JP4575162B2 - 二次元ミクロ流体生体分子分離システム - Google Patents
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Description
本発明は、タンパク質や核酸などの生体分子を分離し、任意でさらに分析を行なうのに有用なミクロ流体生体分子分離システムに関する。
複雑な混合物からの生体分子の分離は、従来クロマトグラフィ技術またはゲル電気泳動技術を利用して行われてきた。しかしながら、従来のゲル電気泳動技術は手間がかかり、解像度に関して限界があった。
特許文献１および特許文献２に記載されているように、ポリアクリルアミドマトリックス用に例えばゲル中にｐＨ勾配が与えられていた。
１９７５年以来、複雑なタンパク質混合物は、一般に二次元ゲル電気泳動を用いて分離されてきたが、該電気泳動においては、第１次元ゲル中のタンパク質の物理的分離は分析対象タンパク質のそれぞれの等電点による分離に基づいている。これは、タンパク質の等電点電気泳動法（ＩＥＦ）と呼ばれている（たとえば、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ ＰＨ．の非特許文献１を参照のこと）
しかしながら、細胞中には典型的には２０，０００を越える異なるタンパク質が存在することから、ＩＥＦゲルでは１つの細胞型中に存在するすべてのタンパク質を解析することはできない。したがって、ある細胞中で発現されるタンパク質のいくつかまたはすべてを研究し、同定すること（プロテオミクス）を望む多くの研究者達は、第２の次元、すなわち第２のゲルを用いてきた。この第２のゲルにおいて、タンパク質は、第１のＩＤＦゲルに対して直角に分離され、タンパク質はそれらの個々の分子量の違いに基づいて分離される。これは二次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥ）と呼ばれている。
国際出願公開公報第ＷＯ９３／１１１７４号
国際出願公開公報第ＷＯ９７／１６４６２号
「タンパク質の高解像度二次元電気泳動(High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins) 」、JBiol Chem. １９７５年５月２５日；２５０（１０）：４００７〜２１頁
１９７５年以来、複雑なタンパク質混合物は、一般に二次元ゲル電気泳動を用いて分離されてきたが、該電気泳動においては、第１次元ゲル中のタンパク質の物理的分離は分析対象タンパク質のそれぞれの等電点による分離に基づいている。これは、タンパク質の等電点電気泳動法（ＩＥＦ）と呼ばれている（たとえば、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ ＰＨ．の非特許文献１を参照のこと）
しかしながら、細胞中には典型的には２０，０００を越える異なるタンパク質が存在することから、ＩＥＦゲルでは１つの細胞型中に存在するすべてのタンパク質を解析することはできない。したがって、ある細胞中で発現されるタンパク質のいくつかまたはすべてを研究し、同定すること（プロテオミクス）を望む多くの研究者達は、第２の次元、すなわち第２のゲルを用いてきた。この第２のゲルにおいて、タンパク質は、第１のＩＤＦゲルに対して直角に分離され、タンパク質はそれらの個々の分子量の違いに基づいて分離される。これは二次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥ）と呼ばれている。
本発明の目的は、高い解像度を得ることができるような、上記に代わる、生体分子の分離装置を提供することにある。
他の目的は、大量の異なる生体分子、例えば５，０００を越える、または１０，０００を越えるまたは１５，０００を越える異なる生体分子からなる組成物から、生体分子を分離する装置を提供することである。
他の目的は、大量の異なる生体分子、例えば５，０００を越える、または１０，０００を越えるまたは１５，０００を越える異なる生体分子からなる組成物から、生体分子を分離する装置を提供することである。
さらに別の目的は、比較的迅速、簡単、かつ使用しやすく、好ましくは再現性の高い、生体分子を分離するため、および任意で同定するため装置を提供することである。
本発明のさらなる目的は、望まれる解像度を得ることができ、公知のプロセスに比べて使用の手間を省くことのできる、生体分子の分離装置を提供することである。
本発明のさらなる目的は、望まれる解像度を得ることができ、公知のプロセスに比べて使用の手間を省くことのできる、生体分子の分離装置を提供することである。
上記および他の目的は、特許請求の範囲において定義する本発明によって達成される。
本発明の背景にある考えは、生体分子を２つ以上の画分に分けるための装置を提供することであり、該画分は例えば、例えばさらなる分離および／または同定などのさらなる処
理に供される。
理に供される。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムを用いて分離および処理する生体分子は、例えばデンマーク国特許出願第ＤＫ ＰＡ２００２−００８７５号に記載されるような水溶液などの液体中に含まれていればよいものとする。
「生体分子」という用語は、ヒトを起源とするなど生物に起源をもつ成分、またはそれらを模倣した合成成分を意図する。生体成分は、例えば、生体分子、組織、細胞、体液、血液成分、微生物、およびそれらの誘導体、またはそれらの一部ならびに任意の他の生体成分を含んでいてもよい。
生体成分は、微生物、植物、動物またはヒトを起源とする１つ以上の生体分子、またはそれらを模倣した合成分子を含んでいてもよい。生体成分または成分は、好ましくはヒトを起源とするか、またはそれらを模倣した合成分子からなるものであってよい。
基本的に、本方法は、タンパク質、糖タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡなどの核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ホルモン、抗原、抗体、脂質およびそれらの分子の１つ以上を含む複合体などの生体分子を分離するのに特に有用であり、前記生体分子は好ましくはタンパク質およびタンパク質複合体からなる群より選択される。
特に関係のある生体分子の例としては、タンパク質、ペプチドおよびタンパク質複合体が挙げられる。タンパク質複合体としては、少なくとも１つのタンパク質が、例えば、イオン結合またはファンデルワールス力によって結合した任意の化学物質が挙げられる。タンパク質複合体は、例えば、少なくとも１０重量％のタンパク質を含んでいてもよい。
タンパク質には、変性、部分変性および非変性タンパク質が含まれる。変性の程度は、基材、分離コーティングを構成する組成、分離コーティングの構造、および、コーティングが基材に対する勾配を有する場合には、分離コーティングの組成および／または構造勾配に依存する。
したがって、いくつかの実施形態において、生体分子が分離相に吸着（および／または固定化）されるために、非変性タンパク質を分離することができる。これにより、分離されたタンパク質または他の生体成分の生物活性を、単離や任意の再フォールディングを行うことなく、直接調べることができるというさらなる利点が与えられる。
