JP4538148B2

JP4538148B2 - 微小に作製されたキャピラリーアレイ電気泳動装置および方法

Info

Publication number: JP4538148B2
Application number: JP2000519779A
Authority: JP
Inventors: ピーターシー．シンプソン，; リチャードエイ．マシーズ，; アダムティー．ウーリー，
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2018-11-06
Also published as: AU1312199A; CA2308366C; US6143152A; MXPA00004350A; US6749734B1; JP2001523000A; EP1027596A1; WO1999024827A1; CA2308366A1

Description

【０００１】
（連邦政府によって後援された研究に関する陳述）
本発明は、許可番号第ＤＥ−ＦＧ−９１ＥＲ６１１２５号（米国エネルギー省により授与）および許可番号第ＨＧ０１３９９号（国立衛生研究所により授与）のもとで政府の支援を伴ってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般的に電気泳動に関し、そしてより詳細には微小に作製された構造物上でキャピラリーアレイ電気泳動を実施するための装置および方法に関する。
【０００３】
遺伝子マッピング、遺伝子配列決定および疾患診断のような多くの診断手順ならびに遺伝子同定手順において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはタンパク質が、それらの物理学的特性および化学的特性に従って分離される。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質に加えて、他の小分子分析物もまた分離される必要があり得る。
【０００４】
１つの電気化学的分離プロセスは、電気泳動として公知である。このプロセスにおいて、分子は、緩衝液に満たされたリザーバと連結されているキャピラリーまたはチャネル中を移動する。キロボルトの範囲の電場が、チャネルの両端部を横切って印加され、分子を移動させる。サンプルは、代表的には高ポテンシャル端部に導入され、そしてこの電場の影響下で、チャネルの低ポテンシャル端部へと移動する。チャネルを通じて移動後、分離されたサンプルは適切な検出器により検出される。
【０００５】
代表的には、核酸およびタンパク質の電気泳動分離は、ゲル分離媒体中で実施される。スラブゲルは電気泳動において主要な役割を果たしてきたけれども、大きな領域にわたって均一なゲルを調製する点、異なるゲルの再現性を維持する点、サンプルをウェルにロードする点、ゲルを均一に冷却する点、多量の媒体、緩衝液、およびサンプルを使用する点、およびヌクレオチドの読み取りを拡大するために長い泳動時間を必要とする点において困難が存在する。さらに、スラブゲルは、高度の多重化および自動化には容易には従わない。近年、微小に作製されたキャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置が、蛍光染料および蛍光標識アミノ酸を分離するために使用されている。さらに、ＤＮＡ制限フラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、短いオリゴヌクレオチド、およびＤＮＡ配列決定フラグメントさえもが、ＣＥ装置を用いて効率的に分離されている。また、一体型の微小装置が開発されており、これらの装置は、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実行し得る直後に、アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）のサイズ決定、ＤＮＡ制限／消化および続いてのサイズに基づく分離、および細胞の選別および選択された細胞の膜の溶解を伴う。しかし、これらの微小に作製された装置は、一度に１つのチャネルでの解析だけしか実施しない。集団スクリーニングまたはＤＮＡ配列決定のような適用について、このような単一チャネルでの観測および解析は、ある集団の多くのメンバーをスクリーニングするには受容できない遅滞を生じる。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、キャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）マイクロプレートを提供する。このマイクロプレートは、プレート上でのサンプルリザーバのアレイに連結された、分離チャネルのアレイを有する。このサンプルリザーバは１つ以上のサンプルインジェクター中によって、体系付けられる。廃液リザーバは、それぞれのサンプルインジェクターのサンプルリザーバから、廃液回収するように提供される。さらに、カソードリザーバは、１つ以上の分離チャネルと複合される。いくつか、またはすべての分離チャネルに共通なアノードリザーバはまた、マイクロプレート上に提供される。さらに、アノードからそれぞれのカソードへの距離は、折りたたまれたチャネルの配置により、一定に保たれる。これらの折り返しの角は、正しい角度であり得るか、より好ましくは、電気泳動の解像度を向上するための滑らかなカーブで有り得る。
