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Technisches Gebiet:
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder
Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung in einer Testsubstanz, wobei
folgende Verfahrensschritte vorhanden sind: Auf- oder Einbringen
einer Nachweissubstanz auf oder in einen vorzugsweise V- oder U-förmigen Bodenbereich
eines Behälters,
Aufteilen des Behälters in
mindestens zwei Bereiche durch Anordnen mindestens einer für bestimmte
Bestandteile einer Testsubstanz durchlässigen Membran in dem Behälter, wobei
ein erster Bereich zur Aufnahme der Testsubstanz vorgesehen ist,
und ein zweiter Bereich die Nachweissubstanz enthält, Einbringen
der Testsubstanz in den hierfür
vorgesehenen Bereich, sowie Aufbringen einer zumindest auf einzelne
Bestandteile der Testsubstanz einwirkenden, ein Hindurchtreten von
Bestandteilen der Testsubstanz durch die Membran beschleunigenden,
im Wesentlichen in Richtung zur Membran hin gerichteten ersten Kraft,
gemäß dem Oberbegriff
des Anspruchs 1. Ebenso betrifft die Erfindung eine Vorrichtung
gemäß dem Oberbegriff des
Anspruchs 8.
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Stand der Technik:
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Menschliche
Blutgruppensubstanzen, aber auch eine Vielzahl von anderen in einem
Organismus gebildeten Substanzen, werden durch spezifische Antigen-Antikörper-Reaktionen
nachgewiesen. Diese Reaktion ist detektierbar über eine Vernetzung, Agglutination,
von Antigenen, Antikörpern
und bestimmten Trägersubstanzen,
die Antigene oder Antikörper
tragen, zu einem makroskopisch erfassbaren Komplex, dem Agglutinat.
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Zum
Nachweis von Antikörpern
und/oder Antigenen in einer Testsubstanz oder einer Testflüssigkeit,
oder zur Blutgruppenbestimmung ist bekannt, eine beispielsweise
Antikörper
und/oder Antigene enthaltende Testsubstanz in einen Behälter zu
geben, der zwei oder mehrere, durch mindestens eine Membran getrennte
Bereiche aufweist, die für
bestimmte Substanzen, beispielsweise für die Antikörper und/oder Antigene oder
bestimmte Verbindungen derselben durchlässig ist. Dabei ist sowohl
denkbar, dass die Antikörper
und/oder Antigene oder bestimmte Verbindungen derselben durch die
Membran hindurch treten können
und die Membran für
andere Bestandteile der Testflüssigkeit
undurchlässig
ist, als auch, dass die Membran für die Antikörper und/oder Antigene oder
bestimmte Verbindungen derselben undurchlässig ist und andere Bestandteile
der Testsubstanz durch die Membran hindurch treten können. Die
Testsubstanz umfasst dabei eine zu untersuchende Körperflüssigkeit
oder einen Bestandteil einer solchen zu untersuchende Körperflüssigkeit, sowie
vorgegebene, spezifische Bindungspartner für in der Körperflüssigkeit nachzuweisende Antikörper und/oder
Antigene oder für
eine Blutgruppe. Die vorgegebenen, spezifischen Bindungspartner
können auch
nachträglich
in die Testsubstanz eingebracht werden, oder sie können beispielsweise
in der Membran oder an deren Oberfläche oder auch an der Oberfläche der
verwendeten Reaktionsgefäße gebunden
sein.
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Der
typischerweise unterhalb der Membran liegende Bereich des Behälters ist
an seiner Oberfläche
mit einer Nachweissubstanz beschichtet, oder enthält eine
solche. Die Nachweissubstanz umfasst typischerweise so genannte
Fangkörper,
Anti-IgG, die dazu dienen, durch die Membran hindurchgetretene,
in Bezug auf das Testergebnis positive oder negative Bestandteile
der Testsubstanz derart zu binden, dass sich am typischerweise V-
oder U-förmig ausgebildeten
Boden des Behälters
oder Reaktionsgefäßes ein
bestimmtes, das Testergebnis wiedergebendes Sedimentationsbild ergibt.
Beispielsweise ergibt sich bei einem positiven Testergebnis ein
gleichmäßiger Rasen
auf den schrägen
Wänden
des Behälters,
wohingegen bei einem negativen Ergebnis eine knopfförmige Ablagerung
am tiefsten Punkt des Behälters
erfolgt. Ebenso ist bekannt, Rasen und knopfförmige Ablagerung genau umgekehrt
auszubilden.
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Aus
der
WO 02/45858 A2 ist
bekannt, dass die Membran aus einer beispielsweise biologischen Substanz
besteht, deren Permeabilität
durch eine beispielsweise der Testflüssigkeit zusetzbare chemische
Substanz veränderbar
ist. Darüber
hinaus ist aus
WO
02/45858 A2 bekannt, das Hindurchtreten beispiels weise
der Antikörper
und/oder Antigene durch die Membran durch Aufbringen einer im Wesentlichen
senkrecht zur Membran wirkenden, zur Membran hin gerichteten externen
Kraft auf die Testsubstanz zu unterstützen und somit zu beschleunigen.
Die gerichtete externe Kraft wird dabei durch eine Zentrifuge, durch
Gravitation, durch ein mittels eines Permanentmagneten erzeugtes
Magnetfeld oder eine Kombination hieraus aufgebracht. Bei der Verwendung
von Magnetkraft ist es hierzu bekannt, die Erythrozyten mittels
einer magnetisch beeinflussbaren Substanz zu präparieren, so dass die Erythrozyten
im Prinzip durch die wirkende Magnetkraft angezogen werden.
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Nachteilig
hieran ist, dass die Anschaffung einer Zentrifuge kostspielig ist,
weshalb Zentrifugen nicht überall
verfügbar
sind und ein solches Verfahren somit nicht überall durchführbar ist.
Darüber
hinaus weisen Verfahren, die einen Zentrifugationsschritt aufweisen
den Nachteil auf, dass sie nur schlecht automatisierbar sind, also
in Bezug auf eine Automatisierung der Schritte beginnend beim Einbringen
der Testsubstanz in einen hierfür
vorgesehenen Behälter über das
Zentrifugieren bis hin zu einer automatischen Auswertung des Testergebnisses
mittels einer Kamera einen sehr hohen technischen Aufwand benötigen.
