JP2002540425A - マイクロスケール全分析システム - Google Patents

マイクロスケール全分析システム

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JP2002540425A JP2000608171A JP2000608171A JP2002540425A JP 2002540425 A JP2002540425 A JP 2002540425A JP 2000608171 A JP2000608171 A JP 2000608171A JP 2000608171 A JP2000608171 A JP 2000608171A JP 2002540425 A JP2002540425 A JP 2002540425A
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エス． ロシエ，ジョエル
レイモン，フレデリック
アッシュ． ジロール，ユーベル
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エコール ポリテクニーク フェデラル ドウ ローザンヌ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、水性媒質内で化学的アッセイを行うための装置に関する。装置は、１以上の反応チャンバ及び各チャンバに連結された液体流入チャネルを内含する。反応チャンバに向かう流体流入チャネルを通る液体の流れは、流入チャネルの壁上に疎水性内表面が存在することによって制御される。通常の条件下では、流体はチャネル内を流れない。しかしながら、外力を加えると、流体は前記チャネルを通って反応チャンバ内へと押し流される。本発明は、数多くの異なる分子相互作用特に固定化された親和性パートナと溶液中の１つの種の間の分子認識、例えば免疫グロブリン／抗原相互作用、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ハプタマー−タンパク質相互作用の監視、薬物及びウイルスの検出、合成分子の高流量スクリーニング、そして標的種の濃度及び反応速度の決定のために応用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、水性サンプル中で標的種の存在を検出するための装置、ならびに標
的種の濃度及び反応速度を決定するための装置に関する。本発明は、数多くの異
なる分子相互作用特に固定化された親和性パートナと溶液中の１つの種の間の分
子認識、例えば免疫グロブリン／抗原相互作用、ＤＮＡハイブリダイゼーション
、ハプタマー−タンパク質相互作用の監視、薬物及びウイルスの検出、合成分子
の高流量スクリーニングに対して応用可能である。
【０００２】 ２つの反応パートナ間の多くの親和性複合体形成は、拡散制御されることから
、反応平衡に達するのに必要とされる時間は直接分子の質量輸送によって左右さ
れる。１つの溶液中における分子の拡散時間は、経路長の２乗に正比例する。標
準的には小さな分子は、１ミリメートルを横断するのに２時間を必要とするのに
対し、１０μｍにわたり拡散するのに１秒未満しか必要としない。従って反応の
平衡時間を減少させるためには、化学的パートナは互いにできるかぎり近く置か
れなくてはならない。反応器サイズをマイクロ寸法まで縮小し、１つのパートナ
を反応器の表面上に固定化し、第２のパートナを反応器に充てんすることにより
、平衡時間を劇的に削減することができる。
【０００３】 微細反応器を使用することにより、親和性アッセイの速度が速くなるばかりで
なく、複合体の熱力学的安定性を理解する上で重要である反応速度に関する情報
の獲得が容易になる。親和性定数Ｋｄは、それぞれ会合及び解離定数を表わす正
及び逆の反応速度定数ｋ＋及びｋ−の間の比率である。強い複合体形成は、吸着
剤親和性アッセイという特殊なケースにおいては微細反応器の表面からの吸着及
び脱着である非常に急速な会合と非常に緩慢な解離によって特徴づけされる。こ
れらの熱力学特性の知識は、親和性アッセイ中のマトリクス要素の非特異的吸着
又は複数の抗原間の交差反応性の研究のために使用することができる。溶液のイ
ンキュベーション時間を加減することにより、より親和性の高いパートナの複合
体形成が奨励され、このとき非特異的吸着は最少限まで削減される。この事実は
、背景シグナルの最小化に起因する免疫吸着アッセイ法の検出限界の低下におけ
る重要な要因でありうる。この方法は同様に、異なる分子量の抗原の吸着を監視
するためにも応用可能である。
【０００４】 １つの分子の拡散係数はその質量に正比例することから、反応チャンバを通し
た分子の拡散時間は、小さい分子と大きな分子について異なっている。同じエピ
トープを伴う異なる分子量の分子の場合（例えばフィブリン分解産物）、拡散係
数がそれらの各々について異なっているのに対し、Ｋｄは全ての分子について同
じであり得る。反応速度実験が実施される場合、より小さな分子は、より大き分
子に先行して定量的に抗体に到達することになる。かくして時間の関数として親
和性反応から結果として得られるシグナルを監視することによって、分解プロセ
スの理解を助けることのできる有用な反応速度情報が生み出される可能性がある
。これらの反応速度論上の事象の後には、一連の微細反応器の壁上に抗体を固定
化し異なる時間中問題の分析物の異なる溶液をインキュベートすることによって
最も容易に達成できる、その反応パートナと接触した状態での分子の滞留時間の
変調が続く可能性がある。
【０００５】 過去において、上述のタイプの分析手順（例えば酵素結合免疫吸着検出法−Ｅ
ＬＩＳＡ）は、マイクロタイタープレートを用いて実施され、比較的低速であっ
た。最近になって、マイクロメートル規模まで分析デバイスのサイズを縮小する
ための多大な努力が行なわれ、その結果反応時間は削減された。
【０００６】 これらの小型化されたシステムは、「マイクロスケール全分析システム」（μ
−ＴＡＳ）と呼ばれ、すでに、少量のサンプルを操作し分析する便利な手段とし
て認知されてきている２−８。今日までの大部分のμ−ＴＡＳデバイスは、ガラ
ス、石英及びシリコンといったような基板上でフォトリソグラフィ、ウェット化
学エッチング又は薄膜被着によって製造されてきた９−１０。製造コストを削減
するため、プラスチック基板も同様に、シリコーンゴム流込み１１−１４，射出
成形１５、押型１６，１７又はレーザーフォトアブレーション１６のいずれかを
用いて微小機械加工されてきた。これらの製造はガラスカバーに対して熱又は陽
極ボンディングにより封着されていることの多いマイクロメートルサイズのチャ
ネルを有する平面デバイスである。相互連結されたチャネルは容易に製造でき、