【０００７】
１つの局面において、リザーバ−は、多数のサンプルの同時ローディングを容易にするために予め決められた間隔により、サンプルリザーバを分離する基板上に配置される。
【０００８】
別の局面において、カソード、アノードおよびインジェクション廃液リザーバを組み合わせて、Ｎが分析されるサンプル数である場合の、基板中の孔の数Ｎを約５／４Ｎに減少させるために重ね合わされる。
【０００９】
別の局面において、分離チャネルは、直線部分から形成される。
【００１０】
別の局面において、分離チャネルは、放射状部分を含み得る曲線部分から形成される。
【００１１】
さらに別の局面において、分離チャネルは、プレートの周囲からプレートの中心領域にまたがっている。この分離チャネルは、直線または放射状様式においてプレートにまたがり得る。
【００１２】
さらに別の局面において、ＣＡＥマイクロプレートアッセンブリは、マイクロプレート、リザーバアレイレイヤー、および電極アレイを用いて形成される。このアッセンブリは、サンプルの取り扱い、電極の導入を単純化し、そしてカソードおよびアノードリザーバ中に存在する緩衝液の容量の増加を可能にする。
【００１３】
本発明の利点は、以下を含む。本発明のマイクロプレートは、大多数のサンプル数の分析を、１度に小さなデバイスで実施することを可能にする。さらに、マイクロプレートは、最小限の混入の危険性のもとでの容易なサンプルのロードを、可能にする。さらに、マイクロプレートは、電気的な番地付けが容易である。さらに、マイクロプレートは、サンプルのより高解像度の分離および検出、サンプルのより早い分離および検出、またはより大量のサンプルの分離および検出を提供し得る、広範な種々の形式を支持する。
【００１４】
他の特徴および利点は、以下の説明および特許請求の範囲より明らかとなる。
【００１５】
（詳細な説明）
図１について、キャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）マイクロプレート１０が示される。マイクロプレート１０は、その上にエッチングされたキャピラリーのアレイまたは分離チャネル５０を有する。図１の１つの実施態様として、４８の個々の分離チャネルが、１５０マイクロ（μｍ）の周期アレイにエッチングされる。この実施態様において、分離チャネル５０は、それぞれ所定の距離の間隔が開いたサンプルリザーバ１０１の８×１２アレイに枝分かれして、８チップピペッタを用いたローディングを容易にする。この場合において、各サンプルリザーバ１０１は、別のサンプルリザーバから１次元で９ｍｍ離れている。分離チャネル５０は、インジェクション領域からアノードリザーバ１００への第１の所定の距離、およびインジェクターグループ１００からカソードリザーバ１２０への第２の所定の距離に広がる。第１の所定の距離は、約１０センチメートルであり得、第２の所定の距離は、約１．８センチメートルであり得る。
【００１６】
それぞれのサンプルリザーバ１０１は、インジェクター群１００〜１１６の１つのようなインジェクター群に属する。さらに、インジェクター群１００、１０２および１０４は、カソードリザーバ１２０に連結される。カソードリザーバ１２０は、３つのサンプルインジェクター１００、１０２および１０４に連結されるが、他のカソードインジェクターは、３つ以上のサンプルインジェクターに連結される。例えば、カソードインジェクター１３０は、サンプルインジェクター１０６、１０８、１１０、１１２、１１４および１１６に連結される。
【００１７】
アノードリザーバ１８０は、スキャンシステムとの衝突を避けるために、この場合においては、非対称な様式において配置される。さらに、アノードリザーバ１８０からカソード１２０または１３０のいずれかへの経路の距離は、全ての分離チャネルにおいて同一である。等しい距離が、アノード１８０と近位の特定のサンプルリザーバと接続した折りたたまれた経路を提供することにより達成され、経路長を伸ばし、そして全てのサンプルリザーバについてアノードリザーバ１８０とカソードリザーバ１２０および１３０のの間の距離の均一性を達成する。
【００１８】
図１の実施態様において、マイクロプレート１０上にある孔Ｈの数は、約５Ｎ／４であり、そしてより正確には、５Ｎ／４＋７（ここで、Ｎはサンプルの数）である。９６のサンプルに平行に処理する図１の実施態様について、平行に配置された１２７個の孔を、ドリルで穴をあけることが必要とされる。この孔の数は、理論的な最小の数の孔であるＮ＋３に近い。孔の数の減少は、マイクロプレート１０にドリルで孔をあける必要のある孔がより少なくなるという点で、有利である。このことにより、製造の効率を増大し、そしてドリルで孔をあける過程に関連した機械的なストレスによって引き起こされる、マイクロプレートの生産における欠損の可能性を減少する。カソード、アノードおよび廃液リザーバが多重である別の理由は、１つの基板上の９６分離システムに適合するように、より実行可能なものにするということである。上述の利点はまた、孔がドリルで孔をあける過程の代わりに、成形過程または接着過程により孔が作られるという事象の適用可能である。
【００１９】
図２に移って、図１のサンプルインジェクター１００の詳細が示される。サンプルインジェクター１００は、複数のサンプルリザーバ２００、２０４、２２０、およに２２４を有する。サンプルリザーバ２００および２２０は第１番目のサンプルを含み、サンプルリザーバ２０４および２２４は第２のサンプルを含む。