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Aus
der
DE 10061515 A1 ist
bekannt, ein Gel in Form von feinen Kügelchen, so genannten Beads, als
Membran zu verwenden. Nach der Reaktion beispielsweise von in der
Testsubstanz enthaltenen Antikörpern
und/oder Antigenen mit einem vorgegebenen, spezifischen Bindungspartner
können
diese durch das Gel unter Einwirkung einer durch eine Zentrifuge
aufgebrachte senkrecht zur Membran hin wirkende, externe Kraft hindurchwandern.
Nachteilig hieran ist, dass auch hier eine Zentrifuge mit den bereits
oben angeführten
Nachteilen benötigt
wird.
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Aus
der
DE 10239568 A1 ist
darüber
hinaus bekannt, den Abstand zwischen den Beads eines Gels durch
Zugabe eines Geleinbettpuffers zu minimieren. Hierdurch wird eine
hohe, zur Membran hin gerichtete Kraft benötigt, damit einzelne Bestandteile der
Testflüssigkeit
das Gel durchdringen können. Eine
solch hohe Kraft kann nur durch eine Zentrifuge aufgebracht werden,
verbunden mit den oben genannten Nachteilen.
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Aus
der
EP 1064557 B1 ist
ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in
einer Testflüssigkeit
sowie zur Blutgruppenbestimmung durch Reaktion mit einem vorgegebenen
spezifischen Bindungspartner bekannt, wobei das Antigen bzw. der
Antikörper
oder der spezifische Bindungspartner in der Testflüssigkeit
ungebunden oder an einen Träger
gebunden ist und wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion
ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern, den entsprechenden
spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches
optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist. Hierbei wird eine
viskose Substanz als Membran verwendet, mit der ein Behälter beschichtet
wird und in dem die viskose Substanz eine homogene Schicht bildet,
welche eine feine Vernetzung bzw. Gitterstruktur ausbildet. In den Behälter wird
anschließend
ein vorbestimmtes Volumen der Testflüssigkeit auf die viskose Substanz
zugefügt,
wobei der spezifische Bindungspartner entweder der Testflüssigkeit
oder der viskosen Substanz zugesetzt ist oder eine weitere Flüssigkeit,
die den spezifischen Bindungspartner enthält, vor oder nach Zufügen der
Testflüssigkeit
dem Gefäß zugefügt wird.
Die Analyse, ob eine Antikörper-Antigen-Reaktion
stattgefunden hat, wird anhand des Sedimentationsbildes optisch
durch eine Bedienungsperson oder automatisch mittels eines Photometers
oder mittels einer Video- oder CCD-Kamera oder eines Fluormeters
vorgenommen. Der Behälter
weist hierbei einen sich von oben nach unten verjüngenden
Querschnitt auf. Das Hindurchtreten von Bestandteilen der Testflüssigkeit
bzw. von Reaktionsprodukten aus Bestandteilen der Testflüssigkeit
und deren spezifischer Bindungspartner durch die viskose Substanz
erfolgt dabei ausschließlich
unter Einwirkung der Schwerkraft, bis sich in der Grenzschicht zwischen
der schrägen
Wandung des Behälters
und der homogenen Schicht aus der viskosen Substanz das auch als Agglutinat
bezeichnete, sichtbare Sediment ausbildet, wobei eine insbesondere
auf der schrägen
Wandung des Gefäßes sich
flächig
ausbildende Agglutinatschicht auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion
hinweist und ein insbesondere im Bereich des tiefsten Punktes des
Bodens bzw. der schrägen
Wandung des Gefäßes sich
bildende, räumlich
gerinfügig ausgedehnte
Ablagerung auf eine negative Reaktion ohne Antigen/Antikörper-Komplex hinweist.
Nachteilig hieran ist, dass das Verfahren aufgrund der Sedimentationsbildung
allein aufgrund der Schwerkraft sehr lange dauert.
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Durch
die
DE 10 2004
013 960 A1 ist zur Qualitätssicherung von Erythrozytenkonzentraten
in einem vertretbaren Zeitraum von ca. 10 Minuten ein Verfahren
und eine Vorrichtung zur Qualitätssicherung
von Erythrozytenkonzentraten mittels nicht-invasiver, optischer
Bestimmung des extrazellulären Hämoglobingehalts
am Blutbeutelsystem mit Hilfe der Sedimentation zellulärer Blutbestandteile
bekannt geworden, ohne den sterilen geschlossenen Blutbeutel öffnen zu
müssen.
Dabei werden zur Sedimentation von Erythrozyten geeignete Vorrichtungen genutzt,
wie z. B. stehende oder langsam laufende Ultraschallwellen und/oder
ein inhomogenes Magnetfeld oder eine mechanische Vorrichtung zur
Beschleunigung der Blutbestandteile. Dabei ist der sterile geschlossene
Behälter
der Anschlussschlauch eines Blutbeutels, in dem sich Erythrozyten
befinden. Zur Sedimentation von Erythrozyten werden stehende oder
langsam laufende Ultraschallwellen genutzt, bei denen sich die Erythrozyten
in den Knotenflächen des
Ultraschallfeldes konzentrieren und dadurch beschleunigt sedimentieren.
Durch einen Reflektor werden die Ultraschallwellen so reflektiert,
dass die einlaufende und die reflektierte Welle in der Überlagerung
eine stehende oder langsam laufende Welle bilden. Ebenso kann zur
Sedimentation ein inhomogenes Magnetfeld genutzt werden, in dem
die Erythrozyten aufgrund des magnetischen Momentes im Hämoglobin
in Richtung des magnetischen Feldgradienten eine Kraft erfahren.
