JP2001523000A

JP2001523000A - 微小に作製されたキャピラリーアレイ電気泳動装置および方法

Info

Publication number: JP2001523000A
Application number: JP2000519779A
Authority: JP
Inventors: ピーターシー．シンプソン，; リチャードエイ．マシーズ，; アダムティー．ウーリー，
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2001-11-20
Anticipated expiration: 2018-11-06
Also published as: WO1999024827A1; EP1027596A1; US6749734B1; JP4538148B2; US6143152A; CA2308366C; MXPA00004350A; CA2308366A1; AU1312199A

Abstract

(57)【要約】プレート上のサンプルリザーバ（１０１）のアレイに連結される分離チャネル（５０）のアレイを有するキャピラリーアレイ電気泳動(ＣＡＥ)マイクロプレート。このサンプルリザーバ（１０１）は、１つ以上のサンプルインジェクタ（１００〜１１６）に組織化される。１つ以上の廃液リザーバが提供され、サンプルインジェクタの各々にあるリザーバから廃液を収集する。さらに、カソードリザーバ（１２０）もまた、１つ以上の分離チャネルと多重化される。電気的経路を完成するために；いくつかの、または全ての分離チャネルに共通するアノードリザーバ（１８０）もまた、このマイクロプレート上に提供される。さらに、このチャネルの配置は、アノードから各々のカソードまでの距離をほぼ一定に保つ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（連邦政府によって後援された研究に関する陳述）本発明は、許可番号第ＤＥ−ＦＧ−９１ＥＲ６１１２５号（米国エネルギー省
により授与）および許可番号第ＨＧ０１３９９号（国立衛生研究所により授与）
のもとで政府の支援を伴ってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有
する。

【０００２】（発明の背景）本発明は、一般的に電気泳動に関し、そしてより詳細には微小に作製された構
造物上でキャピラリーアレイ電気泳動を実施するための装置および方法に関する
。

【０００３】遺伝子マッピング、遺伝子配列決定および疾患診断のような多くの診断手順な
らびに遺伝子同定手順において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮ
Ａ）またはタンパク質が、それらの物理学的特性および化学的特性に従って分離
される。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質に加えて、他の小分子分析物もまた分
離される必要があり得る。

【０００４】１つの電気化学的分離プロセスは、電気泳動として公知である。このプロセス
において、分子は、緩衝液に満たされたリザーバと連結されているキャピラリー
またはチャネル中を移動する。キロボルトの範囲の電場が、チャネルの両端部を
横切って印加され、分子を移動させる。サンプルは、代表的には高ポテンシャル
端部に導入され、そしてこの電場の影響下で、チャネルの低ポテンシャル端部へ
と移動する。チャネルを通じて移動後、分離されたサンプルは適切な検出器によ
り検出される。

【０００５】代表的には、核酸およびタンパク質の電気泳動分離は、ゲル分離媒体中で実施
される。スラブゲルは電気泳動において主要な役割を果たしてきたけれども、大
きな領域にわたって均一なゲルを調製する点、異なるゲルの再現性を維持する点
、サンプルをウェルにロードする点、ゲルを均一に冷却する点、多量の媒体、緩
衝液、およびサンプルを使用する点、およびヌクレオチドの読み取りを拡大する
ために長い泳動時間を必要とする点において困難が存在する。さらに、スラブゲ
ルは、高度の多重化および自動化には容易には従わない。近年、微小に作製され
たキャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置が、蛍光染料および蛍光標識アミノ酸を分
離するために使用されている。さらに、ＤＮＡ制限フラグメント、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）産物、短いオリゴヌクレオチド、およびＤＮＡ配列決定フラ
グメントさえもが、ＣＥ装置を用いて効率的に分離されている。また、一体型の
微小装置が開発されており、これらの装置は、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実行
し得る直後に、アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）のサイズ決定、ＤＮＡ制限／
消化および続いてのサイズに基づく分離、および細胞の選別および選択された細
胞の膜の溶解を伴う。しかし、これらの微小に作製された装置は、一度に１つの
チャネルでの解析だけしか実施しない。集団スクリーニングまたはＤＮＡ配列決
定のような適用について、このような単一チャネルでの観測および解析は、ある
集団の多くのメンバーをスクリーニングするには受容できない遅滞を生じる。

【０００６】（発明の要旨）本発明は、キャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）マイクロプレートを提供す
る。このマイクロプレートは、プレート上でのサンプルリザーバのアレイに連結
された、分離チャネルのアレイを有する。このサンプルリザーバは１つ以上のサ
ンプルインジェクター中によって、体系付けられる。廃液リザーバは、それぞれ
のサンプルインジェクターのサンプルリザーバから、廃液回収するように提供さ
れる。さらに、カソードリザーバは、１つ以上の分離チャネルと複合される。い
くつか、またはすべての分離チャネルに共通なアノードリザーバはまた、マイク
ロプレート上に提供される。さらに、アノードからそれぞれのカソードへの距離
は、折りたたまれたチャネルの配置により、一定に保たれる。これらの折り返し
の角は、正しい角度であり得るか、より好ましくは、電気泳動の解像度を向上す
るための滑らかなカーブで有り得る。

【０００７】１つの局面において、リザーバ−は、多数のサンプルの同時ローディングを容
易にするために予め決められた間隔により、サンプルリザーバを分離する基板上
に配置される。