このため、数ピコリットルの体積での急速な分離及び反応が可能となる。μ−Ｔ
ＡＳのその他の利点は、ベンチ規模の装置に比べたサンプル及び試薬の消費量の
減少及び精度及び再現性の増強にある２１，２２。
【０００７】 マイクロチップについて競合的免疫アッセイ法が実施されてきたが、マイクロ
チャネルは、抗原又は抗体の遊離形態及び結合形態を電気泳動によって分離する
ためだけに使用されてきた。これらのアッセイにおいては、抗体及び標識づけさ
れた抗原が、分析されるべきサンプルに対し特定的な数量で添加される。次に、
サンプルは、限定数の抗体結合部位を求めて競合する標識づけされた及び未変性
の抗原の混合物とインキュベートされる。マイクロチャネルはこのとき、毛細管
電気泳動により複合体から標識づけ済み遊離抗原を分離するために使用され、分
離チャネルの端部でルミネセンス（螢光又はケミルミネンス）によって定量が行
われる。測定された標識づけ済み遊離抗原の量はこのとき、以前に決定されたキ
ャリブレーション曲線を用いてサンプル中の分析物濃度に関係づけされる。この
タイプのアッセイにおいては、マイクロチャネルの壁上への反応パートナの吸着
を回避することが不可欠である。
【０００８】 多数のサンプル２６の同時分析のために他のタイプの免疫アッセイデバイスが
開発されてきた２６。この場合、ビチオンで標識づけされた抗体は、アビジン−
ビチオン架橋によって導波管表面上に固定化された捕捉済み抗体の垂直に方向づ
けされた６本の縞のアレイを形成するべく、ビチオン標識づけされた抗体が、ア
ビジンコーティングの施された導波管上へとパターン化される。次に、さまざま
な濃度で対応する螢光標識づけ済み抗原を含有する６本の水平に方向づけされた
ラインの他のアレイをパターン化することによって、サンドイッチ免疫アッセイ
フォーマットを用いてサンプルが分析される。導波管の表面上の螢光複合体は、
このときダイオードレーザーによって励起され、ＣＣＤカメラにより３６平方ド
ットの螢光強度が収集される。この免疫センサーは、並行して多数のサンプルを
分析でき、又１つのサンプルにつき複数の分析物を同時検出することができる。
【０００９】 数多くの分析方法で、問題の分析物を検出するためにルミネセンスが利用され
ている。ルミネセンスというのは、その基底状態まで緩和して、光励起（フォト
ルミネセンス）又は化学反応（ケミルミネセンス及びエレクトロケミルミネセン
ス）により誘発され得る励起された分子による電磁放射線（ＵＶ，可視光、又は
赤外線）の発出を意味する包括的用語である。化学螢光（ＣＦ）は、ＰＬとＣＬ
の両方の反応メカニズムを組合せる他のクラスの発光反応である。この場合、螢
光発生物質Ａが、化学反応により螢光性生成物Ｃへと変換され、この生成物の励
起により螢光が生成される：
【００１０】 Ａ＋Ｂ→Ｃ＋Ｄ，ｈν１＋Ｃ→Ｃ＊及びＣ＊→Ｃ＋ｈν２
【００１１】 分析を目的として、ルミネセンスを生成する能力を有するアッセイシステムの
反応物の１つを１つの分子に付着させて、これを特異的に「標識づけすることが
できる。このとき単数又は複数の結合材料に対し付着された視察可能な標識の有
無が問題の分析物の存在を表示するものとして使用される。微量の医薬品、微生
物、ホルモン、ウイルス、抗体、核酸及びその他のタンパク質をかかる方法によ
って検出し定量するために多数の実験が開発されてきた。例えば臨床診断におい
て、ルミネセンス検出を用いた競合及びサンドイッチ免疫アッセイが現在、日常
的に使用されている２７，２８。
【００１２】 酵素を媒体とする免疫アッセイにおいては、分子は、ルミネセンス反応の触媒
として作用する酵素で標識づけされる。標準的な例としては、過酸化水素及び水
酸化物イオンの存在下でそれぞれルミノール及びジオキセタンの酸化及びリン酸
塩含有試薬の加水分解を容易にするホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）又はアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識づけされた免疫試薬の検出
がある。同様にして、ＡＬＰは、きわめて螢光性の高い生成物を生み出すべく螢
光発生基質からリン酸塩基を分割するためにＣＦアッセイにおいて使用されてき
た。
【００１３】 ルミネセンスアッセイ方法は、ペプチド、タンパク質及び核酸の分析において
広く使用されている。ＣＬは、フローインジェクション分析（ＦＩＡ）及び高性
能液体クロマトグラフィ３０−３２の両方においてきわめて感度の高い検出方法
であることが示されてきており、これは又アミノ酸神経伝達物質３５，希土類金
属イオン３６又は標識づけ済みタンパク質３７の検出のため、毛細管電気泳動法
（ＣＥ）３３，３４においても利用されてきた。しかしながら、ルミネセンスが
最も一般的に使用される検出方法であるのは、免疫アッセイ法においてである３
４，３８〜４３。
【００１４】 酵素反応速度の測定のための先行技術の方法の中でも、ＵＳ．４，６２１，０
５９号は、毛細管カラムの中を流れかつ固定化済みの酵素と反応する螢光性物質
によって発出された光が、ルミネセンス強度の分布から問題の分析物の数量又は
酵素活性を決定するべくカラムの長手方向に沿って配置された複数の光ファイバ
を通して収集される、１つの方法を開示している。
【００１５】 米国第５，６２４，８５０号は、−０．１μｍ〜１．０ｍｍの内径を有する半
透明の毛細管内で問題の分析物を検出するために螢光が用いられる毛細血管内免
疫アッセイを行うための方法について記述している。同様にして、吸光性材料及
び発光標識付けされたトレーサが分析物／抗分析物複合体と共にインキュベート
され、かくして発出された全ての光が結合済みトレーサーに会合したものを除き
吸光性材料によって吸収されるようになっている均質ケミルミネセンス免疫アッ
セイ法を、例えば米国第５，０１７，４７３号内に記述されているように行うこ
とができる。
【００１６】 機械的又は界面動電ポンピングを用いて１つのウェルから他のウェルまでサン
プルを移動させるため単数又は複数のチャネルによって連結されている複数のウ
ェルを含むシステム内で、単数又は複数のサンプルが並行処理される１つの方法
が、米国第５，５８５，０６９号で開示されている。この装置では、チャネルは
単に２つのウェル間の連結部分として使用されているにすぎず、反応又は検出チ
ャンバとしては用いられていない。
【００１７】 μ−ＴＡＳの使用に付随する主たる問題点の１つは、流れのレイノルド数が低
いことに起因する試薬の適切な混合上の問題点である。他の問題点は、反応速度
論研究にとって不可欠である、流体進入の正確なタイミングにある。これらの問
題に対処するにあたり、当該出願人は、疎水性ゲートを用いて反応チャンバ（例
