JP4080996B2 - 仮想壁を用いて界面流体を連通させる微細化分離装置 - Google Patents

Description

関連出願の参照
本出願は、2001年6月20日に出願された米国特許仮出願第60/299,515号、2001年12月21日に出願された米国特許出願第10/028,852号、2001年12月21日に出願された米国特許出願第10/027,484号、2001年12月21日に出願された米国特許出願第10/027,516号、2001年12月21日に出願された米国特許出願第10/027,171号、2001年12月21日に出願された米国特許出願第10/027,922号、2001年12月21日に出願された米国特許出願第10/029,108号、および2002年1月24日に出願された米国特許出願第10/057,354号に対する優先権を主張するものである。これらの出願はすべて、参照として明示的に本明細書に組み入れられる。

発明の背景
本発明は、微細化システムにおいて試料を分離する装置および方法に関する。特に、本発明は、微細化毛管アレイ分離装置において流体を連通させる流体界面ポートに関する。

遺伝子マッピング、遺伝子配列決定、疾患診断のような多数の診断手順
および遺伝子同定手順において、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、またはタンパク質が、その物理的性質および化学的性質に応じて分離される。DNA、RNA、またはタンパク質だけでなく、他の小さな分子アナライトも分離する必要がある。

1つの電気化学分離プロセスは電気泳動として知られている。このプロセスでは、緩衝液が満たされたリザーバに連結された毛管または分離管路で分子が移送される。キロボルトの範囲の電界が管路の両端間に印加され分子が泳動する。試料は通常、高電位端部から導入され、電界の影響下で、管路の低電位端部の方へ移動する。分離された試料は、管路を通って泳動し、適切な検出器によって検出される。

電気泳動システムの方へ、電気泳動システム内で、または電気泳動システム間で、流体、たとえば試料や、アナライトや、試薬や、合成の前駆物質や、緩衝液を連通させる多数の方法が発表されている。一般に、チップ状装置上に実現された毛管電気泳動カラムに液体を導入するために界面動注入が行われる。この方法では、第1のウェルから分離管路の方へ液体が汲み出され、第1のウェルと下流側に配置された第2のウェルとの間に高駆動電圧を印加することによって電気泳動分離が行われる。試料管路壁の充電された内側表面によって、電気浸透液体流が導入され、それによって液体が第1のウェルから目標の試料管路に汲み取られる。この方法は、「界面動注入」と呼ばれ、いくつかの欠点を有する。1つの欠点は、多数の液体を取り扱う必要がある場合、たとえば、高スループットの合成用途やスクリーニング用途において、微量流体装置上に多数のウェルを一体化する必要があることである。典型的な壁の比較的大きなフットプリントは、実際の化学工程が行われる試料分離管路と比べて、チップ表面の大部分を占有する。微量流体チップのコストは、チップ表面に強く依存するため、この液体注入方式は、ウェルを一体化する必要があるので、高スループットの合成用途およびスクリーニング用途には不適切である。

たとえば、米国特許第6,143,152号は、界面動注入を介して電気泳動システムに試料を導入する試料リザーバのアレイを含む毛管アレイ電気泳動マイクロプレートを含む電気泳動システムを記載している。第1のウェルから分離管路の方へ液体が汲み出され、このウェルと下流側に配置された第2のウェルとの間に高駆動電圧を印加することによって電気泳動分離が行われる。管路壁の充電された内側表面によって、電気浸透液体流が導入され、それによって液体が第1のウェルから目標の試料管路に汲み取られる。第6,143,152号に記載されたシステムの欠点は、試料リザーバのフットプリントが、実際の化学工程が行われる管路（直径約50μm）と比べて比較的大きく（直径約5mm）、そのため注入効率が低いことである。試料リザーバに供給される試料の少量の一部のみが分離管路に導入され、したがって、廃棄物が多く非効率的である。

発明の概要
本発明は、毛管または分離管路のアレイと液体を分離管路に導入し分離管路から除去する1つまたは複数の流体界面ポートとを含む、毛管アレイ電気泳動（CAE
）マイクロプレートなどの分離装置を提供する。例示的な態様の流体界面ポートは、分離装置を直接周囲の環境と連通させるポートであり、1つの分離管路の側壁に形成された開口によって形成される。この開口は、分離管路に液体分離媒体が満たされた場合に仮想壁を形成する。この開口は、毛管力によって分離媒体が分離管路内に保持されるように適切な断面寸法を有している。仮想壁は、開口部内の分離媒体のメニスカスによって形成され、試料管路を通る流体流に実質的に影響を与えないように基本的に分離管路の側壁の代わりとして働く。陰極リザーバは、1つまたは複数の分離管路と組み合わされている。いくつかまたはすべての分離管路に共通する陽極リザーバもマイクロプレート上に設けられており、各分離管路を通る電気経路を形成する。

一局面によれば、試料を分離する分離装置が提供される。分離装置は、1つまたは複数の陽極リザーバと、陽極リザーバに連結され、側壁に囲まれた内側を有する複数の分離管路と、1つの分離管路の側壁に形成され、分離管路の内側および2つまたはそれ以上の分離管路と組み合わされた少なくとも1つの陰極リザーバに達する1つまたは複数の流体界面ポートとを含んでいる。分離管路の内側に配置された流体は、流体界面ポートに仮想壁を形成する。

本発明の他の局面によれば、試料を分離する分離装置が提供される。分離装置は、微細化分離管路のアレイと、流体界面ポートのアレイと、陰極リザーバのアレイと、陽極リザーバのアレイとを含んでいる。分離管路は、側壁に囲まれた内側を有しており、第1の微細化基板の表面および第1の基板の表面に結合された第2の基板の対応する表面に形成されている。各分離管路は第1の端部および第2の端部を有している。流体界面ポートは、各分離管路の側壁に形成され、各分離管路の内側に達する。分離管路の内側に配置された流体は、アレイ内の各流体界面ポートに仮想壁を形成する。陰極リザーバのアレイは、各分離管路の第1の端部に連結されている。少なくとも1つの陽極リザーバが、少なくとも2つの分離管路のそれぞれの第2の端部に連結されている。

