EP2019967A1 - Verfahren zum nachweis von antikörpern und/oder antigenen sowie zur blutgruppenbestimmung in einer testsubstanz - Google Patents

Verfahren zum nachweis von antikörpern und/oder antigenen sowie zur blutgruppenbestimmung in einer testsubstanz

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Publication number
EP2019967A1
EP2019967A1 EP07725480A EP07725480A EP2019967A1 EP 2019967 A1 EP2019967 A1 EP 2019967A1 EP 07725480 A EP07725480 A EP 07725480A EP 07725480 A EP07725480 A EP 07725480A EP 2019967 A1 EP2019967 A1 EP 2019967A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
membrane
force
beads
test substance
substance
Prior art date
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Ceased
Application number
EP07725480A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jörg Spindler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Rotes Kreuz Blutspendendienst Baden-Wurt Gemeinnu GmbH
Original Assignee
Deutsches Rotes Kreuz Blutspendendienst Baden-Wurt Gemeinnu GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Rotes Kreuz Blutspendendienst Baden-Wurt Gemeinnu GmbH filed Critical Deutsches Rotes Kreuz Blutspendendienst Baden-Wurt Gemeinnu GmbH
Publication of EP2019967A1 publication Critical patent/EP2019967A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting antibodies and / or antigens and for determining blood groups in a test substance, the following method steps being present: applying or introducing a detection substance onto or into a preferably V- or U-shaped bottom area of a container, Dividing the container into at least two regions by arranging at least one membrane permeable to specific constituents of a test substance in the container, a first region being provided for receiving the test substance, and a second region containing the analyte, introducing the test substance into the region provided for this purpose, and applying an at least to individual components of the test substance acting, a passage of components of the test substance through the membrane accelerating, directed substantially in the direction of the membrane towards the first force, according to the preamble of claim 1.
  • the invention relates to a device according to the preamble of claim 12.
  • Human blood group substances are detected by specific antigen-antibody reactions. This reaction is detectable via crosslinking, agglutination, of antigens, antibodies and certain carriers carrying antigens or antibodies to a macroscopically detectable complex, the agglutinate.
  • test substance containing, for example, antibodies and / or antigens in a container having two or more, separated by at least one membrane areas
  • the for certain substances such as for Antibodies and / or antigens or certain compounds thereof are permeable. It is conceivable that the antibodies and / or antigens or certain compounds thereof can pass through the membrane and the membrane is impermeable to other constituents of the test liquid, as well as that the membrane for the antibodies and / or antigens or certain compounds thereof is impermeable and other components of the test substance can pass through the membrane.
  • the test substance comprises a body fluid to be examined or a constituent of such a body fluid to be examined, as well as predetermined, specific binding partners for antibodies and / or antigens to be detected in the body fluid or for a blood group.
  • the specified specific binding partners can also be introduced subsequently into the test substance, or they can be bound, for example, in the membrane or on its surface or else on the surface of the reaction vessels used.
  • the region of the container which is typically located below the membrane, is coated on its surface with or contains a detection substance.
  • the analyte typically comprises so-called capture antibodies, anti-IgG, which serve to bind positive or negative components of the test substance passed through the membrane in such a way that the typically V- or U-shaped bottom of the container or reaction vessel gives a particular, the test result reproducing sedimentation image.
  • capture antibodies anti-IgG
  • a positive test results in a uniform turf on the sloping walls of the container, whereas a negative result results in a button-shaped deposit at the lowest point of the container. It is also known to form lawn and button-shaped deposit just the opposite.
  • the membrane consists of, for example, a biological substance whose permeability can be changed by a chemical substance which can be added, for example, to the test liquid.
  • the passage through, for example, As the antibody and / or antigens through the membrane by applying a substantially perpendicular to the membrane acting, directed towards the membrane external force to support the test substance and thus to accelerate.
  • the directed external force is thereby applied by a centrifuge, by gravity, by a magnetic field generated by means of a permanent magnet or a combination thereof.