【００２０】
サンプルインジェクター１００はまた、第１の分離チャネル２０２および第２の分離チャネル２２２を有する。従って、サンプルインジェクター１００はそれぞれの分離チャネルにおける２つの異なったサンプルの連続した分析を可能とする。第１および第２の分離チャネルである２０２および２２２は、交差チャネル２０７により廃液リザーバ２０８に連結される。サンプルインジェクター１００はまた、カソード端２１０およびアノード端２１２も有する。カソードおよびアノード端２１０および２１２は、第１の分離チャネル２０２の逆の端に位置する。同様に、第２のカソード端２１４は、廃液リザーバ２０８に連結された分離チャネル２２２によって、第２のアノード端２１６に連結される。以下に図示するように、アノードリザーバ２１１および２１２、カソードリザーバ２００および２１４、サンプルリザーバ２００、２０４、２２０、２２４および廃液リザーバ２０８の適切なバイアスによって、サンプルは、それらのそれぞれのサンプルリザーバ２００、２０４、２２０および２２４から、交差チャネルを通過して、廃液リザーバへと移動し得、それによって、分離チャネルへの挿入が容易となる。
【００２１】
図３Ａ、３Ｂ，３Ｃおよび３Ｄを参照して、サンプルのそれぞれのサンプルリザーバから、交差チャネルへのローディングの過程、そして続く分離の実施について示す。図３Ａにおいて、注入電圧、好ましくは、約３００ボルト（３．０Ｖ／ｃｍ）が、サンプルリザーバ２００および注入廃液リザーバ２０８との間において適用され、サンプルリザーバから廃液リザーバに通じ、分離チャネルを横切る、チャネルを通してサンプルを引き出す。
【００２２】
図３Ｂにおいては、例えば、約３７００ボルト（３００Ｖ／ｃｍ）の分離電圧が、カソード端２１０およびアノード端２１２の間において適用される。これは、サンプルの電気泳動的な分離を引き起こす。さらに、サンプルリザーバ２００および注入廃液リザーバ２０８の間の電位の逆バイアスが、適用される。好ましくは、逆バイアスの電圧は、約７２０ボルトである。逆バイアス操作は、注入交差チャネル２１３からの過剰なサンプルを一掃する。図３Ｂに図示したように、１００μｍのサンプルプラグが、注入され、そして任意の残りのサンプルが、テーリング副作用を避けるために注入領域から取り除かれる。図３Ｃおよび図３Ｄは、第２のサンプルリザーバ２０４からの類似した注入を示す。図２および図３Ａ〜３Ｄの実施例は、２つのサンプルを操作するが、４つのサンプルを、有意な相互混入をすることなしに、一つのキャピラリーに注入し得る。
【００２３】
代表的なマイクロプレート中への、エッチングパターンの工程を、以下に示す。１つの微細加工の実施例において、ＳｃｈｏｔｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆＹｏｎｋｅｒｓ，ＮＹから入手可能な、ボロフロートグラスウェーハー（Ｂｏｒｏｆｌｏａｔｇｌａｓｓｗａｆｅｒｓ）は、１５秒間、４９％ＨＦでプレエッチングされ、そしてプラズマ増強化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）システムにおける約１５００Åのアモルファスシリコン犠牲レイヤーの沈着の前に洗浄される。ウェーハは、ヘキサメチルジシラザンでプライムし、ＳｈｉｐｌｅｙＣｏｒｐ．ｏｆＭａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡから入手可能な１８１８フォトレジストのようなフォトレジストを用いて、５０００ｒｐｍでスピンコートされる。このフォトレジストは、Ｓｈｉｐｌｅｙより入手可能なマイクロポジット現像濃縮液と水との１：１混合液中で現像される。次いで、ウェーハは、３０分間９０℃で緩やかに焼かれる。マスクパターンは、Ｑｕｉｎｔｅｌのコンタクトマスクアライナー中で紫外線にフォトレジストを露光させることにより基板に転写される。マスクパターンは、ＰＥＣＶＤリアクターでのＣＦ₄プラズマエッチを行うことにより、アモルファスシリコンに転写される。ウェーハは、４９％ＨＦ溶液中で７μｍ／分のエッチング速度で約３分間エッチングされ、最終的なエッチングの深さが２１μｍそしてチャネルの幅が、結合表面で６０μｍまでの幅になるように形成する。フォトレジストは、除去され、そして残されたアモルファスシリコンはＣＦ₄プラズマエッチにより取り除かれる。孔は、Ｗｅｓｔｅｒｖｉｌｌｅ、ＯＨのＣｒｙｓｔａｌｉｔｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な、１．２５ｍｍ直径ダイヤモンドチップドリルビットを用いて、エッチングされたプレートにドリルで孔を開けられる。エッチングされ、ドリルで孔を開けられたプレートは、プログラマブルバキュームファーネス内で類似したサイズおよびタイプの平らなウェーハと熱により接着される。接着後チャネルの表面は、コーティングプロトコールを用いてコートされる。
【００２４】