【０００８】別の局面において、カソード、アノードおよびインジェクション廃液リザーバ
を組み合わせて、Ｎが分析されるサンプル数である場合の、基板中の孔の数Ｎを
約５／４Ｎに減少させるために重ね合わされる。

【０００９】別の局面において、分離チャネルは、直線部分から形成される。

【００１０】別の局面において、分離チャネルは、放射状部分を含み得る曲線部分から形成
される。

【００１１】さらに別の局面において、分離チャネルは、プレートの周囲からプレートの中
心領域にまたがっている。この分離チャネルは、直線または放射状様式において
プレートにまたがり得る。

【００１２】さらに別の局面において、ＣＡＥマイクロプレートアッセンブリは、マイクロ
プレート、リザーバアレイレイヤー、および電極アレイを用いて形成される。こ
のアッセンブリは、サンプルの取り扱い、電極の導入を単純化し、そしてカソー
ドおよびアノードリザーバ中に存在する緩衝液の容量の増加を可能にする。

【００１３】本発明の利点は、以下を含む。本発明のマイクロプレートは、大多数のサンプ
ル数の分析を、１度に小さなデバイスで実施することを可能にする。さらに、マ
イクロプレートは、最小限の混入の危険性のもとでの容易なサンプルのロードを
、可能にする。さらに、マイクロプレートは、電気的な番地付けが容易である。
さらに、マイクロプレートは、サンプルのより高解像度の分離および検出、サン
プルのより早い分離および検出、またはより大量のサンプルの分離および検出を
提供し得る、広範な種々の形式を支持する。

【００１４】他の特徴および利点は、以下の説明および特許請求の範囲より明らかとなる。

【００１５】（詳細な説明）図１について、キャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）マイクロプレート１０
が示される。マイクロプレート１０は、その上にエッチングされたキャピラリー
のアレイまたは分離チャネル５０を有する。図１の１つの実施態様として、４８
の個々の分離チャネルが、１５０マイクロ（μｍ）の周期アレイにエッチングさ
れる。この実施態様において、分離チャネル５０は、それぞれ所定の距離の間隔
が開いたサンプルリザーバ１０１の８×１２アレイに枝分かれして、８チップピ
ペッタを用いたローディングを容易にする。この場合において、各サンプルリザ
ーバ１０１は、別のサンプルリザーバから１次元で９ｍｍ離れている。分離チャ
ネル５０は、インジェクション領域からアノードリザーバ１００への第１の所定
の距離、およびインジェクターグループ１００からカソードリザーバ１２０への
第２の所定の距離に広がる。第１の所定の距離は、約１０センチメートルであり
得、第２の所定の距離は、約１．８センチメートルであり得る。

【００１６】それぞれのサンプルリザーバ１０１は、インジェクター群１００〜１１６の１
つのようなインジェクター群に属する。さらに、インジェクター群１００、１０
２および１０４は、カソードリザーバ１２０に連結される。カソードリザーバ１
２０は、３つのサンプルインジェクター１００、１０２および１０４に連結され
るが、他のカソードインジェクターは、３つ以上のサンプルインジェクターに連
結される。例えば、カソードインジェクター１３０は、サンプルインジェクター
１０６、１０８、１１０、１１２、１１４および１１６に連結される。

【００１７】アノードリザーバ１８０は、スキャンシステムとの衝突を避けるために、この
場合においては、非対称な様式において配置される。さらに、アノードリザーバ
１８０からカソード１２０または１３０のいずれかへの経路の距離は、全ての分
離チャネルにおいて同一である。等しい距離が、アノード１８０と近位の特定の
サンプルリザーバと接続した折りたたまれた経路を提供することにより達成され
、経路長を伸ばし、そして全てのサンプルリザーバについてアノードリザーバ１
８０とカソードリザーバ１２０および１３０のの間の距離の均一性を達成する。

【００１８】図１の実施態様において、マイクロプレート１０上にある孔Ｈの数は、約５Ｎ
／４であり、そしてより正確には、５Ｎ／４＋７（ここで、Ｎはサンプルの数）
である。９６のサンプルに平行に処理する図１の実施態様について、平行に配置
された１２７個の孔を、ドリルで穴をあけることが必要とされる。この孔の数は
、理論的な最小の数の孔であるＮ＋３に近い。孔の数の減少は、マイクロプレー
ト１０にドリルで孔をあける必要のある孔がより少なくなるという点で、有利で
ある。このことにより、製造の効率を増大し、そしてドリルで孔をあける過程に
関連した機械的なストレスによって引き起こされる、マイクロプレートの生産に
おける欠損の可能性を減少する。カソード、アノードおよび廃液リザーバが多重
である別の理由は、１つの基板上の９６分離システムに適合するように、より実
行可能なものにするということである。上述の利点はまた、孔がドリルで孔をあ
ける過程の代わりに、成形過程または接着過程により孔が作られるという事象の
適用可能である。

【００１９】図２に移って、図１のサンプルインジェクター１００の詳細が示される。サン
プルインジェクター１００は、複数のサンプルリザーバ２００、２０４、２２０
、およに２２４を有する。サンプルリザーバ２００および２２０は第１番目のサ
ンプルを含み、サンプルリザーバ２０４および２２４は第２のサンプルを含む。

