各モノクローナル抗体のイムノグロブリンサブクラスを
イムノグロブリンタイピングキットマウス（和光純薬工
業社製）により調べた結果、３１Ａ３はＩｇＧ_２ｂ、８
２Ａ３はＩｇＧ_１であった。

【００６５】（実施例３） ［菌株による反応性の比較及び他菌種との反応性］ （１）ヘリコバクター・ピロリ菌体懸濁液の調製 ５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョ
ン寒天培地上にヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３
５０４；東海大学病院臨床分離株Ｎｏ．１３０、及び、
Ｎｏ．１１２）を筋状に画線した。このプレートを３７
℃で３〜４日間微好気性培養して得られたらせん状菌の
コロニー、又は、更に３７℃で嫌気性環境下にて７日間
放置して得られた球状菌のコロニーを白金耳等でかきと
り、ＰＢＳに懸濁した。４℃にて、１００００×ｇで１
０分間遠心分離した菌体を０．５％ホルマリンに懸濁
し、４℃にて４日間放置して不活化した。その後、ＰＢ
Ｓに懸濁し、４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心
分離する操作を３回繰り返し、菌体を洗浄した後、再
度、ＰＢＳに懸濁し、ヘリコバクター・ピロリらせん状
菌体懸濁液及び球状菌体懸濁液を得た。

【００６６】（２）ヒト腸内菌の菌体懸濁液の調製 ヒト糞便から分離される代表的な腸内菌バクテロイデス
・ブルガタス、及び、エシェリヒア・コリの２菌種を以
下の方法で培養し、得られたコロニーから（１）と同様
の方法により各菌の菌体懸濁液を調製した。即ち、バク
テロイデス・ブルガタス（ＩＦＯ１４２９１）は５％馬
脱繊血を添加したＢＬ寒天培地（日水製薬社製）上で３
７℃で２日間、嫌気培養した。エシェリヒア・コリ（Ａ
ＴＣＣ２５９２２）はブレインハートインヒュージョン
寒天培地上で、３７℃で１日間、好気培養した。

【００６７】（３）他のヘリコバクター属の菌体懸濁液
調製 ヘリコバクター・フェリス（ＡＴＣＣ４９１７９）、ヘ
リコバクター・ヘパティカス（ＡＴＣＣ５１４４８）、
ヘリコバクター・ムステラエ（ＡＴＣＣ４３７７２）及
びヘリコバクター・シナエディ（ＡＴＣＣ３５６８３）
を５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージ
ョン寒天培地上で（１）と同様に培養して、得られたら
せん状菌のコロニーから（１）と同様にしてらせん状菌
体懸濁液を得た。

【００６８】（４）菌体破砕物の調製 （１）、（２）及び（３）で得られた各菌体懸濁液を、
超音波破砕機（セイコー電子工業社製、Ｍｏｄｅｌ ７
２５０）を用いて、ｏｕｔｐｕｔ ３、５０％ｄｕｔｙ
ｃｙｃｌｅの条件にて１０分間超音波処理して菌体を
破砕した。

【００６９】（５）サンドイッチＥＬＩＳＡ （４）で得られた各菌体破砕物（タンパク質濃度１０μ
ｇ／ｍＬ）０．２ｍＬをそれぞれ、実施例２（３）の方
法によりサンドイッチＥＬＩＳＡ（下表２に示したモノ
クローナル抗体３１Ａ３同士、８２Ａ３同士及びメリデ
ィアン社製ＨｐＳＡ）を行った。結果を表２に示した。

【００７０】

【表２】

【００７１】表２に示した通り、モノクローナル抗体３
１Ａ３、８２Ａ３は、ヘリコバクター・ピロリの各菌株
のらせん状菌体、球状菌体に対して高い反応性を示すこ
とがわかった。一方、バクテロイデス・ブルガタス、エ
シェリヒア・コリ、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコ
バクター・ヘパティカス、ヘリコバクター・ムステラ
エ、及び、ヘリコバクター・シナエディに対しては全く
反応しなかった。これに対して、メリディアン社製Ｈｐ
ＳＡは、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・
ヘパティカス、ヘリコバクター・ムステラエ、及び、ヘ
リコバクター・シナエディに対して反応性を示した。

【００７２】

【発明の効果】本発明は、上述の構成よりなるので、被
験者に苦痛を与えることなく、簡便かつ効率よく、極め
て優れた精度で、安定して特異的にヘリコバクター・ピ
ロリ感染を検出することができる。

フロントページの続き (72)発明者 鈴木 信之 東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号 わかもと製薬株式会社内 (72)発明者 平田 晴久 東京都中央区日本橋室町１丁目５番３号 わかもと製薬株式会社内 Ｆターム(参考） 4B065 AA91X AB05 AC14 BA08 BA24 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 CA11 DA76 EA52 FA72

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 消化管排泄物中に存在するヘリコバクタ
   ー・ピロリのネイティブなカタラーゼを、ヘリコバクタ
   ー・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクロ
   ーナル抗体を用いて検出することにより、ヘリコバクタ
   ー・ピロリへの感染を判定する検査方法であって、前記
   モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥ
   ＲＭ Ｐ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２
   Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２８）により産生されたモ
   ノクローナル抗体であることを特徴とする検査方法。
2. 【請求項２】 消化管排泄物中に存在するヘリコバクタ
   ー・ピロリのネイティブなカタラーゼを検出することに
   より、ヘリコバクター・ピロリへの感染を判定するため
   の検査試薬であって、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲ
   Ｍ Ｐ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８２Ａ
   ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２８）により産生されたモノ
   クローナル抗体を構成成分とすることを特徴とする検査
   試薬。
3. 【請求項３】 消化管排泄物中に存在するヘリコバクタ
   ー・ピロリのネイティブなカタラーゼを、ヘリコバクタ
   ー・ピロリのネイティブなカタラーゼに対するモノクロ
   ーナル抗体を用いて検出することにより、ヘリコバクタ
   ー・ピロリへの感染を判定する検査キットであって、前
   記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ３１Ａ３（Ｆ
   ＥＲＭ Ｐ−１８３２９）及び／又はハイブリドーマ８
   ２Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２８）により産生された
   モノクローナル抗体であることを特徴とする検査キッ
   ト。
4. 【請求項４】 ヘリコバクター・ピロリのネイティブな
   カタラーゼに対するモノクローナル抗体を産生するハイ
   ブリドーマであって、ハイブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲ
   Ｍ Ｐ−１８３２９）であることを特徴とするハイブリ
   ドーマ。
5. 【請求項５】 ヘリコバクター・ピロリのネイティブな
   カタラーゼに対するモノクローナル抗体を産生するハイ
   ブリドーマであって、ハイブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲ
   Ｍ Ｐ−１８３２８）であることを特徴とするハイブリ
   ドーマ。
6. 【請求項６】 ヘリコバクター・ピロリのネイティブな
   カタラーゼに対するモノクローナル抗体であって、ハイ
   ブリドーマ３１Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２９）によ
   り産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。
7. 【請求項７】 ヘリコバクター・ピロリのネイティブな
   カタラーゼに対するモノクローナル抗体であって、ハイ
   ブリドーマ８２Ａ３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３２８）によ
   り産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。