  • magnetic force it is known to prepare the erythrocytes by means of a magnetically influenceable substance, so that the erythrocytes are attracted in principle by the magnetic force acting.
  • Components of the test fluid can penetrate the gel.
  • Such a high one Force can only be applied by a centrifuge, combined with the above-mentioned disadvantages.
  • a method for the detection of antibodies and / or antigens in a test liquid as well as blood group determination by reaction with a given specific binding partner is known, wherein the antigen or the antibody or the specific binding partner in the test liquid unbound or to a carrier and wherein, in the case of a positive antigen-antibody reaction, an agglutinate of antigens or antibodies to be detected, the corresponding specific binding partners and the carriers is formed, which is optically detectable as a sedimentation image.
  • a viscous substance is used as a membrane with which a container is coated and in which the viscous substance forms a homogeneous layer which forms a fine mesh or lattice structure.
  • a predetermined volume of the test liquid is then added to the viscous substance in the container, wherein the specific binding partner is added to either the test liquid or the viscous substance, or another liquid containing the specific binding partner is added to the vessel before or after the test liquid is added ,
  • the analysis of whether an antibody-antigen reaction has taken place is made visually from the sedimentation image by an operator or automatically by means of a photometer or by means of a video or CCD camera or a fluorometer.
  • the container in this case has a tapering from top to bottom cross-section.
  • the prior art has the disadvantage that in particular the application of a force by means of a centrifuge due to the high cost is expensive and not widely available.
  • Another disadvantage is that by gravity or by means of a magnetic field alone can not muster as high forces, such as with a centrifuge, whereby the process of passing through takes a long time or even impossible.
  • the object of the invention is therefore to remedy this situation.
  • a first subject of the invention relates to a method for the detection of antibodies and / or antigens in a test substance.
  • the method according to the invention comprises the following method steps:
  • Dividing the container into at least two regions by arranging at least one semipermeable membrane permeable to specific constituents or compounds thereof of a test substance in the container, a first region being provided for receiving the test substance and a second region containing the analyte substance,
  • test substance Preparing and introducing the test substance into the area provided for this purpose, Application of an at least individual constituents of the test substance, a passage of the bestsand parts of the test substance through the membrane accelerating substantially in the direction of the membrane directed first force, and applying an at least on the membrane acting, preferably within a preferably substantially perpendicular acting on the first force extending plane, at least in their direction time-varying second force.
  • the method steps dividing the container into two areas and applying or introducing a detection substance in the area provided for this purpose can also be carried out in the reverse order, without departing from the gist of the invention.
  • the membrane may be made of a solid material, such as gel, or for example a gel in the form of fine beads, so-called beads, or of another material, such as glass or acrylic, between which certain components or compounds of the test substance can pass.
  • the test substance comprises a body fluid to be examined or a constituent of such a body fluid, such as blood, serum or the like, as well as predetermined specific binding partners for antibodies and / or antigens or a blood group to be detected in the body fluid.
  • the test substance can be prepared, for example, by incubation with the body fluid or a constituent of a body fluid.
  • the antibodies and / or antigens or the blood groups to be determined react with a predefined specific binding partner contained in the test substance or subsequently introduced into it. A compound resulting from this reaction is able to penetrate the membrane.
  • the specified, specific binding partners or other substances contained in the test substance are added only after the introduction of the test substance into the container.
  • the analyte may be liquid or solid and may, for example, comprise a coating of a part of the container surface which, for example, forms a chemical compound with certain components of the test liquid that have passed through the membrane, so that, for example, an agglutinate to be detected from a positive antigen-antibody reaction Antigens or antibodies or the specific binding partners and the carriers is formed, which is visually detectable as Sedimentationssent within the container, for example, on the surface of a capture solid analyte.
  • the membrane covers such a coating.
  • the separated second region comprises, for example, only the coating in the form of a capture substance comprehensive detection substance.
  • the first force directed essentially in the direction of the membrane can be generated, for example, by gravity, by a centrifuge or by a magnetic field.