本発明の他の局面によれば、基板と、基板に形成された複数の分離管路と、複数の流体界面ポートと、陽極リザーバとを含む分離装置が提供される。流体界面ポートは、各分離管路の側壁に形成され、分離管路の内側に達し、分離管路の内側に配置された分離媒体は流体界面ポートに仮想壁を形成する。複数の分離管路の各分離管路は、少なくとも1つの専用流体界面ポートと流体連通している。陽極リザーバは、複数の分離管路のうちの2つまたはそれ以上と組み合わされている。

本発明の他の局面によれば、基板と、基板に形成された複数の分離管路と、複数の流体界面ポートと、陰極リザーバとを含む分離装置が提供される。流体界面ポートは、各分離管路の側壁に形成され、分離管路の内側に達する。分離管路の内側に配置された分離媒体は流体界面ポートに仮想壁を形成する。複数の分離管路の各分離管路は、少なくとも1つの専用流体界面ポートと流体連通している。陰極リザーバは、複数の分離管路のうちの2つまたはそれ以上と組み合わされている。

他の局面によれば、液体試料を分離装置に注入する方法が提供される。この方法は、陰極リザーバを2つまたはそれ以上の分離管路のそれぞれの第1の端部に連結する段階と、陽極リザーバを2つまたはそれ以上の分離管路のそれぞれの第2の端部に連結する段階と、液体試料から液滴を形成する段階と、分離管路の側壁に形成された流体界面ポート内の分離媒体によって形成される仮想壁に液滴を送る段階と、流体界面ポートに電圧を印加して試料を分離管路に引き込む段階とを含む。

本発明の他の局面によれば、試料をそれぞれの異なる成分に分離する分離装置を形成する方法が提供される。この方法は、分離装置内の側壁に囲まれた内側によって形成される複数の分離管路を形成する段階と、各分離管路の側壁に流体界面ポートを形成して、各分離管路の内側に達する段階と、陽極リザーバを複数の分離管路のうちの2つまたはそれ以上に連結する段階とを含む。各流体界面ポートは、分離管路に分離媒体が満たされた場合に仮想壁を形成する。

本発明の最後の局面によれば、試料をそれぞれの異なる成分に分離する分離装置を形成する方法が提供される。この方法は、側壁に囲まれた内側によって形成される複数の分離管路を分離装置内に形成する段階と、各分離管路の側壁に流体界面ポートを形成して、各分離管路の内側に達する段階と、陰極リザーバを複数の分離管路のうちの2つまたはそれ以上に連結する段階とを含む。各流体界面ポートは、分離管路に分離媒体が満たされた場合に仮想壁を形成する。

発明の詳細な説明
本発明は、流体を導入し分離装置内の分離管路から流体を除去する改良された流体連通装置を提供する。本発明は、分離管路の側壁に仮想壁を形成する開口部を利用して流体試料を導入しかつ除去することによって、流体試料の制御性を改善し、注入効率を高め、スループットを向上させ、廃棄物を少なくする。本発明について、毛管アレイ電気泳動マイクロプレートを含む例示的な態様を参照して説明する。当業者には、本発明が電気泳動システムに限らず、電気クロマトグラフィーシステム、圧力駆動クロマトグラフィーシステム、および等電子集束システムを含むがそれらに限らない任意の適切な分離システムで実施できることが認識されると考えられる。

1つまたは複数の例示的な態様は、毛管アレイ電気泳動マイクロプレートとの流体連通を実現する。本発明によって、比較的多数の化学工程を小さなチップ表面上で行うことができ、それによって大規模に並列された合成システムおよび分析システムを費用有効に実施し効率的に動作させることができる。本発明はさらに、連通に必要な液体の量を著しく少なくし、化学物質の消費量をかなり減らすと共に、化学廃棄物を少なくする。本発明はさらに、100%に近い注入効率で液体を注入する方法およびシステムを提供し、取り扱われる液体を電気化学的に汚染することのない液体注入方法およびシステムを提供する。本発明は、界面動システムにおいて液体の注入を高速に繰り返し、高スループットの合成用途、スクリーニング用途、および分析用途を実現する方法およびシステムを提供する。本発明はさらに、界面動微量流体システムによって注入すべき流体のガルバニック分離を可能にする。

本明細書では、「分離」は、一定または可変の電界あるいは管路の第1の端部と第2の端部間に作用する移送力の影響下で粒子が分離管路内の流体中を通って移動し、このような条件の下での粒子の移動性に基づいて流体中の粒子を分離させることを指す。このような分離の例には、電気泳動、電気クロマトグラフィ、圧力駆動クロマトグラフィ、および等電子集束が含まれるがそれらに限らない。

本明細書では、「電気泳動システム」は、試料に対して電気泳動を行うのに適したシステムを指す。

図1は、内容が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第6,143,152号に記載された従来の毛管アレイ電気泳動（CAE）マイクロプレート10を示す。マイクロプレート10には、毛管または分離管路50のアレイがエッチングされている。図1に示されているように、先行技術のマイクロプレート10は、150マイクロメートル（μm）周期アレイとしてエッチングされた48個の個々の分離管路を含んでいる。マイクロプレート10は、分離管路50に連結され、マイクロプレート10に試料を導入する試料注入装置11のアレイをさらに含んでいる。各試料注入装置11は、各々が、供給された分離すべき試料を保持する複数の試料リザーバ12と、分離管路50から廃棄物を収集する廃棄物リザーバ13とを含んでいる。マイクロプレート10は、1つまたは複数の分離管路5と組み合わされた複数の陰極リザーバ16と、いくつかまたはすべての分離管路50に共通であり、分離管路50内を通る電気経路を完成する陽極リザーバ18とを含んでいる。マイクロプレートの注入装置11は、対応する陰極に一体型化し、連結している。

図2は、図1に示されているマイクロプレート10の試料注入装置11の詳細を示している。第6143152号特許の試料注入装置11は、供給された分離すべき試料を保持するリザーバ12a、12b、12c、および12dと連通する第1および第2の分離管路50aおよび50bを含んでいる。注入装置11内の第1および第2の分離管路50a、50bは、交差管路27によって廃棄物を収集する廃棄物リザーバ13に連結されている。図示のように、試料注入装置11は陽極端部21aおよび陽極端部22aをさらに含んでいる。陰極端部および陽極端部は、第1の分離管路50aの両端部に配置されている。第2の陰極端部21bは、廃棄物リザーバ13にも連結された第2の分離管路50bによって第2の陽極端部22bに連結されている。