本方法は、核酸、タンパク質およびその一部（モノペプチド、ジペプチド、およびポリペプチド、およびモノヌクレオチド、ジヌクレオチド、およびポリヌクレオチド）、および核酸およびタンパク質を含む複合体の分離に特に有用である。
分離すべき生体成分は、異なるタイプの生体成分の混合物、例えば、タンパク質と核酸の混合物であってもよい。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、一次分離経路と、１つ以上の二次処理経路とを含む。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、一次分離経路と、１つ以上の二次処理経路とを含む。
一実施形態において、ミクロ流体生体分子分離システムは、２つ以上の一次分離経路を含む。これらの経路は、装置の独立した部分であってもいいし、または一方の経路がもう一方のまたは他の経路の予備分離を行うものであってもよい。
一次分離経路は、基材上に保持された分離コーティングの形態であり、前記分離コーテ
ィングは１つ以上の分離層を含む。少なくとも１つの分離層は、水性環境においてプロトン化又は脱プロトン化され得る化学基として定義されるｐＨ活性基を含む１つ以上のｐＨ活性成分で構成されるか、該活性成分を含む。このような経路はデンマーク国特許出願第ＤＫ ＰＡ２００２−００８７５号に開示されている。一次分離経路は、原理的には、デンマーク国特許出願第ＤＫ ＰＡ２００２−００８７５号に開示されるような任意の形状および構造を有していてもよく、たとえば、デンマーク国特許出願第ＤＫ ＰＡ２００２−００８７５号に記載されるように製造することができる。一実施形態において、ｐＨ活性基を有する塗布された捕捉コーティングを、ｐＨバッファ、例えば、酢酸バッファまたはリン酸バッファを用いてさらに平衡化する。基材は、原理的には、デンマーク国特許出願第ＤＫ ＰＡ２００２−００８７５号に好適に開示されるような任意のタイプであってよい。経路の構造、基材および経路の製造方法に関する技術的情報は参照により本願に援用される。
ィングは１つ以上の分離層を含む。少なくとも１つの分離層は、水性環境においてプロトン化又は脱プロトン化され得る化学基として定義されるｐＨ活性基を含む１つ以上のｐＨ活性成分で構成されるか、該活性成分を含む。このような経路はデンマーク国特許出願第ＤＫ ＰＡ２００２−００８７５号に開示されている。一次分離経路は、原理的には、デンマーク国特許出願第ＤＫ ＰＡ２００２−００８７５号に開示されるような任意の形状および構造を有していてもよく、たとえば、デンマーク国特許出願第ＤＫ ＰＡ２００２−００８７５号に記載されるように製造することができる。一実施形態において、ｐＨ活性基を有する塗布された捕捉コーティングを、ｐＨバッファ、例えば、酢酸バッファまたはリン酸バッファを用いてさらに平衡化する。基材は、原理的には、デンマーク国特許出願第ＤＫ ＰＡ２００２−００８７５号に好適に開示されるような任意のタイプであってよい。経路の構造、基材および経路の製造方法に関する技術的情報は参照により本願に援用される。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムの一実施形態において、ｐＨ活性成分は、任意で１つ以上のリンカー分子および／または１つ以上の分離コーティングの層を介して、基材に化学的に結合されている。化学的結合は、例えばデンマーク国特許出願第ＤＫ
ＰＡ２００２−００８７５号に記載されるキノンなどの光化学的反応基を介して提供してもよい。
ＰＡ２００２−００８７５号に記載されるキノンなどの光化学的反応基を介して提供してもよい。
本発明の一実施形態において、分離コーティングは、１，２，３，１０層または５０層、または約１０，０００層にのぼる分離層構成分子からなる分子層の厚みを有していてよい。
本発明の一実施形態において、分離コーティングは、０．０１〜１５μｍ、例えば０．５〜１０μｍの厚みを有する。
本発明の一実施形態において、一次分離経路の分離コーティングを有する分離基材は、自立性のものである。これは、乾燥時に構造が潰れないことを意味する。本実施形態においては、分離コーティングを有する基材の厚みは、その湿潤状態から乾燥状態の間で、２０％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満しか変化しないことが好ましい。分離コーティングの厚みは、その湿潤状態から乾燥状態の間で、２０％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満しか変化しないことが好ましい。
本発明の一実施形態において、一次分離経路の分離コーティングを有する分離基材は、自立性のものである。これは、乾燥時に構造が潰れないことを意味する。本実施形態においては、分離コーティングを有する基材の厚みは、その湿潤状態から乾燥状態の間で、２０％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満しか変化しないことが好ましい。分離コーティングの厚みは、その湿潤状態から乾燥状態の間で、２０％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満しか変化しないことが好ましい。
一実施形態において、一次分離経路の分離コーティングは、一次分離経路に沿って、１ｐＨ単位未満、例えば０．５ｐＨ単位未満、または０．１単位未満しか変化しないｐＨ値を有する。分離コーティングは、一次分離経路に沿って、本質的に同一のｐＨ値を有していてもよい。
本実施形態において、生体分子は、経路全体に電圧をかけた場合に一次経路に沿った２つの画分に分離される。一次分離経路が、例えば、ｐＨ値５を有する場合、生体分子は、等電点（ｐＩ値）が５を越える１つの画分と、ｐＩ値が５未満の１つの画分に分離されることになる。この分離プロセスについてのさらなる情報は、デンマーク国特許出願第ＤＫ
ＰＡ２００２−００８７５号に記載されている。
ＰＡ２００２−００８７５号に記載されている。
分離コーティングのｐＨ値は、分離コーティングを水で湿潤させたときのｐＨ値を指す。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムの一実施形態において、一次分離経路の分離コーティングは、一次分離経路に沿ったｐＨ勾配を含むｐＨを有する。このような徐々に変化するｐＨ値を有する分離経路の製造方法は、参照により本願に援用されるＤＫ ＰＡ２００２−００５９３号に開示されている。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムの一実施形態において、一次分離経路の分離コーティングは、一次分離経路に沿ったｐＨ勾配を含むｐＨを有する。このような徐々に変化するｐＨ値を有する分離経路の製造方法は、参照により本願に援用されるＤＫ ＰＡ２００２−００５９３号に開示されている。
分離経路の分離コーティングがｐＨ勾配を有し、該ｐＨ勾配が基材に結合されたｐＨ活性成分の形態で提供される一実施形態において、例えばデンマーク国特許出願第ＤＫ ＰＡ−２００２−００８５号に記載されるように、勾配はｐＨ活性成分の数の変化によって構成される。
ｐＨ勾配は、一実施形態において、一次分離経路に沿って、例えば約０．１〜５ｐＨ単位または約０．５〜３単位などの、約８ｐＨ単位までの間で変化する、一次分離経路に沿った連続的勾配であってよい。この連続的勾配は、例えば、ｐＨ３〜７であってよい。