えばマイクロチャネル）内への流体の進入を正確に制御できる、ということを発
見した。
【００１８】 従って、本出願は、１つの態様において、少なくとも１つの反応チャンバ、該
反応チャンバ又は各々の反応チャンバと連絡する少なくとも１つの流体流入チャ
ネル、及び水性流体が流体進入力の作用を受けるまで、該流体が１以上の流体流
入チャネルを通って１以上の反応チャンバ内へと通過するのを防止するように適
合させられたゲート手段を含み、該ゲート手段が、疎水性内表面を有する該流体
流入チャネル又は各々の流体流入チャネルの少なくとも一部分を含む装置を提供
している。
【００１９】 好ましくは、装置は、各々が付随する流体流入チャネルを１本もつマイクロチ
ャネルの形をとる複数の反応チャンバを有する。代替的には、複数のマイクロチ
ャネルが、該マイクロチャネルと連絡する１本の共通の導管内へと供給を行なう
単一の流入チャネルにより供給を受けていてもよい。好ましいいくつかの実施形
態においては、流体進入力は、流入チャネルから遠位にあるその端部で各マイク
ロチャネルと連絡している共通の導管に連結された吸収手段によって提供されて
いる。その他の実施形態においては、装置は、回転可能な支持部材を含み、流体
進入力は、基板の回転時点の遠心力によって提供される。適切には、支持部材は
、マイクロチャネルが全体に半径方向に配置されている状態で、マイクロチャネ
ル装置の基板を形成することができる。代替的には、回転可能な支持部材は、平
行なマイクロチャネルを有する単数又は複数のデバイスのための支持体として役
立つことができる。
【００２０】 全てのマイクロチャネルのための１つの共通の流体進入力供給源がもつ利点は
、同時充てんを確保でき、流体進入力が加えられるまで疎水性ゲート手段により
流体サンプルがマイクロチャネル内に入れなくなっているという点にある。さら
にマイクロチャネルの迅速な充てん及び適切な混合を確保するため、流体進入力
の程度を容易にする制御をすることもできる。同様に、例えば吸引度を増大させ
るか又は回転支持部材の回転速度を増大させることによって、チャネル内の流体
に対し増大した力を加えることにより、効率の良い迅速な形でマイクロチャネル
を空にすることもできる。かくして１つのアッセイの正確な終点を達成すること
ができる。数多くの例において、結合した標的種について監視する前に、サンプ
ルを吐出させることが有利である。
【００２１】 望まれる場合、液体試薬又は洗浄用流体を、タンクを形成する封着されたキャ
ビティ内に供給することができる。タンクは、通常閉鎖されたバルブを介してそ
のそれぞれのマイクロチャネルと連絡するように配置できるものであり、又それ
ぞれのピストンによる作用を受けた時点でかかるバルブを通してその中味を吐出
させることができる。代替的には、通常閉鎖されたバルブを介して、全てのマイ
クロチャネルに供給する１本の共通の導管と連絡する単一のタンクが存在してい
てもよい。
【００２２】 マイクロチャネルを用いた標的種の検出は、従来の手段によって達成できる。
例えば、電気化学的検出を可能にするため、装置の好ましい実施形態は、マイク
ロチャネルの表面の少なくとも一部分が導電性材料で形成されるような形で構築
されている。これは、例えば導電性ポリマー性材料又は電極であり得る。いくつ
かの実施形態では、マイクロチャネルの壁の少なくとも一部分が、酸化インジウ
ムといったような半導体材料で形成されていてよい。好ましくは、半導体材料は
透明である。代替的には、検出は、ルミネセンス又は螢光手段により達成でき、
この場合、例えばフォトダイオード又は光電子倍増管といったような電磁放射線
検出器が具備される。
【００２３】 本発明の１つの特定的利点は、マイクロチャネルの内表面上に化学的試薬を固
定化させ、かくしてμ−ＴＡＳタイプのシステム内におけるＥＬＩＳＡタイプの
アッセイの可能性を提供することができるということにある。例えば、オリゴヌ
クレオチド、ポリペプチド、タンパク質（例えは酵素）又はその他の天然又は合
成分子といったような数多くの異なるタイプの試薬をマイクロチャネル壁に対し
付着させることができる。適切には、これらはマイクロチャネル壁の表面上に吸
着させられてもよいし、或いは、（例えばスクシンイミドとのアミド結合を用い
て）それに共有結合によりリンクされていてもよいし、又（例えばポリリシンと
いったような架橋剤を用いて）それに対し静電気によりリンクされていてもよい
。マイクロチャネル及び／又は流体流入チャネルの内表面には同様に、化学的又
は物理的処置によって形成された化学的官能基が具備されていてもよい。
【００２４】 本発明は同様に、いずれの順序でも又同時にでも実施できる、少なくとも１つ
の反応チャンバを形成するステップ及び反応チャンバと連絡する少なくとも１つ
の流体流入チャネルを形成するステップを含み、該流体流入チャネル又は各々の
流体流入チャネルは、流体が流体進入力の作用を受けるまで反応チャンバ内へと
流体流入チャネルを通して流体が通過するのを防止するためのゲート手段として
作用するように適合された疎水性内表面を有している。上述の装置の製造方法に
まで及ぶものである。
【００２５】 製造を容易にするため、装置は好ましくは２つの主要な部分、つまり、マイク
ロチャネル（そして場合によっては流入チャネルも）が（例えば射出成形、高温
型押、フォトアブレーション、流込み成形又は金型上での重合などによって）凹
部として形成される基板、及びマイクロチャネル（そして任意には流入チャネル
も）を形成するべく基板上及び凹部上に適用されるオーバレイ層の形で形成され
る。流入チャネルが基板内に製造されない実施形態においては、例えば、レーザ
ーを用いて種層オーバレイ層を通してせん孔するか又はポリジメチルシロキサン
（ＰＤＭＳ）といったような疎水性材料から成る目地を反応チャンバの入口の上
に被着させることによって、これらを製造することができる。
【００２６】 該装置は、例えばセラミクス、ガラス、半導体、ポリマー又はそれらの組合わ
せといったような適切な任意の材料から形成することができる。特に好ましい実
施形態においては、基板及び積層は、（例えばフォトアブレーションにより）マ
イクロチャネルの容易な形成を可能にするのみならず２つの成分を熱積層技術に
より融合させることもできるポリマー性材料で形成されている。この目的で、ポ
リマーのうちの少なくとも１つが、例えば２００℃以下の融点を有するポリエチ
レンといった比較的低い融点を有する材料から成るということが好ましい。積層
は、有利にはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）といったようなエラストマ材
料でできていてよい。光学検出手段と合わせて使用するための装置においては、
積層が実質的に透明な材料で形成され、基板が実質的に不透明な材料（例えばセ