一群の試料を試料リザーバ12から分離管路50内に充填する場合、試料リザーバ12と廃棄物リザーバ13との間に注入電圧が印加され、試料が交差管路27に引き込まれる。試料群が交差管路27内に充填された後、注入装置11の陰極端部21と陽極端部22との間に約3700ボルト（300V/cm）の分離電圧が印加される。これによって、試料の電気泳動分離が起こる。さらに、試料リザーバ12と注入廃棄物リザーバ13との間に逆バイアスの電位が印加される。逆バイアス電圧は約720Vである。逆バイアス工程によって注入交差管路27から余分な試料が除去され、100μm・サイズの試料群が得られる。

図1および2に示されている構成は、顕著な制限および欠点を有する。図示のように、試料注入装置は、製造するのが困難でコストが高いかなり複雑で大形の構造を必要とする。プレート10の大部分は、実際の電気泳動ではなく試料注入専用であり、空間が無駄になる。さらに、図示の構成では、必要以上の量の試料が本来試料リザーバから分離管路に導入され、それを分離によって減らさなければならいないので、試料が無駄になる。必要な少量の一群の試料を得るために、先行技術のプレートでは、試料リザーバから試料を引き出し、試料を分離して余分の試料を除去し、余分の試料を廃棄物リザーバに送る試料注入回路が必要である。したがって、先行技術のマイクロプレートでは、顕著な量の試料が無駄になると共に、空間および資源の利用が非効率的である。

本発明の例示的な態様によれば、試料が、注入装置群ではなく、分離管路の側壁に形成された流体界面ポートを介して分離管路内に直接注入される改良された分離装置が提供される。図3は、毛管アレイ電気泳動（CAE）マイクロプレート100として図示された本発明の例示的な態様による分離装置を示している。本明細書では、「流体界面ポート」は、分離管路に形成され、分離管路の内側と外側との間に流体が達する開口のような、分離システム内の構造を指す。流体連通ポートは、分離管路の注入領域110に形成され、流体およびその他の材料を対応する分離管路に導入し、かつ／または流体および／もしくはその他の材料を対応する分離管路から除去するのに用いられる。

例示的な態様によれば、マイクロプレート100は、管路の内側の少なくとも一部を密閉する任意の適切な形状を有する側壁によって形成される分離管路500のアレイを含んでいる。分離管路500は、約1.0μmから約250μmの間、好ましくは約25μmから約150μmの間、好ましくは約50μmから約100μmの間の範囲の断面寸法を有している。当業者には、分離管路の適切な体積および長さを決定することができると考えられる。分離管路500は、たとえば、線形構成または非線形構成やU字形構成が含まれる任意の選択された形状または構成を有してよい。マイクロプレート100は、ガラス、プラスチック、シリコンを含むがそれらに限らない任意の適切な材料から形成することができる。毛管電気泳動マイクロプレート100は、印加される電界の影響下で試料をそれぞれの異なる成分に分離する任意の適切な数の分離管路500を含んでよい。マイクロプレート100は、1つまたは複数の分離管路と組み合わされた複数の陰極リザーバ120と、いくつかまたはすべての分離管路500に共通であり、分離管路500内を通る電気経路を完成する陽極リザーバ180とを含んでいる。マイクロプレート100内の分離管路500は、グループ化され対応する陰極リザーバ120に連結されている。

例示的な態様によれば、図4Aに詳しく示されている分離管路500の注入領域110内の流体界面ポート17は、分離管路500の側壁に形成され、試料を分離管路の内側に導入できるようにする開口を含んでいる。流体界面ポート17は、分離管路500の側壁51の一部を開口部を形成するように除去することによって側壁に形成されている。例示的な態様の流体界面ポート17は、約0.1μmから約200μm、好ましくは約25μmから約125μm、最も好ましくは約50μmから約100μmの間の直径を有する、分離管路500の側壁の開口によって形成されている。流体界面ポート17を形成する開口は、円筒形、円板、円錐状、楕円形、および立方体形状を含むがそれらに限らない任意の適切な形状を有してよい。分離管路500の側壁51は、分離管路の体積全体を結合する2つまたはそれ以上の構成要素によって形成することができる。

本発明の例示的な態様によれば、流体界面ポート17を通して試料を注入した後電界を印加することによって分離を行うのに適した分離媒体が分離管路500に満たされる。好ましくは、分離媒体は、1μm臭化エチジウムを含む1xTBE緩衝液に溶かした0.75%重量／体積のヒドロエチルセルロース（HEC）である。ただし、当業者には、試料を分離させる任意の適切な媒体を利用できることが認識されると考えられる。本発明の一態様によれば、分離管路に陽極リザーバ180からふるい分けマトリックスを、すべての分離管路が満たされるまで圧力充填することができる。次いで、電気泳動中のイオン減損を減らすために陽極リザーバ180および陰極リザーバ120に10xTBE緩衝液が満たされる。この流体界面ポート17を脱イオン水ですすいでもよい。

図4Aは、流体界面ポート17を示す、例示的な態様による分離管路500の詳細側面図である。図4Aに示されているように、流体界面ポート17は、分離管路に分離媒体20が満たされた場合に仮想壁15を形成するようなサイズおよび寸法を有している。本明細書では、「仮想壁」は、分離管路の側壁に形成されたポート内の分離媒体によって形成されるメニスカスを指す。メニスカス表面は、必須ではないが、メニスカスが形成される分離管路の壁51と実質的に同一平面を形成してよい。メニスカスは、基本的に、側壁の、開口17を形成する除去された部分の代わりをする。語「仮想」は、電気泳動システムの分離管路500を通る流体流全体が仮想壁の影響を受けるわけでなくすなわち、仮想壁を有するマイクロプレート100内の液体の流れが、仮想壁が存在しない同一のマイクロプレート内を通る液体の流れと実質的に同一であることを表すのに選択されている。一実施例による流体界面ポート17は、ポートもメニスカスも形成されない分離管路と比べて、実質的に液体の流れおよび液体の形状全体に影響を与えない適切な寸法および表面特性を有している。仮想壁は、分離管路の内側と分離管路の外側との間に直接的な界面を形成する。当業者には、流体界面ポートの表面または壁をポートの軸方向高さに沿った任意の場所に形成されることが容易に認識されると考えられる。当業者には、メニスカスが適切なシステム圧力に応じて凹状であっても凸状であってもよいことが認識されると考えられる。