ｐＨ勾配は、一実施形態において、例えば約０．１〜５ｐＨ単位または約０．５〜３単位などの、約８ｐＨ単位までの間で変化する、一次分離経路に沿った段階的勾配であってよい。勾配の段階は、一次分離経路の長手方向に沿って測定した段階の長さ、およびｐＨ値の上昇度のいずれについても、同じであっても異なっていてもよい。
段階的ｐＨ値段階状分離パットの段階は、分離経路区域とも称される。したがって、一実施形態において、本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、分離経路に沿って２個以上、例えば５個、例えば１０個、例えば２０個、例えば５０個、例えば１００個の分離経路区域を含む。ｐＨ値に関して互いに異なる分離経路区域において、隣り合う２つの分離経路区域の間での分離コーティングのｐＨ値の違いは、例えば、０．０５〜４ｐＨ単位、例えば０．１〜２ｐＨ単位、例えば０．２〜１ｐＨ単位の範囲とすることができる。一実施形態において、一次分離経路は、０．１〜０．５のｐＨ段階を有する５〜１０の連続する経路区域を含む。本実施形態において、一次分離経路は、例えば、それぞれ４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０および６．２のｐＨ値を有する８つの連続した経路区域を含む。
一実施形態において、経路区域は同じ長さを有する。
別の実施形態において、２つ以上の経路区域が異なる長さを有していてもよい。一例において、一次分離経路全体に電圧が印加される際に、電極に近い１つ以上の経路区域が、電極からより遠い経路区域よりも短くなるように、経路区域は異なる長さを有している。本実施形態の一例において、一次分離経路は、例えば、経路に沿って、それぞれ２ｘ、１．６ｘ、１．２ｘ、１ｘ、１ｘ、１．２ｘ、１．６ｘおよび２ｘの長さを有する８つの連続する経路区域を含んでいてもよい。ここで「ｘ」は、例えば、１〜１００ｍｍの間、例えば２〜１０ｍｍの間、例えば５ｍｍ前後である。
別の実施形態において、２つ以上の経路区域が異なる長さを有していてもよい。一例において、一次分離経路全体に電圧が印加される際に、電極に近い１つ以上の経路区域が、電極からより遠い経路区域よりも短くなるように、経路区域は異なる長さを有している。本実施形態の一例において、一次分離経路は、例えば、経路に沿って、それぞれ２ｘ、１．６ｘ、１．２ｘ、１ｘ、１ｘ、１．２ｘ、１．６ｘおよび２ｘの長さを有する８つの連続する経路区域を含んでいてもよい。ここで「ｘ」は、例えば、１〜１００ｍｍの間、例えば２〜１０ｍｍの間、例えば５ｍｍ前後である。
一次分離経路は、原理的には任意の所望の長さを有していてもよい。一実施形態において、一次分離経路は、約１ｍｍ〜１０ｃｍ、例えば５〜５０ｍｍの長さを有している。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、一次経路全体に電圧を印加するための手段をさらに含んでいる。このような電圧印加手段は当該技術において一般に知られており、その好ましい例としては、一次分離経路に装着するか、一次分離経路に装着可能に構成してもよい一対の電極を含み、該電極は一次分離経路に沿って距離をおいて分離コーティングに好適に接触する。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、一次経路全体に電圧を印加するための手段をさらに含んでいる。このような電圧印加手段は当該技術において一般に知られており、その好ましい例としては、一次分離経路に装着するか、一次分離経路に装着可能に構成してもよい一対の電極を含み、該電極は一次分離経路に沿って距離をおいて分離コーティングに好適に接触する。
一実施形態において、ミクロ流体生体分子分離システムは、生体分子が電極に直接接触することを防ぐように、各電極と分離コーティングの間に設けられた１つまたは一対の電極バリアを含む。これは、接触によって、生体分子が変性したり変化したりする虞があるからである。陽極電極バリアは、例えば隣接する分離コーティングのｐＨ値よりも低いｐＨ値を有するゲルなどの、導電性の湿潤物質の形態とすることができ、陰極電極バリアは、例えば隣接する分離コーティングのｐＨ値よりも低いｐＨ値を有するゲルなどの、導電性の湿潤物質の形態とすることができる。
ミクロ流体生体分子分離システムは、例えば分離経路および／または同定経路の形態の、１つ以上の二次処理経路を含んでいる。同定経路という用語は、例えば質量、サイズ、または例えば抗原等との反応の比活性など、生体分子の１つ以上のパラメータを同定する経路を意味する。
前記各二次処理経路は、一次分離経路と液体が流れ得るように連通する（以下、「液体連通する」と記載する）１つ以上の入口を含んでいる。この二次処理経路用の１つ以上の入口は、一次分離経路に沿って配置されるかまたは延びる。これにより、一次経路に沿って分離された生体分子は、例えば一次分離経路に沿っての分離後に、さらなる処理、例えばさらなる分離および／または１つ以上のパラメータ、例えばサイズ、質量または抗原などの試薬に対する反応性について同定するための二次処理経路に導入することができる。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムの一実施形態において、一次分離経路および二次処理経路は、１つまたは複数の二次処理経路の方向に作用するように駆動力が与えられた場合に、一次分離経路上で分離後の生体分子が一次分離経路から入口を介して二次処理経路に流入するように、相対的に配置されている。上記駆動力は、例えば求心力または電気泳動力であってもよい。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムの一実施形態において、一次分離経路は、１つまたは複数の回収ステーション、例えば少なくとも３つの回収ステーション、例えば少なくとも４つの回収ステーション、例えば少なくとも５つの回収ステーション、例えば少なくとも７つの回収ステーション、例えば少なくとも１０の回収ステーションを含んでいる。回収ステーションについては、例えば、デンマーク国特許出願第ＤＫ ＰＡ２００２−００８７５号に記載されている。
一実施形態において、１つまたは複数の回収ステーションは、例えば多孔材料の形態の回収空間と、回収チャンバまたは回収キャビティとを含む回収ユニットの形態を有する。
回収ステーションは好ましくは、二次処理経路のための１つまたは複数の入口と液体連通しており、その結果、回収ステーション内に回収された生体分子は、二次処理経路全体に例えば求心力または電気泳動力などの駆動力が与えられた場合に二次処理経路に流入する。
回収ステーションは好ましくは、二次処理経路のための１つまたは複数の入口と液体連通しており、その結果、回収ステーション内に回収された生体分子は、二次処理経路全体に例えば求心力または電気泳動力などの駆動力が与えられた場合に二次処理経路に流入する。
一実施形態において、前記１つまたは複数の回収ステーションは、一次分離経路内の１つ以上の開口部または一次分離経路のオーバーフローエッジの形態である。前記一次分離経路内の１つ以上の開口部または一次分離経路のオーバーフローエッジは、例えば、二次処理経路に対する１つまたは複数の入口を提供し、回収ステーション内に回収された生体分子は、二次処理経路全体に例えば求心力または電気泳動力などの駆動力が与えられた場合に二次処理経路に流入する。
