DE69823347T2 - Mikrofluidisches system und verfahren zu dessen betrieb - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft eine neue mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zur Verwendung dieser Vorrichtung zur Durchführung von In-vitro-Untersuchungen über die Reaktion und Wirkungen verschiedener Verbindungen auf Zellen.
  • LITERATURANGABEN
  • Die folgenden Literaturangaben werden in der Anmeldung genannt.
    • 1. Harrison et al., Science; (1993) 261: 895–897,
    • 2. Fluri et al., Analy. Chem.; (1996) 68: 4285–4290
    • 3. Kitagawa et al., Electrophoresis; (1995) 16: 1364–1368
    • 4. Kricka et al., Pure and Applied Chemistry; (1996) 68: 1831–1836
    • 5. Fettinger et al. Sens Actuat B. 17 (1993) 19
    • 6. Zimmerman et al., The electromanipulation of cells, CRC Press (1996)
    • 7. Fan et al., D. J. Anal Chem.; (1994) 66: 177–184
    • 8. Slappendel et al., J. J. Blood; (1994) 84: 904–909
    • 9. Agar et al., Red Blood Cells of Domestic Mammals; Elsevier; Amsterdam (1983)
    • 10. Greenwalt et al., The human red cell in vivo; Grune & Stratton; New York (1973)
    • 11. Effenhauser et al., Science; (1993) 261: 895–897
    • 12. Effenhauser et al., Anal Chem; (1993) 65: 2637–2642
    • 13. Seiler et al., Anal Chem; (1993) 65: 1481–1488
    • 14. Lehninger, A. L. Biochemistry; 2nd ed.; Worth Publishers: New York (1975)
    • 15. Berry, D. R. The Biology of Yeast; E. Arnold: London (1982)
    • 16. Rech et al., Nucleic Acids Res; (1990) 18: 1313
    • 17. Crowley, J. M. Biophys. J.; (1973) 13: 711–724
    • 18. Zimmermann et al., Biophys. J.; (1974) 14: 881–889
    • 19. Serpersu et al., Biochim, Biophys, Acta; (1985) 812, 779
    • 20. Dower et al., Nucleic Acids Res.; (1988) 16: 6127–6145
    • 21. Hagar et al., Cell Calcium; (1992) 13: 123
    • 22. Boyum, A., "Separation of leucocytes from blood and bone marrow", Scand. J. Clin. Invest. (1968) 21, Suppl. 97
  • HINTERGRUND
  • Nach wie vor ist die Handhabung, Untersuchung und Bearbeitung einzelner Zellen in vitro sowohl für die theoretische als auch für die In-vitro-Untersuchung der biologischen Aktivität von Verbindungen in solchen Zellen von Bedeutung. Herkömmliche biologische Untersuchungssysteme, wie z. B. die Durchflußzytometrie und Zellperfusionskammern, werden jedoch typischerweise mit 1 ml bis 100 ml der Reagenzien oder mehr betrieben. Ein weiterer Nachteil von Verfahren, bei denen große Mengen an Zellen beteiligt sind, ist, daß man die Wirkungen auf eine Zelle vor, während und nach dem Kontakt mit einer Kandidatenverbindung nicht beobachten kann. Schließlich können statistische Schwankungen innerhalb einer Zellpopulation die Fähigkeit zur Aufklärung der Wirkung einer Verbindung einschränken.
  • Kürzlich wurden kleine Einweg-Vorrichtungen zur Handhabung biologischer Proben und zur kontrollierten Durchführung von Invitro-Experimenten entwickelt. Zum Beispiel wurden Mikrochips verwendet, um Aminosäuregemische elektrophoretisch zu trennen (1). Fluri et al. (2) beschreiben ebenfalls eine ganzheitliche Kapillar-Elektrophoresevorrichtung, bei der zur Trennung von Aminosäuregemischen Elektrophorese angewandt wird.
  • In der WO 97/04297 wird ein System im Mikromaßstab zur Handhabung eines Fluids beschrieben, welches einen effizienten Transfer einer Fluidprobe in Nanoliter- bis Pikolitermenge von der räumlich konzentrierten Umgebung eines mikrotechnisch hergestellten Chips an "Off-Chip"-Analyse- oder -Sammeleinrichtungen zur weiteren Off-Chip-Probenhandhabung und -analyse ermöglicht. Das Fluidhandhabungssystem ist in Form von einem oder mehreren Kanälen in einem beliebigen geeigneten Format, bereitgestellt in einem Mikrochipkörper oder -substrat aus Siliciumdioxid, Polymer oder anderem geeigneten nichtleitenden Material oder aus Edelstahl, Edelmetall, Silicon oder einem anderen geeigneten leitenden oder halbleitenden Material, gefertigt. Das Mikrochip-Fluidhandhabungssystem umfaßt eine oder mehrere mit dem Ende von einem oder mehreren der Kanäle ganzheitlich verbundene Austrittsöffnungen zur aufeinanderfolgenden oder gleichzeitigen Off-Chip-Analyse oder -Sammlung der Probe. Die Austrittsöffnung oder -öffnungen kann/können zum Beispiel als Elektrospray-Interface zum Transfer einer Fluidprobe an ein Massenspektrometer konfiguriert sein.
  • In der WO 93/22053 sind Vorrichtungen zum Nachweis der Anwesenheit eines zuvor ausgewählten Analyten in einer Fluidprobe offenbart. Die Vorrichtungen umfassen ein Substrat, das mikrotechnisch hergestellt ist, um eine Probeneinlaßöffnung zu definieren, und ein Strömungssystem im Mesomaßstab mit einem Probenströmungskanal, der sich von der Einlaßöffnung aus erstreckt. Das Strömungssystem im Mesomaßstab umfaßt ferner einen in fließender Verbindung mit dem Strömungskanal stehenden Bereich zur Analyt-Detektion, der aus der Bindungsgruppe zur spezifischen Bindung des Analyten besteht. Der in Mesomaßstabsgröße konstruierte Detektionsbereich ist ausreichend klein, um die Bindung zwischen der Bindungsgruppe und dem Analyten zu begünstigen. Die Bindungsgruppe kann in dem Detektionsbereich immobilisiert sein. Die Detektionssysteme im Mesomaßstab dieser Erfindung können bei einer Vielzahl von Anwendung verwendet werden, einschließlich der Detektion von Zellen oder Makromolekülen oder der Untersuchung von Zellkulturwachstumsreaktionen.
  • In der US 5 180 662 wird ein Verfahren zur quantitativen Untersuchung der zytotoxischen T-Lymphozytenaktivierung durch Messung der mit abgesondertem Granulum verbundenen trypsinartigen Serin-(BLT)-Esteraseaktivität nach der Inkubation der zytotoxischen T-Lymphozyten mit aktivierendem Reiz offenbart. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Inhibitoren (Arzneistoffe) oder Aktivatoren (monoklonale Antikörper) bei ausgewählten suboptimalen Werten der Aktivierung von zytotoxischen T-Lymphozyten zu screenen.
  • In der US 5 460 945 sind In-vitro-Modelle für das In-vivo-Rollen und -Festhalten von Leukozyten entlang der Endothelzellenwand, welches wichtige Schritte bei der Migration von Leukozyten aus der Blutbahn heraus und in das Gewebe hinein als Teil der Entzündungsreaktion sind, offenbart. Die In-vitro-Modelle dieser Erfindung arbeiten unter physiologischen Strömungsbedingungen, die zu physiologischen Scherspannungen führen. Bei einer speziellen Ausführungsform zur Bildung eines Modells zum Leukozytenrollen umfaßt die Vorrichtung dieser Erfindung eine Festphasenoberfläche mit darauf befindlichen Rollmediatormolekülen. Solche Rollmediatoren sind zum Beispiel Selektine und Selektinliganden, die auf Leukozyten exprimierte Bindungspartner besitzen. Bei einer weiteren speziellen Ausführungsform umfaßt die Vorrichtung der Erfindung zur Bildung eines Modells zum Leukozytenrollen, gefolgt von Adhäsion/Festhalten, eine Festphasenoberfläche, auf der sich sowohl Rollmediatoren als auch Integrinbindungspartner befinden. Die Vorrichtungen der Erfindung können zum Sammeln, Konzentrieren, Reinigen und zur Analyse von Blut und Blutbestandteilen, insbesondere Leukozyten und Unterarten davon, verwendet werden. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren oder, alternativ, Promotoren (Agonisten, funktionelle Komponenten) der Entzündungsreaktion. Therapeutische und diagnostische Verfahren, pharmazeutische Zusammensetzungen und Kits werden ebenfalls zur Verfügung gestellt.
  • Die Handhabung einer einzelnen Zelle durch ihre elektrophoretische Mobilität wurde in einer Kapillare gezeigt (3). Mikrochips wurden entwickelt, um die Spermafunktion, hauptsächlich die Mobilität, bei der In-vitro-Befruchtung zu untersuchen (4).
  • Die Untersuchung der Wirkungen von Kandidatenverbindungen auf die Zellfunktion erfordert die vorsichtige Handhabung von Kandidatenverbindungen, die oft sowohl in bezug auf ihre Menge als auch ihre Konzentration eingeschränkt sind. Die Fähigkeit, die Wirkung der Kandidatenverbindungen auf einzelne Zellen in einer Vorrichtung, die eventuell für ein hohes Maß an Multiplexierung geeignet ist, zu beobachten, macht die Mikroanalyse sehr reizvoll. Darüber hinaus wäre die Fähigkeit, die Wirkung einer Kandidatenverbindung auf nichthaftende Zellen zu beobachten, sehr nützlich.
  • In einem Mikrochip enthaltene mikrofluidische Systeme würden kleine Mengen verwenden, was die Vorteile der Kosteneinsparung bei Arbeiten mit teuren Reagenzien, insbesondere mit Kandidatenverbindungen, die für das Screenen von neuen Arzneistoffen hergestellt werden, mitsichbringt und natürlich die erforderliche Menge an Kandidatenverbindung verringern würde.
  • Die Fähigkeit, Zellreaktionen in Klassen einzuteilen und jede Klasse getrennt zu analysieren, würde die offensichtliche statistische Schwankung verringern, die auftritt, wenn eine große Anzahl von Zellen en masse untersucht wird. Untersuchungen an einzelnen Zellen würden auch die Möglichkeit bieten, den Ablauf der Ereignisse innerhalb einer einzelnen Zelle zu untersuchen, im Gegensatz zur Durchflußzytometrie, bei der der Ablauf der Ereignisse an einem Ensemble von Zellen untersucht wird. Statistische Schwankungen innerhalb eines Ensembles können die Fähigkeit zur Aufklärung einer speziellen Wirkung einschränken, wohingegen das Arbeiten mit einzelnen Zellen die Aufklärung und den Störabstand bei einem bestimmten Ereignis maximieren wird.
  • Es wäre daher vorteilhaft, Zellen innerhalb einer mikrotechnisch hergestellten Reaktionsvorrichtung zu handhaben und zu transportieren, so daß eine Beobachtung der Zellreaktionen möglich ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zum Teil ein Verfahren zur Beobachtung der Wirkung einer Verbindung oder einer Mischung aus Verbindungen auf Zellen in einer mikrofluidischen Vorrichtung, die einen Hauptströmungspfad mit einem Detektionsbereich und einem Auslaß und wenigstens zwei Einlaß-Strömungspfade, welche sich am Detektionsbereich oder stromaufwärts davon in einem Stromaufwärtswinkel von weniger als 90° mit dem Hauptströmungspfad kreuzen und in diesen einmünden, besitzt. Das Verfahren umfaßt das Einbringen wenigstens einer Zelle in einen ersten Einlaß-Strömungspfad und einer Kandidatenverbindung in einen zweiten Einlaß-Strömungspfad, das Erzeugen einer Strömung der Zellen und der erwünschten Verbindung in Richtung des Auslasses, das Vermischenlassen der wenigstens einen Zelle mit der Kandidatenverbindung am Kreuzungspunkt zwischen dem zweiten Einlaß-Strömungspfad und dem Hauptströmungspfad und das Beobachten der Wirkung der Verbindung auf die Zellen im Detektionsbereich.
  • In einem ihrer Verfahrensaspekte betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung des Calcium-Einstroms an einer Zelle in einem mikrofluidischen System, das einen Hauptströmungspfad mit einem Detektionsbereich und einem Auslaß und wenigstens zwei Einlaß-Strömungspfade, welche sich am Detektionsbereich oder stromaufwärts davon in einem Stromaufwärtswinkel von weniger als 90° mit dem Hauptströmungspfad kreuzen und in diesen einmünden, besitzt. Das Verfahren umfaßt das Einbringen von Lymphozyten in einen ersten Einlaß-Strömungspfad und eines Aktivators in einen zweiten Einlaß-Strömungspfad, das Erzeugen der Strömung der Lymphozyten und des Aktivators in Richtung des Auslasses, das Vermischenlassen der Lymphozyten mit dem Aktivator am Kreuzungspunkt zwischen dem zweiten Einlaß-Strömungspfad und dem Hauptströmungspfad und das Beobachten der Wirkung des Aktivators auf die Lymphozyten im Detektionsbereich. Dieses Verfahren wird vorzugsweise noch verfeinert, indem die Vorrichtung einen dritten Einlaß-Strömungspfad umfaßt, der stromaufwärts des Detektionsbereichs den Hauptströmungspfad kreuzt, und indem ein Inhibitor zu dem dritten Einlaß-Strömungspfad zugegeben wird und die Wirkung des Inhibitors im Detektionsbereich beobachtet wird.
  • In einem weiteren ihrer Verfahrensaspekte betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung des Leukozytenrollens, umfassend ein mikrofluidisches System, das einen Hauptströmungspfad mit einem Detektionsbereich und einem Auslaß und wenigstens zwei Einlaß-Strömungspfade, welche in einem Stromaufwärtswinkel von weniger als 90° stromaufwärts des Detektionsbereiches den Hauptströmungspfad kreuzen, besitzt, und wobei an die Wände des Hauptströmungspfades im Detektionsbereich Zelladhäsionsmoleküle gebunden sind, das Einbringen von wenigstens einer Leukozytenzelle in einen ersten Einlaß-Strömungspfad, das Einbringen von wenigstens einer Leukozytenzelle und einer Kandidatenverbindung in einen zweiten Einlaß-Strömungspfad, das Erzeugen der Strömung der Zellen und der Kandidatenverbindung in den Hauptströmungspfad und in Richtung des Auslasses, das Vermischenlassen der Leukozyten, der Kandidatenverbindung und der Zelladhäsionsmoleküle, um wechselwirken zu können, und das Beobachten des Leukozytenrollens im Detektionsbereich. Das Verfahren wird vorzugsweise noch verfeinert, indem die Vorrichtung ferner wenigstens zwei Detektionsbereiche umfaßt, wobei die Wände des Hauptströmungspfades im ersten Detektionsbereich frei von Adhäsionsmolekülen sind und an den Wänden des Hauptströmungspfades im zweiten Detektionsbereich Adhäsionsmoleküle haften, und indem das Leukozytenrollen in beiden Detektionsbereichen beobachtet wird.
  • In einem ihrer Produktaspekte betrifft die vorliegende Erfindung eine mikrofluidische Vorrichtung zur Durchführung von In-vitro-Untersuchungen über die Reaktion und Wirkungen verschiedener Verbindungen auf die Zellen, umfassend:
    einen Hauptströmungspfad (2) mit einem Detektionsbereich (10) und einem Auslaß (14) und
    wenigstens zwei Einlaß-Strömungspfade (8, 8'), dadurch gekennzeichnet, daß die Einlaß-Strömungspfade sich am Detektionsbereich (10) oder stromaufwärts davon in einem Stromaufwärtswinkel von weniger als 90° mit dem Hauptströmungspfad (2) kreuzen und in diesen einmünden.
  • Die Erfindung betrifft ferner eine Beobachtungseinrichtung mit einer Mehrzahl mikrofluidischer Vorrichtungen der Erfindung mit einem gemeinsamen Detektionsbereich.