次いで、図４Ａおよび４Ｂにおいては、ＣＡＥマイクロプレートの分解組立図および断面図が示される。図４Ａは、ＣＡＥマイクロプレート３０２上に形成されるエッチングされた分離チャネル３０１および複数のリザーバ３０３がＣＡＥマイクロプレート３０２と共に提供される。リザーバアレイレイヤー３０４は、ＣＡＥマイクロプレート３０２の上にマウントされ、マイクロプレート３０２上に形成されるリザーバの上にさらなるリザーバ空間を提供する。リザーバアレイレイヤー３０４の存在は、カソードおよびアノードリザーバ中の緩衝液の溶量を増加させ、そしてサンプルの操作および電極の導入を簡便にする。好ましくは、リザーバアレイレイヤー３０４は、ガラスマイクロプレート３０２と接触させた場合、防水シールが作製された、１ミリメートルの厚みのエラストマーシートである。リザーバアレイレイヤー３０４は、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭｉｃｈｉｇａｎのＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇから入手可能なＳｙｌｇａｒｄ１８４のようなエラストマーにであり得る。
【００２５】
リザーバアレイレイヤー３０４は、チャネルが分離培地で満たされる前に、マイクロプレート３０２の上に置かれる。好ましくは、分離培地は、１μＭのエチジウムブロマイドを含有する、１ＸＴＢＥ緩衝液中の、０．７５％（重量／容量）の、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）である。さらに、リザーバアレイ３０４は、リザーバからお互いに十分に単離される。分離チャネルは、全てのチャネルが満たされるまで、アノードリザーバ１８０からのシービングマトリックス（ｓｉｅｖｉｎｇＭａｔｒｉｘ）で圧力で満たされる。次いで、アノードおよびカソードリザーバ１８０および１２０は、電気泳動中のイオンの枯渇を減少するために、１０ＸＴＢＥ緩衝液で満たされる。このサンプルリザーバは、脱イオン水でリンスされる。次いで、サンプルは、８チップピペッタを用いて、マイクロタイタープレートからロードされる。
【００２６】
リザーバアレイレイヤー３０４を、マイクロプレート３０２の上に置いた後、電極アレイ３０６が、リザーバアレイ３０４の上に置かれる。電極アレイ３０６は、プリント回路基板を通して、プラチナワイヤーのような導体のアレイを配置して組み立てられる。各導体は、マイクロプレート３０２上で、リザーバと系合するように適合される。さらに、ワイヤーは、回路基板上の金属ストリップと電気的に連結され、個々の共通なタイプのリザーバを、電気的に並行して処理することを可能にする。電極アレイ３０６はまた、緩衝液の蒸発の可能性を減少する。次に電極アレイ３０６は、１つ以上のコンピューター制御電源と連結される。
【００２７】
図４Ｂに示すように、リザーバアレイレイヤー３０４は、マイクロプレート３０２と連結して用いた場合、マイクロプレート３０２に本来つくられたリザーバの有効容積を拡大する。さらに、電極アレイ３０６の電極は、マイクロプレート３０２およびリザーバアレイレイヤー３０６のリザーバをプローブするのに適合されている。溶液は、ピペッタ３０８によりリザーバ中に置かれる。
【００２８】
アセンブリ後、図５に示すように、ＣＡＥマイクロプレート３０２は、ガルボスキャナシステム４００でプローブされる。システム４００は、チャネルの検出帯域で検出器を用いて蛍光を計測する。電気泳動のプロセスの間に、蛍光種は、検出帯域を横切りながら、入射レーザービームにより励起される。直接蛍光検出システムにおいて、標的種は蛍光性であるか、またはそれが発蛍光団で標識することにより蛍光性種へと変換されているかのどちらかである。蛍光性種が検出帯域を横切って通過すると変化を生じる（典型的にはシステム４００により検出し得る蛍光の増大）。
【００２９】
次に分析システムにもどり、ガルボスキャナ４００は、周波数が倍増された（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｕｂｌｅｄ）ＹＧＡレーザー（例えば、ＹＧＡレーザーはＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＳａｎＪｏｓｅのＵｎｉｐｈａｓｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）を有する。ＹＧＡレーザーは、３０ｍＷ、５３２ｎｍビームであり得るビームを発生する。レーザー４０２により発生したビームは、励起フィルター４０４を通過し、そしてミラー４０６により方向を変えられる。ミラー４０６から、ビームはビームエキスパンダー４０８を通過する。拡大後、ビームはダイクロイックビームスプリッタ４１０に向けられる。レーザービームは、最終レンズアセンブリ４２２へビームを向ける反照検流計（ｇａｌｖｏｎｏｍｅｔｅｒ）４２０へ向けられる。このように、ビームは、約５μｍのスポットに焦点を合わされ、ここで、ビームがチャネル中の分子からの蛍光を励起し、そして４０Ｈｚでチャネルを横切ってスキャンされる。生じた蛍光は、最終レンズによって集められ、そして反照検流計（ｇａｌｖｏｍｉｒｒｏｒ）およびダイクロイックビームスプリッタ４１０を約５４５〜６２０ｎｍの範囲で作動する発光フィルター４１２へ向かって通り抜けた。発光フィルター４１２を通り抜けた後、ビームは、レンズ４１２によって焦点を合わされる。次に、ビームは、ピンホール４１６（例えば、増倍電光管（ＰＭＴ）４１８へ送達する４００μｍピンホール）の中を通るように向けられる。
【００３０】