Dazu wird außerhalb
des Blutschlauchs ein statisches Magnetfeld mit einem magnetischen
Feldgradienten parallel zur Gravitation erzeugt, das durch die sogenannte
Kelvin Kraft als Unterstützung
der gravitationsbedingten Sedimentation wirkt. Auch kann zur Sedimentation
von Erythrozyten eine mechanische Bewegung des Schlauches genutzt
werden, die zu hohen Beschleunigungen im Schlauch führt. Auf
diese Weise sedimentieren mit Hilfe der Sedimentation zelluläre Blutbestandteile, die
sich in einem sterilen geschlossenen Behälter befinden, beschleunigt,
ohne den sterilen geschlossenen Behälter zu öffnen.
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Jedoch
ist auch hier wesentlich, dass zur Zentrifugation des Blutbeutelschlauches
ein drehbarer, angetriebener Rotor zum Einsatz kommt, der das Schlauchende
aufnimmt, wobei mittels einer komplizierten Technik eine Gegendrehung
des Schlauchendes erzwungen wird, die die durch die Rotation hervorgerufene
Verdrillung des Schlauchendes kompensiert.
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Zusammengefasst
ist festzuhalten, dass der Stand der Technik den Nachteil aufweist,
dass insbesondere das Aufbringen einer Kraft mittels einer Zentrifuge
aufgrund der hohen Anschaffungskosten kostspielig und nicht überall verfügbar ist.
Weiterhin ist nachteilig, dass sich durch Gravitation oder mittels
eines Magnetfeldes allein keine so hohen Kräfte, wie mit einer Zentrifuge,
aufbringen lassen, wodurch der Vorgang des Hindurchtretens lange
dauert oder gar unmöglich
ist.
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Technische Aufgabe der Erfindung:
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Aufgabe
der Erfindung ist es deshalb, hier Abhilfe zu schaffen.
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Offenbarung
der Erfindung und deren Vorteile: Die Aufgabe wird gelöst durch
die Merkmale des Anspruchs 1 sowie durch die Merkmale des Anspruchs
8.
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Ein
erster Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis
von Antikörpern und/oder
Antigenen in einer Testsubstanz. Das erfindungsgemäße Verfahren
umfasst die folgenden Verfahrensschritte:
- – Auf- oder
Einbringen einer Nachweissubstanz auf oder in einen Bodenbereich
eines Behälters,
- – Aufteilen
des Behälters
in mindestens zwei Bereiche durch Anordnen mindestens einer für bestimmte
Bestandteile Testsubstanz durchlässigen Membran
in dem Behälter,
wobei ein erster Bereich zur Aufnahme der Testsubstanz vorgesehen ist,
und ein zweiter Bereich die Nachweissubstanz enthält,
- – Einbringen
der Testsubstanz in den hierfür
vorgesehenen Bereich,
- – Aufbringen
einer zumindest auf einzelne Bestandteile der Testsubstanz einwirkenden,
ein Hindurchtreten von Bestandteilen der Testsubstanz durch die
Membran beschleunigenden, im Wesentlichen in Richtung zur Membran
hin gerichteten ersten Kraft, sowie
- – Aufbringen
einer mindestens auf die Membran einwirkenden, zumindest in ihrer
Richtung zeitlich veränderlichen,
im Wesentlichen quer zu der ersten Kraft gerichteten zweiten Kraft
durch Ultraschall und/oder durch ein zeitlich veränderliches Magnetfeld.
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Die
Verfahrensschritte Aufteilen des Behälters in zwei Bereiche und
Auf- oder Einbringen einer Nachweissubstanz in den hierfür vorgesehenen
Bereich können
auch in umgekehrter Reihenfolge ausgeführt werden, ohne den Kern der
Erfindung zu verlassen.
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Die
Membran kann aus einem festen Material, wie Gel, oder beispielsweise
aus einem Gel in Form von feinen Kügelchen, so genannten Beads, oder
aus einem anderen Material, wie Glas oder Acryl, bestehen, zwischen
denen bestimmte Bestandteile oder Verbindungen der Testsubstanz
hindurchtreten können.
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Die
Testsubstanz umfasst eine zu untersuchende Körperflüssigkeit oder einen Bestandteil
einer solchen Körperflüssigkeit,
wie beispielsweise Blut, Serum oder dergleichen, sowie vorgegebene, spezifische
Bindungspartner für
in der Körperflüssigkeit
nachzuweisende Antikörper
und/oder Antigene oder eine Blutgruppe. Die Testsubstanz kann beispielsweise
durch Inkubation mit der Körperflüssigkeit
oder einem Bestandteil einer Körperflüssigkeit hergestellt
werden. Die Antikörper
und/oder Antigene oder die zu bestimmenden Blutgruppen reagieren
mit einem in der Testsubstanz enthaltenen oder nachträglich in
diese eingebrachten vorgegebenen spezifischen Bindungspartner. Eine
durch diese Reaktion entstehende Verbindung ist in der Lage, die
Membran zu durchdringen. Dabei ist grundsätzlich denkbar, dass die vorgegebenen,
spezifischen Bindungspartner oder andere in der Testsubstanz enthaltene
Stoffe erst nach dem Einbringen der Testsubstanz in den Behälter zugegeben
werden.
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Die
Nachweissubstanz kann flüssig
oder fest sein und beispielsweise eine Beschichtung eines Teils
der Behälteroberfläche umfassen,
welche mit bestimmten durch die Membran hindurch getretenen Bestandteilen
der Testflüssigkeit
beispielsweise eine chemische Verbindung eingeht, so dass beispielsweise
bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion
ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw.
den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches
optisch als Sedimentationsbild innerhalb des Behälters, beispielsweise auf der
Oberfläche
einer Fangkörper
umfassenden festen Nachweissubstanz, detektierbar ist. So ist beispielsweise
denkbar, dass die Membran eine solche Beschichtung überdeckt.
Der abgetrennte zweite Bereich umfasst dabei beispielsweise nur die
Beschichtung in Form einer Fangkörper
umfassenden Nachweissubstanz.