  • In einem weiteren ihrer Produktaspekte betrifft die Erfindung eine Beobachtungseinrichtung mit einer Mehrzahl mikrofluidischer Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung, wobei die Hauptströmungspfade der mikrofluidischen Vorrichtungen im wesentlichen parallel zu ihren Detektionsbereichen verlaufen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung der Erfindung.
  • 2 ist eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung mit einer Mehrzahl an Einlaß-Strömungspfaden und Detektionsbereichen.
  • 3A, 3B und 3C sind schematische Darstellungen von Beobachtungseinrichtungen mit einer Mehrzahl mikrofluidischer Vorrichtungen von 1, die veranschaulichen, daß die Hauptströmungspfade der mikrofluidischen Vorrichtungen an ihren Detektionsbereichen im wesentlichen parallel verlaufen.
  • 4A ist eine schematische Darstellung eines Hauptströmungspfades in einer mikrofluidischen Vorrichtung der Erfindung mit einer wehrartigen Falle als Strömungsbeschränkungseinrichtung zum Einfangen von Zellen.
  • 4B ist eine schematische, nicht maßstabsgetreue Längsquerschnittansicht des in 4A gezeigten Hauptströmungspfades, entlang des Strömungspfades betrachtet, welche die Wirkung einer zum Einfangen von Zellen verwendeten wehrartigen Falle zeigt.
  • 4C ist eine schematische Darstellung eines Hauptströmungspfades in einer mikrofluidischen Vorrichtung der Erfindung mit einer wehrartigen Falle, die als Strömungsbeschränkungseinrichtung verwendet wird. Die wehrartige Falle definiert Kanäle, die den Zellenstrom weiter behindern.
  • 4D ist ein Aufriß einer Strömungsbeschränkungseinrichtung, wie sie in 4C verwendet wird.
  • 5A und 5B zeigen Bauformen der Mikrochips COPI (5A) und PCRD2 (5B).
  • 6A ist eine Fotografie von Hefezellen, die durch die mikrofluidische Vorrichtung strömen.
  • 6B ist ein Bild eines Hefezellenklumpens in der mikrofluidischen Vorrichtung.
  • 6C ist ein Bild von E. coli an einer Kreuzung der mikrofluidischen Vorrichtung.
  • 7A und 7B sind CCD-Bilder vom Vermischen des Bengalrot-Farbstoffes an einer Kreuzung in der mikrofluidischen Vorrichtung. 7A zeigt die Strömung des Fluids; 7B zeigt das Vermischen von Fluid, wenn die Strömung gestoppt wird.
  • 8 ist ein Schema der Bauform des PCRD1.
  • 9 ist ein Schema der Bauform des PCRD3.
  • 10A, 10B und 10C veranschaulichen die Lyse von Hunde-Erythrozyten, wenn SDS mit Erythrozyten an einer Kreuzung der mikrofluidischen Vorrichtung vermischt wird.
  • 11 ist ein Diagramm einer kinetischen Auftragung des Calciumstroms in einem menschlichen Lymphozyten.
  • 12 ist ein Schema der Bauform von "Y"-konfigurierten mikrofluidischen Vorrichtungen.
  • 13 zeigt einen ungefähren Querschnitt eines Kanals der mikrofluidischen Vorrichtung.
  • 14 ist ein Diagramm für die Ergebnisse des Neutrophilenrollens auf einem mit P-Selektin beschichteten Mikrochip.
  • 15 ist ein Diagramm für die Ergebnisse des ersten Durchgangs des Neutrophilenrollens auf einem mit E-Selektin beschichteten Mikrochip HCRIV.
  • 16 ist ein Diagramm für die Ergebnisse des zweiten Durchgangs des Neutrophilenrollens auf einem mit E-Selektin beschichteten Mikrochip HCRIV.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine mikrotechnisch hergestellte Vorrichtung zur Untersuchung der Wirkung von einer oder mehreren Verbindungen oder einer Mischung von Verbindungen auf einzelne Zellen zur Verfügung. Die Erfindung stellt ferner Systeme zur Verfügung, welche die mikrotechnisch hergestellte Vorrichtung der Erfindung zusammen mit einer Detektionseinrichtung, z. B. einer mikroskopischen Einrichtung, umfassen.
  • Definitionen
  • Vor der detaillierten Erörterung dieser Erfindung werden jedoch zunächst die folgenden Bezeichnungen definiert.
  • Die Bezeichnung "Strömungspfade" bedeutet die Kapillarpfade oder -kanäle, die in der mikrofluidischen Vorrichtung vorhanden sind.
  • Die Bezeichnung "strömungserzeugende Mittel" umfaßt Mittel, welche in der Lage sind, eine Strömung zu erzeugen. Strömung kann durch Unterdruck, Überdruck, elektrophoretisch oder osmotisch erzeugt werden. Dies kann durch peristaltische oder Kolbenpumpen, Spritzen, Elektrizität oder Piezoelemente erreicht werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das strömungserzeugende Mittel in der Lage, die Strömungsrichtung umzukehren. Zum Beispiel kann eine Einrichtung, die sowohl Über- als auch Unterdruck ausüben kann, eine Strömung durch Überdruck erzeugen und die Strömung durch Unterdruck umkehren.
  • Die Bezeichnung "Stop-Flow" bedeutet das Stoppen oder vorübergehende Anhalten der Fluidströmung durch die mikrofluidische Vorrichtung, damit sich die Inhalte der zwei oder mehreren Strömungspfade vermischen können und damit die Beobachtung der Reaktion der Kandidatenverbindung mit der Zelle möglich wird.
  • Die Bezeichnung "Kandidatenverbindung" oder "Arzneistoff-Prototyp" oder "erwünschte Verbindung" bedeutet Arzneistoffkandidaten, Arzneistoff-Prototypen, Zellinhibitoren, Zellaktivatoren, Zelladhäsionsmoleküle, einschließlich Selektine, Lektine, Integrine und Zellrezeptoren, und irgendeine andere Verbindung oder irgendein anderes Reagenz, das zur Ermittlung ihrer/seiner Wirkung auf eine Zelle von Interesse ist.
  • Die Bezeichnung "Zelle" umfaßt sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Zellen, einschließlich Bakterien-, Hefe-, Säugetierzellen usw. Vorzugsweise sind die Zellen eukaryotische Zellen, und besonders bevorzugt sind sie Leukozyten. Andere Zellen sind u. a. Gangliozyten, Fibroblasten oder irgendeine Zelle, die in einer Einzelzellensuspension suspendiert werden kann. Vorzugsweise sind die Zellen entwicklungsfähig.
  • Die Bezeichnung" Zelladhäsionsmoleküle" bedeutet irgendein Molekül, das die Zelladhäsion begünstigt. Diese sind u. a. Selektine, Lektine, Integrine und irgendein anderes Zelloberflächenmolekül, das die Adhäsion von Leukozyten an den Wänden der Vorrichtung begünstigt.
  • Die Bezeichnung "Aktivator" bedeutet eine Kandidatenverbindung, von der angenommen wird, daß sie die Reaktion eine Zelle hervorrufen kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Aktivator das Calciumionophor A23187 (Calcimycin).
  • Die Bezeichnung "Inhibitor" bedeutet eine Kandidatenverbindung, von der angenommen wird, daß sie eine Zelle davon abhält, auf eine Aktivatorverbindung oder ein Zelladhäsionsmolekül zu reagieren.
  • Die Bezeichnung "Calcium-Einstrom" beschreibt den Vorgang der Induktion eines intrazellulären Ca2+-Stroms in Leukozyten, welcher ein Indikator für die Zellaktivierung ist. Aktivierte Leukozyten sind direkt bei normalen oder abnormalen Immunreaktionen beteiligt. Ein rascher Anstieg des intrazellulären Messengers Ca2+ ist das zweite Signal im Aktivierungspfad aller Säugetierzellen. Daher ist ein Anstieg von freiem Ca2+ im Zytosol das Schlüssel-Signalereignis für die Aktivierung.
  • Die Bezeichnung "Leukozytenrollen" bedeutet den Prozeß eines Leukozytenrollens auf einem Endothel als das erste Ereignis, das zur Zellmigration durch das Gewebe führt. Der grundlegende molekulare Mechanismus der Entzündungsreaktion umfaßt eine Kaskade von Ereignissen, die durch die aufeinanderfolgende Bindung verschiedener Adhäsionsrezeptoren ausgelöst wird. Der erste Schritt in der Adhäsionskaskade ist die umkehrbare Bindung, die durch Selektine vermittelt wird und die Leukozyten dazu bringt, entlang des entzündeten Endothels zu rollen. Der zweite Schritt ist die durch Zytokine vermittelte Leukozytenaktivierung, welche die Leukozyten dazu bringt, sich auf dem Endothel zu verflachen, was zur Transmigration in das Gewebe führt. Zellen, die aktiviert werden und sich an die Oberfläche haften, scheinen sich in einem fließenden Strom auf rollende Weise fortzubewegen, wobei sie eine geringere durchschnittliche Geschwindigkeit aufweisen als nichthaftende Zellen.
  • Wie in 1 gezeigt, umfaßt die mikrofluidische Vorrichtung der vorliegenden Erfindung einen Hauptströmungspfad 2 mit einem Auslaß 4 und einem Detektionsbereich 10, der so angeordnet ist, daß er die Detektion einer jeglichen Zellreaktion ermöglicht, und wenigstens zwei Einlaß-Strömungspfade 8 und 8' in Fluidkreuzung mit dem Hauptströmungspfad 2 stromaufwärts des Detektionsbereichs 10 und des Auslasses. Die Einlaß-Strömungspfade haben Einlaßöffnungen 6.
  • Die mikrofluidische Vorrichtung wird aus einem festen Substrat gebildet, vorzugsweise in Form eines Chips. Die Abmessungen der Vorrichtung, z. B. des Chips, sind nicht entscheidend, vorzugsweise liegen diese Abmessungen jedoch in der Größenordnung von etwa 0,001 Zentimeter bis etwa 10 Zentimeter für die Dicke und etwa 0,3 Zentimeter bis etwa 30 Zentimeter an einer Seite.
  • Die Vorrichtung der Erfindung kann zweckmäßigerweise konstruiert werden, indem Strömungskanäle in der Oberfläche eines geeigneten Substrats oder einer geeigneten Grundplatte ausgebildet und anschließend ein Deckel über einer solchen Oberfläche angebracht wird. Es ist auch möglich, die Erfindung so zu konstruieren, daß Strömungskanäle in der Oberfläche der Basis und des Deckels ausgebildet und anschließend die Kanäle zur Deckung gebracht werden, wenn der Deckel auf die Basis montiert wird.
  • Die Basis und der Deckel können aus einem Material wie Silicium, Polysilicium, Quarzglas, Thermoelementmaterialien, Galliumarsenid, Polyamid, Siliciumnitrid und Siliciumdioxid bestehen. Der Deckel und/oder die Basis können/kann auch einen Kunststoff, wie z. B. Acryl, Polycarbonat, Polystyrol, Polyethylen, Polydimethylsiloxan oder andere Harzmaterialien, umfassen. Vorzugsweise können der Deckel und die Basis aus einem Material bestehen, das die Detektion eines Signals ermöglicht, besonders bevorzugt ist es ein Material, das für Ultraviolett-, Infrarot- oder sichtbares Licht durchlässig ist oder den radioaktiven Nachweis ermöglicht. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann es eine relativ dünne, durch Fusion oder anodisch gebundene Schicht aus Glas oder aus durch Ultraschall zusammengeschweißtem Kunststoff-Folienmaterial sein.
  • Die Strömungspfade 2, 8 und 8' haben Abmessungen von etwa 0,1 μm Tiefe und 0,1 μm Breite bis etwa 1 mm Tiefe und 2 mm Breite. Vorzugsweise sind die Strömungspfade etwa 5 μm tief und 500 μm breit bis etwa 30 μm tief bis 200 μm breit. Die Breite der Strömungspfade in der Vorrichtung ist ausreichend klein, um die Wirkung einer Kandidatenverbindung auf eine einzelne Zelle zu beobachten. Vorzugsweise wird die Länge der Strömungspfade im Bereich von etwa 50 μm bis etwa 2 Meter liegen, vorzugsweise beträgt die Länge etwa 1 Millimeter bis etwa 100 Zentimeter.
  • Die Strömungskanäle und die anderen Strukturen können, im Querschnitt gesehen, dreieckig, ellipsoid, quadratisch, rechteckig, kreisförmig sein oder irgendeine andere Form besitzen, wobei wenigstens ein Querschnittsmaß davon, quer zum Strömungspfad des Probenfluids durch eine oder in einer gegebenen Struktur, etwa 0,1 μm bis etwa 2 mm beträgt, vorzugsweise etwa 5 μm bis etwa 500 μm.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform besitzen ein oder mehrere Einlaß-Strömungspfade einen Durchmesser, der größer ist als der des Hauptströmungspfades. Dieser Unterschied im Durchmesser zwischen den Einlaß-Strömungspfaden und dem Hauptstrom erleichtert die Einstellung der Strömungsgeschwindigkeiten. Wenn zum Beispiel das strömungserzeugende Mittel Elektrizität ist, kann die Differenz der Strömungspfadweiten den Abfall des elektrischen Potentials im Hauptpfad ausgleichen und entlang des Hauptströmungspfades einen besseren Potentialgradienten schaffen.
  • Die Einlaßpfade kreuzen sich mit dem Hauptströmungspfad. In 1 ist der Stromaufwärtswinkel der Kreuzung eines jeden der Einlaß-Strömungspfade mit dem Hauptströmungspfad ein Winkel von weniger als 90°, vorzugsweise ein Winkel von weniger als etwa 70° oder besonders bevorzugt ein Winkel von weniger als 50°. Es wurde festgestellt, daß, wenn der Einlaß-Strömungspfad den Haupt strömungspfad in einem Stromaufwärtswinkel von 90° oder mehr kreuzt, die an der Kreuzung des Einlaß-Strömungspfades mit dem Hauptströmungspfad erzeugte Turbulenz zu einer Beschädigung oder zum Aufbrechen der Zellen führen kann. Eine solche Beschädigung oder ein solches Aufbrechen kann vermieden werden, wenn eine genaue Bestimmung der Wirkung der Kandidatenverbindung ermittelt wird. Zusätzlich kann die Lyse der Zellen dazu führen, daß der Hauptströmungspfad verstopft, so daß nachfolgende Beobachtungen von weiteren Zellen verhindert werden.
  • Es ist vorgesehen, daß überschüssiges Probenfluid, Zellen, Reagenzien, Waschlösungen und dergleichen aus dem Hauptströmungspfadauslaß 4 in ein Abfallreservoir mit ausreichendem Fassungsvermögen geleitet werden, so daß sämtliches Probenfluid und sämtliche Reaktionsprodukte sicher zur Entsorgung darin aufgenommen werden.
  • Die Wirkung der Kandidatenverbindung auf die Zelle wird durch den Detektionsbereich 10 beobachtet. Die Detektion der Wirkung der Kandidatenverbindung auf die Zelle kann durch eine Reihe von Verfahren erfolgen, einschließlich der optischen Detektion durch einen transparenten Deckel oder durch einen transluzenten Bereich der Basis entweder visuell oder durch eine Maschine. Die Wirkung der Kandidatenverbindung kann auch durch Änderungen der Strömungseigenschaften oder der elektrischen Leitfähigkeit beobachtet werden. Einrichtungen wie Ventile, Drucksensoren und andere mechanische Sensoren können durch gut bekannte Technologien erzeugt werden. Solche Einrichtungen können direkt auf einem Siliciumsubstrat gemäß gut bekannter Technologien hergestellt werden.