【００２０】サンプルインジェクター１００はまた、第１の分離チャネル２０２および第２
の分離チャネル２２２を有する。従って、サンプルインジェクター１００はそれ
ぞれの分離チャネルにおける２つの異なったサンプルの連続した分析を可能とす
る。第１および第２の分離チャネルである２０２および２２２は、交差チャネル
２０７により廃液リザーバ２０８に連結される。サンプルインジェクター１００
はまた、カソード端２１０およびアノード端２１２も有する。カソードおよびア
ノード端２１０および２１２は、第１の分離チャネル２０２の逆の端に位置する
。同様に、第２のカソード端２１４は、廃液リザーバ２０８に連結された分離チ
ャネル２２２によって、第２のアノード端２１６に連結される。以下に図示する
ように、アノードリザーバ２１１および２１２、カソードリザーバ２００および
２１４、サンプルリザーバ２００、２０４、２２０、２２４および廃液リザーバ
２０８の適切なバイアスによって、サンプルは、それらのそれぞれのサンプルリ
ザーバ２００、２０４、２２０および２２４から、交差チャネルを通過して、廃
液リザーバへと移動し得、それによって、分離チャネルへの挿入が容易となる。

【００２１】図３Ａ、３Ｂ，３Ｃおよび３Ｄを参照して、サンプルのそれぞれのサンプルリ
ザーバから、交差チャネルへのローディングの過程、そして続く分離の実施につ
いて示す。図３Ａにおいて、注入電圧、好ましくは、約３００ボルト（３．０Ｖ
／ｃｍ）が、サンプルリザーバ２００および注入廃液リザーバ２０８との間にお
いて適用され、サンプルリザーバから廃液リザーバに通じ、分離チャネルを横切
る、チャネルを通してサンプルを引き出す。

【００２２】図３Ｂにおいては、例えば、約３７００ボルト（３００Ｖ／ｃｍ）の分離電圧
が、カソード端２１０およびアノード端２１２の間において適用される。これは
、サンプルの電気泳動的な分離を引き起こす。さらに、サンプルリザーバ２００
および注入廃液リザーバ２０８の間の電位の逆バイアスが、適用される。好まし
くは、逆バイアスの電圧は、約７２０ボルトである。逆バイアス操作は、注入交
差チャネル２１３からの過剰なサンプルを一掃する。図３Ｂに図示したように、
１００μｍのサンプルプラグが、注入され、そして任意の残りのサンプルが、テ
ーリング副作用を避けるために注入領域から取り除かれる。図３Ｃおよび図３Ｄ
は、第２のサンプルリザーバ２０４からの類似した注入を示す。図２および図３
Ａ〜３Ｄの実施例は、２つのサンプルを操作するが、４つのサンプルを、有意な
相互混入をすることなしに、一つのキャピラリーに注入し得る。

【００２３】代表的なマイクロプレート中への、エッチングパターンの工程を、以下に示す
。１つの微細加工の実施例において、ＳｃｈｏｔｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
ｏｆＹｏｎｋｅｒｓ，ＮＹから入手可能な、ボロフロートグラスウェーハー（
Ｂｏｒｏｆｌｏａｔｇｌａｓｓｗａｆｅｒｓ）は、１５秒間、４９％ＨＦで
プレエッチングされ、そしてプラズマ増強化学蒸着法（ＰＥＣＶＤ）システムに
おける約１５００Åのアモルファスシリコン犠牲レイヤーの沈着の前に洗浄され
る。ウェーハは、ヘキサメチルジシラザンでプライムし、ＳｈｉｐｌｅｙＣｏ
ｒｐ．ｏｆＭａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡから入手可能な１８１８フォトレ
ジストのようなフォトレジストを用いて、５０００ｒｐｍでスピンコートされる
。このフォトレジストは、Ｓｈｉｐｌｅｙより入手可能なマイクロポジット現像
濃縮液と水との１：１混合液中で現像される。次いで、ウェーハは、３０分間９
０℃で緩やかに焼かれる。マスクパターンは、Ｑｕｉｎｔｅｌのコンタクトマス
クアライナー中で紫外線にフォトレジストを露光させることにより基板に転写さ
れる。マスクパターンは、ＰＥＣＶＤリアクターでのＣＦ₄プラズマエッチを行うことにより、アモルファスシリコンに転写される。ウェーハは、４９％ＨＦ溶
液中で７μｍ／分のエッチング速度で約３分間エッチングされ、最終的なエッチ
ングの深さが２１μｍそしてチャネルの幅が、結合表面で６０μｍまでの幅にな
るように形成する。フォトレジストは、除去され、そして残されたアモルファス
シリコンはＣＦ₄プラズマエッチにより取り除かれる。孔は、Ｗｅｓｔｅｒｖｉｌｌｅ、ＯＨのＣｒｙｓｔａｌｉｔｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な
、１．２５ｍｍ直径ダイヤモンドチップドリルビットを用いて、エッチングされ
たプレートにドリルで孔を開けられる。エッチングされ、ドリルで孔を開けられ
たプレートは、プログラマブルバキュームファーネス内で類似したサイズおよび
タイプの平らなウェーハと熱により接着される。接着後チャネルの表面は、コー
ティングプロトコールを用いてコートされる。