ラミクス材料又は炭素入りポリマー）で形成されていることが好ましい。
【００２７】 他の態様においては、本発明は、少なくとも１つの反応チャンバから遠位にあ
る少なくとも１つの流体流入チャネルの端部にテスト対象の水溶液の少なくとも
１つのサンプルを配置するステップ、流体進入力を加えることによって流体流入
チャネルを介して反応チャンバにサンプルを進入させるステップ、及び標的物質
の存在又は濃度について反応チャンバ内のサンプルを監視するステップを含む、
上述の装置の操作方法にも拡大される。
【００２８】 吸引手段を有する装置の実施形態においては、流体進入力は好ましくは、吸引
手段を活動化させて０．１〜１００秒の範囲内の時間中マイクロチャネルに対し
減圧を加えることによって適用される。マイクロチャネルの排出を行なう目的で
、このとき、任意にはタンクからの洗浄用流体の供給と合わせて、マイクロチャ
ネルに対しさらに低い圧力を提供するように、吸引手段を活動化させることがで
きる。
【００２９】 回転可能な基板又は支持体を用いて構築された装置の実施形態においては、流
体進入力は好ましくは、１〜１００秒の範囲内の時間、毎分１〜１，０００回転
の範囲の角速度で基板又は支持体を回転させることによって加えられる。このと
き、マイクロチャネルは、１〜１００秒の範囲内の時間、毎分１０〜１００，０
００回転の範囲内の増大した角速度で基板又は支持体を回転させることによって
排出され得る。
【００３０】 以下では、本発明について添付図面を参考にして、単なる一例としてさらに詳
細に説明する。
【００３１】 図１〜６のマイクロチャネルデバイスは、ＰＥＴ又はポリカーボネートといっ
たような市販のポリマーのＵＶレーザーフォトアブレーションによって製造され
る。フォトアブレーション手順は、例えば当該出願人により以前に記述されたよ
うに、既知の要領で実施される４４。簡単に言うと、ポリマーシートを、精製水
及びエタノールで洗い流し、次にＸ，Ｙ機械加工台（Ｍｉｃｒｏｃｏｎｔｒｏｌ
，Ｆｒａｎｃｅ）上に取りつける。その後、表面上で１Ｊ／ｃｍ２というパルス
あたりのフルーエンスに対応する２００ｍＪ／パルスで５０Ｈｚの周波数を用い
て、フォトマスク及び１０：１レンズを通してポリマー基板標的に対しＵＶレー
ザーパルス（１９３ｎｍ）（Ｌａｍｂｄａ Ｐｈｙｓｉｋ ＬＰＸ２０５；，Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）を発射する。フォトアブレーションプロセス中、ポリマー基板は
、Ｘ，Ｙパルスモータ（Ｍｉｃｒｏｃｏｔｒｏｌ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、０
．２ｍｍ／秒の速度で水平方向に移動され、結果として長さ２２ｍｍの線形チャ
ネルがもたらされる。マイクロチャネルは標準的に、１〜１，０００μｍの幅を
もち、この例では約１００μｍの幅を有する。チャネルの深さは、使用されるレ
ーザーパルスの数を制御することによって、４０μｍに固定した（各パルスはお
よそ１５０ｎｍをフォトアプレートする）。次に、ベースポリマーシート上にポ
リエチレン層を熱により積層することによってチャネルを封着させ、このときチ
ャネルは、台形を示し、この台形中３つの壁は基板ポリマー（ＰＥＴ又はポリカ
ーボネート）で構成され、上面は積層（ポリエチレン）で構成されている。流体
流入チャネル（又は「ゲート」）（１）は、十分なレーザーパルスを発射するこ
とによって開放されるか又は疎水性積層の中を機械的にせん孔される。１０μｍ
〜１０ｍｍの間の直径をもちうるゲートは、ポリマーの性質に起因して疎水性の
内表面をもち、従って水性流体の通過を阻止する。
【００３２】 マイクロチャネルの精確な配置は、本発明の作用にとってとりわけ重要なこと
ではないが、２つの一般的幾何形状が出願人により開発されテストされ、有益で
あることが証明された。これらのうちの第１のものにおいては、複数のマイクロ
チャネルが、適切には一般に矩形の基板上で互いに平行に配置されている。さま
ざまなマイクロチャネルの流入チャネルの「ゲート」は、線形の多重ピペットデ
バイス（図２参照）からのテスト溶液の迅速かつ効率の良い投入を可能にするた
め、互いに心合せされている。第２の形態においては、マイクロチャネルは、流
入チャネルゲートが円の中心に向かいマイクロチャネルの反対側の（流出）端部
が円周に向かっている状態（図３及び６）又はその逆の状態（図４）で、一般に
円形の基板上で半径方向に配置されている。
【００３３】 流体進入力を提供するためには、数多くの異なる手段を利用することができ、
そのうち好ましい手段は吸引と遠心力である。図２の装置においては、共通の導
管（３）がマイクロチャネル（２）の流出端部に備えられており、これに対し、
流体流入ゲートを通してマイクロチャネル内に流体をひき込むべくデバイスの作
動中に減圧が加えられる。図２の最後の図に例示されているように、吸引手段は
同様に、任意には洗浄用流体の供給と合わせて、ドレンに対しマイクロチャネル
の中味を吐出させるためにさらに強い吸引力を供給するべく利用することもでき
る。図４に例示されている装置は、共通の流出ドレン（６）に吸引が適用されて
いる状態で、類似の要領で作動する。図３及び６に例示されている装置において
は、基板を高速回転させて遠心力を生成することにより、流体は、流体流入ゲー
トを通りマイクロチャネル内まで移行するように強制される。例示された配置に
おいては、各々のマイクロチャネルは独自のドレン（７）を有する。
【００３４】 標準的には、吸引駆動されるデバイス（図２及び図４にあるようなもの）では
、２μｌのサンプルがピペットで各ゲート（１）上に置かれる。次にこの溶液は
共通の導管（３：６）から短時間の吸引によってマイクロチャネル内に投入され
る。この技術は、マイクロチャネル全体に溶液が均一にいきわたるよう保証する
。インキュベーションの後、マイクロチャネルを吸引して、２μｌで３回洗い流
す。ここで、洗浄用溶液の体積がマイクロチャネルの容量（約１００ｎｌ）より
もはるかに大きく、かくして効率の良い洗浄が確保されているということは特記
に値する。遠心圧力により駆動されるデバイスを使用すると、充てん及び洗浄手
順は、各ゲート（１）上に２μｌの溶液を置くことによって達成できる。低速回
転は１以上のマイクロチャネル内へとサンプルを投入させるという結果をもたら
し、その後より高速の回転がマイクロチャネル１以上からサンプルを吐出させる
ために使用される。
【００３５】 図５は、各々のマイクロチャネルが流体流入ゲート（１）に隣接して位置づけ
された封着済みキャビティにより形成された付随する流体タンク（１０）を有す
る、本発明に従った装置の任意の修正形態を例示している。タンクは圧力下で凹