  • Die Vorrichtung kann auch in Kombination mit einem Gerät zur Betrachtung der Wirkung der Kandidatenverbindung auf die Zellen verwendet werden. Bei einer Ausführungsform kann das Gerät zur Betrachtung der Wirkung ein Mikroskop sein. Das Mikroskop kann auch ein invertiertes Mikroskop oder ein konfokales Mikroskop sein. Eine UV-Lichtquelle oder ein Laserstrahl, die/der zur Aktivierung der Zellfluoreszenz verwendet wird, kann ebenfalls verwendet werden, um die Wirkungen der Kandidatenverbindungen auf eine Zelle zu beobachten.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform kann eine Kamera in der Vorrichtung enthalten sein. Die Kamera könnte u. a. eine Videokamera sein. In einer weiteren Ausführungsform können die Daten durch Verwendung eines Photoelektronenvervielfachers (PMT), der am Mikroskop angebracht ist, anstelle einer Kamera erfaßt werden. Wenn ein PMT verwendet wird, besteht die Möglichkeit, eine Lochblende in Verbindung mit dem Mikroskop zu verwenden, um das Blickfeld des PMTs einzuschränken.
  • Es besteht die Möglichkeit, ein Szintillationsgerät zu verwenden, um die Wirkungen einer Kandidatenverbindung auf eine Zelle zu erfassen, wenn ein radioaktiver Farbstoff verwendet wird.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform können elektrische Leiter in die Basis der Vorrichtung eingearbeitet werden, um die Signalübertragung zu ermöglichen. Die elektrischen Leiter in der Vorrichtung leiten die Signale von Druck- oder Elektroleitfähigkeitssensoren, so daß die Erfassung der Leitfähigkeit oder des Drucks der Zellen in dem Strömungssystem möglich ist.
  • Es besteht auch die Möglichkeit, daß die Einlaß-Strömungspfade Einlaß-Reservoire zum Einbringen der Zellen und/oder der Kandidatenverbindungen in die Einlaß-Strömungspfade besitzen.
  • Die mikrofluidische Vorrichtung kann in Kombination mit einem Gerät zum Einbringen von Fluiden und Zellen in die mikrofluidische Vorrichtung über die Einlaßöffnungen 6 und 6' und zum Ablassen von Fluid und Zellen aus der Vorrichtung durch den Auslaß 4 verwendet werden. Das Gerät kann ein Hilfsmittel, wie z. B. eine Pumpe, umfassen, um die Fluide und Zellen durch die Strömungspfade der mikrofluidischen Vorrichtung zu befördern. Die Pumpe kann gemäß bekannten mikrotechnischen Herstellungsverfahren in das Gerät eingebaut werden.
  • Die Fluidsteuerung kann durch Verwendung verschiedener Pumpen, wie z. B. feinbearbeiteter Pumpen, Kolbenpumpen, peristaltischer Pumpen, Membranpumpen, Spritzenpumpen, Volumenokklusionspumpen, sowie durch endoosmotisch induzierte Strömung, durch elektrochemische Gasentwicklung hervorgerufene Strömung und andere Pumpmitteln, die den Fachleuten bekannt sind, erfolgen. Fettinger et al. (5) haben gezeigt, daß es möglich ist, externe Pumpen zu verwenden, um ein mikrofluidisches System ohne Ventile zu steuern. Es besteht auch die Möglichkeit, daß ein Reservoir, das mit den Einlaß-Strömungspfaden 6 und 6' in Verbindung steht, für die Atmosphäre offen gelassen wird, während andere an Pumpen angeschlossen werden, welche durch eine Kombination aus Druck- und Saugmodi betrieben werden, um die Steuerung der Strömung an den Kreuzungspunkten der Pfade zu ermöglichen. Der Betrieb mit Pumpen, die im Unterdruckmodus arbeiten, wird für kleine Arzneistoff-Prototyp-Reservoire mit einem Volumen im Bereich von etwa 10 μl bis etwa 200 μl günstig sein. Es besteht die Möglichkeit, die Genauigkeit und Empfindlichkeit dieses Fluidsteuerungsverfahrens zu erhöhen, indem die Größe der Strömungskanäle so gestaltet wird, daß die Strömung dort wo erwünscht eingeschränkt wird und der Strömungswiderstand dort wo notwendig minimiert wird. Eine gute Fluidsteuerung kann ohne interne Ventile in den Mikrokanälen erzielt werden. Spritzenpumpen sind bevorzugt, da die Strömungsgeschwindigkeit und das Rohvolumen wünschenswert sind. Alternative Pumpen sind mikrotechnisch hergestellte Pumpen, wie z. B. die HSG-IMT-VAMP (Villengen, Deutschland) oder andere im Handel erhältliche Mikropumpen.
  • Die Strömung des Fluids innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung kann auch mittels elektrischer Felder gesteuert werden. In unbeschichteten Glas-Mikrochips ist die Lösungsmittelmobilität aufgrund der elektroosmotischen Strömung größer als die elektrophoretische Mobilität der Zellen, so daß die effektive Strömungsrichtung der Zellen in der Nähe von physiologischen pH-Werten zur Kathode hin verläuft. Hohe elektrische Felder im Bereich von 1 kV/cm für Hefezellen, 2–4 kV/cm für menschliche Erythrozyten und 5–10 kV/cm für Hefezellen wurden bereits verwendet, um DNA oder andere markierte Substanzen mittels Elektroporation in diese Zellarten einzuführen. Felder in diesen Größenordnungen führten zur Membranpermeation, sie führten jedoch nicht zur Zell-Lyse. Vorzugsweise betragen die Felder weniger als etwa 600 V/cm und besonders bevorzugt weniger als 100 V/cm.
  • Es besteht die Möglichkeit, daß solche Mittel zur Erzeugung der Strömung der Kandidatenverbindung und der Zellen durch die Einlaß-Strömungspfade und in den Hauptströmungspfad auch verwendet werden, um die Strömung solcher Verbindungen und Zellen zu stoppen, so daß ein oder mehrere Zellen gleichzeitig mit der Interaktion der Kandidatenverbindung mit der Zelle oder kurz danach im Detektionsbereich vorliegen. Ein Stoppen der Strömung wird die Beobachtung der vollständigen Wirkung der Kandidatenverbindung auf die Zelle möglich machen.
  • Mittel zur Steuerung der Temperatur im Hauptströmungskanal 10 können gegebenenfalls eingesetzt werden, um die Reaktionsbedingungen zu verbessern. Mittel zur Temperaturerfassung im Hauptströmungskanal können nach Wunsch ebenfalls bereitgestellt werden. Das Temperaturerfassungsmittel kann kraftschlüssig mit einem Mikroprozessor oder einer ähnlichen Einrichtung verbunden sein, welche die Gesamtfunktion des Systems steuert, so daß die erfaßte Temperaturänderung mit der Interaktion zwischen der Zelle und der Kandidatenverbindung korreliert.
  • Wie in 2 gezeigt, besteht die Möglichkeit, daß die mikrofluidische Vorrichtung der vorliegenden Erfindung eine Mehrzahl an Einlaß-Strömungspfaden 8, 8', 8'' und 8''' in fließender Verbindung mit dem Hauptströmungspfad umfaßt. Es besteht auch die Möglichkeit, daß die mikrofluidische Vorrichtung eine Mehrzahl an Detektionsbereichen 10, 10' und 10'' enthält, wobei jeder dieser Bereiche sich neben oder unmittelbar stromabwärts des Kreuzungspunktes des Einlaß-Strömungspfades mit dem Hauptströmungspfad befindet. Eine solche Vorrichtung würde die Beobachtung einer Reihe von verschiedenen Kandidatenverbindungen an einer einzigen Zelle ermöglichen, wenn die Zelle im Hauptströmungspfad stromabwärts fließt. Alternativ würde eine solche Vorrichtung die gleichzeitige Überwachung von verschiedenen Kandidatenverbindungen an verschiedenen Zellen ermöglichen, wenn die Zellen sich entlang des Hauptströmungspfades mit den Verbindungen kreuzen.
  • Es besteht auch die Möglichkeit, daß sich der Detektionsbereich sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der Kreuzung eines Einlaß-Strömungspfades mit dem Hauptströmungspfad befindet. Dies würde die Beobachtung einer einzelnen Zelle sowohl vor als auch nach dem Kontakt mit der Kandidatenverbindung oder alternativ die gleichzeitige Beobachtung mehrerer Zellen vor und nach dem Kontakt mit der Kandidatenverbindung ermöglichen.
  • Die 3A, 3B und 3C veranschaulichen andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, bei denen mehrere mikrofluidische Vorrichtungen die Beobachtungseinrichtungen 19, 39 und 51, welche zur Durchführung der Verfahren der Erfindung geeignet sind, bilden. Solche Einrichtungen können verwendet werden, um das Leukozytenrollen zu untersuchen. Bei solchen Beobachtungseinrichtungen werden mehrere Kanäle verwendet, um wenigstens drei relevante Parameter der Untersuchung des Leukozytenrollens zu beobachten: die Geschwindigkeit ohne Rollen, die Geschwindigkeit auf einer Oberfläche, die das Rollen hervorruft, und die Geschwindigkeit auf der gleichen Oberfläche bei vorhandenem Arzneistoff. Ein Mikroskop kann gleichzeitig alle Kanäle auf einmal beobachten.
  • 3A zeigt einen möglichen Aufbau einer Beobachtungseinrichtung 19 mit mehreren Hauptströmungspfaden auf einem einzigen Chip. Dies ermöglicht das simultane Testen mehrerer Kandidatenverbindungen an dem gleichen Zelltyp zur gleichen Zeit. Die Zellkammer 20 ist ein Einlaß, der in fließender Verbindung mit den Mikrochipkanälen 22–22''' steht, welche vier Hauptströmungskanäle definieren. Die Testkammern 24–24''' sind durch zusätzliche Einlässe angeschlossen, die sich mit den jeweiligen Mikrochipkanälen 22–22''' stromabwärts von der Zellkammer 20 kreuzen und eine geeignete Kandidatenverbindung für die Reaktion mit den Zellen, die aus der Zellkammer 20 heraus strömen, zuführen. Die Ströme aus den Aktivatorkammern 26 und 26''' kreuzen die jeweiligen Mikrochipkanäle 22 bzw. 22''' stromabwärts des Zugabepunktes der geeigneten Kandidatenverbindungen aus den Testkammern 24 und 24'''. Jeder der Mikrochipkanäle 22–22''' führt durch einen Beobachtungsbereich 28 und mündet in eine gemeinsame Abfallkammer 30. Die Strömungspfade können so angeordnet sein, daß der Beobachtungsbereich (Mikroskopblickfeld) 28 die gleichzeitige Beobachtung der vier Hauptströmungspfade der Mikrochipkanäle 22–22''' ermöglicht.
  • Wie in der Einrichtung 39 in 3B veranschaulicht, ermöglichen mehrere mikrofluidische Vorrichtungen auf einem Chip mehrere Tests zur gleichen Zeit. Diese mehreren Tests können eine Steuerung auf dem gleichen Chip, jedoch in getrennten Vorrichtungen, umfassen. In Einrichtung 39 stellen die Mikrochipkanäle 42–42'''' die jeweiligen Hauptströmungspfade aus getrennten Zellkammern 40–40'''' dar. Die Ströme der Kandidatenverbindungen aus den Testkammern 44–44'''' kreuzen sich mit den jeweiligen Mikro chipkanälen 42–42''''. Die Aktivatorkammern 46–46'''' kreuzen sich mit den Mikrochipkanälen 42–42'''' stromabwärts vom Zugabepunkt der Kandidatenverbindungen. Jeder der Mikrochipkanäle 42–42''' führt durch einen Beobachtungsbereich und mündet in eine gemeinsame Abfallkammer 50. Wie aus 3B deutlich wird, beobachtet ein Mikroskopblickfeld 48 die Mikrochipkanäle 42–42'''' an einem Punkt stromabwärts vom Zugabepunkt des Aktivators.
  • 3C zeigt noch eine andere Beobachtungseinrichtung 51 mit einer Anordnung für mehrere getrennte mikrofluidische Kanäle auf einem einzelnen Mikrochip. Die Mikrokanäle 50–50'' stellen drei Hauptströmungspfade aus den jeweiligen Zellkammern 52–52'' dar. Stromabwärts befinden sich Einlaß-Strömungspfade 53–53''' aus den jeweiligen Kandidatenverbindungsreservoiren 54–54'. Noch weiter stromabwärts führen die drei Hauptströmungspfade 50–50'' durch einen Detektor 60, wie z. B. ein Mikroskop, in dem die Zellrolleigenschaften beobachtet werden können. Schließlich münden die Mikrokanäle in die Auslässe 58–58''.
  • Die Einrichtung 51 ist mit zusätzlichen Fluidpfaden 57–57'' ausgestattet, welche mit den jeweiligen Fluidströmungssteuerungen 56–56'' verbunden sind. Diese Fluidströmungseinrichtungen können einen Über- oder Unterdruck auf die Ströme in den Hauptströmungspfaden 50–50'' ausüben. Sobald die Zellkammern 52–52'' mit den erwünschten Zellen, zum Beispiel Leukozyten, beschickt und die Reservoire 54–54' mit den Kandidatenverbindungen beschickt worden sind, kann eine Strömung durch einen von den Strömungssteuerungen 56–56'' angelegten Unterdruck erzeugt werden. Die Strömung kann gestoppt und/oder umgekehrt werden, indem mittels der Strömungssteuerungen 56–56'' ein Überdruck angelegt wird. Die Beobachtung der Kanäle kann wie zuvor beschrieben erfolgen.
  • Es ist möglich, daß verschiedene Kombinationen aus Testverbindungen und Aktivatoren oder Inhibitoren gleichzeitig in jeder der 3A, 3B und 3C getestet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die in den 4A und 4B veranschaulicht ist, nutzt Änderungen der Strömungspfad-Querschnittsfläche, um einen Zelleinfangbereich zur Verfügung zu stellen. Diese Änderung kann die Form einer wehrartigen Falle einnehmen. Der Hauptströmungspfad 2 am Kreuzungspunkt mit einem Einlaß-Strömungspfad 8 enthält zwei Sperren (Wehre) 12, die sich am Boden 14 des Hauptströmungspfades entlang auf beiden Seiten des Einlaß-Strömungspfades erstrecken. Die Sperren sind nicht hoch genug, um das obere Ende 15 des Hauptströmungskanals zu erreichen. Die Sperren oder Wehre bilden ein Zellreservoir 13, so daß Zellen, die in den Einlaß-Strömungspfad 8 eingebracht werden, tendenziell im Zellreservoir 13 eingefangen werden. Sämtliche Puffer- oder Kandidatenverbindungen, die in den Hauptströmungspfad stromaufwärts der Wehre oder Sperren eingebracht werden, werden über die Sperren hinweg strömen und mit den eingefangenen Zellen 16 wechselwirken. Es besteht die Möglichkeit, daß anstelle der Verwendung von Wehren oder Sperren zur Änderung des Strömungspfades der Bereich des Hauptströmungspfades unmittelbar neben dem Einlaß-Strömungspfad 8 tiefer sein kann oder der Boden 14 des Hauptströmungspfades niedriger sein kann als der Boden des Einlaß-Strömungspfades oder des Hauptströmungspfades auf beiden Seiten, so daß auf diese Weise das Zellreservoir 13 erzeugt wird. Es besteht ferner die Möglichkeit, daß eine Zelleinfangkraft an den oberen Enden 15 der Sperren oder Wehre 12 oder am Rand des Zellreservoirs ausgeübt wird. Eine solche Zelleinfangkraft könnte die Form elektrischer Ströme, die durch Elektroden erzeugt werden, einnehmen, wie es bei der Dielektrophorese der Fall ist. (6)
  • Eine Variante der zellreservoirbildenden Sperren (Wehre) 12 ist in den 4C und 4D veranschaulicht. In 4C enthält das Wehr Kanäle 18, die in Richtung des Hauptströmungspfades verlaufen. Solche Kanäle 18 können einen dreieckigen Querschnitt besitzen. Es existiert ein zweiter Einlaß-Strömungspfad 8' stromabwärts des Stromabwärts-Wehrs 12'. Es besteht die Möglichkeit, daß ein chemotaktisches Mittel über den Einlaß-Strömungspfad 8' unmittelbar stromabwärts des Wehrs 12' in den Strömungspfad eingebracht wird. Die Lymphozytenreaktion auf das chemotaktische Mittel führt dazu, daß die Lymphozyten durch die Kanäle 18 des Wehrs 12' in Richtung des chemotaktischen Mittels wandern.