【００２４】次いで、図４Ａおよび４Ｂにおいては、ＣＡＥマイクロプレートの分解組立図
および断面図が示される。図４Ａは、ＣＡＥマイクロプレート３０２上に形成さ
れるエッチングされた分離チャネル３０１および複数のリザーバ３０３がＣＡＥ
マイクロプレート３０２と共に提供される。リザーバアレイレイヤー３０４は、
ＣＡＥマイクロプレート３０２の上にマウントされ、マイクロプレート３０２上
に形成されるリザーバの上にさらなるリザーバ空間を提供する。リザーバアレイ
レイヤー３０４の存在は、カソードおよびアノードリザーバ中の緩衝液の溶量を
増加させ、そしてサンプルの操作および電極の導入を簡便にする。好ましくは、
リザーバアレイレイヤー３０４は、ガラスマイクロプレート３０２と接触させた
場合、防水シールが作製された、１ミリメートルの厚みのエラストマーシートで
ある。リザーバアレイレイヤー３０４は、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈｉｇａｎの
ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇから入手可能なＳｙｌｇａｒｄ１８４のようなエラス
トマーにであり得る。

【００２５】リザーバアレイレイヤー３０４は、チャネルが分離培地で満たされる前に、マ
イクロプレート３０２の上に置かれる。好ましくは、分離培地は、１μＭのエチ
ジウムブロマイドを含有する、１ＸＴＢＥ緩衝液中の、０．７５％（重量／容
量）の、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）である。さらに、リザーバアレ
イ３０４は、リザーバからお互いに十分に単離される。分離チャネルは、全ての
チャネルが満たされるまで、アノードリザーバ１８０からのシービングマトリッ
クス（ｓｉｅｖｉｎｇＭａｔｒｉｘ）で圧力で満たされる。次いで、アノード
およびカソードリザーバ１８０および１２０は、電気泳動中のイオンの枯渇を減
少するために、１０ＸＴＢＥ緩衝液で満たされる。このサンプルリザーバは、脱
イオン水でリンスされる。次いで、サンプルは、８チップピペッタを用いて、マ
イクロタイタープレートからロードされる。

【００２６】リザーバアレイレイヤー３０４を、マイクロプレート３０２の上に置いた後、
電極アレイ３０６が、リザーバアレイ３０４の上に置かれる。電極アレイ３０６
は、プリント回路基板を通して、プラチナワイヤーのような導体のアレイを配置
して組み立てられる。各導体は、マイクロプレート３０２上で、リザーバと系合
するように適合される。さらに、ワイヤーは、回路基板上の金属ストリップと電
気的に連結され、個々の共通なタイプのリザーバを、電気的に並行して処理する
ことを可能にする。電極アレイ３０６はまた、緩衝液の蒸発の可能性を減少する
。次に電極アレイ３０６は、１つ以上のコンピューター制御電源と連結される。

【００２７】図４Ｂに示すように、リザーバアレイレイヤー３０４は、マイクロプレート３
０２と連結して用いた場合、マイクロプレート３０２に本来つくられたリザーバ
の有効容積を拡大する。さらに、電極アレイ３０６の電極は、マイクロプレート
３０２およびリザーバアレイレイヤー３０６のリザーバをプローブするのに適合
されている。溶液は、ピペッタ３０８によりリザーバ中に置かれる。

【００２８】アセンブリ後、図５に示すように、ＣＡＥマイクロプレート３０２は、ガルボ
スキャナシステム４００でプローブされる。システム４００は、チャネルの検出
帯域で検出器を用いて蛍光を計測する。電気泳動のプロセスの間に、蛍光種は、
検出帯域を横切りながら、入射レーザービームにより励起される。直接蛍光検出
システムにおいて、標的種は蛍光性であるか、またはそれが発蛍光団で標識する
ことにより蛍光性種へと変換されているかのどちらかである。蛍光性種が検出帯
域を横切って通過すると変化を生じる（典型的にはシステム４００により検出し
得る蛍光の増大）。

【００２９】次に分析システムにもどり、ガルボスキャナ４００は、周波数が倍増された（
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｕｂｌｅｄ）ＹＧＡレーザー（例えば、ＹＧＡレーザ
ーはＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＳａｎＪｏｓｅのＵｎｉｐｈａｓｅＣｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎから入手可能）を有する。ＹＧＡレーザーは、３０ｍＷ、５３２ｎ
ｍビームであり得るビームを発生する。レーザー４０２により発生したビームは
、励起フィルター４０４を通過し、そしてミラー４０６により方向を変えられる
。ミラー４０６から、ビームはビームエキスパンダー４０８を通過する。拡大後
、ビームはダイクロイックビームスプリッタ４１０に向けられる。レーザービー
ムは、最終レンズアセンブリ４２２へビームを向ける反照検流計（ｇａｌｖｏｎ
ｏｍｅｔｅｒ）４２０へ向けられる。このように、ビームは、約５μｍのスポッ
トに焦点を合わされ、ここで、ビームがチャネル中の分子からの蛍光を励起し、
そして４０Ｈｚでチャネルを横切ってスキャンされる。生じた蛍光は、最終レン
ズによって集められ、そして反照検流計（ｇａｌｖｏｍｉｒｒｏｒ）およびダイ
クロイックビームスプリッタ４１０を約５４５〜６２０ｎｍの範囲で作動する発
光フィルター４１２へ向かって通り抜けた。発光フィルター４１２を通り抜けた
後、ビームは、レンズ４１２によって焦点を合わされる。次に、ビームは、ピン
ホール４１６（例えば、増倍電光管（ＰＭＴ）４１８へ送達する４００μｍピン
ホール）の中を通るように向けられる。