部（１４）内への変形しうるバルブ部材（１３）を含む通常は閉鎖したバルブ（
１２）を用いて、マイクロチャネルと連絡する。タンク（１０）は、その中で密
にはめ合わされるような断面形状を有するピストン（１１）によって加えられる
下向きの圧力によって破壊されうるシール（１５）によって、キャッピングされ
ている。タンク（１０）内のピストン（１１）の下向きの運動は、タンク内の流
体圧力を増大させ、かくしてバルブ（１２）を開放しタンクからの流体がマイク
ロチャネル内に進入できるようにしている。いずれかの特定のアッセイの必要条
件に応じて、タンクに試薬を充てんするか又は洗浄用流体を充てんすることがで
きる。
【００３６】 一例を挙げると、Ｄ−２量体のための免疫アッセイを行う上での本発明に従っ
た装置の有用性を立証するために、さまざまなテストが行なわれた。Ｄ−２量体
は、血栓塞栓性事象における診断指標として使用される。すなわち、血中のＤ−
２量体濃度を監視することによって、深静脈血栓症及び肺塞栓症を診断すること
ができる。過去においては、Ｄ−２量体の最も信頼性の高いアッセイは、例えば
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏの「Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ Ｄ−Ｄｉ」
といったようなＥＬＩＳＡ技術により実施されてきた。しかしながら、標準的な
ＥＬＩＳＡ技術は、緊急の状況には適しておらず、カラーベースの検出システム
を用いる代替的な膜ベースの技術が開発されてきた４８。しかし、これらの技術
には、検出メカニズムが主観的すぎるという欠点がある。
【００３７】 当該テストでは、酵素の検出は、化学螢光基質溶液（ＶＣＲ，Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）によって行なわれた。このシステムは、ＡＬＰにより加水分解されたＡｔｔ
ｏｐｈｏｓ基質の螢光検出に基づくものである。このとき、マイクロチャネルを
螢光画像形成装置スクリーン（ＭＰ８４０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ
ｃｓ）に露呈させ、全てのチャネルを１分間読み取った。その後、Ｉｍａｇｅ
Ｑｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて画
像を数量化した。マイクロチャネル内の酵素のキャリブレーションは、基質溶液
を異なる濃度の酵素と混合し５分間インキュベートすることによって達成した。
その後、マイクロチャネルに混合物を充てんし、蛍光画像形成装置で分析した。
実際のテストでは、マイクロチャネルの表面上に酵素を固定化し、チャネルに対
しＶＣＲ溶液を添加し、５分後に螢光を測定した。
【００３８】 タンパク質の固定化は、室温で１時間物理吸着により達成した。マイクロチャ
ネル内にマウスＩｇＧ抗体（Ｓｅｒｂｉｏ，Ｆｒａｎｃｅ）を１０μｇ／ｍｌ又
は１００μｇ／ｍｌのいずれかの量で入れその後ウェットチャンバ内で１時間イ
ンキュベートすることによりこれを固定化した。その後、表面をＰＢＳ及び２０
％のＴｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ／水：０．２ｍｌ／Ｌ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）で洗浄し、洗浄用緩衝液中で、熱ショックＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ
）の５０μｇ／ｍｌ溶液を用いて１時間遮断させた。もう１回の洗浄ステップの
後、チャネルに抗原溶液を個別に充てんした。５分後（その他の時間が以下で規
定されている化学速度実験の場合を除く）、マイクロチャネルを洗い流し、アル
カリ性ホスファターゼで標識づけされた抗原（ＡＬＰ−ＤＤｉ）の１０μｇ／ｍ
ｌ溶液を導入し、５分後再び洗い流した。
【００３９】 ５分間インキュベーションを行った後の酵素濃度に対する螢光の依存性は、図
７にグラフで表わされている。検出限界には、１ｎｇ・ｍｌ−１の範囲内で達し
ている。非線形検出範囲は、加水分解産物が高い可溶性をもたず、より高い濃度
で表面上に沈降しうるという事実に起因するものである。それでも、このシステ
ムは、マイクロチャネル内の酵素濃度を数量化するために使用することができる
。
【００４０】 マイクロチャネル内の吸着された抗体の活性を研究するために、２つの異なる
インキュベーション手順に着手した。まず第１に、数本のチャネルをＢＳＡのみ
でインキュベートした。第２に、いくつかのさらなるチャネルをまずはＡｂでそ
して次にＢＳＡでインキュベートした。その後全てのチャネルにＤＤｉ−ＡＬＰ
を充てんし、１時間インキュベートし、上述の手順に従って吸引により洗浄した
。各チャネルの螢光強度を次に測定した。結果は図８に示されている。ＢＳＡの
みでインキュベートしたチャネルは、ポリマー基板自体のものと著しく異なって
いない低い螢光を示した。これとは対照的に、抗体でインキュベートされたチャ
ネルは、はるかに螢光性が高く、かくして、ＤＤｉ−ＡＬＰが抗体上で吸着され
たことを立証した。この実験は、吸着された抗体のうちの一部分が表面上でなお
も活性であること、そしてＢＳＡがＤＤｉ−ＡＬＰ複合体の非特異的吸着に対し
て有効なブロッカーであることを示している。
【００４１】 図９は、１０μｇ・ｍｌ−１の吸着された抗体上の異なる濃度のＡＬＰ−ＤＤ
ｉの吸着の後のチャネル内の基質の螢光を示す。マイクロチャネルラインの螢光
強度は、異なるマイクロチャネル内の濃度勾配を明確に示している。全てのマイ
クロチャネルの相対的強度は、図１０にグラフで示されている。チャネルの飽和
には約３０μｇ／ｍｌで到達している。
【００４２】 図１１は、異なる時間インキュベートされたマイクロチャネルの螢光強度を示
す。短かいインキュベーション時間（５分未満）については、強度は線形的に大
きくなり、抗原が非常に急速に抗体によって捕捉されることを示している。全て
の抗原は、拡散によってなお表面に到達していなかったと考えられる。この第１
の勾配は、おおよそ、壁に対する分子の拡散に追従している。このとき分子は急
速に反応し、反応はほぼ拡散制御された状態となく。５分のインキュベーション
の後、反応は、２つの異なる現象によって促されるより緩慢な反応速度により制
御される。すなわち第１に、大きな分子は、はるかに緩慢に拡散し、従って長時
間の後に表面に達する。この場合、分子は、その分子量が１０００ＫＤより大き
いものでありうる部分的に分解したフィブリン生成物でありうる。第２に、非特
異的吸着の傾向が存在する。つまりかかる反応は、免疫学的認識よりもはるかに