電極アレイ３０６は、１つ以上の電源装置４２８（例えば、シリーズＰＳ３００、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＳｔａｎｆｏｒｄＲｅｓｅａｒｃｈＳｙｓｔｅｍｓから入手可能）に接続される。電源装置は、コンピューターに接続され、そしてソフトウェアが自動的に時間および電極アレイ３０６への適切な電圧の切り換えを制御する。そのソフトウェアは従来のコンピューター言語で書かれ得るか、またはＬａｂＶＩＥＷ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓｏｆＡｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓより入手可能）のようなデータ収集ソフトウェアに特定され得る。次に、空間的に別々の蛍光発光に相当するデータは、Ｂｕｒｒ−ＢｒｏｗｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆＴｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａの１６ビットＡ／Ｄコンバーターを用い約７７ｋＨｚで取得し得る。次に、対数データ圧縮は、動的測定範囲の５つの線形順序の生成に適用される。そのデータは、１６ビットイメージとして得られ、次に、電気泳動図は、各チャネルを横切るデータポイントを計算するのに適したソフトウェア（例えば、ＩＰＬａｂ、ＳｉｇｎａｌＡｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ｖｉｒｇｉｎｉａより入手可能）を用いて作成される。全てのレーンの検出が、０．０９秒時間分解能で、システム４００により成し遂げられた。
【００３１】
（実験）
ＨＦＥ（遺伝ヘモクロマトーシスのためのマーカー遺伝子）の電気泳動分離および蛍光検出は、本発明のＣＡＥマイクロプレートを用いた生物学的に関連のあるサンプルの高処理量分析を実証するために行われた。ＨＦＥは、時が経てば疾患を生じる組織中の鉄の蓄積を生ずる遺伝的障害である。この蓄積は最初に肝臓に影響する。白人（コーカサス人）集団の０．１〜０．５％は、この疾患の原因であるＨＦＥＣ２８２Ｙ変異体についてホモ接合性である。もし早期に検出されれば、処理が開始され得、そして長期的効果を避けられ得る。このマーカー遺伝子について集団をスクリーニングするため、高処理量スクリーニングシステムが必要とされる。
【００３２】
本実験において、サンプルは、ＨＦＥ遺伝子中のＣ２８２Ｙ変異をアッセイするためにＰＣＲ増幅そして消化を用いて調製された。ヌクレオチド８４５のこのＧＡ変異は、ＨＦＥ遺伝子中にＲｓａＩ制限部位を生じる。ＤＮＡ物質は、標準的な方法を用いて末梢血白血球から単離された。変異体部位を含むＨＦＥエキソンは、以下のプライマーで増幅させた：
ＨＨ−Ｅ４Ｂ：５’ＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＣ３’
ＨＣ２８２Ｒ：５’ＣＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＴＣＡＡＣＣ３’
ＨＣ２８２Ｒプライマーは、Ｆｅｄｅｒら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．１３，３９９〜４０８（１９９６）（本明細書で参考として援用する）で議論されたプライマーである。ＨＨ−Ｅ４Ｂプライマーは、５’ビオチンタグを含む。２５μｌ増殖反応は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．８）、５０ｍＭＫＣｌ、０．７５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭｄＮＴＰ、各プライマー７．５ｐＭおよび１．５ＵＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪから入手可能）を含む。このＰＣＲを、３つの継続的条件下で実行した：５サイクル（９５℃１分間、６４℃１分間、７２℃１分間）、５サイクル（９５℃１分間、６０℃１分間、７２℃１分間）、および２５サイクル（９５℃１分間、５６℃１分間、７２℃１分間）。増幅産物の制限消化は、２ＵＲｓａＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む６μｌ緩衝液へ各増幅されたサンプルの４μｌを加え、そして３７℃で９０分間消化することにより実行された。サンプルは、９６サンプル透析プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡから入手可能）上でＤＩ水に対して透析された。サンプル型は初め、０．５×ＴＢＥ中、１％アガロース−３％ＳｅａＰｌａｑｕｅゲル（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥから入手可能）上の制限フラグメントの分離により確立された。ゲルは、３０分間０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムで染色し、そしてＵＶ透過照明器（ＳｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅモデルＴＲ−３０２）上で、１２３ｂｐラダ―（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手可能）を用いて可視化して、フラグメントサイズを決定した。