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Die
im Wesentlichen in Richtung zur Membran hin gerichteten ersten Kraft
kann beispielsweise durch Gravitation, durch eine Zentrifuge oder
durch ein Magnetfeld erzeugt werden, wobei erfindungsgemäß aufgrund
der hohen Anschaffungskosten auf eine Zentrifuge verzichtet wird
und vorzugsweise ausschließlich
Gravitations- und/oder Magnetkräfte eingesetzt
werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
weist gegenüber
dem Stand der Technik den Vorteil auf, dass durch das Aufbringen
einer mindestens auf die Membran einwirkenden, zumindest in ihrer
Richtung zeitlich veränderlichen
und im Wesentlichen quer zur ersten Kraft wirkenden zweiten Kraft
ein Hindurchtreten von bestimmten Bestandteilen oder deren Verbindungen
mit einem vorbestimmten, spezifischen Bindungspartner allein durch
Schwerkraft oder eine magnetische Kraft innerhalb einer überschaubaren,
kurzen Zeit möglich
ist. Dies ist deshalb möglich,
da die auf die Membran einwirkende, zumindest in ihrer Richtung
zeitlich veränderliche
zweite Kraft die Membran in eine Schwingungsbewegung versetzt, wodurch
sich insbesondere an den Umkehrpunkten der Schwingungsbewegung Lücken zwischen
den die Membran bildenden Molekülen
oder Teilchen bilden, bzw. der Abstand zwischen den Molekülen oder
Teilchen der Membran zunimmt bzw. durch die bei der Schwingungsbewegung auftretenden
Beschleunigungen die Anpresskraft zwischen den einzelnen Molekülen oder
Teilchen der Membran kurzzeitig verringert wird, so dass die gewünschten
Bestandteile oder deren Verbindungen, angetrieben von der ersten,
gerichteten Kraft leichter vom ersten Bereich des Behälters durch
die Membran hindurch in den zweiten Bereich des Behälters gelangen
können.
Indem die Ebene, innerhalb der die in ihrer Richtung zeitlich veränderliche
zweite Kraft wirkt, im Wesentlichen normal bzw. normal zu der auf
die Testflüssigkeit
einwirkenden externen Kraft verläuft,
wird eine Verringerung der Anpresskräfte zwischen den Molekülen oder Teilchen
der Membran erreicht ohne die überwiegende
Bewegungsrichtung von bestimmten Bestandteilen der Testsubstanz
beim Hindurchtreten durch die Membran zu beeinflussen.
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Eine
vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die zeitlich
veränderliche
Kraft sowohl in ihrer Richtung, als auch in ihrem Betrag veränderlich
ist. So ist beispielsweise denkbar, die Membran in eine harmonische
Schwingung zu versetzen, angeregt beispielsweise durch eine harmonische,
auf die Membran einwirkende in ihrer Richtung zeitlich veränderliche
zweite Kraft. Bei einer harmonischen Schwingung nehmen die Beschleunigung ebenso
wie die Bewegungsgeschwindigkeit sinus- bzw. cosinusförmig stetig
zu und ab.
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Eine
besonders vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass
die Membran ein Gel in Form von feinen Kügelchen, so genannten Beads, als
Gelschicht umfasst. Besteht die Membran aus Beads, so ist es möglich, dass
die in ihrer Richtung zeitlich veränderliche zweite Kraft direkt
durch Ultraschall oder ein wechselndes Magnetfeld auf die Beads
einwirkt, wodurch sich aufgrund der individuellen Schwingungen der
Beads ständig
Lücken
zwischen diesen auftun, bzw. an mehreren Stellen gleichzeitig Anpresskräfte zwischen
den Beads verringert werden, wodurch ein Hindurchtreten von bestimmten
Bestandteilen der Testsubstanz durch die Membran deutlich beschleunigt
wird. Bei Einsatz eines, vorzugsweise wechselnden, Magnetfeldes
sind beispielsweise die in der Testsubstanz befindlichen Erythrozyten
sowie die Beads mit ferromagnetischen Partikeln beschichtet.
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Dabei
ist denkbar, dass das Gel darüber
hinaus einen Stoff umfasst, der in einem Ruhezustand der Membran
einen minimalen Abstand zwischen den Beads sicherstellt. Hierdurch
wird der Vorteil erreicht, dass außer den für einen Nachweis gewünschten
Bestandteilen der Testflüssigkeit
keine anderen Bestandteile durch das Gel hindurchtreten können und
eine sehr gute Aufreinigung der durch die Beads hindurchtretenden
Bestandteile der Testflüssigkeit
sichergestellt wird.
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Erfindungsgemäß wird somit
die zeitlich veränderliche
Kraft durch Ultraschall aufgebracht. Ebenso ist denkbar, dass die
zeitlich veränderliche
Kraft alternativ oder zusätzlich
zu den oben angegebenen Möglichkeiten
durch ein zeitlich veränderliches
Magnetfeld aufgebracht wird. Im letztgenannten Fall ist denkbar,
die Membran oder Bestandteile derselben oder Bestandteile der zu
untersuchenden Testflüssigkeit
mit ferromagnetischem Material zu dotieren, so dass das zeitlich
veränderliche
Magnetfeld direkt auf die Membran einwirken kann.
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Eine
weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass
die erste Kraft eine magnetische Anziehungskraft umfasst. In diesem
Fall sind die Erythrozyten mit ferromagnetischen Partikel behaftet,
so dass die Erythrozyten durch ein auf sie einwirkendes Magnetfeld
in die Richtung desselben beschleunigt werden. Darüber hinaus
ist denkbar, dass die erste Kraft die Schwerkraft umfasst.
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Ein
zweiter Gegenstand der Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung eines
oben beschriebenen Verfahrens. Eine solche erfindungsgemäße Vorrichtung
umfasst
- – einen
Behälter
mit mindestens einem mit einer Nachweissubstanz versehenen Bodenbereich,
- – mindestens
eine den Behälter
in mindestens zwei Bereiche unterteilende, für bestimmte Bestandteile oder
Verbindungen einer Testsubstanz durchlässige, Membran, wobei ein erster
Bereich zur Aufnahme der Testsubstanz vorgesehen ist, und ein zweiter
Bereich die Nachweissubstanz enthält,
- – Mittel
zum Aufbringen einer zumindest auf einzelne Bestandteile der Testflüssigkeit
einwirkenden ersten, im Wesentlichen in Richtung zur Membran hin
wirkenden externen Kraft, sowie
- – einen
Ultraschallschwinger oder ein elektromagnetisches Wechselfeld oder
ein wechselndes magnetisches Feld zum Aufbringen einer zumindest
auf einzelne Teile oder Moleküle
der Membran einwirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen,
im Wesentlichen quer zu der ersten Kraft gerichteten zweiten Kraft.