緩慢であり、分子レベルでの再組織を必要とする静電気又は疎水性相互作用によ
り駆動される。従ってこのタイプの非特異的吸着は、短かいインキュベーション
時間により排除されうる。
【００４３】 図１２は、競合的免疫アッセイ法の後のＤ−２量体濃度の螢光依存性を示す。
低い濃度範囲では、固定化された抗体部位の大部分がＤＤｉにより占有されてお
らず、かくしてＤＤｉ−ＡＬＰが大量に存在すること、従ってより螢光性の高い
基質を加水分析することを可能にしている。１０００ｎｇ・ｍｌ−１以上の濃度
では、Ｄ−２量体分子は、抗体部位の大部分の上に存在し、従ってわずかな部位
しかＤＤｉ−ＡＬＰにとって利用可能ではない。濃度範囲（１００〜１０００ｎ
ｇ・ｍｌ−１）の中心部位は、システムの強い濃度依存性を示し、２ケタ検出範
囲は、診断用応用分野にとって有利な範囲内にある。４９
【００４４】 これらの実験は、マイクロチャネル内でのＥＬＩＳＡ技術の実施可能性を実証
している。速い平衡化時間及び急速な充てん及び濯ぎ手順の恩恵を受けて、（キ
ャリブレーションを含めた）アッセイを完了するのに必要な時間は、マイクロタ
イタープレート内でのＥＬＩＳＡについての３時間という標準的時間に比べて、
１０分未満まで短縮可能である。望まれる場合には、基板上に何百ものマイクロ
チャネルを具備することができ、同時充てんを確保できる能力は、きわめて効率
の高い並行アッセイの可能性を提供する。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ａ）疎水性ゲート上の水性サンプル液滴の被着後及びｂ）サンプル投
入後の、例示された発明に従った装置の一実施形態の概略的横断面図である。
【図２】 図２は、吸引によって達成される並行したサンプル採取、投入及び洗浄ステッ
プを例示する概略的平面図である。
【図３】 図３は、並行した充てん及び洗浄ステップが遠心力によって達成される、本発
明に従った装置の１変形実施形態の概略的平面図である。
【図４】 図４は、溶液がわずかな吸引によって投入され強い吸引によって洗浄される、
本発明に従った装置のさらなる実施形態の概略的平面図である。
【図５ａ】 図５ａは、流体流入チャネルに隣接する流体タンクを内蔵する。本発明に従っ
た装置の一実施形態の部分平面図である。
【図５ｂ】 図５ｂは、付着されたタンクの中に貫入しバルブを通してその中味を反応チャ
ンバ内に吐出する際のピストンの作用を例示する、図５ａの装置とそれに付随す
るピストンの２つの垂直断面で構成されている。
【図６】 図６は、ポリカーボネートコンパクトディスクのＵＶレーザーフォトアブレー
ションによって製造された、実質的に図３の装置と同じように構築された本発明
に従った装置の１実施形態の上面平明図である。
【図７】 図７は、本発明に従った装置の１実施形態のマイクロチャネル内のＡＬＰ−Ｄ
Ｄｉ溶液を用いた、螢光画像形成装置から得たキャリブレーション曲線である。
【図８】 図８は、本発明に従った装置の、ＢＳＡのみでインキュベートされたものとＢ
ＳＡ及び抗−ＤＤｉでインキュベートされたもの（図中ＢＳＡ＋Ａｂと記されて
いるもの）を含めた２本のマイクロチャネルの使用が関与するテストにおける、
ＤＤｉ−ＡＬＰ間の結合レベルを表わす螢光結果を例示するグラフである。
【図９】 図９は、異なるマイクロチャネルが異なる濃度のＤＤｉ−ＡＬＰとインキュベ
ートされた、図６に例示されたタイプの装置を使用して得られた螢光画像である
。
【図１０】 図１０は、抗体でコーティングされたマイクロチャネルを有する、図６に例示
されたタイプの装置における異なるＡＬＰ−ＤＤｉ濃度から得られた螢光の強度
を例示するグラフである。
【図１１】 図１１は、少なくとも１本の抗体コーティングされたマイクロチャネルを有す
る、本発明に従った装置の１実施形態における、ＡＬＰ−ＤＤｉのインキュベー
ション以降の経時的螢光強度変動を例示するグラフである。そして
【図１２】 図１２は、少なくとも１本の抗体コーティングされたマイクロチャネルを有す
る、本発明に従った装置の１実施形態を利用したＤ−２量体を伴う競合免疫アッ
セイ法における螢光強度（結合したＡＬＰ−ＤＤｉを示す）を例示するグラフで
ある。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月２７日（２００１．４．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 35/08 Ｇ０１Ｎ 1/28 Ｖ 27/26 ３３１Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 レイモン，フレデリック スイス国，セアッシュ−1093 ラ コンベ ルジョン，シュマン デ マリオネッテ 15 (72)発明者 ジロール，ユーベル アッシュ． スイス国，セアッシュ−1088 ロプラ Ｆターム(参考） 2G052 AA28 AB16 AD26 AD46 BA12 BA14 CA02 CA03 CA04 CA20 CA29 CA30 DA09 DA12 DA15 EB11 EB12 EC17 FC06 FC07 FC11 FC15 FD12 FD20 GA08 GA11 GA18 GA21 GA28 GA30 HC36 JA03 JA04 JA07 JA11 JA13 JA16 2G058 AA09 DA07 EA11 FB03 GA02

Claims (59)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 水性流体が関与する化学アッセイを行うための装置であって
    ；少なくとも１つの反応チャンバ、該反応チャンバ又は各々の反応チャンバと連
    絡する少なくとも１つの流体流入チャネル、及び水性流体が流体進入力の作用を
    受けるまで、該流体が１以上の流体流入チャネルを通って１以上の反応チャンバ
    内へと通過するのを防止するように適合させられたゲート手段を含み、該ゲート
    手段が、疎水性内表面を有する該流体流入チャネル又は各々の流体流入チャネル
    の少なくとも一部分を含む装置。
  2. 【請求項２】 反応チャンバが１〜１０００μｍの範囲内の少なくとも１つ
    の寸法を有するマイクロチャネルを含む請求項１に記載の装置。
  3. 【請求項３】 流体流入チャネルが１つの基板内に形成され、少なくともこ
    の基板の一部分が、疎水性材料で構成されている請求項１又は２に記載の装置。
  4. 【請求項４】 流体流入チャネルが１つの基板内に形成され、この基板の少
    なくとも一部分は、それを疎水性にするべく、物理的又は化学的に処理されてい
    る、請求項１又は２のいずれか１項に記載の装置。