請求項８に記載の分離装置が２つ以上の分離経路区画を含む本発明によるミクロ流体生体分子分離システムの一実施形態において、該２つ以上の分離経路区画の主要部分、好ましくは全体が、区画回収ステーションを含む。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムの一実施形態において、１つまたは複数の二次経路は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む架橋ポリアクリルアミドゲル、両性電解質含有架橋ゲル（ＩＥＦ）、アガロースゲル、セルロースゲル、およびシリカゲルなどのポリアミドゲルからなる群より選択されるゲルなどのゲルの形態または該ゲルを含んで構成される。本実施形態においては、ミクロ流体生体分子分離システムは、唯一または少数の二次経路を含むことが望ましい。
ゲルの形態の１つの二次経路を含む一実施形態において、一次経路及び二次経路は互いにほぼ直交している。二次経路は好ましくは、上縁と下縁の間の長さと幅とを有する。一次分離経路は好ましくは、二次経路に沿って延設され、例えば二次経路の下縁またはその付近（１〜１００ｍｍ）で、二次経路と接触して、電極を適用するための場所を与え、これにより前記一次経路および前記二次経路は互いに液体連通する。本実施形態の一例において、一次分離経路は、シート状ゲルへの１つまたは複数の入口開口部を有したシート状ゲルの上に施されている。
二次処理経路がゲルの形態である本実施形態において、本装置は、二次処理経路全体に電圧を印加するための手段をさらに含むことが望ましい。好ましい使用において、まず最初に電圧を一次分離経路全体に印加し、分離後、電圧を二次ゲル処理経路全体に印加する。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムの一実施形態において、一次分離経路は、基材内のチャネルの形態またはチャネル内に含まれている。本実施例において、一次分離経路の基材をチャネル壁によって構成してもよいし、分離コーティングを含む基材をチャネル内に配置してもよい。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムの一実施形態において、（１つまたは複数の）二次処理経路は、基材内のチャネルの形態もしくは基材内のチャネル内に含まれている。
本発明によるミクロ流体生体分子分離システムの一実施形態において、本装置は、ミクロチャネル構造を含むディスク状装置の形態である。ミクロチャネル構造は、二次処理経路を含むことが好ましい。一実施形態において、ミクロチャネル構造は、一次分離経路および二次処理経路の双方を含む。
ディスク状装置は、例えば、参照により本願に援用される国際出願公開公報第ＷＯ０１４７６３７号、同第ＷＯ９７／２１０９０号、同第ＷＯ０２０７５７７５号、同第ＷＯ０２０７５７７６号、および同第ＷＯ９９５８２４５号のいずれかに記載されているようなものであるが、さらなる前提として、ディスクは上述のような二次処理経路と液体連通した一次分離経路をさらに含み、二次処理経路はそれぞれ、国際出願公開公報第ＷＯ０１４７６３７号、同第ＷＯ９７／２１０９０号、同第ＷＯ０２０７５７７５号、同第ＷＯ０２０７５７７６号、および同第ＷＯ９９５８２４５号に開示されるようなミクロチャネル構造で構成される。
したがって、一実施形態において、本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、国際出願公開公報第ＷＯ０２０７５７７６号に記載のようなＭＳポートを含むディスク状装置の形態である。
一実施形態において、本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、国際出願公開公報第ＷＯ０１４７６３７号に開示される非イオン性親水性ポリマーを露出する被膜を有するミクロチャネル構造の形態の二次処理経路を含む。
一実施形態において、本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、国際出願公開公報第ＷＯ０１４６４６５号に規定されるようなＵ字型体積規定構造を含む二次処理経路を含むディスク状装置の形態である。
一実施形態において、本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、国際出願公開
公報第ＷＯ９９５８２４５号にさらに記載されるような、二次処理経路内の流れが、異なる表面特性を有した装置の異なる表面によって制御されるように構成された二次処理経路を含むディスク状装置の形態である。
公報第ＷＯ９９５８２４５号にさらに記載されるような、二次処理経路内の流れが、異なる表面特性を有した装置の異なる表面によって制御されるように構成された二次処理経路を含むディスク状装置の形態である。
一実施形態において、本発明によるミクロ流体生体分子分離システムは、国際出願公開公報第ＷＯ９７２１０９０号にさらに記載されるように、回転速度、持続時間または方向を制御するために設定される電磁的に読み取り可能な指示で符号化した平面を含むディスク状装置の形態である。
一実施形態において、ミクロチャネルは１０ｍｍ２未満、好ましくは５ｍ２未満、より好ましくは０．１ｍｍ２未満の断面積を有している。ミクロチャネル構造は、さらに、ミクロチャネルに比べて例えば２倍まで、３倍まで、５倍まであるいは１０倍までの大きさの表面積を有する反応チャンバ、リザーバ等を含んでいてもよい。
一実施形態において、ディスク状装置は略環状であり中心部を含んでいる。中心部は、例えば直径１〜１００ｍｍ、例えば５〜５０ｍｍの開口などの、開口の形態であってよい。一次分離経路と二次処理経路とを含むミクロチャネル構造は、中心部の周りに配置してもよく、好ましくは一次分離経路を部分的または全体的に中心部の周りに環状リングとして配置し、二次処理経路を一次分離経路よりも周縁の近くに配置する。
一実施形態において、二次処理経路は、例えばフィルタ装置を有したチャンバの形態、および／または、反応チャンバの形態、例えば捕捉分子と反応し得る生体分子を捕捉するための捕捉分子を有した反応チャンバの形態の、１つまたは複数のチャンバを含む。
一実施形態において、二次処理経路は、表面特性が変化する壁を有したミクロチャネルを含む。
一実施形態において、二次処理経路は、例えば上述のゲルの群より選択されるゲルなどの分離媒体を含んだミクロチャネルを含む。
一実施形態において、二次処理経路は、例えば上述のゲルの群より選択されるゲルなどの分離媒体を含んだミクロチャネルを含む。
一実施形態において、一次分離経路は、分離コーティングを有する一次ミクロチャネルによって提供される。一次ミクロチャネルは、例えば略環状であり、ディスク状装置の中心部の周りに延設してもよい。本実施形態において、二次処理経路は好ましくは一次経路からディスク状装置の周囲に向けて延出する。さらに、一次分離経路を与えるチャネルは、一次ミクロチャネル中の開口部の形態の２つ以上の回収ステーションを含んでいてもよく、前記開口部が二次経路への入口を構成する。