  • Verfahren
  • Die oben beschriebene mikrofluidische Vorrichtung kann bei einem Verfahren zur Beobachtung der Wirkung einer Verbindung auf eine Zelle verwendet werden, wie es nachstehend detaillierter beschrieben ist.
  • In 1 wird eine Lösung, welche die zu beobachtenden spezifischen Zellen enthält, über die Einlaßöffnung 6 in den ersten Einlaß-Strömungspfad 8 eingebracht. Die Kandidatenverbindung wird über eine zweite Einlaßöffnung 6 in den zweiten Einlaß-Strömungspfad 8' eingebracht. Beide Einlaß-Strömungspfade 8 und 8' stehen in fließender Verbindung mit dem Hauptströmungspfad 2. Es wird ein Strom aus den Zellen und der Kandidatenverbindung in Richtung des Hauptströmungspfades erzeugt. Man läßt die Zellen mit der Kandidatenverbindung an der Kreuzung des zweiten Einlaß-Strömungspfades 8' und des Hauptströmungspfades 2 wechselwirken, und die Wirkung der Verbindung auf die Zellen wird im Detektionsbereich 10 beobachtet. Selbstverständlich ist die Reihenfolge der Kreuzung der ersten und zweiten Einlaßpfade mit dem Hauptströmungspfad 2 nicht entscheidend. Die Zellen können in den zweiten Einlaß-Strömungspfad 8' und die Kandidatenverbindung in den ersten Einlaß-Strömungspfad 8 eingebracht werden.
  • Nachdem die Zellen und/oder Verbindungen eingebracht wurden, wird innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung eine Strömung erzeugt. Bei einem bevorzugten Verfahren wird die Strömung durch eine Spritze oder eine Spritzenpumpe, die am Auslaß 4 des Hauptströmungspfades 2 befestigt ist, gesteuert. Die Spritze wird so aufgezogen, daß ein Unterdruck auf das System wirkt und eine Strömung erzeugt wird. Die Strömung kann auch durch Elektrizität oder durch ein piezoelektrisches Element durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erzeugt werden.
  • Die mikrofluidische Vorrichtung besitzt wenigstens einen Detektionsbereich, wo die Inhalte der Kapillarströmungspfade beobachtet werden können.
  • Es besteht die Möglichkeit, den Strom der Zellen und der Kandidatenverbindung zu stoppen, wenn eine Zelle oder eine Gruppe von Zellen an der Kreuzung des Hauptströmungspfades und des zweiten Einlaßpfades angelangt, um die Wirkung der Kandidaten verbindung auf die Zellen zu beobachten. Die Dauer, für die der Strom gestoppt oder unterbrochen wird, wird von der Dauer der Reaktion der Zelle mit der Verbindung abhängen. Der Strom wird angehalten, damit die Zelle ausreichend mit der Verbindung reagieren kann, so daß eine mögliche Änderung in der Zelle oder der Zellfunktion beobachtet werden kann. Eine solche Dauer beträgt vorzugsweise 0,1 Sekunden bis 60 Minuten, besonders bevorzugt 1 Sekunde bis 10 Minuten. Sobald die Zelle mit der Verbindung reagiert hat, sofern eine solche Reaktion stattfindet, oder die Zelle und die Verbindung sich eine ausreichende Zeit lang vermischt haben, damit eine Reaktion stattfinden kann, wird der Strom der Zelle und der Verbindung erneut erzeugt, um die Zelle aus dem Detektionsbereich zu spülen und die Beobachtung einer weiteren Zelle mit der Kandidatenverbindung zu ermöglichen.
  • Es besteht die Möglichkeit, daß die mikrofluidische Vorrichtung eine Mehrzahl an Einlaß-Strömungspfaden enthält, wie es in 2 gezeigt ist. Bei einer solchen Vorrichtung werden die Zellen und der Puffer in einen Einlaßpfad gegeben, die Kandidatenverbindung wird in einen zweiten Einlaßpfad gegeben, und eine zweite Verbindung kann in einen dritten Einlaßpfad gegeben werden. Ein Strom der Zellen und der Verbindungen in den Hauptströmungspfad und in Richtung des Auslasses wird erzeugt und die Wirkung der Verbindungen auf die Zellen im Detektionsbereich beobachtet. Es besteht die Möglichkeit, daß die erste Verbindung ein Inhibitor und die zweite Verbindung ein Aktivator einer Zellfunktion ist.
  • Bei einem bevorzugten Verfahren läßt man die Zellen und den Inhibitor innerhalb des Hauptströmungspfades vermischen. Die Strömung wird durch die Spritze oder Spritzenpumpe gesteuert, so daß die Zellen und der Inhibitor sich vermischen, wenn sie durch den Hauptströmungspfad fließen. Die Zell/Inhibitor-Mischung kommt dann an der Kreuzung des dritten Einlasses mit dem Aktivator in Kontakt. Bei diesem Verfahren kann auch ein Rückdruck auf bestimmte Einlaß-Strömungspfade angewandt werden. Eine Spritze wird an dem Einlaßpfad angebracht, während die Spritze am Auslaß aufgezogen wird. Die offenen Einlaß-Strömungspfade (diejenigen ohne eine daran angebrachte Spritze) werden leichter zum Auslaß hin strömen. Dies ermöglicht ein gesteuertes Einmischen der Einlaßpfade in den Hauptströmungspfad.
  • Reagenzien können zu dem Hauptströmungspfad hinzugegeben werden, um die Beobachtung der Reaktion der Zelle auf die Kandidatenverbindung zu erleichtern. Solche Reagenzien sind u. a. sichtbare Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe und radioaktive Farbstoffe. Solche Farbstoffe können direkt mit Komponenten, die von den Zellen durch Reaktion mit der Kandidatenverbindung erzeugt werden, reagieren. Alternativ kann ein solcher Farbstoff entweder kovalent oder nichtkovalent an einen Liganden oder Antikörper, der sich an Komponenten bindet, die von den Zellen bei der Reaktion mit der Kandidatenverbindung erzeugt werden, gebunden werden. Radioaktive Farbstoffe sind u. a. 32P, 125I und 3H. Fluoreszenzfarbstoffe sind u. a. Fluorescein, Calcein-AM, Fluo-3, Fura-2, Indo-1, Quin-2 und verwandte Verbindungen die von Molecular Probes erhältlich sind. Fluoreszenz-pH-Indikatoren sind u. a. Verbindungen wie SNAFL, SNARF und verwandte pH-Indikatoren. Die Lebensfähigkeit der Zelle kann durch Verwendung der Verbindung Calcein-AM gemessen werden. Die DNA kann in toten Zellen mit Ethidiumhomodimer detektiert werden.
  • Die Wände der Strömungspfade können auch vor dem Einbringen von Zellen und/oder Verbindungen in die Vorrichtung beschichtet werden. Geeignete Verbindungen sind u. a. fetales Kälberserum, Rinderserumalbumin, mit den untersuchten Verbindungen nicht verwandtes Eiweiß, Gelatine oder Ovalbumin. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Beschichtung auf den Wänden der Strömungspfade elektrostatisch neutral, um die elektrostatische Ladung der Wände der Strömungspfade zu neutralisieren. Vorzugsweise wird fetales Kälberserum verwendet, um die Strömungspfade zu beschichten. Eine Polymerbeschichtung, wie z. B. Polysiloxan oder Polyacrylamid oder Polymethylmethacrylat, kann ebenso verwendet werden, um die Strömungspfade vor der Verwendung der Vorrichtung zu beschichten.
  • Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um die Induktion eines intrazellulären Ca2+-Stroms innerhalb der Leukozyten, der ein Indiz für die Zellaktivierung ist, zu untersuchen. Aktivierte Leukozyten sind bei normalen und abnormalen Immunreaktionen direkt beteiligt. Ein rascher Anstieg des intrazellulären Messengers Ca2+ ist das zweite Signal im Aktivierungspfad aller Zellen. Ähnlich wie bei Neutrophilen, ist ein zehnfacher Anstieg der Konzentration von freiem Ca2+ im Zytosol das Hauptsignalereignis für die Aktivierung. Die Verfahren dieser Erfindung bieten die Möglichkeit zur Untersuchung des Einflusses von Agonisten oder Antagonisten auf die Zellfunktion anhand dieses Verfahrens.
  • Arzneistoffe, welche die Ca2+-Aktivierung verhindern, können bei der Behandlung abnormaler Immunreaktionen von wesentlicher Bedeutung sein. Das Screening von Arzneistoffkandidaten oder Arzneistoff-Prototypen durch Untersuchung ihrer Wirkung auf die Ca2+-Kanalaktivierung von nichthaftenden Lymphozyten ist von Nutzen. Die Fähigkeit, die Kinetik der Arzneistoff-Prototyp-Bindung und -Freisetzung durch Zellen zu ermitteln, ohne dabei herkömmliche pharmakokinetische Studien zu ersetzen, würde zusätzliche, sehr informative Daten während der frühen Stadien des Screenings liefern.
  • Bei einem Assay zur Messung des Ca2+-Einstroms werden die Zellen und der Puffer mit einem Calciumindikator, wie z. B. Fluo-3, vermischt und in den ersten Einlaßpfad gegeben, der Aktivator wird in den zweiten Einlaßpfad gegeben und ein Strom der Zellen und des Aktivators erzeugt. Der Strom wird gestoppt, wenn eine oder mehrere Zellen sich mit dem Aktivator an der Kreuzung des Hauptströmungspfades und des zweiten Einlaß-Strömungspfades vermischen. Jeglicher Ca2+-Einstrom wird im Detektionsbereich gemessen.
  • Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um Inhibitor-Prototypen für den Calcium-Einstrom zu untersuchen. Es besteht die Möglichkeit, daß der Inhibitor-Prototyp mit den Zellen, dem Puffer und dem Calciumindikator vermischt wird, bevor die Zellen in den ersten Einlaß-Strömungspfad gegeben werden. Der Aktivator wird in den zweiten Einlaß-Strömungspfad gegeben und der Strom der Zellen und des Aktivators induziert. Der Strom wird gestoppt, wenn ein oder mehrere Zellen sich mit dem Aktivator an der Kreuzung des Hauptströmungspfades und des zweiten Einlaß-Strömungspfades vermischen. Jeglicher Ca2+-Einstrom wird im Detektionsbereich gemessen. Es ist auch möglich, eine Vorrichtung zu verwenden, die drei Einlaß-Strömungspfade enthält. Die Zellen und der Puffer werden mit einem Calciumindi kator, wie z. B. Fluo-3, vermischt und in den ersten Einlaß-Strömungspfad gegeben, der Inhibitor-Prototyp wird in den zweiten Einlaß-Strömungspfad gegeben, der Strom wird induziert, und man läßt den Inhibitor und die Zellen vermischen. Der Strom kann gestoppt werden, um den Zellen ausreichend Zeit zu geben, mit dem Inhibitor zu reagieren. Der Aktivator wird in den dritten Einlaßpfad gegeben und die Strömung der Zellen und des Aktivators induziert. Die Strömung wird gestoppt, wenn eine oder mehrere Zellen sich mit dem Aktivator an der Kreuzung des Hauptströmungspfades und des zweiten Einlaß-Strömungspfades vermischen. Jeglicher Ca2+-Einstrom wird im Detektionsbereich gemessen.
  • Das Verfahren kann auch verwendet werden, um die extrazelluläre Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (oxidative burst) durch Zellen zu untersuchen. Das Enzym NADPH-Oxidase, das in stimulierten Granulozyten vorliegt, ist bei dem aus mehreren Komponenten bestehenden Enzymweg, der zur Erzeugung des Superoxid-Anions O2 – führt, beteiligt. Die extrazelluläre Produktion reaktiver Sauerstoffspezies ist eine wichtige bakterizide Eigenschaft dieser Leukozyten. Unter pathologischen Bedingungen kann diese extrazelluläre Produktion reaktiver Sauerstoffspezies jedoch zur Gewebeverletzung beitragen. Der Enzymweg kann durch eine Reihe von Antagonisten, einschließlich ganzer Bakterien, Phorbolester, chemotaktischer fMLP(Formylmethionin-Leucin-Phenylalanin)-Peptide und einer Reihe von Zytokinen, aktiviert werden. Die Produktion von O2 – kann durch Verwendung des oxidationsempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs Dihydrorhodamin 123 auf eine ähnliche Weise wie die oben für die Messung des Ca2+-Einstroms beschriebene Weise gemessen werden.
  • Die Verfahren dieser Erfindung können auch verwendet werden, um das Leukozytenrollen auf einer Adhäsionsmatrix zu untersuchen. Das Leukozytenrollen auf einem Endothel wird als der erste Vorgang, der zur Zellmigration durch das Gewebe führt, angesehen, ein Schlüsselschritt bei Autoimmunerkrankungen, wie z. B. Arthritis. Die Inhibierung des Primärvorgangs des Zellrollens, d. h. der Selektin-Ligand-Wechselwirkung, sollte eine Reihe von biologisch wichtigen Vorgängen blockieren.
  • Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein gereinigtes Zelladhäsionsmolekül in den Hauptströmungspfad eingebracht und der Strom des Zelladhäsionsmoleküls den Hauptströmungspfad entlang durch den Detektionsbereich erzeugt, um zu ermöglichen, daß die Zelladhäsionsmoleküle sich an die Wände des Hauptströmungspfades im Detektionsbereich haften. Die Leukozyten werden in den ersten Einlaß-Strömungspfad gegeben und ihr Strom in den Hauptströmungspfad induziert. Jegliches Rollen der Leukozyten bei der Einwirkung der adsorbierten Zelladhäsionsmoleküle wird im Detektionsbereich beobachtet. Es besteht die Möglichkeit, daß ein Inhibitor oder Aktivator für das Rollen mit den Leukozyten vermischt wird und die Mischung durch einen zweiten Einlaß-Strömungspfad in die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung eingebracht wird und die Wirkung dieses Inhibitors oder Aktivators auf das Rollen der Leukozyten im Detektionsbereich beobachtet wird. Es wurde festgestellt, daß, wenn der Hauptströmungspfad der Vorrichtung einen Querschnitt von 30 μm bis etwa 500 μm, vorzugsweise 50 μm bis etwa 300 μm, besitzt, die Zellen aus den ersten und zweiten Einlaß-Strömungspfaden sich nicht sofort vermischen und die Wirkungen des Inhibitors oder Aktivators auf die Rollfähigkeit einer Zellpopulation parallel mit Kontrollzellen innerhalb des Hauptströmungspfades beobachtet werden können. Alternativ kann dieses Verfahren unter Verwendung der in 3 veranschaulichten Vorrichtung durchgeführt werden, um die Beobachtung verschiedener Zelladhäsionsmoleküle, Inhibitoren und Aktivatoren auf verschiedene Zellen gleichzeitig zu ermöglichen.
  • Weiterhin besteht die Möglichkeit, daß die Vorrichtung einen dritten Einlaß-Strömungspfad besitzt, der zwischen dem ersten und dem zweiten Einlaß-Strömungspfad liegt, welche zum Hauptströmungspfad hinführen. Ein Puffer könnte in den dritten Einlaß-Strömungspfad eingebracht werden, um die Zellen, die aus dem ersten Einlaß-Strömungspfad kommen, von den Zellen, die aus dem zweiten Einlaß-Strömungspfad kommen, innerhalb des Hauptströmungspfades zu trennen. Die Querschnittsgrößen des dritten Einlaß-Strömungspfades betragen vorzugsweise etwa 5 μm–500 μm und besonders bevorzugt etwa 30 μm–60 μm.
  • Die vorliegende Erfindung bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Verfahren zur Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen auf Zellen. Derzeit werden Bioassays für den Calcium-Strom auf Mikrotiterplatten oder durch Küvettenvermischen durchgeführt. Bioassays für das Leukozytenrollen werden in Tieren oder in großen Rollkammern durchgeführt. Diese Erfindung ermöglicht die Betrachtung der Wirkung einer Verbindung, die von Interesse ist, auf eine lebende Zelle in Echtzeit. Die Größe der mikrofluidischen Vorrichtung führt zu einer größeren Anzahl von Verbindungen, die physikalisch untersucht werden können. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung verringern die Menge an Probenverbindung, die benötigt wird, und ermöglich die leichte Handhabung einzelner Zellen oder kleiner Zellklumpen.