  • a centrifuge is dispensed with due to the high acquisition costs and preferably only gravitational and / or magnetic forces are used.
  • the inventive method has the advantage over the prior art that by the application of a force acting on at least on the membrane, at least in their direction temporally variable and acting substantially transversely to the first force second force passage of certain components or their compounds with a predetermined, specific binding partner alone by gravity or a magnetic force within a manageable, short time is possible.
  • the force acting on the membrane at least in their direction temporally variable second force causes the membrane in a vibrational motion, which form gaps between the membrane-forming molecules or particles, in particular at the reversal points of the vibrational motion, or the distance increases between the molecules or particles of the membrane or by the vibration during movement occurring accelerations, the contact force between the individual molecules or particles of the membrane is briefly reduced, so that the desired components or their compounds, driven by the first, directed force can easily pass from the first region of the container through the membrane into the second region of the container , Since the plane within which the second force, which varies in time with respect to its direction, is essentially normal or normal to the external force acting on the test fluid, a reduction of the contact forces between the molecules or particles of the membrane is achieved without the predominant movement of the membrane. tion direction of certain constituents of the test substance when passing through the membrane to influence.
  • an advantageous embodiment of the invention provides that the time-varying force is variable both in their direction, as well as in their amount.
  • the membrane in a harmonic oscillation, stimulated for example by a harmonic, acting on the membrane in their direction temporally variable second force.
  • the acceleration as well as the speed of movement continuously increase and decrease sinusoidally or cosinusoidally.
  • An additional advantageous embodiment of the invention provides that the temporally variable, second force acts on the entire container including the membrane and is dimensioned in its strength and temporal change of direction so that, for example, a sedimentation image required for a proof remains unmolested , An action of the temporally variable in their direction second force on the membrane is thus the easiest to implement.
  • a particularly advantageous embodiment of the invention provides that the membrane is a gel in the form of fine beads, so-called beads, as
  • Gel layer comprises. If the membrane consists of beads, it is possible that the time-variable in their direction second force directly, for example by Ultrasound or an alternating magnetic field, acts on the beads, which constantly gaps due to the individual vibrations of the beads auftun, or at several points simultaneously contact forces between the beads are reduced, whereby a passage of certain components of the test substance through the membrane clearly is accelerated.
  • a, preferably changing, magnetic field for example, located in the test substance erythrocytes and the beads are coated with ferromagnetic particles.
  • the gel further comprises a substance which ensures a minimum distance between the beads in a resting state of the membrane. This has the advantage that, apart from the components of the test liquid desired for detection, no other components can pass through the gel and a very good purification of the constituents of the test liquid passing through the beads is ensured.
  • the time-varying force is applied by shaking, shaking or the like.
  • the time-varying force can be applied by ultrasound.
  • the time-varying force is applied by a time-varying magnetic field as an alternative or in addition to the above-mentioned possibilities. In the latter case, it is conceivable to dope the membrane or constituents of the same or constituents of the test liquid to be investigated with ferromagnetic material, so that the time-varying magnetic field can act directly on the membrane.
  • a further advantageous embodiment of the invention provides that the first force comprises a magnetic attraction.
  • the first force comprises a magnetic attraction.
  • the first force includes gravity.
  • a second object of the invention relates to a device for carrying out a method described above.
  • Such a device according to the invention comprises
  • a container having at least one provided with a preferably catcher detection substance, preferably V- or U-shaped bottom portion, - at least one container in at least two areas dividing, permeable to certain components or compounds of a test substance, membrane, wherein a first area for Recording a test substance is provided, and a second region containing the analyte, - means for applying at least to individual components of the
  • Test liquid acting first acting in the direction of the membrane towards external force, as well as
  • the means for applying a second force acting at least on individual parts or molecules of the membrane, at least in their direction with respect to time, preferably acting transversely to the first force, can be used according to the invention
  • An advantageous embodiment of the device according to the invention provides that the membrane of a gel in the form of fine beads, so-called Beads, consists. It is conceivable that the beads are magnetized to apply the second force by an alternating magnetic field.