図4Aは、分離媒体20の試料を仮想壁15を介して液滴の形で導入するプロセスをさらに示している。図示のように、液体試料19aは、試料導入管路や試料リザーバなどの中間構造を必要とせずに仮想壁15を通して分離管路500内の分離媒体20内に直接注入することができる。図示の態様によれば、液体試料は、液滴生成システム185を用いて液体試料19aの液滴19bを形成し、液滴を、仮想壁15を横切り分離管路500の内側に入るように、図4Aに速度ベクトルVで示されている適切な速度および方向によって仮想壁15の方へ液滴を送ることによって導入される。流体界面ポート17は、分離管路の内側と外側との間に直接的な界面を形成する。本発明によれば、マイクロプレート100内に配置された分離媒体20と周囲の気体相との間の界面は、個別の管路構造またはリザーバ構造によってではなく、分離管路50内の固体壁が局所的に存在しないことによって形成される。

図示の態様によれば、流体界面ポート17の横方向寸法は、実質的に分離管路500の直径以下であり、一方、図示の液滴19bの直径は流体界面ポート17の横方向寸法よりも小さい。流体界面ポート17は、ウェルや試料導入管路のような従来の流体界面ポートと比べて実質的に小さいデッドボリュームを有する。本明細書では、「デッドボリューム」は、流体界面ポート17内に保持される液体の体積を指す（すなわち、分離管路を通る分離媒体のフロー・フィールド（flow field）によって流体界面ポートを通して流されることのない、流体界面ポートが保持する液体の体積）流体界面ポート17の総体積は、側壁に形成された開口の面積および側壁51の厚さによって定められる。流体界面ポート17を満たす分離媒体の体積は、デッドボリュームを定める。図示の態様によれば、流体界面ポートは、約1ナノリットルよりも少なく、好ましくは1ピコリットルよりも少なく、最も好ましくはほぼ零であるデッドボリュームを有する。好ましくは、デッドボリュームは、流体界面ポート17を通して注入される液体試料の体積よりも少ない。

開口のサイズおよび流体界面ポートの疎水性によってデッドボリュームのサイズが決定される。たとえば、図4Aに示されている分離管路500は零デッドボリュームを有し、すなわち、流体界面ポート17に液体が保持されることはなく、ポート17を通して注入された試料は直接分離管路の内側に入る。他の態様によれば、分離媒体は開口を部分的に満たしても、完全に満たしてもよく、デッドボリュームは非零であるが実質的な小さな値であってよい。デッドボリュームは、メニスカス15が上向きに膨張するか、それとも下向きに膨張するか、ポート17の疎水性によって制御される因子、分離管路500を満たす分離媒体の特性、ポート17を形成する開口のサイズにも依存する。

仮想壁15によってもたらされる比較的小さなデッドボリュームにより、直接的な界面が形成され、貴重な量の試料を分離管路500の外側から分離管路500の内側に直接注入することができる。流体界面ポート17のデッドボリュームが少ないので分離管路に試料を直接注入できるため、分離管路500に注入される試料の量の調節が改善され、試料を効率的に使用できるようになり、試料の廃棄物が著しく少なくなる。さらに、非常に少ないデッドボリュームによって実現される直接的な注入により、互いに異なる試料間のクロス汚染が軽減または防止され、かつ流体界面ポート17を洗浄する必要なしに第1の試料の直後に第2の試料をシステムに直接注入することができる。逆に、流体試料を分離管路に導入する試料リザーバを含む個別の注入装置構造を使用する第6143152号特許に記載されたマイクロプレートでは、デッドボリュームが分離管路のサイズと比べて著しく大きい。分離管路の内側に流体試料を導入するには、まず流体試料がデッドボリュームを通過しなければならない。デッドボリュームが大きいと、試料が分散し、注入の時間と、試料が分離管路に入る時間との間に時間遅延が起こり、注入が非効率的になり、場合によっては、互いに異なる試料間にクロス汚染が起こり、実際に分離管路に達する試料の量を調節するのが困難になる。これらの問題は、例示的な態様による仮想壁15を形成する流体界面ポート17を用いることによって解消または軽減される。

貴重な量の試料を分離システムの分離管路に直接注入することができるため、分離システムの構成および動作が著しく簡略化される。本発明では、複数の試料リザーバ、廃棄物リザーバ、および交差管路が無くても試料の注入を推進することができ、分離管路の側壁に直接形成された開口を利用して試料を分離管路の内側と連通させる。再び図3を参照すると、マイクロプレート100の注入領域110は、図1に示されているマイクロプレート注入装置と比べて著しく簡略化されている。例示的な態様の流体界面ポートは、分離管路に導入される試料の体積の調節を改善し、同時に、システムの全体的な構造を簡略化し、より小形のマイクロプレートを実現し、より多くの試料を処理できるようにする。本発明の例示的な態様の流体界面ポート17はさらに、汚染の恐れなしに第1の試料の後に他の試料を直接、分離管路500に注入できるようにする。これに対して、第6,143,152号特許のマイクロプレートは、様々な試料を処理するために、プレート上に別々の試料リザーバを必要とし、それぞれの異なる試料ごとに異なる時間に作動させられる。

図3の態様では、マイクロプレート100の穴Hの数は、第6,143,152号特許に記載されたマイクロプレートと比べて著しく少なくなっている。例示的な態様の各分離管路500では、試料の分離および導入を可能にする流体界面ポート17を形成する開口部は1つだけでよく、マイクロプレート100は陰極および陽極用の開口部をさらに含んでいる。これに対して、第6,143,152号特許のマイクロプレート10の穴の数は、注入装置11を介した試料導入により多くの穴が必要であるため5N/4+7である。例示的な態様ではマイクロプレート100に形成される穴が少なくなるため、製造効率が高まり、さらに、掘削プロセスに伴う機械的応力によってマイクロプレートの作製時に欠陥が生じる可能性が低くなる。さらに、陰極120および陽極180が複数の分離管路500と組み合わされるので、より多くの分離管路500を単一の基板に取り付けることができる。流体界面ポート17のサイズが小さくなるため、より小形の構造も実現され、ずっと多くの分離管路500を単一の基板上に取り付けることができる。上記の利点は、掘削プロセスではなく成形プロセスまたは結合プロセスによって穴を形成する場合に適用することもできる。