  5. 【請求項５】 流体流入チャネルが、１０μｍ２〜１０００ｍｍ２の範囲内
    の断面積を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
  6. 【請求項６】 流体流入チャネルが、（例えばエッペンドルフ（登録商標）
    タイプの）標準的ピペットと形状が相補的になるように成形されている、請求項
    １〜５のいずれか１項に記載の装置。
  7. 【請求項７】 流体進入力がピストン圧力によって提供されている、請求項
    １〜６のいずれか１項に記載の装置。
  8. 【請求項８】 各々流入チャネル及び付随するゲート手段と連絡している複
    数の個別の反応チャンバを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
  9. 【請求項９】 各々の反応チャンバに個別の流入チャネルが具備されている
    、請求項８に記載の装置。
  10. 【請求項１０】 全ての反応チャンバに対する共通の導管を形成する１本の
    流入チャネルが存在する、請求項８に記載の装置。
  11. 【請求項１１】 各々のマイクロチャネルが流入チャネルから遠位にあるそ
    の端部において、共通導管と連絡しており、該共通導管は、導管に対し減圧を加
    えかくして作動中のマイクロチャネルを通して流体を引込むべく選択的に適合さ
    れた吸引手段に連結されている、請求項２に付帯する請求項８，９又は１０に記
    載の装置。
  12. 【請求項１２】 共通導管が０．０１ｍｍ２〜２５ｃｍ２の範囲内の断面積
    を有する、請求項１０又は１１に記載の装置。
  13. 【請求項１３】 マイクロチャネルが一般に互いに平行に配置されている、
    請求項１〜１２のいずれか１項に記載の装置。
  14. 【請求項１４】 マイクロチャネルが共通導管に対し一般に垂直に配置され
    ている、請求項１０〜１２のいずれか１項に付帯する請求項１３に記載の装置。
  15. 【請求項１５】 １本のテープ上に合わせて取付けられた請求項１４に記
    載の複数の装置を含む装置。
  16. 【請求項１６】 実質的に円形の基板を含み、マイクロチャネルが実質的に
    半径方向に配置され、各々のマイクロチャネルの流入チャネルが円の円周に向か
    っており、その反対側の端部が、前記吸引手段に連結された中央チャンバと連絡
    している、請求項１１に記載の装置。
  17. 【請求項１７】 実質的に円形の基板を含み、マイクロチャネルが実質的に
    半径方向に配置され、１以上の流入チャネルが円の中心に向かって配置され、各
    マイクロチャネルが、該円の円周に向かって反対側の端部に廃棄物チャンバを有
    する、請求項８又は９に記載の装置。
  18. 【請求項１８】 実質的に円形の基板の厚みが５０〜５０００μｍの範囲内
    にある、請求項１６又は１７に記載の装置。
  19. 【請求項１９】 円形基板が回転可能であり、基板を回転させた時に遠心圧
    力により流体進入力が提供される、請求項１６に記載の装置。
  20. 【請求項２０】 回転可能な支持部材上に配置された請求項１３又は１４に
    記載の複数の装置を含む装置において、支持部材を回転させた時に遠心圧力によ
    って流体進入力が提供される、装置。
  21. 【請求項２１】 封着されたキャビティが水性流体の充てんされたタンクを
    形成している状態で該反応チャンバ又は各反応チャンバがその近くに具備されて
    いる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の装置。
  22. 【請求項２２】 キャビティ内の水性流体に増大した圧力を加えることによ
    って開放させることのできる、通常は閉鎖しているバルブを介してタンクが反応
    チャンバと連絡している、請求項２１に記載の装置。
  23. 【請求項２３】 キャビティ内に適合するように整形された外部幾何形状を
    有するピストンをさらに含み、キャビティは、作動中ピストンによって破られる
    破断可能なシールによってキャッピングされており、キャビティ内へのピストン
    の動きが、バルブを介してキャビティから反応チャンバまで水性流体を推進する
    のに必要な増大した圧力を提供する、請求項２２に記載の装置。
  24. 【請求項２４】 反応チャンバの表面の少なくとも一部分が導電性材料で形
    成されており、さらに、電気化学手段により反応チャンバ内の標的種の検出を可
    能にするべく、前記導電性部分に連結された電気的検出回路をさらに含む請求項
    １〜２３のいずれか１項に記載の装置。
  25. 【請求項２５】 前記導電性部分が導電性ポリマー性材料で形成されている
    、請求項２４に記載の装置。
  26. 【請求項２６】 前記導電性部分が電極によって形成されている、請求項２
    ４に記載の装置。
  27. 【請求項２７】 前記電極が半導体材料でできている、請求項２６に記載の
    装置。
  28. 【請求項２８】 前記半導体材料が実質的に透明である、請求項２７に記載
    の装置。
  29. 【請求項２９】 半導体材料が酸化インジウムである、請求項２８に記載の
    装置。
  30. 【請求項３０】 反応チャンバ内の標的種によって発出された放射線を検出
    するように適合された電磁放射線検出手段をさらに含む、請求項１〜２３のいず
    れか１項に記載の装置。
  31. 【請求項３１】 検出手段が、反応チャンバの少なくとも一部分に沿って配
    置された少なくとも１つのフォトダイオード又は少なくとも１つの光電子増倍管
    アレイを含む、請求項３０に記載の装置。
  32. 【請求項３２】 化学試薬が、反応チャンバの内表面の少なくとも一部分の
    上に固定化されており、該試薬は、その存在又は濃度を決定すべき標的種と相互
    作用するように適合されている、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の装置。
  33. 【請求項３３】 試薬がオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質又
    は他の天然又は合成の分子を含む請求項３２に記載の装置。
  34. 【請求項３４】 試薬が反応チャンバの前記内表面上に吸着されている、請
    求項３２又は３３に記載の装置。
  35. 【請求項３５】 試薬が、反応チャンバの前記内表面に対し共有結合によっ
    て付着させられている、請求項３２又は３３に記載の装置。
  36. 【請求項３６】 共有結合がスクシンイミド結合剤を介して達成される、請