  • Um die vorliegende Erfindung und deren Vorteile weiter zu veranschaulichen, sind die folgenden spezifischen Beispiele angegeben, wobei selbstverständlich ist, daß diese nur veranschaulichend und in keiner Weise einschränkend gedacht sind.
  • BEISPIELE
  • Beispiel I – Herstellung der Mikrochipvorrichtung
  • Glaselemente (3 Inch × 3 Inch) wurden am Alberta Microelectronic Centre mittels eines modifizierten Silicium-Feinbearbeitungsverfahrens hergestellt. (7) Das Substrat war eine 600 μm dicke 0211-Glasplatte (Corning Glass Works, Corning, NY). Entweder 15 oder 30 μm tiefe Kanäle wurden auf eine Glasplatte geätzt. Die Längen und Breiten der Kanäle sind in den 5A und 5B angegeben. Eine Deckplatte, in die Löcher für einen Zugriff von außen gebohrt worden waren, wurde durch Wärme mit der geätzten Platte verbunden, wobei das folgende Temperaturprogramm verwendet wurde: 0,5 Stunden bei 440°C, 0,5 Stunden bei 473°C, 6 Stunden bei 605°C, 0,5 Stunden bei 473°C, gefolgt von der Abkühlung über Nacht. Kleine, mit Epoxidharz um die gebohrten Löcher herum geklebte Kunststoff-Pipettenröhrchen wurden als Vorrichtungs-Reservoire zur Aufnahme von Proben- oder Pufferlösungen verwendet. Pt-Drähte wurden für einen elektrischen Kontakt eingebaut. Einige Chips wurden innen mit AquaSil (Pierce, Rockford, IL) beschichtet. Eine 1%ige wäßrige Lösung wurde durch eine Spritze in die Kanäle gepreßt, unter Vakuum entfernt, und anschließend ließ man über Nacht härten.
  • Vor dem Verbinden der Platten wurden beide Platten durch Druck in einer Class-100-Reinigungshaube mit einer MicroAutomation-2066-Hochdruck-Reinigungsstation gewaschen. Die beiden Platten wurden vor dem Inkontaktbringen zur Deckung gebracht. Nach dem Inkontaktbringen wurde ausreichend Druck angelegt, um die gesamte eingeschlossene Luft auszutreiben. Das Fehlen von Interferenz-Randzonen bewies einen guten Kontakt. Kleine Schmutzteilchen führten zum Auftreten von Newton-Ringen um die Verunreinigung herum und machten eine Trennung und erneute Reinigung der Wafer notwendig. Dieses Reinigungsverfahren wurde auch auf Pyrex-Wafer angewandt, wobei eine so geringe Anzahl an Bindungsdefekten resultierte, daß nur ein Bindungszyklus erforderlich war.
  • Beispiel II – Elektrophoretische Mobilität in einem Mikrochip
  • Pufferlösungen und Reagenzien
  • Ein Phosphatpuffer, jeweils 40 mM von Na2HPO4 und KH2PO4 (BDH, analysenrein), wurde entweder mit NaOH oder HCl auf pH 7,4 eingestellt und als isotonischer Puffer für Hunde-Erythrozyten verwendet. (Die Plasmakonzentrationen von Na– und K– in Hundeplasma betragen 94 bzw. 6 mM. (8, 9) Wenn von einem Monoanion als Gegenion ausgegangen wird, ergibt sich eine Osmolarität von 200 mM, was der des hergestellten Puffers entspricht.) Ein hypotonisches Lösungsmittel, entionisiertes Wasser, wurde verwendet, um Hefe- oder E.coli-Zellensuspensionen herzustellen. Natriumdodecylsulfat (SDS, Serva, analysenrein) wurde mit einer Konzentration von 3 mM (0,1 Gew.-%) in entionisiertem Wasser hergestellt. Andere Chemikalien waren reinst und wurden ohne weitere Reinigung verwendet.
  • Zellproben
  • Rote Blutzellen von einem gesunden Hund wurden von Heritage Medical Research Centre (Edmonton, AB, Kanada) bezogen. Blutproben wurden unter Verwendung von EDTA als Antikoagulationsmittel gesammelt. Diese wurden zur Auftrennung in die verschiedenen Blutkomponenten zentrifugiert. Nach der Entfernung des Plasmas und des Buffy Coats wurden die Erythrozyten als Zell-Pellet entfernt. Eine Citrat-Phosphat-Dextrose(CPD)-Lösung (9), die zur Aufbewahrung von menschlichem Vollblut zur Steigerung der Lebensfähigkeit roter Zellen nach der Lagerung verwendet wird (10), wurde durch Zugabe von KCl sowie NaCl für die Handhabung und Aufbewahrung der Hundezellen angepaßt. Die Lösungen enthielten 2,5 mM Dextrose, 1,6 mM Natriumcitrat, 0,28 mM Citronensäure, 0,15 mM Na2HPO4, 94 mM NaCl und 6,0 mM KCl. Eine 5%-Hämatokrit-Erythrozytensuspension wurde verwendet. Die Zellen wurden mehrmals mit dem isotonischen Phosphatpuffer gewaschen, um den Aufbewahrungspuffer zu entfernen, wobei eine Sanyo-MSE-MicroCentaur-Zentrifuge verwendet wurde.
  • Bäckerhefe Typ II (Saccharomyces cerevisiae) wurde von Sigma (Milwaukee, WI) bezogen. E.coli (nichtpathogener Stamm, BlueScript) wurde von D. Khasa von Renewable Resources, University of Alberta, zur Verfügung gestellt. Die Hefezellenzahl betrug 108/ml, und die E.coli-Zellenzahl betrug 3 × 108/ml, sofern nichts anderes angegeben ist.
  • Die 5A und 5B veranschaulichen den Aufbau der für diese Arbeit verwendeten Vorrichtungen. Beide Vorrichtungen verwenden eine "Doppel-T"-Struktur, welche die Bildung geometrisch definierter Lösungs-Plugs ermöglicht. (1, 11, 12) An die verschiedenen Reservoire wurden Potentiale angelegt, um den Lösungsmittelstrom innerhalb der vier kreuzenden Kanäle zu steuern.
  • Das Experiment zum Hefezellentransport wurde mit der COPI-Vorrichtung durchgeführt, die in 5A veranschaulicht ist. Während der Beladung mit Hefezellen wurde das Probenreservoir (S) bei +100 V gehalten, während das Probenabfallreservoir auf Masse lag. Während der Injektion wurde das Pufferreservoir (B) auf –500 V eingestellt, und die S- und SW-Reservoire wurden beide bei +450 V gehalten, und das Pufferabfallreservoir (BW) lag auf Masse.
  • Das Experiment zum E.coli-Zellentransport wurde an der Y-Kreuzung der PCRD2-Vorrichtung durchgeführt, die in 5B veranschaulicht ist. Die Zellen wurden am BW1-Reservoir eingebracht, dessen Potential bei Masse lag. Das BW2-Reservoir besaß ein Potential von –200 V. Die Potentiale der anderen Reservoire (B, S und SW) waren zunächst frei. Um die Strömungsrichtung zu steuern, wurden anschließend –200 V zwischen den BW2- und SW-Reservoiren hin- und hergeschalten, wobei das alternierende Reservoir frei gelassen wurde.
  • Das Experiment zur sichtbaren Zell-Lyse wurde in der COPI- Vorrichtung (5A) durchgeführt. Das B-Reservoir, das Erythrozyten enthielt, und das S-Reservoir, das 3 mM SDS enthielt, wurden beide bei +150 V gehalten, während das SW-Reservoir auf Masse lag. Das Potential bei BW war frei.
  • Für das Zell-Lyse-Experiment mit PMT-Detektion wurde die PCRD2-Vorrichtung (5B) verwendet. Die Zellen wurden in das S-Reservoir gegeben, an das 400 V angelegt wurden, verglichen mit der Masse am SW-Reservoir. Eine 3 mM SDS-Lösung wurde in das B-Reservoir gegeben. Während der Zell-Lyse wurden 400 V sowohl an Reservoir S als auch an Reservoir B angelegt, während die Lyse beendet wurde, indem man Reservoir B frei ließ. Die anderen Reservoire, BW1 und BW2, wurden zu allen Zeiten frei gelassen.
  • Die Beobachtungen wurden mit einem Olympus-Mikroskop (BH-2) durchgeführt, welches mit einer JVC-Videokamera (TK-1280) ausgestattet war. Die Bilder wurden zunächst unter Verwendung eines JVC-S-Videokassettenrekorders (HR-S7200U) aufgezeichnet und anschließend mit einer Computer-Eyes/1024-Bildeinfangplatte erfaßt und mit einem Codonics-NP1600-Photodrucker ausgedruckt. Alternativ wurde ein Adapter hergestellt, um einen Photoelektronenvervielfacher (PMT) auf dem Mikroskop anzubringen, um den Durchgang von Zellen durch Induktionslichtstreuung zu detektieren. Ein feines Loch mit einem Durchmesser von 10 μm wurde verwendet, um das Blickfeld des PMT zu begrenzen. Das computergesteuerte System zum Anlegen von elektrischen Spannungen an die Reservoire der Vorrichtung und zur Aufzeichnung des PMT-Signals wurde bereits beschrieben. (7, 13)
  • Die drei untersuchten Zelltypen sind in ihrer Größe und Form recht verschieden: Bäckerhefe ist nahezu kugelförmig mit einem Durchmesser von etwa 5 μm; der verwendete E.coli-Stamm ist röhrenförmig, wobei seine Längsausdehnung von Submikrometer bis etwa 2 μm reicht; wohingegen Hunde-Erythrozyten (rote Blutzellen) einen Durchmesser von 8 μm und eine Dicke von 2 μm besitzen. (9, 14, 15). Alle diese Zelltypen sind negativ geladen, (9, 14, 15), so daß sie in einem elektrischen Feld aufgrund elektrophoretischer Einflüsse in Richtung der Anode wandern werden. In unbeschichteten Glas-Chips ist jedoch die Lösungsmittelmobilität aufgrund des elektroosmotischen Flusses größer als die elektrophoretische Mobilität der Zellen, daher verläuft die Gesamt strömungsrichtung der Zellen in der Nähe von physiologischen pH-Werten zur Kathode hin. Starke elektrische Felder im Bereich von 1 kV/cm für Hefezellen (16), 2–4 kV/cm für menschliche Erythrozyten (17, 18, 19) und 5–10 kV/cm für Hefezellen (20) wurden verwendet, um DNA oder andere markierte Substanzen mittels Elektroporation in diese Zelltypen einzubauen. Felder in diesen Größenordnungen führten zu einer Membranpermeation, nicht jedoch zur Zell-Lyse. Felder von weniger als 600 V/cm und noch typischer 100 V/cm wurden verwendet, so daß keine Lyse stattfinden sollte. Die kleine Anzahl von Zellen, die sich direkt in der Doppelschichtregion der Elektroden befand, welche verwendet wurde, um die Triebkraft in den Reservoiren zu liefern, lysierte jedoch.
  • Da der elektroosmotische Strom den elektrischen Feldlinien folgt, bewirkte das Anlegen eines Potentials zwischen den Proben- und den Probenabfallreservoiren, daß die Zellen sich in die Ecken der Kreuzungen im Doppel-T-Layout begeben und einen Zellstopfen entlang der Achse des Hauptkanals bilden.
  • 6A bestätigt, daß dieses ventillose Steuerschema zur Zelltransportführung geeignet ist. Ein Potential von 100 V (60 V/cm in der Doppel-T-Region) erzeugt einen Hefezellenstrom, der sich mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von 0,18 ± 0,02 mm/s durch das Doppel-T bewegt. Sobald sich ein Hefezellenstopfen unter stationären Bedingungen an der Kreuzung gebildet hat, kann er den Hauptkanal herab gespritzt werden, indem die Potentiale auf das Puffer- und das Pufferabfallreservoir geschaltet werden. 6B veranschaulicht ein Paket von sechs Zellen, das sich auf diese Weise gebildet hat und das den Hauptkanal entlang zu wandern beginnt. Potentiale von 500 V an B und 450 V sowohl an S als auch SW ergaben ein elektrisches Feld im Hauptkanal von 60 V/cm und eine Geschwindigkeit von 0,16 ± 0,02 mm/s. Bei einem Potential von etwa 455 V an der Injektorkreuzung gewährleisteten diese Polaritäten eine schwache Rückströmung in die Proben- und Probenabfallreservoire während der Injektion, welche zur Definition des Zellpakets hilfreich war. Felder, die wenigstens 160 V/cm stark sind, können angelegt werden, um Geschwindigkeiten von 0,49 ± 0,08 mm/s für die Hefezellen zu ergeben.
  • 6C veranschaulicht ein Beispiel für die Handhabung von E.coli-Zellen an der Y-Kreuzung der PCRD2-Vorrichtung, wobei elektrische Felder verwendet werden, um die Strömungsrichtung zu steuern. Diese Zellen bewegten sich mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von 0,054 ± 0,005 mm/s bei 35 V/cm, und bei 140 V/cm wurden Geschwindigkeiten von 0,28 ± 0,05 mm/s erreicht. Höhere Spannungen ergeben höhere Strömungsgeschwindigkeiten ohne Zell-Lyse, dies wurde jedoch nicht im Detail untersucht, da die Bildrate der Kamera eine Auflösung der Zellen bei höheren Geschwindigkeiten nicht zuließ. Die Strömungsrichtung konnte leicht zwischen den zwei Zweigen des Y durch Umschalten des negativen Potentials zwischen den zwei Zweigen des Y umgestellt werden, wobei das Potential des anderen Zweiges frei gelassen wurde. Die Zellen im freien Kanal blieben stationär, während das Potential an den anderen Zweig angelegt wurde.
  • Die Mobilisierung und die Steuerung der Strömungsrichtung waren auch mit roten Blutenzellen sowohl bei der Doppel-T- als auch der Y-Kreuzungsgeometrie möglich. Die Erythrozytengeschwindigkeiten betrugen 0,058 ± 0,007 mm/s bei 90 V/cm in einer isotonischen Pufferlösung. Experimente, die in einem anderen Puffer, der 137 mm NaCl und 2,7 mM KCl, 4,2 mM Na2HPO4 und 1,4 mM KH2PO4 und 1,1 mM Dextrose enthielt, durchgeführt wurden, ergaben höhere Geschwindigkeiten, z. B. 0,55 ± 0,09 mm/s bei 140 V/cm.
  • Oberflächenbeschichtungen
  • Zellen neigen dazu, sich an Kapillarwände zu haften. Die Hefe- und E.coli-Zellen in anfänglichen Experimenten, die mit Zellenzahlen von 4 × 108/ml bzw. 13 × 108/ml für Hefe- bzw. E.coli-Zellen durchgeführt wurden, haften sich an die Kapillarwände. Die Verringerung der Konzentrationen auf 1 × 109/ml bzw. 3 × 108/ml für Hefe- bzw. E.coli-Zellen beseitigte im wesentlichen dieses Problem. Es wurde festgestellt, daß es in Vorrichtungen mit einem Querschnitt von 15 μm × 55 μm bei Hefe und Erythrozyten zu einer geringeren Zellenhaftung kam als in Vorrichtungen mit Kanälen mit einem Querschnitt von etwa 30 μm × 70 μm. In allen Vorrichtungen kam es jedoch zu einem gewissen Absitzen der Hefe- und roten Blutzellen in den Lösungsmittelreservoiren, die mit den Kanälen in Kontakt standen. Dies bedeutete, daß die Zellenkonzentration im Inneren der Chipkanäle nicht immer gleich der Konzentration der in die Reservoire eingebrachten Zellen war. Dennoch konnten die Experimente mehrere Stunden lang durchgeführt werden, bevor die Probenreservoirzellensuspensionen gewechselt werden mußten.