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Die
Mittel zum Aufbringen einer zumindest auf einzelne Teile oder Moleküle der Membran
einwirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen,
quer zur ersten Kraft wirkenden zweiten Kraft können erfindungsgemäß
- 1. Ultraschall und/oder
- 2. eine Magnetisierung der Membran oder von Teilen derselben
umfassen.
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Eine
vorteilhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor,
dass die Membran aus einem Gel in Form von feinen Kügelchen, so
genannten Beads, besteht. Hierbei ist denkbar, dass die Beads magnetisiert
werden, um die zweite Kraft durch ein wechselndes Magnetfeld aufzubringen.
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In
weiterer vorteilhafter Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
besteht die Membran aus einem Gel in Form von feinen Kügelchen,
so genannten Beads.
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In
Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist das Mittel zum Aufbringen einer zumindest auf einzelne Teile
oder Moleküle
der Membran einwirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen,
zweiten Kraft ein Ultraschallschwinger oder ein elektromagnetisches
Wechselfeld und die durchlässige
Membran ist von der zweiten Kraft beaufschlagbar.
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Wege zur Ausführung der Erfindung:
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Ein
erfindungsgemäßes Verfahren
zum Nachweis von Antikörpern
und/oder Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung läuft wie
folgt ab:
Eine Testsubstanz oder Testflüssigkeit wird unter Verwendung
einer zu untersuchenden Körperflüssigkeit
oder eines Bestandteils einer solchen Körperflüssigkeit hergestellt. Die Testsubstanz
umfasst einen vorgegebenen spezifischen Bindungspartner für einen
nachzuweisenden Antikörper
oder für
ein nachzuweisendes Antigen oder für eine bestimmte Blutgruppe.
Unter Verwendung eines Behälters
für eine einzelne
Probe, in welchen ein Gel in Form von feinen Kügelchen, Beads, eingebracht
ist, welches den Behälter
in zwei Bereiche unterteilt, einen zur Aufnahme der Testflüssigkeit
und einen zur Aufnahme einer Fangkörper umfassenden Nachweissubstanz, findet
in der Testflüssigkeit
eine Reaktion mit dem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner
statt, wobei die Antigene bzw. die Antikörper oder die spezifischen
Bindungspartner in der Testflüssigkeit
ungebunden und/oder an einen Träger,
der auch der Behälter
sein kann, gebunden sind.
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Der
die Testflüssigkeit
enthaltende Behälter wird
einem Inkubationsschritt in einem Inkubator, sowie anschließend einem
Agglutinationsschritt ausgesetzt. Während des Agglutinationsschritts
wirkt eine erste, im Wesentlichen senkrecht zur Oberfläche des Gels
hin gerichtete externe Kraft auf die Testsubstanz oder auf einzelne
Bestandteile der Testsubstanz ein. Gleichzeitig wirkt eine zweite,
zumindest in ihrer Richtung, vorzugsweise jedoch in Betrag und Richtung,
zeitlich veränderliche
Kraft auf das Gel oder auf einzelne Teile des Gels ein, um ein Hindurchtreten der
nachzuweisenden Antigene bzw. Antikörper bzw. den spezifischen
Bindungspartnern und den Trägern durch
das Gel zu beschleunigen.
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Die
zweite Kraft wirkt dabei senkrecht zur ersten Kraft. Bei positiver
Antigen-Antikörper-Reaktion
bildet sich auf den Fangkörpern
am Behälterboden
ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw.
den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern, an die die Antigene bzw. Antikörper gebunden
sind, welches optisch als Sedimentationsbild innerhalb des Behälters detektierbar ist.
Das Sedimentationsbild ergibt sich dadurch, dass beispielsweise
bei in der Testflüssigkeit
enthaltenen Antikörpern
oder Antigenen diese nach Reaktion mit den vorgesehenen spezifischen
Bindungspartnern durch das Gel hindurchtreten, und auf einer beispielsweise
auf einen V- oder U-förmigen Bodenbereich
des Behälters
aufgetragenen Nachweissubstanz anhaften. Dieses Anhaften ist durch
ein rasenartiges Sedimentationsbild erkennbar. Sind keine Antikörper oder
Antigene in der Testsubstanz enthalten, bildet sich kein Rasen aus
und es entsteht ein Sedimentationsbild mit einer knopfförmigen Ablagerung an
der tiefsten Stelle des Behälterbodens.
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Zusätzlich ist
denkbar, dem Behälter
eine vorbestimmte Menge eines Gemisches eines Puffers, Geleinbettpuffer,
mit dem Gel, Puffer-Gel-Gemisch, zuzugeben, wobei das Puffer-Gel-Gemisch eine
derart geringe Viskosität
aufweist, dass es in flüssiger
Form vorliegt, welche die Pipettierung des Puffer-Gel-Gemisches
mittels Stepper oder Pipette in das Mikrogefäß gestattet, und wobei der
Geleinbettpuffer die Eigenschaft aufweist, den Abstand zwischen
den einzelnen Beads innerhalb des Puffer-Gel-Gemisches zu minimieren.
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Wichtig
ist hervorzuheben, dass das erfindungsgemäße Verfahren bei Verwendung
eines Gels in Form von Beads als Membran weder einen Waschschritt,
noch einen Zentrifugationsschritt benötigt, sondern dass gerade derartige
Schritte erfindungsgemäß vermieden
werden.
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Ein
Waschschritt ist nach dem Stand der Technik beispielsweise nötig, um
freie Antikörper,
die während
der Inkubation nicht mit Antigenen eine Bindung eingegangen sind,
aus der Testsubstanz auszuwaschen.
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Um
einen Waschschritt auszuschließen
werden Beads, vorzugsweise SEPHADEX-Beads, aufgeschwemmt mit Puffer,
auch als Gel Beads oder auch als Gelverfahren bekannt, verwendet.