【００３０】電極アレイ３０６は、１つ以上の電源装置４２８（例えば、シリーズＰＳ３０
０、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＳｔａｎｆｏｒｄＲｅｓｅ
ａｒｃｈＳｙｓｔｅｍｓから入手可能）に接続される。電源装置は、コンピュ
ーターに接続され、そしてソフトウェアが自動的に時間および電極アレイ３０６
への適切な電圧の切り換えを制御する。そのソフトウェアは従来のコンピュータ
ー言語で書かれ得るか、またはＬａｂＶＩＥＷ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓｏｆＡｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓより入手可能）のようなデータ
収集ソフトウェアに特定され得る。次に、空間的に別々の蛍光発光に相当するデ
ータは、Ｂｕｒｒ−ＢｒｏｗｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆＴｕｃｓｏｎ
，Ａｒｉｚｏｎａの１６ビットＡ／Ｄコンバーターを用い約７７ｋＨｚで取得し
得る。次に、対数データ圧縮は、動的測定範囲の５つの線形順序の生成に適用さ
れる。そのデータは、１６ビットイメージとして得られ、次に、電気泳動図は、
各チャネルを横切るデータポイントを計算するのに適したソフトウェア（例えば
、ＩＰＬａｂ、ＳｉｇｎａｌＡｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ｖｉｒｇｉ
ｎｉａより入手可能）を用いて作成される。全てのレーンの検出が、０．０９秒
時間分解能で、システム４００により成し遂げられた。

【００３１】（実験）ＨＦＥ（遺伝ヘモクロマトーシスのためのマーカー遺伝子）の電気泳動分離お
よび蛍光検出は、本発明のＣＡＥマイクロプレートを用いた生物学的に関連のあ
るサンプルの高処理量分析を実証するために行われた。ＨＦＥは、時が経てば疾
患を生じる組織中の鉄の蓄積を生ずる遺伝的障害である。この蓄積は最初に肝臓
に影響する。白人（コーカサス人）集団の０．１〜０．５％は、この疾患の原因
であるＨＦＥＣ２８２Ｙ変異体についてホモ接合性である。もし早期に検出さ
れれば、処理が開始され得、そして長期的効果を避けられ得る。このマーカー遺
伝子について集団をスクリーニングするため、高処理量スクリーニングシステム
が必要とされる。

【００３２】本実験において、サンプルは、ＨＦＥ遺伝子中のＣ２８２Ｙ変異をアッセイす
るためにＰＣＲ増幅そして消化を用いて調製された。ヌクレオチド８４５のこの
ＧＡ変異は、ＨＦＥ遺伝子中にＲｓａＩ制限部位を生じる。ＤＮＡ物質は、標準
的な方法を用いて末梢血白血球から単離された。変異体部位を含むＨＦＥエキソ
ンは、以下のプライマーで増幅させた：ＨＨ−Ｅ４Ｂ：５’ＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＣ３’ ＨＣ２８２Ｒ：５’ＣＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＴＣＡＡＣＣ３’ ＨＣ２８２Ｒプライマーは、Ｆｅｄｅｒら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．１３
，３９９〜４０８（１９９６）（本明細書で参考として援用する）で議論された
プライマーである。ＨＨ−Ｅ４Ｂプライマーは、５’ビオチンタグを含む。２５
μｌ増殖反応は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．８）、５０ｍＭＫ
Ｃｌ、０．７５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭｄＮＴＰ、各プライマー７．５ｐＭおよび１．５ＵＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，
Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪから入手可能）を含む。このＰＣＲを、３つの継続
的条件下で実行した：５サイクル（９５℃１分間、６４℃１分間、７２℃１分間
）、５サイクル（９５℃１分間、６０℃１分間、７２℃１分間）、および２５サ
イクル（９５℃１分間、５６℃１分間、７２℃１分間）。増幅産物の制限消化は
、２ＵＲｓａＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む６μｌ緩衝
液へ各増幅されたサンプルの４μｌを加え、そして３７℃で９０分間消化するこ
とにより実行された。サンプルは、９６サンプル透析プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡから入手可能）上でＤＩ水に対して透析された。サ
ンプル型は初め、０．５×ＴＢＥ中、１％アガロース−３％ＳｅａＰｌａｑｕｅ
ゲル（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥから入手可能
）上の制限フラグメントの分離により確立された。ゲルは、３０分間０．５μｇ
／ｍｌ臭化エチジウムで染色し、そしてＵＶ透過照明器（Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎ
ｅモデルＴＲ−３０２）上で、１２３ｂｐラダ―（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手可能）を用
いて可視化して、フラグメントサイズを決定した。