上述のようなディスク状装置の形態のミクロ流体生体分子分離システムの動作において、被処理生体分子を、一次分離経路に、例えば経路の中間またはその一方または双方の端部において付与する。一次分離経路全体に電圧を印加することにより、生体分子をｐＨ画分に分離し、その後、分離された生体分子を求心力を用いて二次処理経路内に押し入れる。求心力は、例えば、国際出願公開公報第ＷＯ０１４７６３７号、同第ＷＯ９７／２１０９０号、同第ＷＯ０２０７５７７５号、同第ＷＯ０２０７５７７６号、同第ＷＯ０１４６４６５号および、同第ＷＯ９９５８２４５号のいずれかに記載のように、ディスクを回転させることにより付与される。
以下、本発明を図面および実施例を参照しながらさらに説明する。
実施例１ ２つの回収ステーションを有する電気泳動ディスク
使用した材料：
・特注のポリエステルディスク
・不織ポリエステル材料（Ｈ１０１０，５３ｇ／ｍ２）（Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ社）
・Ｎ−［４−（３−アミノプロピル）モルフォリル］−９．１０−アントラキノン−２−カルボキサミド（ＡＱ−０３）
・１０×５ｍｍ ＩＥＦサンプルアプリケーションピース（８０−１１２９−４６）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・１０×２．５ｍｍ ＩＥＦ電極片（１８−１００４−４０）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・サンプル付与片（１８−１００２−７６）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・プラチナ電極φ０．５ｍｍ
・１０×３ｍｍポリアクリルアミドゲル；８％Ｔ：２．７％Ｃ；ｐＨ３．５
・１０×３ｍｍポリアクリルアミドゲル；２．７％Ｃ；ｐＨ１０．５
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−１０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−３０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−５０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファ−ｐＨ６．５
・７Ｍ尿素；２Ｍチオ尿素
・溶解バッファ（７Ｍ尿素；１Ｍチオ尿素；２％ＣＨＡＰＳ；５ｍＭトリス）
・９０μｇＨｅＬａ抽出物を２０μＬの溶解バッファに溶解したもの
・圧縮窒素−Ｎ４８
・プログラム可能電源（ＥＰＳ３５０１ＸＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・特注ディスクスピナー
使用した材料：
・特注のポリエステルディスク
・不織ポリエステル材料（Ｈ１０１０，５３ｇ／ｍ２）（Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ社）
・Ｎ−［４−（３−アミノプロピル）モルフォリル］−９．１０−アントラキノン−２−カルボキサミド（ＡＱ−０３）
・１０×５ｍｍ ＩＥＦサンプルアプリケーションピース（８０−１１２９−４６）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・１０×２．５ｍｍ ＩＥＦ電極片（１８−１００４−４０）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・サンプル付与片（１８−１００２−７６）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・プラチナ電極φ０．５ｍｍ
・１０×３ｍｍポリアクリルアミドゲル；８％Ｔ：２．７％Ｃ；ｐＨ３．５
・１０×３ｍｍポリアクリルアミドゲル；２．７％Ｃ；ｐＨ１０．５
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−１０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−３０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−５０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファ−ｐＨ６．５
・７Ｍ尿素；２Ｍチオ尿素
・溶解バッファ（７Ｍ尿素；１Ｍチオ尿素；２％ＣＨＡＰＳ；５ｍＭトリス）
・９０μｇＨｅＬａ抽出物を２０μＬの溶解バッファに溶解したもの
・圧縮窒素−Ｎ４８
・プログラム可能電源（ＥＰＳ３５０１ＸＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・特注ディスクスピナー
不織ポリマーの官能化：
５５ｍｍの幅を有する１ｍｇのポリエステル材料Ｈ１０１０を、連続ループとして条片を供給する機械的装置上に載置した。条片に１００μＭのＡＱ−０３の水溶液を供給し、ＵＶ照射して熱風で乾燥させた後、ＡＱ−０３溶液に戻す。このようにして、アントラキノンをポリマー材料に共有結合させる。全部で１００μモルのＡＱ−０３が結合する。材料をリン酸バッファ中で平衡化し、蒸留水中で２回洗浄し、乾燥させる。
５５ｍｍの幅を有する１ｍｇのポリエステル材料Ｈ１０１０を、連続ループとして条片を供給する機械的装置上に載置した。条片に１００μＭのＡＱ−０３の水溶液を供給し、ＵＶ照射して熱風で乾燥させた後、ＡＱ−０３溶液に戻す。このようにして、アントラキノンをポリマー材料に共有結合させる。全部で１００μモルのＡＱ−０３が結合する。材料をリン酸バッファ中で平衡化し、蒸留水中で２回洗浄し、乾燥させる。
実験セットアップの準備：
特注のポリエステルディスクの直径は１２０ｍｍ、厚みは２ｍｍ、中央の孔は１５ｍｍである。分離溝１の形態の環状一次分離経路を、直径４５ｍｍ、幅３ｍｍ、深さ１ｍｍとなるように加工する。分離溝はディスクの円周の１８０°をカバーする。環状分離溝１の両端において、幅１０ｍｍ、厚み５ｍｍ、深さ１ｍｍの矩形の回収ステーション溝２を前記両端に直交するように設ける。各矩形の回収ステーション溝２を通る半径上には、中心と各回収ステーション溝２の間にリザーバ３が配置される。リザーバ３は、流路８によって回収ステーション溝に連結される。回収ステーション溝２のその反対側において、流路８は径方向外側に続いており、ディスクの中心から６０，７５および９０ｍｍの所にある３つのフィルタホルダー４ａ，４ｂ，４ｃと、ディスクの中心から１０５ｍｍの所にあるリザーバ５と交差する。各矩形の回収ステーション溝２と直交して、長さ１０ｍｍ、幅３ｍｍ、深さ１ｍｍの別の矩形のゲル溝６を加工する。最後に矩形の電極溝７を、ゲル溝の端部６において、長さ１０ｍｍ、幅２．５ｍｍ、深さ１ｍｍとなるように加工する。
特注のポリエステルディスクの直径は１２０ｍｍ、厚みは２ｍｍ、中央の孔は１５ｍｍである。分離溝１の形態の環状一次分離経路を、直径４５ｍｍ、幅３ｍｍ、深さ１ｍｍとなるように加工する。分離溝はディスクの円周の１８０°をカバーする。環状分離溝１の両端において、幅１０ｍｍ、厚み５ｍｍ、深さ１ｍｍの矩形の回収ステーション溝２を前記両端に直交するように設ける。各矩形の回収ステーション溝２を通る半径上には、中心と各回収ステーション溝２の間にリザーバ３が配置される。リザーバ３は、流路８によって回収ステーション溝に連結される。回収ステーション溝２のその反対側において、流路８は径方向外側に続いており、ディスクの中心から６０，７５および９０ｍｍの所にある３つのフィルタホルダー４ａ，４ｂ，４ｃと、ディスクの中心から１０５ｍｍの所にあるリザーバ５と交差する。各矩形の回収ステーション溝２と直交して、長さ１０ｍｍ、幅３ｍｍ、深さ１ｍｍの別の矩形のゲル溝６を加工する。最後に矩形の電極溝７を、ゲル溝の端部６において、長さ１０ｍｍ、幅２．５ｍｍ、深さ１ｍｍとなるように加工する。