【００３３】
図６Ａおよび６ＢはＣＡＥマイクロプレート上の９６個のＨＦＥサンプルの分離のイメージを示す。９６個のサンプルを、１チャネルあたり二つのインジェクションリザーバに相当する、４８個のサンプルの２回の実行に別けた。本実験において、１９個の異なるサンプルを９６サンプルウェルに分散して、サンプル分析において５倍の冗長性を与えた。オリジナルイメージ５００は、第１の注入について得られ、一方オリジナルイメージ５０４は、第２の注入について得られた。さらに、オリジナルイメージ５００および５０４に相当する、拡大イメージ５０２および５０６が示されている。示されている電気泳動イメージの幅は、４８レーンについて７．４ｍｍであり、そして９６サンプルの完全な分析は、８分未満で行われた。拡大イメージは、そのバンドが、高い強度および分解能であることを示す。このイメージは右レーンが左より約２０秒速いスマイルを示す。これは、スキャニングレンズからの適切な間隔を守る注入領域側へのアノードの配置により生じる電気泳動電圧の勾配によって生じる。
【００３４】
図７は、図６Ａおよび図６Ｂのイメージから得られた９６個の電気泳動図を示す。全ての電気泳動図は、分離物と比較する目的で１６７ｂｐダブレットと整列させるために移動されている。１６７ｂｐフラグメントは、ＨＨＥ４Ｂプライマーの部分的なビオチン化（ビオチン化形態がそのダブレット中のより遅く移動するフラグメントを説明するように）に起因してダブレットとして現れる。１６７ｂｐダブレットは、分離を比較する電気泳動図のアライメントのための有用な基準点を提供し、そしてサイズ決定ラダーの必要なしに正確な遺伝子型決定を許容する。図７に示すように、１１１ｂｐと１４０ｂｐバンドとの間の平均距離は、第１の注入について、それぞれ、０．８秒および０．６秒の標準偏差（ＳＤ）を伴って７．３秒、および第２の注入について、それぞれ、１．１秒および０．５秒のＳＤを伴って６．６秒である。ｔ検定を用いて、両注入の型決定（ｔｙｐｉｎｇ）は、約９９．９％の信頼水準であると決定された。
【００３５】
図８に言及すると、ＣＡＥマイクロプレート６００の第二の実施態様が示されている。図８において、マイクロプレート６００は、それぞれ廃液リザーバ６０２および６０８、サンプルリザーバ６０４、６０６、６１０および６１２を含むインジェクターのアレイである。各インジェクター単位は、それぞれ、２つのカソードリザーバ６１４または６１６の１方と接続されている。さらに、各インジェクター単位は、キャピラリーまたはチャネル６２０のアレイの１つのキャピラリーと接続されている。キャピラリーまたはチャネル６２０は、アノード６３０と接続されている。この設計において、９６個のサンプルは、１つのキャピラリーに連続的に４個のサンプルを注入することにより分析され得る。さらに、２４個の分離キャピラリーまたはチャネルは、９６個のサンプルリザーバ中の物質の分析に用いられる。その上、インジェクター単位のそれぞれは、２つの廃液リザーバを有する。合計で、図８の実施態様は３Ｎ／２＋３の孔数を有する。
【００３６】
次に図９に言及すると、ＣＡＥマイクロプレート６５０の第３の実施態様が、開示される。図９のＣＡＥマイクロプレート６５０において、カソードリザーバ６５２は、ＣＡＥマイクロプレート６５０の周囲に配置される。さらに、１つのアノードリザーバ６６０は、ＣＡＥマイクロプレート６５０の中心に配置される。より長い分離チャネルが所望される場合、分離チャネルまたはキャピラリーは単に、螺旋型のマイクロプレート６５０の中心に向かってマイクロプレート６５０の外周から広がり得る。あるいは、短い経路が所望される場合、分離チャネルまたはキャピラリーは単に、ＣＡＥマイクロプレート６５０の中心６６０へ向かってマイクロプレート６５０の周囲を接続する直線であり得る。
【００３７】
次に図１０および１１にもどると、図９のＣＡＥマイクロプレートのインジェクター単位および図９のマイクロプレートの周囲のインジェクター単位の位置が、詳細に図示されている。図１０において、２つの分離チャネルまたは、キャピラリー６７０および６７１は、共通廃液リザーバ６７２または共通カソードリザーバ６７４に接続されている。さらに、分離チャネル６７０および６７１は、サンプルリザーバ６７６および６７８に接続されている。図１０および１１に示すように、サンプルと廃液リザーバとの間の接続は、オフセットした方法（ｏｆｆ−ｓｅｔｍａｎｎｅｒ）で交差し得る。
【００３８】
次に図１２に言及すると、図９の共通アノード６６０が、詳細に図示されている。図１１に示すように、複数の分離チャネルまたはキャピラリー８００〜８１０は、中心領域８２０に集まる、放射状のパターンであり得る、曲線パターンを形成する。中心領域８２０から、分離チャネルまたはキャピラリーは、中心領域８２０の周囲から、ＣＡＥマイクロプレートの中心での共通アノードリザーバ６６０への通路を形成する。中心領域８２０は、回転スキャナが検出目的で用いられ得る領域である。
【００３９】