    求項３５に記載の装置。
  37. 【請求項３７】 試薬が、架橋剤を介して反応チャンバの前記内表面に対し
    て静電気により付着されている、請求項３２又は３３に記載の装置。
  38. 【請求項３８】 架橋剤がポリリシンである、請求項３７に記載の装置。
  39. 【請求項３９】 流体流入チャネル及び／又は反応チャンバの内表面の少な
    くとも一部分には、表面の化学的又は物理的処理によって形成された化学的官能
    基が具備されている、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の装置。
  40. 【請求項４０】 反応チャンバ及び／又は流体流入チャネルが１以上の凹部
    （ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）として形成されている基板を含み、該反応チャンバ及
    び／又は流体流入チャネルが基板上に適用されたオーバレイ層によって封着され
    ている、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の装置。
  41. 【請求項４１】 基板及びオーバレイ層がポリマー性材料で形成され、材料
    のうちの少なくとも１つの融点は、基板及びオーバレイ層が熱積層により共に封
    着され得るよう充分低いものである、請求項４０に記載の装置。
  42. 【請求項４２】 前記少なくとも１つの材料がポリエチレンである、請求項
    ４１に記載の装置。
  43. 【請求項４３】 オーバレイ層がエラストマ材料で形成されている、請求項
    ４０又は４１に記載の装置。
  44. 【請求項４４】 エラストマ材料がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で
    ある、請求項４３に記載の装置。
  45. 【請求項４５】 基材の少なくとも一部分が、実質的に不透明の材料で形成
    され、オーバレイ層が実質的に透明な材料で形成されている、請求項３０又は３
    １に付帯する、請求項４０に記載の装置。
  46. 【請求項４６】 実質的に不透明の材料が炭素充てんされたポリマー又はセ
    ラミクス材料を含む、請求項４５に記載の装置。
  47. 【請求項４７】 いずれの順序でも又同時にでも実施できる、少なくとも１
    つの反応チャンバを形成するステップ及び反応チャンバと連絡する少なくとも１
    つの流体流入チャネルを形成するステップを含み、該流体流入チャネル又は各々
    の流体流入チャネルは、流体が流体進入力の作用を受けるまで反応チャンバ内へ
    と流体流入チャネルを通して流体が通過するのを防止するためのゲート手段とし
    て作用するように適合された疎水性内表面を有している、請求項１〜４６のいず
    れか１項に記載の装置の製造方法。
  48. 【請求項４８】 装置がポリマー性材料から形成されている、請求項４７に
    記載の方法。
  49. 【請求項４９】 装置が、射出成形、高温型押、フォトアプリケーション、
    流し込成形又は金型上での重合によって形成されている、請求項４８に記載の方
    法。
  50. 【請求項５０】 中に少なくとも１つの凹部を有する基板を形成するステッ
    プ及び、少なくとも１つの流体流入チャネル及び／又は少なくとも１つの反応チ
    ャンバを形成するべく該凹部又は各々の凹部を封着するように基板上にオーバレ
    イ層を適用するステップを含む、請求項４８又は４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 オーバレイ層が熱積層により基板と封着されている、請求
    項５０に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 装置の少なくとも一部分がセラミクス材料、ガラス、導体
    又は半導体材料で形成されている、請求項４７に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 少なくとも１つの反応チャンバから遠位にある少なくとも
    １つの流体流入チャネルの端部にテスト対象の水溶液の少なくとも１つのサンプ
    ルを配置するステップ、流体進入力を加えることによって流体流入チャネルを介
    して反応チャンバにサンプルを進入させるステップ、及び標的物質の存在又は濃
    度について反応チャンバ内のサンプルを監視するステップを含む、請求項１〜４
    ６のいずれか１項に記載の装置の操作方法。
  54. 【請求項５４】 １以上のサンプルは、標的物質の存在又は濃度について１
    以上の反応チャンバ又は吐出されたサンプルが監視される前に、１以上の反応チ
    ャンバから退出させられる、請求項５３に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 サンプル又は各々のサンプルが、ピペット、シリンジ又は
    電動インジェクタを用いて適用される、請求項５３又は５４に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 吸引手段によって流体進入力が提供され、吸引手段が０．
    １〜１００秒の範囲内の時間反応チャンバ又は各々の反応チャンバに対し減圧を
    加えるように活動化される、請求項１１又はそれに付帯する任意の請求項に記載
    の装置を操作するための請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 １〜１００秒の範囲内の時間、毎分１〜１，０００回転の
    範囲内の角速度で基板又は支持部材を高速回転させることによって流体進入力が
    提供される、請求項１９又は２０又はそれに付帯する任意の請求項に記載の装置
    を操作するための、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 １〜１００秒の範囲内の時間、毎分１０〜１００，０００
    回転の範囲内のより高い角速度で基板を高速回転させることによって反応チャン
    バからサンプルが吐き出される、請求項５７に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 流体進入力がピストン圧力により提供される、請求項７又
    はそれに付帯する任意の請求項に記載の装置を操作するための、請求項５３〜５
    ５のいずれか１項に記載の方法。
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