Die Aufschwemmung befindet sich in den einzelne Behälter bildenden
Kavitäten
einer Mikrotiter-Platte (Mt-Platte). Sephadex Beads sind sehr gut
geeignet, um eine Aufreinigung, also eine Trennung von Such-Erythrozyten
und in der Testflüssigkeit
enhaltenen ungebundenen Antikörpern
und Antigenen durchzuführen.
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Die
Testflüssigkeit,
die Such-Erythrozyten mit Serum und freie Antikörper enthält, schwimmt nach dem Transfer
auf den Sephadex Beads. Damit die in der Testflüssigkeit enthaltene Such-Erythrozyten
Aufschwemmung durch die Sephadex Beads kommt, ist nach dem Stand
der Technik zwingend ein Zentrifugationsschritt vonnöten. Dabei
erfolgt eine Aufreinigung der Such-Erythrozyten. Die Such-Erythrozyten
werden dabei von der Aufschwemmung, welche freie Antikörper und
Proteinanteile enthält,
getrennt. Auf Grund der Zentrifugalkraft gehen die Such-Erythrozyten
durch die Lücken
der Beads, während
die flüssigen
Serum Anteile der Testflüssigkeit
darauf liegen bleiben. Wenn die Such-Erythrozyten zusätzlich magnetisiert
sind können
sie mittels magnetischer Kraft angezogen werden.
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Da
die magnetische Kraft und/oder die Gravitation zu gering ist, können diese
Erythrozyten nach dem Stand der Technik nur durch niedrig visköse homogene
Flüssigkeiten
gezogen werden. Das bedeutet, die hervorragenden Aufreinigungseigenschaften der
Sephadex Beads kann nicht genutzt werden. Die Such-Erythrozyten
bleiben oben auf den Sephadex Beads liegen, da Gravitations- und
Magnetkräfte nicht
ausreichen, diese durch alle Lücken
zu ziehen. Somit müsste
trotzdem ein Zentrifugationsschritt eingesetzt werden. Damit ist
aber die äußerst aufwendige
Magnetisierung der Such-Erythrozyten überflüssig.
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Bei
Benutzung von Beads müssen
deshalb nach dem Stand der Technik teure, große und unhandliche Zentrifugen
eingesetzt werden.
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Diese
Problematik wird umgangen, indem beispielsweise unter permanenter
Magnetkraft und gleichzeitigem sanftem, vorsichtigem Schütteln kurzzeitig
immer neue Lücken
zwischen den Beads entstehen, durch die die Such-Erythrozyten zwischen den
Beads hindurchschlüpfen
können.
Die nur geringe auf die Such-Erythrozyten einwirkende Erdgravitation
wird durch das Schütteln überlagert.
Das sanfte vorsichtige Schütteln
ist so gestaltet, dass die Beads nur leicht verschoben werden. Dabei
kommt es zu keiner Vermischung mit Serum und den darin vorkommenden
Antikörpern.
Das bedeutet das Serum schwimmt immer oben auf den Beads und kommt nicht
mit dem Boden der mit der Nachweissubstanz in Form von Fangkörpern kodierten
Fläche
in Berührung.
Somit werden nur die Such-Erythrozyten auf Grund der magnetischen
Anziehungskraft mit Hilfe eines Permanentmagneten zwischen den Sephadex Beads
hindurchgezogen. Bei diesem Hindurchschlupfen durch die Sephadex
Beads erfolgt somit gleichzeitig ein Aufreinigungsschritt.
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Der
Aufreinigungsschritt ist wesentlich, da somit auf einen nach dem
Stand der Technik erforderlichen Waschschritt verzichtet werden
kann. An der Bodenwandung der Mt-Platte haftet nur eine bestimmte
Menge von die Nachweissubstanz bildenden Fangkörpern, die hier als Anti-IgG
Fänger-Antikörper ausgebildet
sind. Würde
beim Hindurchtreten der Such-Erythrozyten durch die Sephadex Beads
keine Aufreinigung erfolgen, würden
die Fänger-Antikörper zum
größten Teil
von den freien im Serum befindlichen Antikörpern aufgebraucht werden.
Die Menge der ungebundenen IgG-Antikörper in der Testflüssigkeit
sind mengenmäßig deutlich
größer, als
die Menge der Such-Erythrozyten,
beladenen mit spezifischen Antikörpern.
Damit würde
sich ohne den Aufreinigungsschritt kein Rasen, der eine positive
Reaktion anzeigt, ausbilden.
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Im
Detail läuft
ein Antikörper-Suchtest
wie folgt ab:
- A) In drei Kavitäten einer
mit Anti-IgG Fangkörpern
kodierte, bevorzugt als Rundbodenplatte ausgeführten Reaktionsplatte, die
mehrere, jeweils einen U-förmigen
Behälter
bildende Kavitäten
aufweist, werden 0,025 ml aufgeschwemmte Sephadex Beads eingefüllt. Anstelle
der U-förmige
Kavitäten
aufweisenden Rundbodenplatte kann auch ein V-Boden verwendet werden.
- B) Eine bei einem Volumen von 0,025 ml 0,6% spezifische Testzellen
mit Testzellen 1, 2, 3 mit 0,025 ml Patientenserum umfassende Testflüssigkeit
kommt in drei Kavitäten
einer Mischplatte. Diese werden unter starkem permanentem Mischen,
was beispielsweise durch Schütteln
erfolgen kann, 5 bis 15 Minuten bei 37°C inkubiert.
- C) Anschließend
wird das inkubierte Gemisch auf die Sephadex-Beads der Reaktionsplatte
transferiert. Diese Platte kommt auf einen Permanentmagneten. Unter
gleichmäßigem vorsichtigem Schütteln über ca.
2 bis 3 Minuten gehen die in der Testflüssigkeit enthaltenen Such-Erythrozyten durch
die Beads. Eine negative Reaktion ist durch eine knopfförmige Sedimentation
an der tiefsten Stelle der U-förmigen
Kavität
erkennbar, eine positive Reaktion durch eine Rasenbildung (Fangkörper sind
zum Beispiel Anti-IgG und können
unterschiedliche Antigene sein).