官能化したＨ１０１０を環状の分離溝１に適合するように裁断し、分離溝１に配置する
。Ｈ１０１０材料と良好に接触する矩形の回収ステーション溝２のぞれぞれに、サンプルアプリケーションピースを１つずつ配置する。左側の矩形のゲル溝６には、ｐＨ３．５を有するゲルを陽極に対するバリアとして配置し、右側の矩形のゲル溝６には、ｐＨ１０．５を有するゲルを陰極に対するバリアとして配置する。いずれのゲルもサンプルアプリケーションピースと良好に接触させて配置する。電極溝７のそれぞれには、ＩＥＦ電極片を各ゲル材料に良好に接触させて配置する。電極を各ＩＥＦ電極片上に、左側が陽極、右側が陰極となるように配置する。
。Ｈ１０１０材料と良好に接触する矩形の回収ステーション溝２のぞれぞれに、サンプルアプリケーションピースを１つずつ配置する。左側の矩形のゲル溝６には、ｐＨ３．５を有するゲルを陽極に対するバリアとして配置し、右側の矩形のゲル溝６には、ｐＨ１０．５を有するゲルを陰極に対するバリアとして配置する。いずれのゲルもサンプルアプリケーションピースと良好に接触させて配置する。電極溝７のそれぞれには、ＩＥＦ電極片を各ゲル材料に良好に接触させて配置する。電極を各ＩＥＦ電極片上に、左側が陽極、右側が陰極となるように配置する。
電気泳動：
上記２つのＩＥＦ電極片を７Ｍ尿素：２Ｍチオ尿素溶液で湿潤させる。ゲルは溶解バッファで再水和させる。Ｈ１０１０は溶解バッファ中で飽和させる。生体分子試料を、官能化１０１０の一次分離経路の中央に、サンプル付与片を用いて付与する。
上記２つのＩＥＦ電極片を７Ｍ尿素：２Ｍチオ尿素溶液で湿潤させる。ゲルは溶解バッファで再水和させる。Ｈ１０１０は溶解バッファ中で飽和させる。生体分子試料を、官能化１０１０の一次分離経路の中央に、サンプル付与片を用いて付与する。
このセットアップを窒素雰囲気中に置き、装置に、４時間の間に０〜２５００Ｖの電圧を線形的な傾斜ステップで印加する。次に、２５００Ｖの一定電圧にさらに１１時間維持してから、電気泳動を終了する。処理を連続的に追跡するために、電気泳動の間、装置内の電流をモニタする。
濾過：
ｍｉｎｉｔａｎフィルタを、フィルタホルダ４ａ，４ｂ，４ｃに合うように裁断し、５０ｋＤａフィルタが最も内側のホルダ４ａ，３０ｋＤａフィルタが真ん中のフィルタホルダ４ｂ、１０ｋＤａフィルタが最も外側のフィルタホルダ４ｃ内に配置されるように配置する。２２０μＬの溶解０バッファを各リザーバ３内に入れ、ディスクを１００ＲＰＭで６０秒間回転させ（回収ステーション溝２からの試料の再抽出）、その後、濾過のために１５００ＲＰＭで１０分間回転させる。
ｍｉｎｉｔａｎフィルタを、フィルタホルダ４ａ，４ｂ，４ｃに合うように裁断し、５０ｋＤａフィルタが最も内側のホルダ４ａ，３０ｋＤａフィルタが真ん中のフィルタホルダ４ｂ、１０ｋＤａフィルタが最も外側のフィルタホルダ４ｃ内に配置されるように配置する。２２０μＬの溶解０バッファを各リザーバ３内に入れ、ディスクを１００ＲＰＭで６０秒間回転させ（回収ステーション溝２からの試料の再抽出）、その後、濾過のために１５００ＲＰＭで１０分間回転させる。
結果：
分離された材料をフィルタ（４ａ，４ｂ，４ｃ）およびリザーバ５から以下の画分内に回収する。
左側：
（４ａ）：ｐＩ＜６．５；質量＞５０ｋＤａ
（４ｂ）ｐＩ＜６．５；５０ｋＤａ＞質量＞３０ｋＤａ
（４ｃ）ｐＩ＜６．５；３０ｋＤａ＞質量＞１０ｋＤａ
（５）ｐＩ＜６．５；質量＜１０ｋＤａ
分離された材料をフィルタ（４ａ，４ｂ，４ｃ）およびリザーバ５から以下の画分内に回収する。
左側：
（４ａ）：ｐＩ＜６．５；質量＞５０ｋＤａ
（４ｂ）ｐＩ＜６．５；５０ｋＤａ＞質量＞３０ｋＤａ
（４ｃ）ｐＩ＜６．５；３０ｋＤａ＞質量＞１０ｋＤａ
（５）ｐＩ＜６．５；質量＜１０ｋＤａ
右側：
（４ａ）：ｐＩ＞６．５；質量＞５０ｋＤａ
（４ｂ）ｐＩ＞６．５；５０ｋＤａ＞質量＞３０ｋＤａ
（４ｃ）ｐＩ＞６．５；３０ｋＤａ＞質量＞１０ｋＤａ
（５）ｐＩ＞６．５；質量＜１０ｋＤａ
（４ａ）：ｐＩ＞６．５；質量＞５０ｋＤａ
（４ｂ）ｐＩ＞６．５；５０ｋＤａ＞質量＞３０ｋＤａ
（４ｃ）ｐＩ＞６．５；３０ｋＤａ＞質量＞１０ｋＤａ
（５）ｐＩ＞６．５；質量＜１０ｋＤａ
実施例２ ３つの回収ステーションを用いた電気泳動ディスク
使用した材料：
・特注のポリエステルディスク
・不織ポリエステル材料（Ｈ１０１０，５３ｇ／ｍ２）（Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ社）
・４−（２−アントラキノイル）−４−オキソ−３−アザ−ブタン酸（ＡＱ−０１）
・Ｎ−［４−（３−アミノプロピル）モルフォリル］−９．１０−アントラキノン−２−カルボキサミド（ＡＱ−０３）
・１０×５ｍｍ ＩＥＦサンプルアプリケーションピース（８０−１１２９−４６）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・１０×２．５ｍｍ ＩＥＦ電極片（１８−１００４−４０）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・サンプル付与片（１８−１００２−７６）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・プラチナ電極φ０．５ｍｍ
・１０×３ｍｍポリアクリルアミドゲル；８％Ｔ：２．７％Ｃ；ｐＨ３．５
・１０×３ｍｍポリアクリルアミドゲル；２．７％Ｃ；ｐＨ１０．５
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−１０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−３０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−５０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファ−ｐＨ６．５
・７Ｍ尿素；２Ｍチオ尿素
・溶解バッファ（７Ｍ尿素；１Ｍチオ尿素；２％ＣＨＡＰＳ；５ｍＭトリス）
・９０μｇＨｅＬａ抽出物を２０μＬの溶解バッファに溶解したもの
・圧縮窒素−Ｎ４８
・プログラム可能電源（ＥＰＳ３５０１ＸＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・特注ディスクスピナー
使用した材料：
・特注のポリエステルディスク
・不織ポリエステル材料（Ｈ１０１０，５３ｇ／ｍ２）（Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ社）
・４−（２−アントラキノイル）−４−オキソ−３−アザ−ブタン酸（ＡＱ−０１）
・Ｎ−［４−（３−アミノプロピル）モルフォリル］−９．１０−アントラキノン−２−カルボキサミド（ＡＱ−０３）