  • the membrane consists of a gel in the form of fine beads, so-called beads, wherein either the beads or the V- or U-shaped bottom portion of the container with to detect the sought antibodies and / or the sought antigens Fangantibodies and / or is coated with Fangantigene.
  • the means for applying a force acting on at least individual parts or molecules of the membrane, at least in their direction time-varying second force is a shaker or an ultrasonic oscillator or an electromagnetic alternating field and the permeable, membrane is of the second force acted upon.
  • Antigens and blood typing are as follows:
  • a test substance or test liquid is prepared by using a body fluid to be examined or a component of such a body fluid.
  • the test substance comprises a predetermined specific binding partner for an antibody to be detected or for an antigen to be detected or for a specific blood group.
  • a container for a single sample in which a gel in the form of fine beads, beads, which divides the container into two regions, one for receiving the test liquid and one for receiving a collecting body comprising the detection substance is found in the test liquid a reaction with the given specific binding partner instead, wherein the antigens or the antibodies or the specific binding partner in the test fluid unbound and / or bound to a carrier, which may also be the container.
  • the container containing the test liquid is exposed to an incubation step in an incubator, and then to an agglutination step.
  • a first external force directed substantially perpendicular to the surface of the gel acts on the test substance or on individual constituents of the test substance.
  • a second, at least in their direction, but preferably in magnitude and direction, time-varying force acts on the gel or on individual parts of the gel to a
  • the second force acts perpendicular to the first force. If there is a positive antigen-antibody reaction, it forms on the catcher bodies at the bottom of the container
  • Antibodies are bound, which optically as Sedimentationssent within the
  • the Container is detectable.
  • the sedimentation image results from the fact that, for example, in the case of antibodies or antigens contained in the test liquid, they pass through the gel after reaction with the intended specific binding partners and adhere to a detection substance applied, for example, to a V- or U-shaped bottom region of the container. This clinging is recognizable by a turf-like sedimentation pattern. If no antibodies or antigens are present in the test substance, no turf is formed and a sedimentation image is formed with a button-shaped deposit at the lowest point of the container bottom.
  • the container a predetermined amount of a mixture of a buffer, gel-bed buffer, with the gel, buffer-gel mixture, the buffer-gel mixture having such a low viscosity that it is in liquid form containing the Pipette the buffer gel mixture by means of Stepper or pipette allowed in the microvessel, and wherein the gel embedding buffer has the property of minimizing the distance between the individual beads within the buffer-gel mixture.
  • a washing step is necessary according to the state of the art, for example, to wash out free antibodies which have not bonded with antigens during the incubation, from the test substance.
  • beads preferably SEPHADEX beads, suspended with buffer, also known as gel beads or also known as gel methods, are used.
  • the slurry is located in the individual container-forming wells of a microtiter plate (Mt plate).
  • Sephadex beads are very well suited to a purification, so one
  • the test fluid containing serum and antibody-free search erythrocytes, floats on the Sephadex beads after transfer.
  • a centrifugation step is absolutely necessary according to the prior art.
  • the search erythrocytes are separated from the suspension, which contains free antibodies and protein components. Due to the centrifugal force, the search erythrocytes pass through the gaps of the beads while the liquid serum portions of the test fluid remain thereon. If the search erythrocytes are additionally magnetized, they can be attracted by magnetic force.
  • this problem is circumvented by temporarily creating new gaps between the beads through which the search erythrocytes can slip through between the beads, for example under permanent magnetic force and at the same time gentle, careful shaking.
  • the only slight gravitational effect on the search erythrocytes is superimposed by the shaking.
  • the gentle, careful shaking is designed so that the beads are only slightly shifted.
  • the search erythrocytes are drawn between the Sephadex beads by virtue of the magnetic attraction force by means of a permanent magnet. In this passing through the Sephadex beads thus takes place simultaneously a purification step.
  • the purification step is essential because it can be dispensed with a washing step required by the prior art.