サンプルは、手動または自動で充填され得る。連続的注入は、予定されたキャピラリーの数のサンプル処理能力の増大に用いられ得る。さらに、本発明の１つの実施態様は１チャネルあたり２つのサンプルを注入する一方、１チャネルあたり４個のサンプルの注入を用いて、１プレートあたり１９２個のサンプルを分析し得る。その上、ＣＡＥマイクロプレート上のキャピラリーの数の増加は、任意のサンプル汚染の導入なしに処理能力を対応し増大させた。さらに、プレートはガラスまたはプラスチックで作られ得る。
【００４０】
さらに、スキャニング検出システムは、その対物レンズの反転および下からのスキャニングにより変化し得る。プレートの下の光学機器の構成部品の位置は、容易な操作およびサンプルの導入を許容した。スキャニングの反転もまた、アノードリザーバとの空間的衝突をさけ、それによってアノードの中心配置を許容した。その上、ＰＣＲ反応チャンバのアレイは、本発明のマイクロプレートとともに用いられて低容量サンプルの完全な増幅を可能にし得、サンプル操作および手動の移動の排除し得、およびコスト削減し得る。さらに、本発明は、電子電熱器、熱伝対、および検出システムが、ＣＡＥ電気泳動プロセスを増強する微小流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）キャピラリーのアレイを用いられ得ることを熟慮する。
【００４１】
本発明は、その１つの実施態様を参照して示しそして記載してきたが、当業者は、形態および詳細における上記および他の変化が、以下の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることを理解する。
【図面の簡単な説明】
明細書に取り込まれ、そしてその一部を構成する添付した図面は、本発明を模式的に示し、および上記の一般的な説明、および以下の詳細な説明とともに、本発明の原理を説明する。
【図１】図１は、キャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）マイクロプレートの配置図である。
【図２】図２は、図１のサンプルインジェクターの模式図である。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、図２のサンプルインジェクターの操作の図である。
【図４】図４Ａは、ＣＡＥマイクロプレートアッセンブリの分解透視図である。図４Ｂは、図４ＡのＣＡＥマイクロプレートアッセンブリの断面図である。
【図５】図５は、ＣＡＥマイクロプレートと連結したレーザー励起ガルボスキャナーの図である。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、遺伝性ヘモクロマトーシスのための遺伝子マーカーの分離イメージである。
【図７】図７は、図６Ａおよび６Ｂのイメージから作成される電気泳動図のプロットである。
【図８】図８は、第二のＣＡＥマイクロプレートの配置図である。
【図９】図９は、第三のＣＡＥマイクロプレートの配置図である。
【図１０】図１０は、図９のサンプルインジェクターの模式図である。
【図１１】図１１は、図９のＣＡＥマイクロプレート配置図の周辺部分の拡大図である。
【図１２】図１２は、図９のＣＡＥマイクロプレート配置図の中心部分の拡大図である。

Claims

キャピラリーアレイ電気泳動プレートであって：
該プレート上に作製される複数の分離チャネル；
該分離チャネルに連結される複数のサンプルリザーバであって、ここで、各分離チャネルは、少なくとも２つのサンプルリザーバに液体連結される、サンプルリザーバ；
２つ以上の該分離チャネルに連結される廃液リザーバ；
２つ以上の該分離チャネルに連結されるアノードリザーバ；および
２つ以上の該分離チャネルに連結されるカソードリザーバ；
を備える、キャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記プレート上にマウントされたリザーバアレイレイヤーをさらに備え、該リザーバアレイレイヤーは、それを通って延びる複数の孔を有するシートを備え、ここで、該孔は、該プレート上の該リザーバに対応するパターンで分散される、請求項１に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記リザーバアレイレイヤー上にマウントされた電極アレイをさらに備え、該電極アレイは基板を備え、該基板は該基板の表面から延びる導体のアレイを有し、該導体は、各導体が該リザーバアレイレイヤー内の前記複数の孔のうちの一つと係合することを可能にするパターンで分散される、請求項２に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記複数のサンプルリザーバが、前記プレート中に規則正しく間隔を置いて配置される、請求項１に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記分離チャネルが、前記キャピラリーアレイ電気泳動プレート上に放射状のパターンで配置される、請求項１に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記分離チャネルが、前記キャピラリーアレイ電気泳動プレート上に螺旋方のパターンで配置される、請求項１に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記分離チャネルが、前記キャピラリーアレイ電気泳動プレート上に折りたたまれたパターンで配置される、請求項１に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