試料は仮想壁15を介してマイクロプレート100内の分離管路500内に手動で充填することも自動的に充填することもできる。直列注入を用いて、所定数の毛管によって試料スループットを高めることができる。一態様によれば、分離管路は、分離管路500に複数の試料を導入できるようにする仮想壁を形成する複数の流体界面ポートを有してよい。さらに、CAEマイクロプレート100上の毛管の数を増やすと、それに応じて、試料汚染を導入することなしにスループットが高くなる。仮想壁を用いて流体をマイクロプレート100と連通させることの特定の利点は、流体界面ポート17を洗浄する必要なしに第1の試料の直後に異なる試料を注入できることである。

たとえば、試料液滴は、マルチヘッド・ピペッタや、2001年9月25日に出願され、「2ピン液体試料供給システム（Two-Pin Liquid Sample Dispensing System）」という名称を有し、内容が参照して本明細書に組み入れられる米国特許仮出願第60/325,001号および「液滴供給システム（Droplet Dispensing System）」という名称を有し、内容が参照して本明細書に組み入れられる米国特許仮出願第60/325040号に記載された液滴供給システムのような任意の適切な液滴生成システム185を用いて形成し供給することができる。当業者には、任意の適切な液滴生成システムを用いて試料の液滴を形成し本発明の例示的な態様による分離装置に供給できることが認識されると考えられる。

図4Bは、分離すべき液体試料19aを仮想壁15を通して分離媒体に導入するプロセスを示す、流体界面ポート17の位置における分離管路500の縦断面図である。図4Bに示されているように、液滴生成システム185は、液滴を保持する液滴保持要素181を含んでいる。例示的な態様によれば、液滴保持要素181は、2001年9月25日に出願され、「2ピン液体試料供給システム（Two-Pin Liquid Sample Dispensing System）」という名称を有する米国特許仮出願第60/325001号および「液滴供給システム（Droplet Dispensing System）」という名称を有する米国特許仮出願第60/325040号に記載された、仮想壁15に接触することによって分離管路500に液滴を導入するピンを含んでよい。

図4Cは、液体試料19aを分離媒体20に注入した直後の分離管路500の断面図である。図示のように、液体試料19aは、分離媒体20中に貴重な体積を有する明確な輪郭を有する試料群190を形成している。他の態様によれば、液体試料は分離媒体20に溶解するか、分離媒体20と融合または混合する。液体試料19aは、仮想壁15を介して導入された後、以下に詳しく説明するように、マイクロプレート100内の分離管路500の両端間に電界を印加することにより分離媒体20によって分離管路を通して移送される。

分離管路の側壁51に配置され仮想壁15を形成する流体界面ポート17は、分離管路の内側に直接達するようにデッドボリュームが十分に少ない、円筒形や円錐形のような任意の適切な形状を有してよい。図4Dに示されている一態様によれば、流体界面ポート17の内壁63は、分離媒体20をはじき分離媒体を開口部17から除去する材料で形成されるかまたはそのような材料で被覆されている。好ましい態様によれば、分離管路500の内壁64は、分離媒体20を引き付け、分離媒体20を分離管路500内に保持する。流体界面ポート17内の液体反発部は、液体がマイクロプレート10から漏れるのを防止し、分離管路に分離媒体20が満たされた場合に流体界面ポート17内に仮想壁15が反復的に形成されるようにする。分離媒体20を引き付ける内壁64を用いることによって、分離媒体20による分離管路500の自動的な受動毛管充填がさらに改善される。毛管力の結果として、ポンプや圧力チャンバなどの外部エネルギーや圧力源を適用する必要なしに分離管路500を自動的に満たすことができる。

図4Eは、分離管路500および仮想壁15が被覆層66で覆われる態様を示している。例示的な態様によれば、被覆層66は、分離管路内の分離媒体20と混合できる液体層を含んでいる。被覆層は、分離媒体20が分離管路から開口部17を通って蒸発するのを防止し、しかも液体19aなどの液体試料を被覆層66および仮想壁15を通して分離管路500に注入するのを可能にする。

図4Fに示されている他の態様によれば、分離管路500内の流体界面ポートは、各開口部が、分離管路500に分離媒体20が満たされた場合に仮想壁15を形成する、開口部17のアレイ72によって形成される。アレイ72内の仮想壁15は、互いに近接して配置されており、それによって、図4Gに示されているように液体ウィッキング・をプロセスによって注入することができる。分離管路500に液体試料を導入する場合、図4Gに示されているように、選択された量の液体試料19aがアレイ72上に配置され、したがって、毛管力によって液体試料19aが分離管路500に逃がされる。好ましい態様によれば、流体界面ポート17の内壁63は、分離媒体20をはじくようになっており、一方、流体界面ポート17の他の表面は好ましくは、液体試料19aを引き付けるようになっている。開口部のアレイを用いて仮想壁のアレイを形成すると、液滴19bを特定の仮想壁の方へ厳密に向ける必要性および重大性が低くなる。液滴はアレイの方向に向けるだけでよく、毛管力によって液滴を管路の内側に引き込むことができる。分離管路500内への試料の注入を達成するうえで、推進される液滴の速度および方向はそれほど重要ではない。

本発明の他の態様によれば、分離管路内の複数の位置において液体を仮想壁を介して導入または吐出するのを可能にする複数の開口部が分離管路500の側壁51に配置される。たとえば、分離管路500は、分離管路500の幅を横切ってまたはこの幅に沿って位置させられ、複数の液体を同時にまたは順次導入できるようにする複数の仮想壁15を形成する、複数の流体界面ポート17を含んでよい。このように、より多くの液体を複数の仮想壁を介して分離管路に直接注入することができる。分離管路に沿って複数の仮想壁を用いることによってさらに、複数の異なる液体を同時に導入し混合することができる。あるいは、分離管路500は、分離管路の長さに沿って配置され、流体流路内のそれぞれの異なる位置に沿って液体を順次分離管路に導入するかまたは分離管路から吐出するのを可能にする、複数の仮想壁を含んでよい。