・１０×５ｍｍ ＩＥＦサンプルアプリケーションピース（８０−１１２９−４６）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・１０×２．５ｍｍ ＩＥＦ電極片（１８−１００４−４０）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・サンプル付与片（１８−１００２−７６）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・プラチナ電極φ０．５ｍｍ
・１０×３ｍｍポリアクリルアミドゲル；８％Ｔ：２．７％Ｃ；ｐＨ３．５
・１０×３ｍｍポリアクリルアミドゲル；２．７％Ｃ；ｐＨ１０．５
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−１０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−３０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・Ｍｉｎｉｔａｎ濾過プレート−ＰＢＧＣ ０ＭＰ ０４−５０（ｋＤａ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファ−ｐＨ６．５
・７Ｍ尿素；２Ｍチオ尿素
・溶解バッファ（７Ｍ尿素；１Ｍチオ尿素；２％ＣＨＡＰＳ；５ｍＭトリス）
・９０μｇＨｅＬａ抽出物を２０μＬの溶解バッファに溶解したもの
・圧縮窒素−Ｎ４８
・プログラム可能電源（ＥＰＳ３５０１ＸＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ社）
・特注ディスクスピナー
不織ポリマーの官能化：
５５ｍｍの幅を有する１ｍｇのポリエステル材料Ｈ１０１０を、連続ループとして条片を提供する機械的装置上に載置した。条片に１００μＭのＡＱ−０１の水溶液を供給し、ＵＶ照射して熱風で乾燥させた後、ＡＱ−０１溶液に再び戻す。このようにして、アントラキノンをポリマー材料に共有結合させる。全部で１００μモルのＡＱ−０１が結合する。これによりｐＨ４を有する材料が得られる。
５５ｍｍの幅を有する１ｍｇのポリエステル材料Ｈ１０１０を、連続ループとして条片を提供する機械的装置上に載置した。条片に１００μＭのＡＱ−０１の水溶液を供給し、ＵＶ照射して熱風で乾燥させた後、ＡＱ−０１溶液に再び戻す。このようにして、アントラキノンをポリマー材料に共有結合させる。全部で１００μモルのＡＱ−０１が結合する。これによりｐＨ４を有する材料が得られる。
同様のコーティング手順を、１００μＭのＡＱ−０３の水溶液を用いてＨ１０１０の新しい小片に対して繰り返した。このＡＱ−０３処理した材料をリン酸バッファ中で平衡化し、蒸留水中で２回洗浄し、乾燥させる。これによりｐＨ６．５を有する材料が得られる。
実験セットアップの準備：
特注のポリエステルディスクの直径は１２０ｍｍ、厚みは２ｍｍ、中央の孔は１５ｍｍである。分離溝１，２の形態の環状一次分離経路を、直径４５ｍｍ、幅３ｍｍ、深さ１ｍｍとなるように加工する。分離溝はディスクの円周の２７０°をカバーする。環状分離溝１，２の両端および中間点に、幅１０ｍｍ、厚み５ｍｍ、深さ１ｍｍの矩形の回収ステーション溝３を環状溝に直交するように配置する。各矩形の回収ステーション溝３を通る半径には、中心と各回収ステーション溝３の間にリザーバ４を配置する。リザーバ４は、流路９によって回収ステーション溝３に連結される。回収ステーション溝３のその反対側において、流路９は径方向外側に続いており、ディスクの中心から６０，７５および９０ｍｍに位置する３つのフィルタホルダー５ａ，５ｂ，５ｃと、ディスクの中心から１０５ｍｍに位置するリザーバ６と交差する。陽極区画と陰極区画における各矩形の回収ステーション溝３と垂直に、長さ１０ｍｍ、幅３ｍｍ、深さ１ｍｍの別個の矩形のゲル溝７を加工する。最後にゲル溝の端部７において矩形の電極溝８を、長さ１０ｍｍ、幅２．５ｍｍ、深さ１ｍｍとなるように加工する。
特注のポリエステルディスクの直径は１２０ｍｍ、厚みは２ｍｍ、中央の孔は１５ｍｍである。分離溝１，２の形態の環状一次分離経路を、直径４５ｍｍ、幅３ｍｍ、深さ１ｍｍとなるように加工する。分離溝はディスクの円周の２７０°をカバーする。環状分離溝１，２の両端および中間点に、幅１０ｍｍ、厚み５ｍｍ、深さ１ｍｍの矩形の回収ステーション溝３を環状溝に直交するように配置する。各矩形の回収ステーション溝３を通る半径には、中心と各回収ステーション溝３の間にリザーバ４を配置する。リザーバ４は、流路９によって回収ステーション溝３に連結される。回収ステーション溝３のその反対側において、流路９は径方向外側に続いており、ディスクの中心から６０，７５および９０ｍｍに位置する３つのフィルタホルダー５ａ，５ｂ，５ｃと、ディスクの中心から１０５ｍｍに位置するリザーバ６と交差する。陽極区画と陰極区画における各矩形の回収ステーション溝３と垂直に、長さ１０ｍｍ、幅３ｍｍ、深さ１ｍｍの別個の矩形のゲル溝７を加工する。最後にゲル溝の端部７において矩形の電極溝８を、長さ１０ｍｍ、幅２．５ｍｍ、深さ１ｍｍとなるように加工する。
ＡＱ−０１で官能化した材料Ｈ１０１０を環状の分離溝１に適合するように裁断し、分
離溝１に配置する。ＡＱ−０３で官能化した材料Ｈ１０１０を環状の分離溝２に適合するように裁断し、分離溝２に配置する。Ｈ１０１０材料と良好に接触する矩形の回収ステーション溝３のぞれぞれに、サンプルアプリケーションピースを１つずつ配置する。左側の矩形のゲル溝７には、ｐＨ３．５を有するゲルを陽極に対するバリアとして配置し、右側の矩形のゲル溝７には、ｐＨ１０．５を有するゲルを陰極に対するバリアとして配置する。いずれのゲルもサンプルアプリケーションピースと良好に接触させて配置する。電極溝８のそれぞれには、ＩＥＦ電極片を各ゲル材料に良好に接触させて配置する。陽極電極を陽極ＩＥＦ電極片８上に載置し、陰極電極を陰極ＩＥＦ電極片８上に配置する。
離溝１に配置する。ＡＱ−０３で官能化した材料Ｈ１０１０を環状の分離溝２に適合するように裁断し、分離溝２に配置する。Ｈ１０１０材料と良好に接触する矩形の回収ステーション溝３のぞれぞれに、サンプルアプリケーションピースを１つずつ配置する。左側の矩形のゲル溝７には、ｐＨ３．５を有するゲルを陽極に対するバリアとして配置し、右側の矩形のゲル溝７には、ｐＨ１０．５を有するゲルを陰極に対するバリアとして配置する。いずれのゲルもサンプルアプリケーションピースと良好に接触させて配置する。電極溝８のそれぞれには、ＩＥＦ電極片を各ゲル材料に良好に接触させて配置する。陽極電極を陽極ＩＥＦ電極片８上に載置し、陰極電極を陰極ＩＥＦ電極片８上に配置する。
電気泳動
上記２つのＩＥＦ電極片を７Ｍ尿素：２Ｍチオ尿素溶液で湿潤させる。ゲルは溶解バッファで再水和させる。Ｈ１０１０は溶解バッファ中で飽和させる。タンパク質試料を、ＡＱ−０３官能化１０１０の一次分離経路２の中間に、サンプル付与片を用いて付与する。
上記２つのＩＥＦ電極片を７Ｍ尿素：２Ｍチオ尿素溶液で湿潤させる。ゲルは溶解バッファで再水和させる。Ｈ１０１０は溶解バッファ中で飽和させる。タンパク質試料を、ＡＱ−０３官能化１０１０の一次分離経路２の中間に、サンプル付与片を用いて付与する。
このセットアップを窒素雰囲気中に置き、装置に、４時間の間に０〜２５００Ｖの電圧を線形的な傾斜ステップで印加する。次に、２５００Ｖの一定電圧にさらに１１時間維持してから、電気泳動を終了する。処理を連続的に追跡するために、電気泳動の間、装置内の電流をモニタする。
濾過：