  • Die Behandlung der Kapillarwände mit einem im Handel erhältlichen Trichlorhexadecylsilanmittel, um die Wände hydrophob zu machen, verringerte ebenfalls die Probleme mit der Zelladhäsion. Diese Beschichtung verringerte im wesentlichen den elektroosmotischen Fluß, so daß die roten Blutzellen in isotonischer Lösung eine Gesamtmigration in Richtung der Anode zeigten. Dennoch verblieb ausreichend Restladung auf den Kanalwänden, damit, in dem destillierten Wasser, das mit Hefe- oder E.coli-Zellen verwendet wurde, der elektroosmotische Fluß noch immer zur Gesamtmigration in Richtung der Kathode führte.
  • Lyse von Hunde-Erythrozyten
  • Um die Reaktion der Zellen nach ihrem Transport an einen bestimmten Ort zu veranschaulichen, wurde ein einfaches Experiment durchgeführt, das die Lyse von Erythrozyten (oder die Hämolyse) durch ein Detergens umfaßt. Diese Reaktion findet nach dem Vermischen eines Zellenstroms an einer Kreuzung mit einem weiteren Strom, der ein Lysemittel enthält, statt. Es wurde festgestellt, daß das anionische Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) die Zellen ausreichend rasch lysierte, so daß der Ablauf der Lyse in einem fließenden Strom innerhalb des Chips beobachtet werden konnte. Obwohl SDS die Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses verändern wird, wird die Richtung des Lösungsmittelstroms weiterhin zur Kathode hin sein, daher blieb der Strom gut kontrolliert.
  • Zwei etwas unterschiedliche Experimente wurden durchgeführt, um die Erythrozyten-Lyse zu untersuchen. Bei einer Untersuchung wurde ein Photoelektronenvervielfacher("PMT")-Detektor stromabwärts eines Vermischungspunktes nahe dem Doppel-T der in 5B gezeigten PCRD2-Vorrichtung angebracht. Zur Steuerung eines Zellenstroms wurde ein Potential von 400 V zwischen den S- und SW-Reservoiren angelegt. Anschließend wurde ein Potential von 400 V periodisch an Reservoir B angelegt, das ein Lysemittel enthielt, welches aus einer 3 mM SDS-Lösung in entionisiertem Wasser bestand. Diese Potentiale ergaben eine Feldstärke von 380 V/cm zwischen der Kreuzung und dem Detektionspunkt, wenn nur das Zellreservoir angeschlossen war. Eine Feldstärke von 520 V/cm lag vor, wenn sowohl der Zellen- als auch der SDS-Kanal angeschlossen waren. Die Zell-Lysereaktion wurde durch Messung der Änderung des gestreuten Lichts von den Zellen (unter Verwendung eines Epilumineszenzmikroskops) an einer Stelle 2,5 mm stromabwärts des Vermischungspunktes verfolgt. Das Signal fiel ab, als das SDS mit dem fließenden Zellenstrom vermischt wurde, und erlangte anschließend seinen ursprünglichen Wert wieder, sobald der SDS-Strom gestoppt wurde. Das Signal schwankt in Gegenwart der Zellen aufgrund der unstetigen Schwankung der Anzahl der Zellen in dem Detektionsvolumen als Funktion der Zeit. Das Experiment zeigt die Fähigkeit der elektrokinetischen Ventilwirkung, die Zufuhr des Lysereagenzes auf Verlangen zu steuern, sowie die chemische Verarbeitung von Zellen auf dem Chip.
  • In einem zweiten Experiment wurden die Zellen in das Pufferreservoir gegeben, wobei 3 mM SDS in dem Probenreservoir vorlagen und beide Reservoire ein Potential von 150 V besaßen. Das Probenabfallreservoir lag auf Masse, was zu einem steten Strom von Zellen und SDS führte, welche sich in der Doppel-T-Region vermischten und um die Ecke in Richtung Probenabfall wanderten (130 V/cm, etwa 0,058 ± 0,007 mm/s für die Zellen). 10A zeigt die Zellen, die von links eintreten, wobei das SDS von oben eingemischt wird. In 10B haben die zwei Zellen, die als 1 und 4 gekennzeichnet sind, begonnen, mit SDS zu reagieren und zu lysieren. Das SDS ist nicht über den gesamten Kanal diffundiert, so daß die Zellen 2 und 3 entlang der Wand beim Betrachten noch immer intakt sind. 10C zeigt, daß die Reste von Zelle 1 aus dem Sichtfeld abtransportiert wurden, während die anderen drei markierten Zellen jetzt ebenfalls lysiert sind. Insgesamt 0,3 s sind während dieser drei Bilder vergangen.
  • Beispiel III – Calcium-Einstromassay
  • Der Calcium-Einstrom ist bei bedeutenden Zellfunktionen und -reaktionen von Lymphozyten beteiligt. In diesem Assay wird der Calciumionen-Einstrom in die Lymphozyten durch ein Calciumfreisetzungsmittel, Calcimycin (A23187 Calcium-Ionophor), induziert. Der Anstieg der Konzentration der freien intrazellularen Calciumionen führt zu einem Anstieg des Fluoreszenzsignals der mit einem Fluoreszenzmittel vorbehandelten Zellen. Die kinetischen Ergebnisse des Calcium-Einstroms können mit dem Stop-Flow-Verfahren in der mikrofluidischen Vorrichtung untersucht werden.
  • Die Untersuchung des Calcium-Einstromverfahrens umfaßt mehrere Schritte. Zunächst müssen ein Aktivator, Calcimycin (A23187 Calcium-Ionophor) und der Calciumionenkomplex auf der Zelloberfläche adsorbieren. Anschließend muß der Komplex durch die Zellmembran diffundieren. Drittens muß die Dissoziation zwischen dem A23187 und dem Calciumion stattfinden, sobald der Komplex sich im Inneren des Zytosols befindet. Schließlich komplexiert ein Fluoreszenzmittel, Fluo-3 AM, mit dem freigesetzten Calcium und erzeugt emittiertes Licht, das detektiert werden kann (Fluoreszenz).
  • Reagenzien und Chemikalien
  • RPMI 1640 ohne Phenol-Rot-Gewebekulturmedium und Delbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung ("PBS") wurden von Gibco BRL (Burlington, Ontario, Canada) bezogen. Der langwellige zytosolische Calciumindikator Fluo-3 AM, das nichtionische Detergens PLURONIC F-127 und das Calcium-Ionophor A23187 in Form der freien Säure (Calcimycin) wurden von Molecular Probes (Eugene, Oregon) bezogen. Menschliches Serumalbumin (HSA) wurde von Bayer Corp. (Kankakee, Illinois) bezogen. Das LYMPHOLYTE-Poly wurde von Cedarlane (Hornby, Ontaria, Canada) bezogen. Alle anderen Chemikalien, einschließlich Verapamil, Mefenaminsäure, fetales Kälberserum (FCS), D-(+)-Glucose, N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), wurden von Sigma Chemical Co. (Oakville, Ontario, Canada) bezogen.
  • Herstellung und Markierung von menschlichen Lymphozyten
  • Zur Messung des Calcium-Einstroms wurde zunächst ein calciumspezifisches Fluorophor, Fluo-3 AM (Molecular Probes), zu gereinigten menschlichen Lymphozyten als Acetoxymethyl(AM)ester zugegeben.
  • Menschliche Lymphozyten aus Venenblut von gesunden Spendern wurden durch LYMPHOLYTE-Poly-Gradientenzentrifugation wie bei Boyum (22) beschrieben isoliert. Nach der Isolierung mononuklearer Zellen wurden die restlichen Blutplättchen aus der Zellensuspension entfernt, indem das Zellpellet in PBS/3 mM EDTA/1% HSA erneut suspendiert und 12 Minuten lang bei 800 U/Minute zentrifugiert wurde. Die Zellen wurden dreimal gemäß dem obigen Verfahren gewaschen. Das gereinigte Lymphozytenpellet wurde in 5,0 ml calciumfreiem HEPES-Puffer (5 mM KCl, 145 mM NaCl, 1 mM Na2HPO4 0,5 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7,4) erneut suspendiert.
  • Eine 10-μl-Probe der Fluo-3-AM-Lösung wurde in 5,0 ml calciumfreiem HEPES-Puffer suspendiert. Die 5,0-ml-Lymphozytenlösung wurde mit der 5,0 ml Fluo-3-AM-Lösung vermischt, um eine 2 μM Lymphozyten-Fluo-3-AM-Markierungslösung herzustellen. Die Lymphozyten wurden 60 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Hämatologiemischer inkubiert. Dieses Fluo-3-AM-Markierungsverfahren wurde gemäß der Beschreibung von Hagar et al. (21) durchgeführt.
  • Nach der Lymphozytenmarkierung wurden die Zellen dreimal mit calciumfreiem HEPES-Puffer gewaschen. Die markierten Lymphozyten wurden mit 1 × 107 Zellen/ml in RPMI 1640 ohne Phenolrot-Medium suspendiert und bis zur Verwendung bei 22°C gehalten.
  • Ermittlung der Mischzeit
  • Um die Mischzeit am Punkt B in 7A zu ermitteln, wurde ein Farbstoff, Bengalrot, (5 mM) in den durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren hergestellten Aktivatorkanal (#4) von PCRD1 (8) eingebracht. Die Strömung ist laminar, und bei dieser Strömungsgeschwindigkeit kommt es zu keiner Diffusion von Farbstoff in den Puffer während der Transitzeit. 7 zeigt den Grad der Diffusion des Farbstoffs in den Puffer 0,2 Sekunden nach dem Stop-Flow. Nach etwa 0,4 Sekunden war im CCD-Detektor kein Gradient mehr sichtbar. Einfache Diffusionsschätzungen zeigen, daß ein gleichmäßiges Vermischen weniger als 1 Sekunde dauern sollte. Dies ermöglicht Untersuchungen der Kinetik einzelner Zellvorgänge, die langsamer als 1 Sekunde sind.
  • Herstellung des mikrofluidischen Systems
  • 5%iges fetales Kälberserum ("FCS") in RPMI 1640 ohne Phenolrot-Medium (Gibco BRL, Burlington, Ontario, Canada) war entweder im Zellmedium enthalten und/oder wurde 30 Minuten vor der Verwendung durch das mikrofluidische System gespült. Die FCSbeschichteten Kanäle verringerten den elektroosmotischen Fluß erheblich. Daher wurde für das Stop-Flow-Verfahren ein hydrodyna- misches Strömungssystem unter Verwendung von Unterdruck, welcher durch Spritzensaugwirkung angelegt wurde, verwendet.
  • Verwendung des mikrofluidischen Systems
  • Die 8 und 9 zeigen den Aufbau der durch das in Beispiel 1 angegebene Verfahren hergestellten Post-Column-Vorrichtung.
  • In 8 wurde Puffer zu den Kanälen #1 und #2 zugegeben, Lymphozyten, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, wurden zu Kanal #3 zugegeben, und der Aktivator A23187 wurde zu Kanal #4 zugegeben.
  • Der Lösungsmittelstrom wurde durch Saugwirkung (Unterdruck), die mit einer manuell betriebenen Glasspritze an den Abfallauslaß angelegt wurde, vorangetrieben. Der Unterdruck zieht Lösung aus allen vier Einlaßreservoiren an, wobei aus dem Aktivatorreservoir etwa eine gleichgroße Menge angezogen wird wie aus den anderen drei Reservoiren zusammen.
  • Ein mit einem 25X-Objektiv und einer CCD-Kamera ausgestattetes Fluoreszenzmikroskop wurde über dem Detektionsbereich an Punkt "B" in 8 angebracht und ermöglichte die Beobachtung von Zellen, wenn sie den Detektionsbereich passierten. Die Vorrichtung wurde in einem Stop-Flow-Modus betrieben, wobei der Strom gestoppt wurde, wenn eine einzelne Zelle zur Beobachtung in den Detektionsbereich eindrang. Durch Stoppen des Stroms konnten die zwei unvermischten Bereiche, d. h. der Hauptströmungspfad und der Aktivator-Strömungspfad, an der Kreuzung ineinanderdiffundieren, so daß eine Zellreaktion mit dem zugegebenen Aktivatorreagenz begann.
  • Nach 4 Sekunden am Vermischungspunkt zeigte der Lymphozyt eine Fluoreszenz, die durch den Calcium-Einstrom bei der Aktivierung mit A23187 verursacht wurde. Früheren Berichten zufolge beträgt der Anstieg des emittierten Lichts von nichtaktivierten zu aktivierten Calciumkanälen in den Zellen je nach Zelltyp und Verfahren das 2- bis 40fache. Der beobachtete Anstieg bei der emittierten Fluoreszenz lag typischerweise in der Größenordnung von 5- bis 10fach. Eine kinetische Darstellung des Calcium-Stroms am menschlichen Lymphozyten ist in 12 gezeigt.
  • Die Lösung in dem Inhibitorreservoir wurde durch Puffer aus nichtinhibierten Kontrollexperimenten ersetzt. Um eine größere Flexibilität des Verfahrens zu erreichen, kann alternativ eine zweite Spritze an das Aktivatorreservoir (Kanal #4) oder an das Pufferreservoir (Kanal #1) angeschlossen werden, um einen Fluß aus diesen Kanälen heraus zu verhindern, während die Zellen an Punkt "B" gebracht werden. Dies ermöglicht die einfache Durchführung von Kontrollexperimenten.
  • Das Doppelspritzensteuerungsverfahren wurde unter Verwendung des Bengalrot-Farbstoffs an Punkt "B" auf dem Chip durchgeführt. In 8 wurde Puffer zu den Strömungspfaden #1, #2 und #3 zugegeben, und Bengalrot-Farbstoff wurde zum Strömungspfad #4 zugegeben. Die Spritze wurde an die "Abfall"- und Strömungs-pfade Nummer #4 angeschlossen. Durch Änderung des Rückdrucks oder der Strömungsgeschwindigkeit war es möglich, die Strömung auf 0% Farbstoff bis 100% Farbstoff einzustellen. Eine geringe Rückströmung in den "Stopped-Flow"-Kanal wurde jedoch benötigt, um einen "Stopped-Flow" in dem Kanal zu gewährleisten.
  • Beispiel IV – Calcium-Einstromassay mit Lymphozyteninhibitor
  • Die mikrofluidische Vorrichtung und menschliche Lymphozyten wurden wie in Beispiel III beschrieben hergestellt.
  • In 8 wurden 100 μM Verapamil, ein Inhibitor, in Kanal #1 gegeben, Puffer wurde in Kanal #2 gegeben, Leukozyten wurden in Kanal #3 gegeben und Calciumaktivator A23187 wurde in Kanal #4 gegeben.
  • Die Vorrichtung wurde wie in dem obigen Beispiel III beschrieben betrieben. Verapamil wurde an der Kreuzung bei Punkt "A" der Vorrichtung (8) zu den Lymphozyten hinzugegeben. Die Lymphozyten wurden mit Verapamil vier Minuten lang inkubiert, während sie durch den Hauptkanal zum Vermischungspunkt "B" transportiert wurden. Bei der Beobachtung des mit Verapamil behandelten Lymphozyten trat keine Fluoreszenz auf. Somit rief Verapamil eine bedeutende Verringerung der Aktivierung des Calcium-Stroms am menschlichen Lymphozyten hervor.
  • Dieses Beispiel wurde an zwanzig einzelnen Lymphozyten durchgeführt, und es wurden jeweils vergleichbare Ergebnisse erzielt. Die Verapamil-Inhibierung war zeitabhängig, denn Lymphozyten, die 30 Sekunden lang mit Verapamil im Mischkanal inkubiert wurden, zeigten keine Inhibierung.