図5は、本発明の例示的な態様による図3のマイクロプレート100を含む界面動システム400を示している。図5に示されている例示的な態様によれば、マイクロプレート100は、流体界面ポート17、陰極リザーバ120、および陽極リザーバ180と組み合わされた複数の溶液に電気的に接触する電極アレイ306に結合されている。電極アレイ306は、白金ワイヤなどの導体のアレイをプリント回路板内に配置することによって製造される。各導体は、マイクロプレート100上の流体界面ポート17あるいはリザーバ120または180に係合するようになっている。さらに、これらのワイヤは、共通の種類の個々の流体界面ポートに並列に電気的にアドレス指定できるように回路板上の金属ストリップに電気的に接続されている。電極アレイ306は、仮想壁を通して緩衝液が蒸発する可能性も低くする。電極アレイ306は、コンピュータによって制御される1つまたは複数の電源428に接続されている。

組立後、例示的なCAEマイクロプレート100は、レーザ励起ガルボノレーザを含むガルボスキャナ・システム400を用いて調べられる。システム400は、分離管路500の検出ゾーンで検出器を用いて蛍光を測定する。電気泳動プロセス中に、蛍光種が検出ゾーンを横切る際、目標種が、蛍光を発するか、または目標種に発蛍光団でタグ付けすることによって蛍光種に転換される。蛍光種が検出ゾーンを横切ると、システム400によって検出可能な蛍光の変化、通常は蛍光の増大が起こる。

例示的なガルボスキャナ400は、カリフォルニア州サンホセのUniphase Corporationから市販されているYAGレーザなどの周波数2倍YAGレーザ402を有してよい。YAGレーザは、ビーム、たとえば30mW、532nmビームを生成する。レーザ402によって生成されたビームは、励起フィルタ404を通過し、鏡406によって方向を変えられる。ビームは、鏡406からビーム・エキスパンダ408を通過する。ビームは、膨張後、二色性ビーム・スプリッタ410に送られる。レーザ・ビームはガルバノメータ420に送られ、ガルバノメータ420はビームを最後のレンズ・アセンブリ422に送る。このようにして、ビームは、約5μmのスポットに集束され、そこで管路内の分子からの蛍光を励起し、40Hzで管路を横切って走査される。結果として得られた蛍光は、最後のレンズによって収集され、ガルバノミラーおよび二色性ビーム・スプリッタ410を通過し、約545〜620nmの範囲で動作する放出フィルタ412に至る。ビームは、放出フィルタ412を通過した後、レンズ414によって集束される。次に、ビームは400μmピンホールなどのピンホール416を通過して光電子増倍管（PMT）418に供給される。

図示のように、電極アレイ306は、カリフォルニア州サニーベールのStandard Research Systemsから市販されている直列PS300のような1つまたは複数の電源428に接続することができる。これらの電源は、電極アレイ306に適切な電圧が供給されるように自動的にタイミングをとり切り替えるように制御されるコンピュータおよびソフトウェアに接続されている。ソフトウェアは、従来のコンピュータ言語で書くことも、テキサス州オースチンのNational Instrumentsから市販されているLabVIEWなどのデータ獲得ソフトウェアで指定することもできる。次いで、空間的に明確な蛍光放出に対応するデータを、アリゾナ州タクソンのBurr-Brown Corporationから市販されている16ビットA/D変換器を用いて約77kHzで獲得することができる。次いで、対数データ圧縮が適用され、5線形オーダーの動的測定レンジが生成される。このデータは16ビット画像として得られ、次いでウィーンのSignal Analyticsから市販されているIPLabのような適切なソフトウェアを用いて各管路を横切るデータ・ポイントの和を求めることによってエレクトロフェログラムが生成される。

図示のように、例示的な界面動システム400は、複数の異なる反応およびプロセスを比較小さな基板上で生じさせるのを可能にする小形の構造を有している。仮想壁15を形成する開口部を用いて互いに平行な分離管路500の側壁に流体界面ポート17を形成すると、液体試料が分離管路500と直接連通することができ、注入効率が向上し、システム400に導入される液体の体積の調節が容易になり、マイクロプレートのサイズが実質的に小さくなり、廃棄物が少なくなり、液体試料を分離管路に導入するのが容易になる。

図6を参照すると、本発明の例示的な態様によって試料を分離するCAEマイクロプレート600の第2の態様が示されている。図6では、マイクロプレート600は、液体試料を電界の影響下でそれぞれの異なる成分に分離する分離管路500のアレイを含んでいる。各分離管路500は、仮想壁を形成する分離管路の側壁の開口部によって形成される1つまたは複数の流体界面ポート170を含んでいる。各分離管路500は、それぞれ2つの陰極リザーバの一方660または661に連結されている。分離管路500は陽極630に連結されている。

次に図7を参照すると、本発明の開示によって試料を分離するCAEマイクロプレート650の第3の態様が示されている。図7のCAEマイクロプレート650では、陰極リザーバ660はCAEマイクロプレート650の周囲に位置している。さらに、陽極リザーバ630はCAEマイクロプレート650の中心に位置している。分離管路または毛管500は、より長い分離管路が望ましい場合、マイクロプレート650の外周からマイクロプレート650の中心の方へらせんパターンを描いて延びることができる。または、短い経路が望ましい場合、分離管路500または毛管は、単に、図9に示されている、マイクロプレート650の周囲とCAEマイクロプレート650の中心632を連結する直線であってよい。流体界面ポート170は、分離管路500の側壁の、マイクロプレート650の周囲に設けられ、マイクロプレートへの試料の導入を容易にする。

次に、図8を参照すると、図7のCAEマイクロプレート650の、本発明の例示的な態様の開示によって分離管路の側壁に形成された流体界面ポート170を含む注入領域、および図7のマイクロプレートの周囲における注入領域の位置が詳しく示されている。図8では、2つの分離管路または毛管500aおよび500bが共通の陰極リザーバ660に連結されている。さらに、分離管路500aおよび500bは、その側壁に形成された流体界面ポート170を含んでいる。上述のように、流体界面ポートは、各分離管路500aおよび500bの側壁の開口部によって形成され、液体試料と分離媒体を連通させるのを可能にする。開口部は、分離媒体が流体界面ポート170に仮想壁15を形成するようなサイズおよび寸法を有している。