【００３３】図６Ａおよび６ＢはＣＡＥマイクロプレート上の９６個のＨＦＥサンプルの分
離のイメージを示す。９６個のサンプルを、１チャネルあたり二つのインジェク
ションリザーバに相当する、４８個のサンプルの２回の実行に別けた。本実験に
おいて、１９個の異なるサンプルを９６サンプルウェルに分散して、サンプル分
析において５倍の冗長性を与えた。オリジナルイメージ５００は、第１の注入に
ついて得られ、一方オリジナルイメージ５０４は、第２の注入について得られた
。さらに、オリジナルイメージ５００および５０４に相当する、拡大イメージ５
０２および５０６が示されている。示されている電気泳動イメージの幅は、４８
レーンについて７．４ｍｍであり、そして９６サンプルの完全な分析は、８分未
満で行われた。拡大イメージは、そのバンドが、高い強度および分解能であるこ
とを示す。このイメージは右レーンが左より約２０秒速いスマイルを示す。これ
は、スキャニングレンズからの適切な間隔を守る注入領域側へのアノードの配置
により生じる電気泳動電圧の勾配によって生じる。

【００３４】図７は、図６Ａおよび図６Ｂのイメージから得られた９６個の電気泳動図を示
す。全ての電気泳動図は、分離物と比較する目的で１６７ｂｐダブレットと整
列させるために移動されている。１６７ｂｐフラグメントは、ＨＨＥ４Ｂプ
ライマーの部分的なビオチン化（ビオチン化形態がそのダブレット中のより遅く
移動するフラグメントを説明するように）に起因してダブレットとして現れる。
１６７ｂｐダブレットは、分離を比較する電気泳動図のアライメントのための
有用な基準点を提供し、そしてサイズ決定ラダーの必要なしに正確な遺伝子型決
定を許容する。図７に示すように、１１１ｂｐと１４０ｂｐバンドとの間の
平均距離は、第１の注入について、それぞれ、０．８秒および０．６秒の標準偏
差（ＳＤ）を伴って７．３秒、および第２の注入について、それぞれ、１．１秒
および０．５秒のＳＤを伴って６．６秒である。ｔ検定を用いて、両注入の型決
定（ｔｙｐｉｎｇ）は、約９９．９％の信頼水準であると決定された。

【００３５】図８に言及すると、ＣＡＥマイクロプレート６００の第二の実施態様が示され
ている。図８において、マイクロプレート６００は、それぞれ廃液リザーバ６０
２および６０８、サンプルリザーバ６０４、６０６、６１０および６１２を含む
インジェクターのアレイである。各インジェクター単位は、それぞれ、２つのカ
ソードリザーバ６１４または６１６の１方と接続されている。さらに、各インジ
ェクター単位は、キャピラリーまたはチャネル６２０のアレイの１つのキャピラ
リーと接続されている。キャピラリーまたはチャネル６２０は、アノード６３０
と接続されている。この設計において、９６個のサンプルは、１つのキャピラリ
ーに連続的に４個のサンプルを注入することにより分析され得る。さらに、２４
個の分離キャピラリーまたはチャネルは、９６個のサンプルリザーバ中の物質の
分析に用いられる。その上、インジェクター単位のそれぞれは、２つの廃液リザ
ーバを有する。合計で、図８の実施態様は３Ｎ／２＋３の孔数を有する。

【００３６】次に図９に言及すると、ＣＡＥマイクロプレート６５０の第３の実施態様が、
開示される。図９のＣＡＥマイクロプレート６５０において、カソードリザーバ
６５２は、ＣＡＥマイクロプレート６５０の周囲に配置される。さらに、１つの
アノードリザーバ６６０は、ＣＡＥマイクロプレート６５０の中心に配置される
。より長い分離チャネルが所望される場合、分離チャネルまたはキャピラリーは
単に、螺旋型のマイクロプレート６５０の中心に向かってマイクロプレート６５
０の外周から広がり得る。あるいは、短い経路が所望される場合、分離チャネル
またはキャピラリーは単に、ＣＡＥマイクロプレート６５０の中心６６０へ向か
ってマイクロプレート６５０の周囲を接続する直線であり得る。

【００３７】次に図１０および１１にもどると、図９のＣＡＥマイクロプレートのインジェ
クター単位および図９のマイクロプレートの周囲のインジェクター単位の位置が
、詳細に図示されている。図１０において、２つの分離チャネルまたは、キャピ
ラリー６７０および６７１は、共通廃液リザーバ６７２または共通カソードリザ
ーバ６７４に接続されている。さらに、分離チャネル６７０および６７１は、サ
ンプルリザーバ６７６および６７８に接続されている。図１０および１１に示す
ように、サンプルと廃液リザーバとの間の接続は、オフセットした方法（ｏｆｆ
−ｓｅｔｍａｎｎｅｒ）で交差し得る。

【００３８】次に図１２に言及すると、図９の共通アノード６６０が、詳細に図示されてい
る。図１１に示すように、複数の分離チャネルまたはキャピラリー８００〜８１
０は、中心領域８２０に集まる、放射状のパターンであり得る、曲線パターンを
形成する。中心領域８２０から、分離チャネルまたはキャピラリーは、中心領域
８２０の周囲から、ＣＡＥマイクロプレートの中心での共通アノードリザーバ６
６０への通路を形成する。中心領域８２０は、回転スキャナが検出目的で用いら
れ得る領域である。

【００３９】サンプルは、手動または自動で充填され得る。連続的注入は、予定されたキャ
ピラリーの数のサンプル処理能力の増大に用いられ得る。さらに、本発明の１つ
の実施態様は１チャネルあたり２つのサンプルを注入する一方、１チャネルあた
り４個のサンプルの注入を用いて、１プレートあたり１９２個のサンプルを分析
し得る。その上、ＣＡＥマイクロプレート上のキャピラリーの数の増加は、任意
のサンプル汚染の導入なしに処理能力を対応し増大させた。さらに、プレートは
ガラスまたはプラスチックで作られ得る。