  • Beispiel V – Extrazelluläre Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (Oxidative Burst)
  • Die Produktion des Superoxidanions O2 – kann durch Verwendung des oxidationsmittelempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffes Dihydrorhodamin 123 (Molecular Probes) gemessen werden. Granulozyten werden in Gegenwart von 2 μM Dihydrorhodamin 123 20 Minuten lang bei 37°C inkuziert. Die markierten Zellen werden dann gewaschen und in PBS erneut suspendiert. Diese Zellen werden dann auf die Induktion der Oxidative-Burst-Wege hin analysiert, wobei die wie in Beispiel III beschriebene mikrofluidische Vorrichtung verwendet wird. Mittels Stop-Flow werden einzelne Granulozyten mit einem Aktivator, wie z. B. fMLP, vermischt und die Fluoreszenzinduktion beobachtet. Ähnliche, auf Fluoreszenz basierende Assaytypen können für Agonisten, die intrazelluläre pH-Änderungen hervorrufen, oder zur Untersuchung von programmiertem Zelltod verwendet werden.
  • Beispiel VI – Wehreinrichtung
  • Mäuse-Lymphozyten (5 × 107) wurden mit PBS in den Chip gewaschen. Zwei Wehreinrichtungen wurden in der mikrofluidischen Vorrichtung verwendet. Der Abstand zwischen den Wehren in der ersten Einrichtung betrug 1 μm, und in der zweiten Einrichtung betrug er 3 μm. Der Strom wurde durch einen durch eine Spritze erzeugten Druck induziert.
  • In beiden Einrichtungen wanderten die Lymphozyten durch das Wehr. Als die Zellen in das Wehr eindrangen, füllten sie alle Bereiche aus, in denen Flüssigkeit strömte, so daß sie einen wirksamen Stopfen bildeten, der die Fluidströmung verringerte. Dann war ein höherer Druck notwendig, um die Zellbewegung erneut zu starten. Dies führte dazu, daß die Zellen über das obere Ende des Wehrs wanderten.
  • Die 4A und 4B zeigen ein Schema einer auf einem Wehr basierenden Vorrichtung zum physikalischen Einfang von Zellen, erzeugt durch Verwendung eines Zwei-Masken-Verfahrens in Glas. Die Kinetik der Calciumaufnahme und -freisetzung einer einzelnen Zelle kann mit diesen Strukturen untersucht werden.
  • Beispiel VII – Selektin-Bindung zur Auswahl von Kanälen einer mikrofluidischen Vorrichtung
  • Dieses Beispiel zeigt, daß Selektine an spezifische Strömungspfade in der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung gebunden werden können.
  • Die mikrofluidischen Strömungspfade, wie sie in 8 (PCRD1) und 5B (PCRD2) gezeigt sind, wurden zunächst unter Vakuum gesetzt, um Staub- und Fremdteilchen zu entfernen, welche sich in den Strömungspfaden einnisten und zum Verstopfen führen könnten. Gefilterte phosphatgepufferte Dulbecco-Kochsalzlösung (PBS) (Gibco) wurde zu den Strömungspfaden hinzugegeben und mit einem Vakuum 30 Minuten lang bei Raumtemperatur hindurchgespült. Nach dem Spülen des Mikrochips wurden die Strömungspfade auf Luftblasen überprüft. Luftblasen wurden bei aufrechterhaltenem Vakuum aus den Strömungspfaden entfernt.
  • Bei jedem Experiment wurde die mikrofluidische Vorrichtung 2 Stunden lang bei 37°C während des Stroms von Selektin durch die Strömungspfade inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurden die Strömungspfade 10 Minuten lang unter Vakuum mit PBS gespült. 100 µl einer 1 : 10-Verdünnung von monoklonalem primärem Maus-Antikörper (Anti-P oder -E-Selektin) wurden anschließend zugegeben, um sich an das zuvor gebundene Selektin zu binden. Dieser primäre Antikörper wurde mit Rückdruck 1,0 Stunden lang durch die Strömungspfade gespült. Nach der Inkubation des primären Antikörpers wurden die Strömungspfade mit PBS gespült.
  • 100 µl einer 1 : 10-Verdünnung von sekundärem Antikörper (Ziegen F(ab')2 Anti-Maus-IgG (H + L), markiert mit Fluoreszein (Pierce) wurden anschließend zu den Strömungspfaden hinzugegeben. Der sekundäre Antikörper wurde 15 bis 30 Minuten lang bei 37°C mit Vakuum durch die Strömungspfade gesaugt. Nach der Inkubation des sekundären Antikörpers wurden die Strömungspfade erneut mit PBS gespült, während der selektingebundene Strömungspfad unter einem Mikroskop sichtbar gemacht wurde.
  • Sobald der ungebundene fluoreszierende sekundäre Antikörper weggewaschen war, wurde der gebundene sekundäre Antikörper an den Kanalwänden sichtbar, was bedeutete, daß das korrespondierende Selektin an die Kanalwand gebunden war.
  • Im ersten Experiment wurde gereinigtes Selektin (P oder E) zu dem Abfallauslaß von PCRD1 (8) zugegeben; die Spritze wurde an Einlaß #4 angesetzt und das Fluid zum Einlaß #4 hin gezogen. Primärer Antikörper wurde zu dem Abfallauslaß zugegeben und die Spritze an Einlaß #2 angesetzt und der Antikörper zum Einlaß #2 hin gezogen. Schließlich wurde sekundärer Antikörper zu den Einlässen #1, #2, #3 und #4 zugegeben und die Spritze an den Abfallauslaß angesetzt und der sekundäre Antikörper zum Abfallauslaß hin gezogen. Lediglich am Abfallkanal wurde Fluoreszenz beobachtet.
  • Im zweiten Experiment wurden Membranextrakte, die Selektine enthielten, zu den Strömungspfaden #1 und #2 zugegeben, und fetales Kälberserum wurde zu Strömungspfad #3 zugegeben. Eine Spritze wurde an den Abfall-Strömungspfadauslaß angesetzt, und die Selektine und das fetale Kälberserum wurden zum Abfallauslaß hin gezogen. Primärer Antikörper wurde zu den Strömungspfaden #1, #2, #3 und #4 zugegeben und die Spritze an den Abfall-Strömungspfadauslaß angesetzt und aufgezogen. Sekundärer Antikörper wurde ebenfalls zu den Strömungspfaden #1, #2, #3 und #4 zugegeben und die Spritze an den Abfall-Strömungspfadauslaß angesetzt und aufgezogen. Fluoreszenz war in den Pfaden #1 und #2 zu beobachten, nicht jedoch in den Pfaden #3 und #4.
  • Dies veranschaulicht, daß Selektine zu anderen Strömungspfaden hinzugegeben werden können und der Bereich der Selektinbindung an spezielle Stellen an den Strömungspfaden gesteuert werden kann.
  • Beispiel VIII – Zellrollen
  • Leukozyten bewegen sich mittels drei Mechanismen in ein Gewebe hinein. Erstens besitzen naive Leukozyten eine Heimkehr-Reaktion oder -Wanderung über hochendotheliale Venule in sekundäre Lymphgewebe hinein. Zweitens zeigen stimulierte Leukozyten und/oder Gedächtniszellen eine gewebebegrenzte Wanderung an Stellen, wie z. B. an ein Schleimepithel oder eine Schleimhaut. Schließlich transmigrieren Leukozyten sowie Neutrophile und Monozyten in entzündete Gewebe als Reaktion auf lokalisierte Reize. Der grundlegende molekulare Mechanismus der Entzündungsreaktion wurde aufgeklärt und umfaßt eine Kaskade von Ereignissen, die durch die sequentielle Bindung verschiedener Adhäsionsrezeptoren eingeleitet werden. Der erste Schritt in dieser Adhäsionskaskade ist die reversible, durch Selektine vermittelte Bindung. Selektine bewirken, daß die Leukozyten entlang des entzündeten Endothels rollen. Während der nächsten Phase bringt ein durch Zytokine vermitteltes Leukozytenaktivierungsereignis die Leukozyten dazu, sich auf dem Endothel zu verflachen, was zur Transmigration in das Gewebe führt. Die Transmigration hängt von der Integrin-Ligandenbindung ab. Man weiß heute, daß die grundlegenden Schritte dieser Adhäsionskaskade und der bei dem Verfahren beteiligte Rezeptor auch bei der Bewegung naiver und Gedächtnis-Leukozyten zum Einsatz kommen.
  • Herkömmliche Zellrollverfahren benötigen bis zu 50 ml Lösung pro Test oder die Dosis für ein Tier im Bereich von 100 mg/kg. Im Gegensatz dazu würde durch Verwendung dieses Systems eine typische Arzneistoffdosis im Bereich von 100 µg/ml Blut dazu führen, daß nur 1–20 µg eines Arzneistoff-Prototyps für Tests an Hunderttausenden von Zellen benötigt werden.
  • Mikrotechnisch hergestellte Kanäle können auch verwendet werden, um das Zellrollen in einem Teil des Kanals und die Inhibierung des Rollens in einem anderen Teil des gleichen Kanals (z. B. eine interne Kontrolle) zu untersuchen. Dies wird mit einem kontinuierlichen Strom, z. B. ohne Verwendung einer Stop-Flow-Analyse, erzielt.
  • Die 12 und 13 zeigen die Vorrichtung, die für dieses Experiment verwendet wurde. 12 zeigt das Layout von einer der Vorrichtungen, und 13 zeigt den ungefähren Querschnitt von einem der Kanäle in der Vorrichtung, wobei die variablen Messungen der nachstehenden Tabelle I entsprechen. Der Querschnitt nimmt annähernd eine Wannenform mit gekrümmten Seiten und einem flachen Boden ein. Tabelle I zeigt die Messungen der variablen Abmessungen der Kanäle.
  • TABELLE I
    Figure 00420001
  • Konditionierung mikrofluidischer Vorrichtungen
  • Die mikrofluidischen Vorrichtungen müssen eine Stunde vor der ersten Verwendung und anschließend vor und nach jedem Experiment mit konzentrierter Salpetersäure konditioniert werden, indem sie 1) 10 Minuten lang mit konzentrierter Salpetersäure, 2) 10 Minuten lang mit entionisiertem destilliertem Wasser, 3) 10 Minuten lang mit zweimolarer Schwefelsäure, 4) 10 Minuten lang mit entionisiertem destilliertem Wasser, 5) 10 Minuten lang mit einmolarer NaOH und 6) 10 Minuten lang mit entionisiertem destilliertem Wasser gespült werden.
  • Dieses Verfahren wurde durch Konditionierung dreier getrennter Kanäle, A, B und C, ermittelt. Kanal A wurde mittels der Schritte 1 und 2 konditioniert, Kanal B wurde durch Anwendung der Schritte 1–4 konditioniert, und Kanal C wurde durch Anwendung der Schritte 1–6 konditioniert. Jeder Kanal wurde anschließend mit Selektin beschichtet und das Zellrollen beobachtet. Es wurde festgestellt, daß das Zellrollen in Kanal C reproduzierbarer war und in stärkerem Umfang stattfand als in den Kanälen A oder B, vermutlich aufgrund einer besseren Oberflächenbedeckung mit Selektin in Kanal C.
  • Strömungsgeschwindigkeit
  • Vor der Untersuchung des Zellrollens ist es notwendig, sowohl die Strömungsgeschwindigkeit in jedem Kanal als auch die Probenzufuhr aus jedem Reservoir zu untersuchen.
  • Die Strömungsgeschwindigkeit in jedem Kanal wurde basierend auf der Messung der Zeit, die ein bekanntes Volumen Wasser benötigte, um durch den Kanal zu fließen, berechnet. Dies wurde bei verschiedenen Spritzenpumpengeschwindigkeiten durchgeführt, um die Spritzenpumpe zu kalibrieren. Die lineare Geschwindigkeit (laminare Strömungsgeschwindigkeit) wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet: Strömungsgeschwindigkeit = (Volumenströmungsgeschwindigkeit cm3s–1)/Kanalquerschnitt cm2)
  • Die Ergebnisse für das HCRIVa mit 100 µm Tiefe und das HCRIVc mit 50 µm Tiefe sind in der nachstehenden Tabelle II gezeigt, wobei optimale Werte für die speziellen Kanäle in Figur 12 fett dargestellt sind:
  • TABELLE II
    Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Probenzufuhr
  • Um die Proben- und Pufferzufuhrzeit für jedes Reservoir zu ermitteln, wurde eine konzentrierte Lösung von Bengalrot-Farbstoff in RPMI 1640 (Gibco BRL, Burlington Ont. Canada) in das erste Reservoir gegeben, und RPMI 1640 alleine wurde in das zweite Reservoir gegeben. Der Hauptströmungskanal wurde unter einem Mikroskop etwa 1–2 cm nach der Kreuzung der Reservoirkanäle beobachtet.
  • Wenn die HCRIVc-Vorrichtung verwendet wurde und der Farbstoff vom rechten Reservoir dem Kanal zugeführt wurde und der Puffer alleine vom linken Reservoir dem Kanal zugeführt wurde, bedeckte der Farbstoff 150 µm des Kanals, wohingegen der Puffer nur 120 µm des Kanals bedeckte, und es gab einen 30-µm-Diffusionsbereich in der Mitte des Kanals. Demnach ist es möglich, zwei Zellrollereignisse innerhalb des gleichen Kanals zu beobachten, wobei eine Zelle einem Inhibitor ausgesetzt ist und die andere Zelle keinen derartigen Einfluß erfährt. Das Zellrollen in der Mitte des Kanals (im Diffusionsbereich) kann vom Inhibitor beeinflußt werden und wurde daher nicht gewertet.
  • Es besteht ferner die Möglichkeit, daß ein dritter Einlaß-Strömungspfad zwischen dem ersten und dem zweiten Einlaß-Strömungspfad in die Vorrichtung eingebaut wird. Ein Pufferstrom könnte vom dritten Einlaß-Strömungspfad in den Hauptkanal erzeugt werden. Der Pufferstrom würde die Zellen aus dem ersten Einlaß-Strömungspfad von denen aus dem zweiten Einlaß-Strömungspfad trennen.
  • Zellrollen von Neutrophilen
  • Zur Vorbereitung des Zellrollen wurden die Kanäle mit dem erwünschten Selektin durch Verfahren, ähnlich den in Beispiel VII genannten Verfahren, beschichtet.
  • Um das Zellrollen zu untersuchen, wurden die zwei Reservoire, die in einen Kanal münden, mit Zellen befüllt. Die Inhalte sowohl des ersten als auch des zweiten Reservoirs (nur Zellen) wurden in den Kanal gesaugt und das Zellrollen beobachtet.
  • Anschließend wurde ein erwünschter Inhibitor zu den Zellen in dem zweiten Reservoir zugegeben und das zweite Reservoir dann so in den Kanal gesaugt, daß der Zellenstrom aus dem ersten Reservoir und der Zellenstrom aus dem zweiten Reservoir sich an den Rändern des Kanals nicht vermischten, sondern Seite an Seite durch den Kanal flossen.
  • Das Zellrollen wurde unter Verwendung eines mit P-Selektin beschichteten Mikrochips und eines mit E-Selektin beschichteten Mikrochips beobachtet.