ｍｉｎｉｔａｎフィルタを、フィルタホルダ５ａ，５ｂ，５ｃに適合するように裁断し、５０ｋＤａフィルタが最内側のホルダ５ａ，３０ｋＤａフィルタが真ん中のフィルタホルダ５ｂ、１０ｋＤａフィルタが最外側のフィルタホルダ５ｃ内に配置されるように配置する。２２０μＬの溶解０バッファを各リザーバ４内に入れ、ディスクを１００ＲＰＭで６０秒間回転させ（回収ステーション溝３からの試料の再抽出）、その後、濾過のために１５００ＲＰＭで１０分間回転させる。
ｍｉｎｉｔａｎフィルタを、フィルタホルダ５ａ，５ｂ，５ｃに適合するように裁断し、５０ｋＤａフィルタが最内側のホルダ５ａ，３０ｋＤａフィルタが真ん中のフィルタホルダ５ｂ、１０ｋＤａフィルタが最外側のフィルタホルダ５ｃ内に配置されるように配置する。２２０μＬの溶解０バッファを各リザーバ４内に入れ、ディスクを１００ＲＰＭで６０秒間回転させ（回収ステーション溝３からの試料の再抽出）、その後、濾過のために１５００ＲＰＭで１０分間回転させる。
結果：
分離された材料をフィルタ（５ａ，５ｂ，５ｃ）およびリザーバ６から以下の画分内に回収する。
陽極：
（５ａ）：ｐＩ＜４；質量＞５０ｋＤａ
（５ｂ）ｐＩ＜４；５０ｋＤａ＞質量＞３０ｋＤａ
（５ｃ）ｐＩ＜４；３０ｋＤａ＞質量＞１０ｋＤａ
（６）ｐＩ＜４；質量＜１０ｋＤａ
中間：
（５ａ）：ｐＩ＜４＜６．５；質量＞５０ｋＤａ
（５ｂ）ｐＩ＜４＜６．５；５０ｋＤａ＞質量＞３０ｋＤａ
（５ｃ）ｐＩ＜４＜６．５；３０ｋＤａ＞質量＞１０ｋＤａ
（６）ｐＩ＜４＜６．５；質量＜１０ｋＤａ
陰極：
（５ａ）：ｐＩ＞６．５；質量＞５０ｋＤａ
（５ｂ）ｐＩ＞６．５；５０ｋＤａ＞質量＞３０ｋＤａ
（５ｃ）ｐＩ＞６．５；３０ｋＤａ＞質量＞１０ｋＤａ
（６）ｐＩ＞６．５；質量＜１０ｋＤａ
分離された材料をフィルタ（５ａ，５ｂ，５ｃ）およびリザーバ６から以下の画分内に回収する。
陽極：
（５ａ）：ｐＩ＜４；質量＞５０ｋＤａ
（５ｂ）ｐＩ＜４；５０ｋＤａ＞質量＞３０ｋＤａ
（５ｃ）ｐＩ＜４；３０ｋＤａ＞質量＞１０ｋＤａ
（６）ｐＩ＜４；質量＜１０ｋＤａ
中間：
（５ａ）：ｐＩ＜４＜６．５；質量＞５０ｋＤａ
（５ｂ）ｐＩ＜４＜６．５；５０ｋＤａ＞質量＞３０ｋＤａ
（５ｃ）ｐＩ＜４＜６．５；３０ｋＤａ＞質量＞１０ｋＤａ
（６）ｐＩ＜４＜６．５；質量＜１０ｋＤａ
陰極：
（５ａ）：ｐＩ＞６．５；質量＞５０ｋＤａ
（５ｂ）ｐＩ＞６．５；５０ｋＤａ＞質量＞３０ｋＤａ
（５ｃ）ｐＩ＞６．５；３０ｋＤａ＞質量＞１０ｋＤａ
（６）ｐＩ＞６．５；質量＜１０ｋＤａ
Claims (17)
- 略環状であって中心部を有しミクロチャネル構造が前記中心部の周りに配置されているディスク状装置の形態であり、一次分離経路と、１つ以上の二次処理経路とを含むミクロ流体生体分子分離システムであって、前記一次分離経路は基材に保持された分離コーティングの形態であり、前記分離コーティングは、１つ以上の分離層を含み、少なくとも１つの分離層が、水性環境中でプロトン化または脱プロトン化されうる化学基として定義されるｐＨ活性基を含む１つ以上のｐＨ活性成分で構成されるか、または該ｐＨ活性成分を含み、前記流体生体分子分離システムは、一次分離経路全体に電圧を印加するための手段を含み、各二次処理経路は、一次分離経路と液体流通する１つ以上の入口を含み、前記１つ以上の入口は一次分離経路に沿って設けられるか、該一次経路に沿って延び、前記分離コーティングは、０．０１〜１５μｍの厚みを有し、前記ｐＨ活性成分は光化学的反応性基を介して前記基材に結合されていることを特徴とするミクロ流体生体分子分離システム。
- 一次分離経路の分離コーティングは、一次分離経路に沿って、１ｐＨ単位未満しか変化しないｐＨ値を有し、前記分離コーティングは、一次分離経路に沿って、本質的に同一のｐＨ値を有することを特徴とする請求項１に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 分離コーティングに接触してまたは接触できるように一次分離経路に沿って離間されて設けられた正電極と負電極の形態の、一対の電極をさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 一次分離経路は、１つ以上の回収ステーションを含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 各分離経路区画は区画回収ステーションを含むことを特徴とする請求項４に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 一次分離経路は、１ｍｍ〜１０ｃｍの長さを有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 該システムは１つの二次経路を含み、前記二次経路はゲルの形状であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記一次経路および前記二次経路は互いに直交しており、前記二次経路は上縁と下縁との間の長さおよび幅を有し、前記一次分離経路は前記二次経路の幅に沿って延びるとともに前記二次経路の下縁と接触することにより、前記一次経路および前記二次経路は互いに液体流通することを特徴とする請求項７に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 該システムは、二次処理経路全体に電圧を印加する手段をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記二次経路は、基材内のチャネルの形態であるか、該チャネルに含まれることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記二次処理経路は１つ以上の反応チャンバを含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記二次処理経路は、表面特性が変化する壁を有するミクロチャネルを含むことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記二次処理経路は、分離媒体を含むミクロチャネルを含むことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記一次分離経路は、分離コーティングを有する一次ミクロチャネルによって提供され、前記一次ミクロチャネルは略環状であり、ディスク状装置の中心部の周りに配置されることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 前記二次処理経路は、一次経路からディスク状装置の周囲に向けて延びることを特徴とする請求項１４に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 一次分離経路を提供する前記チャネルは、一次ミクロチャネル内に設けられた二次経路への入口を構成する開口部の形態にある２つ以上の回収ステーションを含むことを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
- 二次処理経路のうちの１つ以上が、分離経路であることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか１項に記載のミクロ流体生体分子分離システム。
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