  • On the bottom wall of the Mt-plate adheres only a certain amount of the detection substance forming catches, which are designed here as anti-IgG catcher antibodies.
  • catches which are designed here as anti-IgG catcher antibodies.
  • the amount of unbound IgG antibody in the test fluid is quantitatively much larger than the amount of search erythrocytes loaded with specific antibodies. Thus, without the purification step, no turf indicating a positive reaction would be formed.
  • an antibody screening test using the method according to the invention proceeds as follows:
  • A) 0.025 ml of suspended Sephadex beads are introduced into three wells of a reaction plate which is coded with anti-IgG gullets and preferably designed as a round bottom plate and which has a plurality of cavities each forming a U-shaped container.
  • a reaction plate which is coded with anti-IgG gullets and preferably designed as a round bottom plate and which has a plurality of cavities each forming a U-shaped container.
  • the U-shaped cavities having round bottom plate and a V-bottom can be used.
  • test volume of at a volume of 0.025 ml 0.6% specific test cells with test cells 1, 2.3 with 0,025ml patient serum comprehensive test fluid comes in three wells of a mixing plate. These are incubated at 37 ° C. for 5 to 15 minutes with vigorous permanent mixing, which can be done, for example, by shaking.
  • Step C Subsequently, the incubated mixture is transferred to the Sephadex beads of the reaction plate. This plate comes on a permanent magnet. With constant gentle shaking for about 2 to 3 minutes, the search erythrocytes contained in the test liquid pass through the beads. A negative reaction is indicated by a button-shaped sedimentation at the deepest point of the U-shaped cavity, a positive reaction by a turf formation (catching bodies are for example anti-IgG and can be different antigens).
  • Step B can be omitted by pipetting the cells 1, 2, 3 with serum directly onto the filled reaction plate. This is then incubated for 15 min at 37 ° C without permanent mixing. Subsequently, the reaction plate comes to the permanent magnet.
  • step B including transfer from the mixing plate to the reaction plate, may be omitted.
  • the beads are preferably chosen to be larger than the erythrocytes; in case 3. the beads are preferably chosen smaller than the erythrocytes.
  • the beads are set in motion via a changing electromagnetic or alternating permanent magnetic field. Since the, for example, also magnetized, search erythrocytes are larger and heavier than the beads, they react more slowly to the changing magnetic field, which causes the beads to vibrate. Or, differently directed magnetic fields may be applied so that only the magnetic field applied to the magnetized search erythrocytes, for example in the vertical direction, which is generated by a permanent magnet located below the bottom of the container, will accelerate the same toward the bottom of the container.
  • the alternating magnetic field acting on the magnetized beads moves them back and forth, for example only horizontally.
  • the search erythrocytes because of their larger surface area, are numerically populated with more magnetic nanoparticles, they react stronger on the constant, directed magnetic field of the permanent magnet, whereby they are faster in their movement toward the permanent magnet, as in the direction of the alternating magnetic field.
  • the magnetized search erythrocytes are then closer to the permanent magnet.
  • a further separation effect is achieved, according to which the large particles of the search erythrocytes separate at the container bottom from the smaller particles. It has proved to be particularly advantageous if the shaking movement ends in abrupt reversal points, so that a high acceleration is present at the reversal points for a very short time.
  • either the beads or the gel, by which the membrane is to be understood in the general sense may be coated or mixed with trapping antibodies and / or with trapping antigens for the detection of the antibodies sought and / or the antigens sought.
  • the U- or V-shaped bottom of the container is coated in a known manner with Fanganti stresses and / or with Fangantigene.
  • the specific, known capture antibodies, namely proteins as antibodies, or antigens can thus be located either on the vessel wall in the lower region of the container or on the beads themselves (coded beads) or they can be arranged loosely between the beads.
  • FIG. 1 An example of the invention is shown in the drawing and described below.
  • a container 1 in three different time phases a), b) and c) is shown.
  • a permanent magnet 2 is rotatably arranged which, according to the principle of the stirring magnet, is mounted around one of its axes, preferably way around the one with the largest moment of inertia, is able to rotate.