  • 1) Mit P-Selektin beschichteter Chip
  • Der HCRIVa-Mikrochip wurde durch Verfahren, ähnlich den in Beispiel VII beschriebenen Verfahren, mit 20 µg/ml P-Selektin beschichtet und zwei Stunden lang inkubiert. Isolierte menschliche Neutrophile wurden mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 µl/Minute durch den Roll-Mikrochip geleitet (etwa 800/cm Scherrate = 40 dyn/cm2 Scherkraft). Die Kontrollergebnisse zeigen die Zahl der Neutrophile, die an der rechten und an der linken Seite des mit P-Selektin beschichteten Kanals während des Stroms rollen. Während des Stroms erhielt die linke Seite des Kanals keinen Roll-Inhibitor, wohingegen Anti-P-Selektin-Antikörper zum rechten Reservoir bei etwa 1 : 15 : 17 zugegeben wurde und mit den Zellen in die rechte Seite des Kanals strömten. Es wurde beobachtet, daß der Anti-P-Selektin-Antikörper das Neutrophilenrollen an der mit P-Selektin beschichteten Oberfläche an der rechten Seite des Kanals inhibierte. Die Ergebnisse sind in 14 in Diagrammform dargestellt und in der nachstehenden Tabelle III aufgeführt:
  • Tabelle III Zahl der Neutrophile an P-Selektin
    Figure 00460001
  • 2) Mit E-Selektin beschichteter Chip
  • Ein zweiter HCRIVa-Mikrochip wurde wie in Beispiel VII beschrieben mit 20 µg/ml E-Selektin beschichtet und zwei Stunden lang inkubiert. Isolierte menschliche Neutrophile wurden mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 µl/Minute durch den Roll-Mikrochip geleitet (etwa 800/cm Scherrate = 40 dyn/cm2 Scherkraft). Die Kontrollergebnisse zeigen die Zahl der Neutrophile, die an der rechten und an der linken Seite des mit E-Selektin beschichteten Kanals während des Stroms rollen. Im ersten Durchgang wurde der Anti-E-Selektin-Antikörper zum rechten Reservoir bei etwa 1 : 54 : 42 zugegeben, und im zweiten Durchgang wurde der Anti-E-Selektin-Antikörper zum rechten Reservoir bei etwa 0 : 39 : 30 zugegeben. Die Ergebnisse sind in den 15 und 16 in Diagrammform dargestellt und in den nachstehenden Tabellen IV und V aufgeführt:
  • Tabelle IV Zahl der Neutrophile an E-Selektin – Erster Durchgang
    Figure 00470001
  • Tabelle V Zahl der Neutrophile an E-Selektin – Zweiter Durchgang
    Figure 00470002
  • Figure 00480001
  • Eine frische Lösung von 1000 µg/ml Sialyl-Lewisx wurde ebenfalls auf ihre Fähigkeit, das Neutrophilenrollen in Gegenwart von E-Selektin zu inhibieren, untersucht. Es wurde festgestellt, daß Sialyl-Lewisx das Rollen sofort inhibierte. Fucoidin (Sigma, St. Louis MO) in Gegenwart von entweder E-Selektin oder P-Selektin brauchte länger, um das Neutrophilenrollen zu inhibieren.
  • Beispiel IX – Zellrollassay mit unverdünntem menschlichem Blut
  • Unverdünntes menschliches Vollblut wurde in dem Zellrollassay, das in dem obigen Beispiel VII beschrieben ist, verwendet.
  • Dieses Assay wurde mit der HCRIVc-Vorrichtung durchgeführt, welche eine unterschiedliche Tiefe hatte (a = 300 µm: b = 200 µm: c = 50 µm). Diese Vorrichtung wurde zuvor mit E-Selektin wie oben beschrieben beschichtet. 50 µl heparinisiertes menschliches Vollblut (1 mg/ml Heparin wurde dem Blut zugegeben) wurde in das erste Reservoir der in 12 gezeigten "Y"-förmigen Vorrichtung gegeben. Das menschliche Blut wurde durch eine Spritzenpumpe bei einer optimalen Strömungsgeschwindigkeit für die Vorrichtung (siehe Tabelle II) aus dem Reservoir in den Kanal geleitet, und der Hauptströmungskanal wurde etwa 1–2 cm von der Kreuzung von "Y" entfernt 15 Minuten lang unter dem Mikroskop beobachtet.
  • 50 µl einer Mischung aus Inhibitor und heparinisiertem Blut wurden in das zweite Reservoir gegeben und 3–10 Minuten lang in den Kanal eingespeist. Die Zeitdauer, die benötigt wurde, um das Rollen der Leukozyten in dem Vollblut zu inhibieren, hing von dem untersuchten Inhibitor ab. Anti-E-Selektin-Antikörper in Gegenwart von E-Selektin oder eine frische Lösung von 1000 µg/ml Sialyl-Lewisx in Gegenwart von E-Selektin inhibierte das Leukozytenrollen sofort. Fucoidin (Sigma, St. Louis, MO) in Gegenwart von E-Selektin benötigte eine länger Zeit, um das Leukozytenrollen im Vollblut zu inhibieren. Das Zellrollen wurde im Strom aus dem ersten Reservoir beobachtet, wohingegen eine Inhibierung des Rollens in dem Strom aus dem zweiten Reservoir beobachtet wurde.
  • Die Beobachtung des Zellrollens kann im Vollblut aufgrund der Anwesenheit von roten Blutzellen schwierig sein, insbesondere bei Zellen am Boden der Platten. Dieses Problem wurde durch Verwendung der dünneren Vorrichtung (50 µm Tiefe) gelöst, in der das Zellrollen sowohl an den oberen als auch unteren Platten leicht gleichzeitig ohne Schwierigkeit sichtbar gemacht werden konnte.
  • Die Modifizierung der oben beschriebenen verschiedenen Ausführungsformen dieser Erfindung wird für die Fachleute nach der Lektüre der Offenbarungen dieser Erfindung, wie sie hierin beschrieben sind, offensichtlich sein. Die oben beschriebenen Beispiele sind nicht einschränkend sondern lediglich beispielhaft für diese Erfindung, deren Umfang durch die folgenden Ansprüche definiert ist.

Claims (43)

  1. Mikrofluidische Vorrichtung zur Durchführung von In-Vitro-Untersuchungen über die Reaktion und Wirkungen verschiedener Verbindungen mit bzw. auf Zellen, umfassend: einen Hauptströmungspfad (2) mit einem Detektionsbereich (10) und einem Auslaß (14) und wenigstens zwei Einlaß-Strömungspfade (8, 8'), wobei die Einlaß-Strömungspfade sich am Detektionsbereich (10) oder stromaufwärts davon in einem Stromaufwärtswinkel von weniger als 90° mit dem Hauptströmungspfad (2) kreuzen und in diesen einmünden.
  2. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, die ferner zwei Einlaß-Strömungspfade (8, 8') umfaßt.
  3. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, die ferner drei Einlaß-Strömungspfade (8, 8', 8'') umfaßt.
  4. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei der Hauptströmungspfad (2) wenigstens einen Detektionsbereich (10) an jeder Kreuzung eines jeden Einlaß-Strömungspfades (8) mit dem Hauptströmungspfad (2) oder stromabwärts davon umfaßt.
  5. Mikrofluidische Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Hauptströmungspfad (2) etwa 0,1 µm tief und 0,1 µm breit bis etwa 1 mm tief und 2 mm breit ist.
  6. Mikrofluidische Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der erste Einlaß-Strömungspfad (8) etwa 0,1 µm tief und 0,1 µm breit bis etwa 1 mm tief und 2 mm breit ist.
  7. Mikrofluidische Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, die ferner ein Mittel zur Ausübung einer strömungsinduzierenden Kraft umfaßt.
  8. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die strömungsinduzierende Kraft Elektrizität ist.
  9. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die strömungsinduzierende Kraft Fluid-Unter- oder -Überdruck ist.
  10. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei die Vorrichtung ein Mittel zum Anlegen von Über- oder Unterdruck an den Auslaß umfaßt.
  11. Mikrofluidische Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Vorrichtung ferner Zellen in wenigstens einem der Einlaß-Strömungspfade (8, 8') und dem Hauptströmungspfad (2) umfaßt.
  12. Mikrofluidische Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Vorrichtung ferner Leukozyten, einen Calciumfarbstoff und eine Kandidatenverbindung im Hauptströmungspfad (2) umfaßt.
  13. Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, die ferner Abweichungen im Querschnitt des Hauptströmungspfades (2) umfaßt.
  14. Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei die Abweichungen einen Zelleneinfangbereich (13) erzeugen.
  15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei die Schwankungen Wehre (12) sind.
  16. Beobachtungseinrichtung mit einer Mehrzahl an mikrofluidischen Vorrichtungen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, die einen gemeinsamen Detektionsbereich (48) besitzen.
  17. Beobachtungseinrichtung nach Anspruch 16, wobei die Hauptströmungspfade (42) der mikrofluidischen Vorrichtungen am gemeinsamen Detektionsbereich (48) im wesentlichen parallel verlaufen.
  18. Beobachtungseinrichtung mit einer Mehrzahl mikrofluidischer Vorrichtungen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Hauptströmungspfade (42) der mikrofluidischen Vorrichtungen an deren Detektionsbereichen (48) im wesentlichen parallel verlaufen.
  19. Verfahren zur Beobachtung der Wirkung von einer oder mehreren Kandidatenverbindungen auf Zellen in einer mikrofluidischen Vorrichtung, umfassend: (a) Bereitstellen einer in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 beanspruchten mikrofluidischen Vorrichtung, (b) Einbringen von wenigstens einer Zelle, die in einen ersten Einlaß-Strömungspfad (8) strömt, und einer Kandidatenverbindung in einem zweiten Einlaß-Strömungspfad (8') in die mikrofluidische Vorrichtung, (c) Herbeiführen einer Strömung der Zellen und der Kandidatenverbindung in Richtung des Auslasses (4), (d) Vermischenlassen der wenigstens einen Zelle mit der Kandidatenverbindung am Kreuzungspunkt des zweiten Einlaß-Strömungspfades und des Hauptströmungspfades und (e) Beobachten der Wirkung der Kandidatenverbindung auf die Zellen im Detektionsbereich (10).
  20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem der Kreuzungspunkt der Einlaß-Strömungspfade mit dem Hauptströmungspfad (2) einen Stromaufwärtswinkel von weniger als 70° besitzt.
  21. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem der Kreuzungspunkt der Einlaß-Strömungspfade (8) mit dem Hauptströmungspfad (2) einen Stromaufwärtswinkel von weniger als 50° besitzt.
  22. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 19 bis 21, bei dem die mikrofluidische Vorrichtung drei Einlaß-Strömungspfade (8, 8', 8'') besitzt und eine zweite Kandidatenverbindung in den dritten Einlaß-Strömungspfad (8'') gegeben wird.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die mikrofluidische Vorrichtung vier Einlaß-Strömungspfade (8, 8', 8'', 8''') besitzt und eine dritte Kandidatenverbindung in den vierten Einlaß- Strömungspfad (8''') gegeben wird.
  24. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 19 bis 23, das ferner das Anhalten der Strömung der Zellen umfaßt, während sich die Zellen im Detektionsbereich (10) befinden.
  25. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 24, bei dem die Zellen Säugetierzellen sind.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem die Säugetierzellen Blutzellen sind.
  27. Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 26, bei dem die untersuchte Kandidatenverbindung ein Zellaktivator ist und die Zelle ein Lymphozyt ist.
  28. Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 26, bei dem die untersuchte Kandidatenverbindung ein Inhibitor ist und die Zellen Lymphozyten sind.
  29. Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 28, bei dem die Strömungspfade mit einer Substanz überzogen sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteinen, Glycoproteinen, Phospholipiden, hydrophilen Polymeren und hydrophoben Polymeren.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem die Strömungspfade mit Protein überzogen sind.
  31. Verfahren nach Anspruch 22 oder Anspruch 23, das ferner die Beobachtung der Zellen in jedem von einer Reihe von Detektionsbereichen (10) umfaßt, wobei der Hauptströmungspfad (2) eine Mehrzahl an Detektionsbereichen umfaßt und der jeweilige Detektionsbereich sich am jeweiligen Kreuzungspunkt des jeweiligen Einlaß-Strömungspfades (8) mit dem Hauptströmungspfad (2) oder stromabwärts davon befindet.
  32. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem Zellen in einen ersten Einlaß-Strömungspfad (8) gegeben werden, Zellaktivator in einen zweiten Einlaß-Strömungspfad (8') gegeben wird und eine Kandidatenverbindung in einen dritten Einlaß-Strömungspfad (8'') gegeben wird.
  33. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 32, bei dem die Strömung durch eine elektrische Kraft herbeigeführt wird.
  34. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 32, bei dem die Strömung durch Fluid-Über- oder -Unterdruck herbeigeführt wird.
  35. Verfahren zur Untersuchung des Calcium-Einstroms in einem Lymphozyt, umfassend: (a) Bereitstellen einer wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 beanspruchten mikrofluidischen Vorrichtung, (b) Einbringen von Lymphozyten in einen ersten Einlaß-Strömungspfad (8) und eines Aktivators in einen zweiten Einlaß-Strömungspfad (8'), (c) Herbeiführen der Strömung der Lymphozyten und des Aktivators in Richtung des Auslasses (4), (d) Vermischenlassen der Lymphozyten mit dem Aktivator am Kreuzungspunkt des zweiten Einlaß-Strömungspfades (8') und des Hauptströmungspfades (2) und (e) Beobachten der Wirkung des Aktivators auf die Lymphozyten im Detektionsbereich (10).
  36. Verfahren nach Anspruch 35, bei dem die mikrofluidische Vorrichtung drei Einlaß-Strömungspfade (8, 8', 8'') umfaßt und das Verfahren ferner die Zugabe einer Kandidatenverbindung in einen dritten Einlaß-Strömungspfad (8'') und die Beobachtung der Wirkung der Kandidatenverbindung auf die Lymphozyten im Detektionsbereich (10) umfaßt.
  37. Verfahren zur Untersuchung von Leukozytenrollen, umfassend: (a) Bereitstellen einer in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 beanspruchten mikrofluidischen Vorrichtung, bei der an die Wände des Hauptströmungspfades im Detektionsbereich Zelladhäsionsmoleküle gebunden sind, (b) Einbringen von wenigstens einem Leukozyten in einen ersten Einlaß-Strömungspfad (8) (c) Einbringen von wenigstens einem Leukozyten und einer Kandidatenverbindung in einem zweiten Einlaß-Strömungspfad (8'), (d) Herbeiführen des Flusses der Zellen und der Verbindung in den Hauptströmungspfad (2) und in Richtung des Auslasses (4), (e) Vermischenlassen der Leukozyten, der Kandidatenverbindung und der Zelladhäsionsmoleküle, um wechselwirken zu können, und (e) Beobachten des Leukozytenrollens im Detektionsbereich (10).
  38. Verfahren nach Anspruch 37, bei dem die Vorrichtung einen Hauptströmungspfad mit einem Querschnitt von etwa 30 µm bis etwa 500 µm umfaßt.
  39. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, bei dem die Vorrichtung einen dritten Einlaß-Strömungspfad (8'') umfaßt und Puffer in den dritten Einlaß-Strömungspfad eingebracht wird.
  40. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, bei dem die Vorrichtung drei Einlaß-Strömungspfade (8, 8', 8'') umfaßt und das Verfahren ferner die Zugabe eines Inhibitors in den dritten Einlaß-Strömungspfad (8''), das Vermischen des Inhibitors, der Leukozyten und der Kandidatenverbindung und das Beobachten des Leukozytenrollens im Detektionsbereich (10) umfaßt.
  41. Verfahren nach Anspruch 40, das ferner das Anhalten des Flusses der Zellen, der Kandidatenverbindung und des Inhibitors während des Vermischschrittes umfaßt.
  42. Verfahren zur Beobachtung der Wirkung von einer oder mehreren Kandidatenverbindungen auf Zellen in einer Beobachtungseinrichtung, umfassend: (a) Bereitstellen einer in Anspruch 16 beanspruchten Beobachtungseinrichtung, (b) Einbringen von wenigstens einer Zelle, die in der Lage ist, in der mikrofluidischen Vorrichtung zu strömen, in einen ersten Einlaß-Strömungspfad (42) einer ersten mikrofluidischen Vorrichtung und wenigstens einer Zelle, die in der Lage ist, in der mikrofluidischen Vorrichtung zu strömen, in einen ersten Einlaß-Strömungspfad (42') einer zweiten mikrofluidischen Vorrichtung und einer ersten Kandidatenverbindung in einen zweiten Einlaß-Strömungspfad der ersten mikrofluidischen Vorrichtung und einer zweiten Kandidatenverbindung in einen zweiten Einlaß-Strömungspfad der zweiten mikrofluidischen Vorrichtung, (c) Herbeiführen der Strömung der Zellen und der Kandidatenverbindungen in Richtung des Auslasses (50), (d) Vermischenlassen der Zellen mit den Kandidatenverbindungen und (e) Beobachten der Wirkung der Kandidatenverbindung auf die Zellen im gemeinsamen Detektionsbereich (48).
  43. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem die Hauptströmungspfade (2) der mikrofluidischen Vorrichtungen im gemeinsamen Detektionsbereich (48) im wesentlichen parallel verlaufen.
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