次に、図9を参照すると、図7の例示的なマイクロプレートの共通の陽極630が詳しく示されている。図9に示されているように、複数の分離管路または毛管500a〜500jは、中央領域632に収束する曲線パターン、たとえば放射状パターンを形成する。中央領域632から、分離管路または毛管は、中央領域632の周囲からCAEマイクロプレートの中心にある共通の陽極リザーバ630までの通路を形成している。中央領域630は、回転スキャナを検出のために使用できる領域である。

さらに、対物レンズを反転させ、下から走査することによって、走査検出システムを変更することができる。光学系をプレートの下に置くと試料の操作および導入が容易になる。走査を反転させることによって、陽極リザーバとの空間的な衝突も回避され、それによって陽極を中央に配置することができる。さらに、PCR反応チャンバのアレイを本発明のマイクロプレートまたはその他の分離システムと一緒に用いて、少量の試料を全体的に増幅できるようにし、試料の操作および手動での移送を不要にし、コストを減らすことができる。さらに、本発明では、電子ヒータ、熱電対、および検出システムを微量流体毛管のアレイと一緒に用いて分離プロセスを向上させることが考えられる。

分離管路の側壁内の仮想壁を用いて分離システム用の流体界面ポートを形成すると、従来の流体界面に勝る顕著な利点がもたらされる。仮想壁を含む流体界面ポートは、製造するのが比較的簡単であり、小形であり、吐出効率が高く、動作／流れに悪影響を与えず、双方向性にすることができ、様々な用途に有用である。例示的な態様は、試料管路や試料リザーバのような個別の試料導入構造を不要にし、分離管路に試料を直接注入するのを可能にする。仮想壁を形成する流体界面ポートを使用するとさらに、より小形の分離装置が得られ、処理できる試料の数が増え、分離管路への試料の導入に対する制御が改善され、導入プロセスが容易にかつ簡単になり、廃棄物が少なくなり、資源が全体的に節約される。

本発明について、毛管アレイ電気泳動装置における例示的な態様に関して説明した。当業者には、本発明が毛管アレイ電気泳動マイクロプレートに限らず、本発明の開示によって、電気クロマトグラフィーシステム、圧力駆動クロマトグラフィーシステム、および等電子集束システムを含むがそれらに限らない任意の適切な分離システムにおいて、仮想壁を含む流体界面ポートを実施できることが認識されると考えられる。本発明の範囲から逸脱せずに上記の構成にある種の変更を加えることができるので、上記の説明に含まれるかまたは添付の図面に示されたすべての事項は例示的なものと解釈され、制限的な意味では解釈されないものとする。

特許請求の範囲が、本明細書に記載された本発明のすべての一般的な特徴および特定の特徴と、言葉の問題として、これらの特徴間に入ると言える本発明の範囲のすべての記述をカバーすることも理解されたい。

先行技術の毛管アレイ電気泳動（CAE）マイクロプレートを示す図である。 図1の試料注入装置の概略図である。 本発明の例示的な態様による毛管アレイ電気泳動（CAE）マイクロプレートを示す図である。 分離管路内に液体液滴を受け入れるための流体界面ポートを含む分離管路の断面側面図である。 流体界面ポートの位置における図4の分離管路の縦断面図である。 液滴を受けたすぐ後の分離管路の内側の液体の構成を示す、本発明の開示による仮想壁を有する分離管路の断面図である。 本発明の他の態様による仮想壁を有する分離管路の断面図である。 被覆層を含む、本発明の他の態様による仮想壁を有する分離管路の断面図である。 仮想壁を形成する開口のアレイを有する分離管路の断面図である。 図4に示される分離管路への液体の導入を示す。 本発明の例示的な態様による図3のCAEマイクロプレートに関するレーザ励起ガルボスキャナを示す図である。 本発明の他の態様による毛管アレイ電気泳動（CAE）マイクロプレート・レイアウトを示す図である。 本発明の他の態様による毛管アレイ電気泳動（CAE）マイクロプレート・レイアウトを示す図である。 図7のCAEマイクロプレート・レイアウトの周辺部の拡大図である。 図7のCAEマイクロプレートの中心部の拡大図である。

Claims (44)

1つまたは複数の陽極リザーバと、
陽極リザーバに連結され、各々が、側壁に囲まれた内側を有する複数の分離管路と、
1つの分離管路の側壁に形成された円板形状の開口をそれぞれ含み、分離管路の内側に達し、分離管路の内側に配置された分離媒体によって形成されるメニスカスが分離管路の側壁と実質的に同一平面である、1つまたは複数の流体界面ポートと、
2つまたはそれ以上の分離管路と組み合わされた少なくとも1つの陰極リザーバとを含む分離装置。

リザーバおよび流体界面ポートに結合できる電極アレイをさらに含む、請求項1記載の装置。

装置が、外周および中心を有し、分離管路が外周を中心に連結している、請求項1記載の装置。

流体界面ポートが、約1ナノリットルよりも少ないデッドボリュームを有する、請求項1記載の装置。

流体界面ポートが、零デッドボリュームを有する、請求項1記載の装置。

流体界面ポートが、仮想壁を形成する開口のアレイを含む、請求項1記載の装置。

流体界面ポートが、約25μmから約125μmの間の直径を有する、請求項1記載の装置。

装置が毛管アレイ電気泳動プレートである、請求項1記載の分離装置。

装置が電気クロマトグラフィーシステムである、請求項1記載の分離装置。

装置が、圧力駆動クロマトグラフィーシステムを含む、請求項1記載の分離装置。

装置が、等電子集束システムを含む、請求項1記載の分離装置。

第1の微細化基板の表面および第1の基板の表面に結合された第2の基板の対応する表面に形成され、各々が、側壁、第1の端部、および第2の端部に囲まれた内側を有する、微細化分離管路のアレイと、
分離管路の側壁に形成された円板形状の開口をそれぞれ含み、各分離管路の内側に達し、分離管路の内側に配置された分離媒体によって、アレイ内の各流体界面ポートにメニスカスが分離管路の側壁と実質的に同一平面で形成される流体界面ポートのアレイと、
各分離管路の第1の端部に連結された陰極リザーバのアレイと、
少なくとも1つの陽極リザーバが、少なくとも2つの分離管路のそれぞれの第2の端部に連結された陽極リザーバのアレイとを含む分離装置。