請求項１に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレートであって、前記廃液リザーバは、
前記複数の分離チャネルに連結された複数の廃液リザーバ、
を備え、前記プレートは、
分離チャネルを横切り、そして、廃液リザーバに連結するサンプルリザーバに連結した交差チャネルによって形成される、インジェクター、
をさらに備える、キャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記複数の分離チャネルが第１の基板の表面に形成され、そして、第２の基板の対応する表面が該第１の基板の表面に結合する、請求項８に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記プレート上にマウントされたリザーバアレイレイヤーをさらに備える、請求項８に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレートであって、ここで、該リザーバアレイレイヤーは、それを通って延びる複数の孔を有するシートを備え、ここで、該孔は、該プレート上の該リザーバに対応するパターンで分散される、キャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記第１の基板が、前記サンプルリザーバ、前記廃液リザーバ、前記カソードリザーバ、および、前記アノードリザーバと整列した電極のアレイを備え、該電極のアレイは、該サンプルリザーバ、該廃液リザーバ、該カソードリザーバ、および、該アノードリザーバの組合せ中の複数の溶液に対して電気的に接触する、請求項９に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記電極アレイが前記２つの基板と一体である、請求項１１に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記キャピラリーアレイ電気泳動プレートがＨ個のリザーバを備え、Ｈは５Ｎ／４＋７に等しく、ここでＮはサンプルリザーバの数である、請求項８に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
さらに、前記プレートと電気的接触をする電極アレイを備える、請求項８に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記両方の基板がガラスから作製される、請求項９に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記両方の基板がプラスチックから作製される、請求項９に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記キャピラリーアレイ電気泳動プレートが、ガラスとプラスチックの組合せから作製される、請求項９に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
請求項１に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレートであって、さらに、以下：
前記プレートの外周近傍に位置するカソードリザーバの第１のセット；
前記プレートの中心近傍に位置するアノードリザーバの第２のセット；
をさらに備え、ここで、該第２のセット内のリザーバの数は、該第１のセット内のリザーバの数よりも少なく、そして、ここで、前記複数の分離チャネルは、該カソードリザーバの第１のセットを、該アノードリザーバの第２のセットに連結する、キャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記複数の分離チャネルが、前記リザーバの第１のセットを、前記リザーバの第２のセットに放射状に連結する、請求項１８に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
請求項１に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレートであって、前記廃液リザーバは、前記分離チャネルに連結した廃液リザーバのアレイを備える、キャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記カソードリザーバが、前記分離チャネルに連結されたカソードリザーバのアレイを備える、請求項１に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
前記アノードリザーバが、前記分離チャネルに連結されたアノードリザーバのアレイを備える、請求項１に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
請求項１３に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレートであって、さらに、前記サンプルリザーバおよび前記廃液リザーバと整列し、そして、該サンプルリザーバおよび該廃液リザーバの組合せ中の複数の溶液に対して電気的に接触する電極のアレイを備える、キャピラリーアレイ電気泳動プレート。