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Der
Schritt B kann entfallen indem die Zellen 1, 2, 3 mit Serum gleich
auf die befüllte
Reaktionsplatte einpipettiert werden. Diese wird dann 15 Min bei
37° C ohne
permanentes Mischen inkubiert. Anschließend kommt die Reaktionsplatte
auf den Permanentmagneten. Unter gleichmäßigem vorsichtigen Schütteln über ca.
2 bis 3 Min gehen die Such-Erythrozyten durch die Beads. Auch hier
ist eine negative Reaktion durch einen Knopf und eine positive Reaktion
durch einen Rasen erkennbar (Fangkörper sind zum Beispiel Anti-IgG).
Der sich hieraus ergebende Vorteil ist, dass der Schritt B einschließlich des
Transfers von der Mischplatte auf die Reaktionsplatte entfallen
kann.
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Grundsätzlich sind
drei verschiedene Ansätze
denkbar, damit eine kurzzeitige Lückenbildung zwischen den Beads
auftritt:
- 1. durch einen handelsüblichen
Schüttler
oder Rüttler
- 2. durch Ultraschall und
- 3. durch eine Magnetisierung der Beads.
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In
den Fällen
1. und 2. werden die Beads vorzugsweise größer als die Erythrozyten gewählt; im Fall
3. werden die Beads vorzugsweise kleiner als die Erythrozyten gewählt. Im
letzten Fall werden die Beads über
ein wechselndes elektromagnetisches oder wechselndes permanentmagnetisches
Feld in Bewegung gebracht. Da die, beispielsweise ebenfalls magnetisierten,
Such-Erythrozyten größer und
schwerer sind als die Beads, reagieren sie träger auf das wechselnde Magnetfeld,
das die Beads in Schwingung versetzt. Oder es können unterschiedlich gerichtete Magnetfelder
aufgebracht werden, so dass nur das auf die magnetisierten Such-Erythrozyten,
zum Beispiel in senkrechter Richtung einwirkende Magnetfeld, welches
durch einen unterhalb des Bodens des Behälters befindlichen Dauermagneten
erzeugt wird, dieselben in Richtung zum Boden des Behälters beschleunigt.
Das auf die magnetisierten Beads einwirkende wechselnde Magnetfeld
bewegt diese, zum Beispiel nur horizontal, hin und her. Da die Such-Erythrozyten
auf Grund ihrer größeren Oberfläche darüber hinaus
zahlenmäßig mit
mehr magnetischen Nanopartikeln besetzt sind, reagieren sie stärker auf
das konstante, gerichtete Magnetfeld des Permanentmagneten, wodurch
sie schneller sind in ihrer Bewegung in Richtung auf den Permanentmagneten
zu, als in Richtung des wechselnden Magnetfeldes. Damit kommt es
zu einer Trennung der magnetisierten Such-Erythrozyten gegenüber den
magnetischen Beads. Die magnetisierten Such-Erythrozyten befinden
sich anschließend
näher am
Permanentmagneten. Darüber
hinaus wird ein weiterer Trennungseffekt erreicht, wonach sich die
großen
Partikel der Such-Erythrozyten am Behälterboden gegenüber den
kleineren Partikeln separieren. Es hat sich als besonders vorteilhaft
herausgestellt, wenn die Schüttelbewegung
in abrupten Umkehrpunkten endet, so dass in den Umkehrpunkten für eine sehr
kurze Zeit eine hohe Beschleunigung vorhanden ist.
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Prinzipiell
können
entweder die Beads oder das Gel, worunter die Membran im allgemeinen
Sinn zu verstehen ist, mit Fangantikörpern und/oder mit Fangantigenen
zum Nachweis der gesuchten Antikörper
und/oder der gesuchten Antigenen beschichtet oder durchmischt sein.
Oder der U- oder V-förmige
Boden des Behälters
ist in bekannter Weise mit Fangantikörpern und/oder mit Fangantigenen
beschichtet. Die spezifischen, bekannten Fangantikörper, nämlich Proteine
als Antikörper,
oder Antigene können
somit entweder an der Gefäßwandung
im unteren Bereich des Behälters
oder auf den Beads selbst sich befinden (kodierte Beads) oder sie
können
lose zwischen den Beads angeordnet sein.
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Wichtig
ist hervorzuheben, dass es grundsätzlich denkbar ist, die oben
genannten drei Methoden zu kombinieren.
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Ein
Beispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und anschließend beschrieben.
In der Zeichnung ist ein Behälter 1 in
drei zeitlich unterschiedlichen Phasen gezeigt.
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Für eine erste
Anwendungsvariante sind die folgenden Bedingungen einzuhalten: Unter
dem Behälter 1 ist
drehbar ein Permanentmagnet 2 angeordnet, welcher gemäß dem Prinzip
des Rührfischmagneten
um eine seiner Achsen, vorzugs weise um diejenige mit dem größten Trägheitsmoment,
zu rotieren imstande ist. Bei einer Mehrzahl von Behältern befindet
sich unter jedem Behälter
ein solcher Permanentmagnet. Der konkav gewölbte Boden 3 des Behälters 1 ist
innen mit Fangantikörpern
oder -antigenen beschichtet. Im Behälter 1 befinden sich
als Membran oder als sogenannte graduelle Schicht Beads 4,
welche in etwa die Größe von 1
bis 2 μm
Durchmesser aufweisen und von festerem Zustand sind. Des Weiteren
sind die Beads 4 mit einer ferromagnetischen Substanz magnetisiert,
z. B. an ihrer Oberfläche,
die in etwa 25 μm2 beträgt.
Somit sind die Beads entsprechend leicht. Des Weiteren haben die
zum Einsatz in einer Testflüssigkeit 7 gelangenden
Erythrozyten 5 meist die Form eines Diskus mit einem Durchmesser von
etwa 7,5 bis 8,7 μm;
die Oberfläche
hat etwa die Fläche
von 136 μm2. Die Erythrozyten 5 sind ebenfalls
auf der Oberfläche
magnetisiert, vorzugsweise mit einer ferromagnetischen Substanz.