流体界面ポートが、約25μmから約125μmの間の直径を有する、請求項12記載の分離装置。

第1および第2の基板がガラスで作られている、請求項12記載の分離装置。

第1および第2の基板がプラスチックで作られている、請求項12記載の分離装置。

リザーバ・アレイ層に結合できる電極アレイをさらに含む、請求項12記載の分離装置。

電極アレイが2つの基板と一体である、請求項16記載の分離装置。

流体界面ポートが、基板の一方上に規則的な間隔を置いて配置され、並列充填装置から溶液を受け入れる、請求項17記載の分離装置。

第1の基板が、流体界面ポート、陰極リザーバ、および陽極リザーバと組み合わされた複数の溶液に電気的に接触するように流体界面ポート、陰極リザーバ、および陽極リザーバに揃えられた電極のアレイを含む、請求項12記載の分離装置。

分離装置がH個の穴を有し、Hが、分離装置において同時に処理すべき試料の数に概ね等しい、請求項12記載の分離装置。

分離装置が、ガラスとプラスチックの組合せで作られている、請求項12記載の分離装置。

分離装置に電気的に接触する電極アレイをさらに含む、請求項12記載の分離装置。

1つの分離管路内に複数の流体界面ポートが配置されている、請求項12記載の分離装置。

第1の基板が、流体界面ポート内の複数の溶液に電気的に接触するように流体界面ポートに揃えられた電極のアレイを含む、請求項12記載の分離装置。

装置が毛管アレイ電気泳動プレートである、請求項12記載の分離装置。

装置が電気クロマトグラフィーシステムである、請求項12記載の分離装置。

装置が、圧力駆動クロマトグラフィーシステムを含む、請求項12記載の分離装置。

装置が、等電子集束システムを含む、請求項12記載の分離装置。

基板と、
基板に形成され、各々が側壁に囲まれた内側を有する複数の分離管路と、
分離管路の側壁に形成された円板形状の開口をそれぞれ含み、分離管路の内側に達し、分離管路の内側に配置された分離媒体によって流体界面ポートにメニスカスが分離管路の側壁と実質的に同一平面で形成され、複数の分離管路の各分離管路が少なくとも1つの専用流体界面ポートを含む複数の流体界面ポートと、
複数の分離管路のうちの2つまたはそれ以上と組み合わされた陽極リザーバとを含む分離装置。

流体界面ポートが、約25μmから約125μmの間の直径を有する、請求項29記載の分離装置。

基板と、
基板に形成され、各々が側壁に囲まれた内側を有する複数の分離管路と、
分離管路の側壁に形成された円板形状の開口をそれぞれ含み、分離管路の内側に達し、分離管路の内側に配置された分離媒体によって流体界面ポートにメニスカスが分離管路の側壁と実質的に同一平面で形成され、複数の分離管路の各分離管路が少なくとも1つの専用流体界面ポートを含む複数の流体界面ポートと、
複数の分離管路のうちの2つまたはそれ以上と組み合わされた陰極リザーバとを含む分離装置。

流体界面ポートが、約25μmから約125μmの間の直径を有する、請求項31記載の分離装置。

基板に結合された電極のアレイをさらに含む、請求項31記載の装置。

複数の流体界面ポートが、基板に規則的な間隔を置いて配置され、対応する流体界面ポートに保持した試料をそれぞれ充填すべく構成された複数の試料注入装置を含む、並列充填装置に係合するようになっている、請求項31記載の装置。

並列充填装置がマルチヘッド・ピペッタを含む、請求項34記載の装置。

並列充填装置が、液体試料の液滴を保持し、仮想壁に接触することによって流体界面ポートに液体試料の液滴を導入するピンを含む、請求項35記載の分離装置。

分離管路が、分離装置上に放射状パターンを描いて配置されている、請求項31記載の分離装置。

液体試料を分離装置に注入する方法であって、
陰極リザーバを2つまたはそれ以上の分離管路のそれぞれの第1の端部に連結する段階と、
陽極リザーバを2つまたはそれ以上の分離管路のそれぞれの第2の端部に連結する段階と、
液体試料から液滴を形成する段階と、
分離管路の側壁に形成された円板形状の開口を含む流体界面ポート内の分離媒体によって形成され、分離管路の側壁と実質的に同一平面であるメニスカスに液滴を送る段階と、
流体界面ポートに電圧を印加して試料を分離管路に引き込む段階とを含む方法。

試料を異なる成分に分離する分離装置を形成する方法であって、
各分離管路が側壁に囲まれた内側によって形成される複数の分離管路を、複数の分離装置内に形成する段階と、
前記分離管路の側壁に円板形状の開口をそれぞれ含み、各分離管路の内側に達し、分離管路に分離媒体が満たされた場合に分離管路の側壁と実質的に同一平面であるメニスカスを形成する、複数の流体界面ポートを形成する段階、
陽極リザーバを複数の分離管路のうちの2つまたはそれ以上に連結する段階とを含む方法。

複数の流体界面ポートを形成する段階が、側壁の一部を除去し、約25μmから約125μmの間の直径を有する開口を形成する段階を含む、請求項39記載の方法。

分離管路が、分離装置上に放射状パターンを描いて配置されている、請求項39記載の方法。

試料をそれぞれの異なる成分に分離する分離装置を形成する方法であって、
各分離管路が側壁に囲まれた内側によって形成される複数の分離管路を、分離装置内に形成する段階と、
前記分離管路の側壁に円板形状の開口をそれぞれ含み、各分離管路の内側に達し、分離管路に分離媒体が満たされた場合に分離管路の側壁と実質的に同一平面であるメニスカスを形成する、複数の流体界面ポートを形成する段階、
陰極リザーバを複数の分離管路のうちの2つまたはそれ以上に連結する段階とを含む方法。

複数の流体界面ポートを形成する段階が、側壁の一部を除去し、約25μmから約125μmの間の直径を有する開口を形成する段階を含む、請求項42記載の方法。

分離管路が、分離装置上に放射状パターンを描いて配置されている、請求項42記載の方法。

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