【００４０】さらに、スキャニング検出システムは、その対物レンズの反転および下からの
スキャニングにより変化し得る。プレートの下の光学機器の構成部品の位置は、
容易な操作およびサンプルの導入を許容した。スキャニングの反転もまた、アノ
ードリザーバとの空間的衝突をさけ、それによってアノードの中心配置を許容し
た。その上、ＰＣＲ反応チャンバのアレイは、本発明のマイクロプレートととも
に用いられて低容量サンプルの完全な増幅を可能にし得、サンプル操作および手
動の移動の排除し得、およびコスト削減し得る。さらに、本発明は、電子電熱器
、熱伝対、および検出システムが、ＣＡＥ電気泳動プロセスを増強する微小流体
（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）キャピラリーのアレイを用いられ得ることを熟慮
する。

【００４１】本発明は、その１つの実施態様を参照して示しそして記載してきたが、当業者
は、形態および詳細における上記および他の変化が、以下の請求の範囲の精神お
よび範囲から逸脱することなくなされ得ることを理解する。

【図面の簡単な説明】

明細書に取り込まれ、そしてその一部を構成する添付した図面は、本発明を模
式的に示し、および上記の一般的な説明、および以下の詳細な説明とともに、本
発明の原理を説明する。

【図１】図１は、キャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）マイクロプレートの配置図で
ある。

【図２】図２は、図１のサンプルインジェクターの模式図である。

【図３】図３Ａ〜３Ｄは、図２のサンプルインジェクターの操作の図である。

【図４】図４Ａは、ＣＡＥマイクロプレートアッセンブリの分解透視図である。図４Ｂ
は、図４ＡのＣＡＥマイクロプレートアッセンブリの断面図である。

【図５】図５は、ＣＡＥマイクロプレートと連結したレーザー励起ガルボスキャナーの
図である。

【図６】図６Ａおよび６Ｂは、遺伝性ヘモクロマトーシスのための遺伝子マーカーの分
離イメージである。

【図７】図７は、図６Ａおよび６Ｂのイメージから作成される電気泳動図のプロットで
ある。

【図８】図８は、第二のＣＡＥマイクロプレートの配置図である。

【図９】図９は、第三のＣＡＥマイクロプレートの配置図である。

【図１０】図１０は、図９のサンプルインジェクターの模式図である。

【図１１】図１１は、図９のＣＡＥマイクロプレート配置図の周辺部分の拡大図である。

【図１２】図１２は、図９のＣＡＥマイクロプレート配置図の中心部分の拡大図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者マシーズ，リチャードエイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 94556 −1224，モラガ，デーンフィールドプレイス 93 (72)発明者ウーリー，アダムティー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02178−3643，ベルモント，ダートマウスストリート 45，アパートメントナンバー１