Zum Beispiel werden zur Magnetisierung der Erythrozyten magnetische
Nanopartikel von ca. 200 nm der Firma Ademtech eingesetzt. Die Erythrozyten
weisen noch den Vorteil auf, dass diese flexibel sind und somit besser
durch Lücken
hindurchwandern können.
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Mit
der Bezugsziffer 6 ist in 1a ein
Ultraschallschwinger gekennzeichnet, welcher ebenfalls zum Aufbringen
der zweiten Kraft F verwendet werden kann. In diesem Fall ist vorzugsweise
der unter dem Boden des Behälters 1 befindliche
Dauermagnet 2 in 1a als ortsfester
Magnet mit einem permanenten Magnetfeld aufzufassen, welches als
erste Kraft auf die mit einer ferromagnetischen Substanz beladenen
Erythrozyten und/oder Beads einwirkt.
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Nunmehr
werden die mit einem Puffer aufgeschwemmten, vorbenannten Beads
in Behälter
gefüllt,
zum Beispiel in diejenigen einer Rundboden-MT-Platte, welche im
konkaven Bodenbereich mit Anti-IgG beschichtet ist. Darauf werden
die in einer Testflüssigkeit 7 aufgeschwemmten
Erythrozyten 5 gegeben, welche mit IgG-Antikörper beladen
sind. Auf diese Weise werden alle Kavitäten beschickt.
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Diese
Rundboden-MT-Platte wird auf eine 96-Magnetplatte aufgesetzt, welche
die Größe einer MT-Platte
hat, so dass sich unter jeder Kavität am Boden ein Permanentmagnet
mit Magnetausrichtung Südpol
und Nordpol befindet. Die Magneten werden um ihre Achse mittels
eines Motors gedreht, wodurch ein permanent-magnetisches Wechselfeld
erzeugt wird. Ebenso ist aber gleichzeitig die permanente Anzugskraft
von ferromagnetischen Materialien hin zum Magneten gegeben.
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Durch
das permanent-magnetisches Wechselfeld geraten die Beads in eine
rotierende Schwingbewegung. Dabei entstehen größer und kleiner werdende Lücken zwischen
den Beads, was man als Wellen unterschiedlicher Dichte interpretieren
kann. Die schwereren und somit trägeren aber flexibleren Erythrozyten
können
dadurch die sich öffnenden,
und schließenden,
Lücken
zwischen den Beads in Richtung des Magneten passieren. Die Flüssigkeit
der Erythrozyten, innerhalb der dieselben auf die Beads aufgefüllt worden
sind, bleibt als Schicht oben auf den Beads erhalten. Somit erhält man eine
Trennung bzw. Aufreinigung der Erythrozyten. Sobald die Erythrozyten
am Boden angekommen sind, bleiben sie bei einer positiven Reaktion
an der Bodenwand hängen
und bilden einen Rasen; oder die Erythrozyten sammeln sich bei negativer
Reaktion in Form eines Knopfes in der Mitte des Bodens des Behälters.
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Bei
der Verwendung eines sich bewegenden Permanentmagneten zur Erzeugung
eines permanent-magnetischen Wechselfeldes wird der Magnet in der
Richtung gedreht, in der die größte wechselnde Feldänderung
im Bereich des Bodens des Behälters bewirkt
wird.
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Für die Blutgruppenbestimmung
kann die folgende Variante zur Erzielung einer Agglutination in der
Membran durchgeführt
werden.
- A: In die Beads, welche eine graduelle
Schicht darstellen und deren Größe zwischen
20 bis 50 μm
beträgt,
werden zu je 25 μl
freie IgM-Antikörper
zum Nachweis der Blutgruppen eingemischt, nämlich zum Beispiel Beads mit
Anti-A oder Anti-B oder Anti-D. Diese Mischung wird anschließend in
eine Rundbodenplatte A1, A2, A2 usw. einpipettlert.
- B: Darauf werden 25 μl
0,6% magnetisierte aufgeschwemmte Erythrozyten von unbekannter Blutgruppe
aufgegeben. Es erfolgt eine Inkubation von ca. 5 bis 10 Minuten.
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Anschließend wird
die vorbenannte Rundbodenplatte auf eine statische 96-Magnetenvorrichtung aufgestellt,
so dass sich wiederum, wie oben beschrieben, sich unter jeder Kavität ein Dauermagnet befindet.
Rundbodenplatte und Magnetenvorrichtung bilden eine statische Einheit.
Diese statische Einheit wird nun mechanisch geschüttelt bzw.
gerüttelt,
zum Beispiel mittels einer Rüttelvorrichtung.
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Bei
einer negativen Reaktion wandern die magnetisierten Erythrozyten
durch die sich öffnenden – und wieder
schließenden
und wieder öffnenden – Lücken zwischen
den Beads, in denen sich freie Anti-A, IgM befinden, in Richtung
zum Magneten und sammeln sich in der Mitte des Bodens in Form eines Knopfes
an der tiefsten Stelle. Die Erythrozyten tragen nicht das spezifische
Antigen A auf ihrer Oberfläche.
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Eine
positive Reaktion wird nachgewiesen, wenn sich auf den Oberflächen der
Erythrozyten viel Antigen A befindet, so dass es mit den im Gel
(Beads) befindlichen Anti-A IgM Antikörpern zu einer stabilen Vernetzung
kommt. Diese bleiben dann aufgrund der Netzbildung auf dem Gel liegen.
Bei einer geringeren Antigendichte werden sie in die Beads einwandern,
aber eine räumliche
Zusammenballung, nämlich
Agglutination, bilden, die nicht mehr die Lücken zwischen den Beads passieren
kann und somit stecken bleibt. Dies kann visuell als eine räumlich große Wolke
in der Sicht von oben oder seitlich auf den Behälter erkannt werden. Die mit
Antigen A beladenen Erythrozyten können nicht an die tiefste Stelle wandern.
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Gewerbliche Anwendbarkeit:
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Die
Erfindung ist insbesondere im Bereich des Nachweises von Antikörpern und/oder
Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung gewerblich anwendbar.