  • a permanent magnet is located under each container.
  • the concave bottom 3 of the container 1 is internally coated with capture antibodies or antigens.
  • In the container 1 are as a membrane or as a so-called gradual layer beads 4, which have approximately the size of 1 micron to 2 microns in diameter and are of a firmer state.
  • the beads 4 are magnetized with a ferromagnetic substance, for example on its surface, which is approximately 25 ⁇ m 2 .
  • the beads are correspondingly light.
  • the erythrocytes 5 that reach the test liquid 7 are mostly in the form of a disc having a diameter of about 7.5 to 8.7 ⁇ m; the surface has about the area of 136 ⁇ m 2 .
  • the erythrocytes 5 are also magnetized on the surface, preferably with a ferromagnetic substance. For example, to magnetize the erythrocytes magnetic nanoparticles of about 200nm of the company. Used Ademtech.
  • the erythrocytes also have the advantage that they are flexible and thus can better walk through gaps.
  • an ultrasonic transducer is characterized, which can also be used for applying the second force F.
  • the permanent magnet 2 located under the bottom of the container 1 in FIG. 1a is preferably to be regarded as a stationary magnet with a permanent magnetic field, which acts as a first force on the erythrocytes and / or beads loaded with a ferromagnetic substance.
  • the above-mentioned beaded with a buffer beads are filled in containers, for example in those of a round bottom MT plate, which is coated in the concave bottom area with anti-IgG.
  • the erythrocytes 5 suspended in a test liquid 7 are added, which are loaded with IgG antibodies. In this way all cavities are charged.
  • This round-bottomed MT plate is placed on a 96-well plate the size of an MT plate, so that under each cavity on the ground Permanent magnet with magnetic orientation South Pole and North Pole is located.
  • the magnets are rotated about their axis by means of a motor, whereby a permanent-magnetic alternating field is generated.
  • the permanent tightening force is given by ferromagnetic materials towards the magnet.
  • the beats Due to the permanent magnetic alternating field, the beats get into a rotating oscillatory motion. This results in larger and smaller gaps between the beads, which can be interpreted as waves of different densities. The heavier and thus more sluggish but more flexible erythrocytes can thereby pass the opening, and closing, gaps between the beads in the direction of the magnet.
  • the liquid of the erythrocytes, within which they have been filled up on the beads, remains as a layer on top of the beads. Thus one obtains a separation or purification of the erythrocytes. Once the erythrocytes have reached the bottom, they stick to the bottom wall in a positive reaction and form a lawn; or the erythrocytes accumulate in the negative reaction in the form of a button in the middle of the bottom of the container.
  • the magnet When using a moving permanent magnet to generate a permanent magnetic alternating field, the magnet is rotated in the direction in which the largest alternating field change is effected in the region of the bottom of the container.
  • the following variant can be carried out to achieve agglutination in the membrane.
  • A In the beads, which are a gradual layer and whose size is between 20 .mu.m to 50 .mu.m, 25 .mu.l free IgM antibodies are mixed for detection of blood groups, namely, for example, beads with anti-A or anti-B or anti-D , This mixture is then pipetted into a round bottom plate A1, A2, A2, etc.
  • B Then 25 ⁇ l 0.6% magnetized bloated erythrocytes of unknown blood group are given up. There is an incubation of about 5 minutes to 10 minutes.
  • round bottom plate is placed on a static 96- magnetic device, so that in turn, as described above, under each cavity is a permanent magnet.
  • Round bottom plate and magnet device form a static unit.
  • This static unit is now mechanically shaken or vibrated, for example by means of a vibrator.
  • the magnetized erythrocytes migrate through the opening - re-closing and re-opening - gaps between the beads containing free anti-A, IgM towards the magnet and gathering in the middle of the bottom a button at the lowest point.
  • the erythrocytes do not carry the specific antigen A on their surface.