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】キャピラリーアレイ電気泳動プレートであって：該プレート上に形成される分離チャネルのアレイ；および該プレート上に形成され、かつ該分離チャネルに連結されるサンプルリザーバ
のアレイ；を備える、キャピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項２】前記サンプルリザーバのアレイが、１つ以上のサンプルイン
ジェクタへと組織化される、請求項１に記載のプレート。
【請求項３】各サンプルインジェクタ中に配置される廃液リザーバをさら
に備える、請求項２に記載のプレート。
【請求項４】前記廃液リザーバの１つが、各サンプルインジェクタ中の１
つ以上のサンプルリザーバに連結される、請求項３に記載のプレート。
【請求項５】カソードリザーバをさらに備え、該カソードリザーバが１つ
以上の分離チャネルに連結される、請求項１に記載のプレート。
【請求項６】１つ以上の分離チャネルに共通なアノードリザーバをさらに
備える、請求項１に記載のプレート。
【請求項７】請求項１に記載のプレートであって、前記プレートが、外部
ペリメータの近傍に配置される１組のリザーバを備え、そして１組のリザーバが
中心の近傍に配置されており、そして前記分離チャネルが、該外部ペリメータの
近傍の該リザーバを該中心の近傍のリザーバに連結する、プレート。
【請求項８】前記分離チャネルが前記外部ペリメータを前記中心に半径方
向に連結する、請求項７に記載のプレート。
【請求項９】前記リザーバアレイと連結可能な電極アレイをさらに備える
、請求項１に記載のプレート。
【請求項１０】前記リザーバアレイに連結可能な開口部のアレイを備える
リザーバアレイレイヤーをさらに備える、請求項９に記載のプレート。
【請求項１１】前記リザーバアレイが、前記プレート上で１次元または２
次元に規則正しく間隔を置いて配置され、かつマルチヘッドのピペッタに係合す
るように適用される、請求項１に記載されるプレート。
【請求項１２】キャピラリーアレイ電気泳動プレートであって：該プレー
トの表面に形成される複数の分離チャネル；該プレートの表面に形成される１つ以上のアノードリザーバ；および該プレートの表面に形成される１つ以上のインジェクタを備え、該インジェク
タが：該プレート上に形成され、かつ該分離チャネルに連結される複数のサンプル
リザーバ；該プレート上に形成され、かつ該分離チャネルに連結される複数の廃液リザ
ーバ；および該複数の分離チャネルと多重化される少なくとも１つのカソードリザーバを備える、キャピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項１３】前記リザーバに連結可能な電極アレイをさらに備える、請
求項１２に記載のプレート。
【請求項１４】前記プレートが、外部ペリメータおよび中心を備え、そし
て前記分離チャネルが該外部ペリメータを該中心に連結する、請求項１２に記載
のプレート。
【請求項１５】キャピラリーアレイ電気泳動プレートであって：第１の微小に作製された基板の表面、および第２の基板の対応する表面に形成
され、該第１の基板および第２の基板に結合される、微小に作製された分離チャ
ネルのアレイであり、該チャネルの各々が第１の端部および第２の端部を備える
、アレイ；該プレートの表面に形成されるサンプルリザーバのアレイ；該プレートの表面に形成される廃液リザーバのアレイ；該分離チャネル各々の第１の端部に連結されるカソードリザーバのアレイ；該分離チャネル各々の第２の端部に連結されるアノードリザーバのアレイ；お
よび分離チャネルを横切り、かつ廃液リザーバと連結する１つ以上のサンプルリザ
ーバに連結される注入チャネルにより形成されるインジェクタを備える、キャピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項１６】両方の基板が微小に作製される、請求項１５に記載のキャ
ピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項１７】前記基板がガラスから作製される、請求項１５に記載のキ
ャピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項１８】前記基板がプラスチックから作製される、請求項１５に記
載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項１９】１つ以上の分離チャネルが共通のカソードリザーバに連結
される、請求項１５に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項２０】１つ以上の分離チャネルが共通の廃液リザーバに連結され
る、請求項１５に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項２１】１つ以上の分離チャネルが共通のアノードリザーバに連結
される、請求項１５に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項２２】１つ以上のサンプルリザーバが１つの分離チャネルおよび
１つ以上の廃液リザーバに連結される、請求項１５に記載のキャピラリーアレイ
電気泳動プレート。
【請求項２３】前記プレートの上に取り付けられるリザーバアレイレイヤ
ーをさらに備え、該リザーバアレイレイヤーが前記サンプルリザーバ、前記廃液
リザーバ、前記カソードリザーバ、および前記アノードリザーバに連結するため
に配置される開口部を備える、請求項１５に記載のキャピラリーアレイ電気泳動
プレート。
【請求項２４】前記リザーバアレイレイヤーに連結可能な電極アレイをさ
らに備える、請求項１５に記載のプレート。
【請求項２５】前記第１の基板が、前記サンプルリザーバ、前記廃液リザ
ーバ、前記カソードリザーバおよび前記アノードリザーバに整列され、該リザー
バ中の溶液と電気的接触する電極のアレイを備える、請求項１５に記載のキャピ
ラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項２６】前記電極アレイが前記２つの基板と一体である、請求項２
４に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項２７】前記サンプルリザーバが、前記プレート上に規則正しく間
隔を置いて配置され、マルチヘッドピペッタシステムから溶液を受ける、請求項
２６に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項２８】前記プレートがＨ個の孔を備え、ここでＨはほぼ５Ｎ／４
に等しく、Ｎは処理されるべきサンプルの数である、請求項１５に記載のキャピ
ラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項２９】各カソードリザーバから対応するインジェクタまでの距離
がほぼ等しく、そして各インジェクタから各分離チャネルのためのその対応する
アノードリザーバまでの距離がほぼ等しい、請求項１５に記載のキャピラリーア
レイ電気泳動プレート。
【請求項３０】前記プレートがガラスまたはプラスチックから作製される
、請求項１５に記載のキャピラリーアレイ電気泳動プレート。
【請求項３１】キャピラリーアレイ電気泳動プレートを形成する方法であ
って：該プレートの表面に微小に作製される分離チャネルのアレイを形成する工程；該プレートの表面に微小に作製されるサンプルリザーバのアレイを形成する工
程；および該微小に作製されるサンプルリザーバのアレイを該微小に作製される分離チャ
ネルのアレイに連結する工程を包含する、方法。
【請求項３２】前記サンプルリザーバのアレイを１つ以上のインジェクタ
にグループ分けする工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】各サンプルインジェクタ中に廃液リザーバを形成する工程
をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】カソードリザーバを前記サンプルリザーバと多重化する工
程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】請求項３４に記載の方法であって、アノードリザーバを前
記プレート上の全てのサンプルリザーバに多重化する工程をさらに包含し、ここ
で各カソードリザーバから対応するインジェクタまでの距離がほぼ等しく、そし
てここで各インジェクタから各分離チャネルのためのその対応するアノードリザ
ーバまでの距離がほぼ等しい、方法。
【請求項３６】サンプルリザーバ、廃液リザーバ、カソードリザーバ、お
よびアノードリザーバに連結される微小に作製される分離チャネルを備えるキャ
ピラリーアレイ電気泳動プレートを通じてサンプルを注入する方法であって：該サンプルを交差チャネル領域に引き出すために、該カソードリザーバおよび
該アノードリザーバに注入プラグ幅を制御するためのバイアス電圧を印加しなが
ら第１リザーバと廃液リザーバとの間に注入電圧を印加する工程；該カソードリザーバと該アノードリザーバとの間に泳動電圧を印加する工程；
および該廃液リザーバおよび該インジェクタリザーバに、該サンプルの残留物を引き
出すためのバイアス電圧を印加する工程を包含する、方法。