  • a positive reaction is detected if there is much antigen A on the surfaces of the erythrocytes, so that stable crosslinking occurs with the anti-A IgM antibodies in the gel (beads). These will then remain on the gel due to the formation of nets. With a lower antigenic density, they will migrate into the beads, but form a spatial aggregation, namely agglutination, which can no longer pass through the gaps between the beads and thus get stuck. This can be visually recognized as a spatially large cloud in the view from above or laterally on the container. The erythrocytes loaded with antigen A can not migrate to the lowest point.
  • the invention is particularly applicable in the field of detection of antibodies and / or antigens and for blood group determination commercially.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung in einer Testsubstanz beschrieben, umfassend die Verfahrensschritte: Auf- oder Einbringen einer Nachweissubstanz auf oder in einen vorzugsweise V- oder U-förmigen Bodenbereich eines Behälters, Aufteilen des Behälters in mindestens zwei Bereiche durch Anordnen mindestens einer für bestimmte Bestandteile einer Testsubstanz durchlässigen, semipermeablen Membran in dem Behälter, wobei ein erster Bereich zur Aufnahme der Testsubstanz vorgesehen ist, und ein zweiter Bereich die Nachweissubstanz (Anti-IgG) enthält, Einbringen der Testsubstanz in den hierfür vorgesehenen Bereich, sowie Aufbringen einer zumindest auf einzelne Bestandteile der Testsubstanz einwirkenden, ein Hindurchtreten von Bestsandteilen der Testsubstanz durch die Membran beschleunigenden, im Wesentlichen in Richtung zur Membran hin gerichteten ersten Kraft, sowie Aufbringen einer mindestens auf die Membran einwirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen zweiten Kraft. Darüber hinaus wird eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens beschrieben.

Description

Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmunq in einer Testsubstanz
Technisches Gebiet: Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung in einer Testsubstanz, wobei folgende Verfahrensschritte vorhanden sind: Auf- oder Einbringen einer Nachweissubstanz auf oder in einen vorzugsweise V- oder U-förmigen Bodenbereich eines Behälters, Aufteilen des Behälters in mindestens zwei Bereiche durch Anordnen mindestens einer für bestimmte Bestandteile einer Testsubstanz durchlässigen Membran in dem Behälter, wobei ein erster Bereich zur Aufnahme der Testsubstanz vorgesehen ist, und ein zweiter Bereich die Nachweissubstanz enthält, Einbringen der Testsubstanz in den hierfür vorgesehenen Bereich, sowie Aufbringen einer zumindest auf einzelne Bestandteile der Testsubstanz einwirkenden, ein Hindurchtreten von Bestandteilen der Testsubstanz durch die Membran beschleunigenden, im Wesentlichen in Richtung zur Membran hin gerichteten ersten Kraft, gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Ebenso betrifft die Erfindung eine Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 12.
Stand der Technik:
Menschliche Blutgruppensubstanzen, aber auch eine Vielzahl von anderen in einem Organismus gebildeten Substanzen, werden durch spezifische Antigen- Antikörper-Reaktionen nachgewiesen. Diese Reaktion ist detektierbar über eine Vernetzung, Agglutination, von Antigenen, Antikörpern und bestimmten Trägersubstanzen, die Antigene oder Antikörper tragen, zu einem makroskopisch erfassbaren Komplex, dem Agglutinat.
Zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in einer Testsubstanz oder einer Testflüssigkeit, oder zur Blutgruppenbestimmung ist bekannt, eine beispielsweise Antikörper und/oder Antigene enthaltende Testsubstanz in einen Behälter zu geben, der zwei oder mehrere, durch mindestens eine Membran getrennte Bereiche aufweist, die für bestimmte Substanzen, beispielsweise für die Antikörper und/oder Antigene oder bestimmte Verbindungen derselben durchlässig ist. Dabei ist sowohl denkbar, dass die Antikörper und/oder Antigene oder bestimmte Verbindungen derselben durch die Membran hindurch treten können und die Membran für andere Bestandteile der Testflüssigkeit undurchlässig ist, als auch, dass die Membran für die Antikörper und/oder Antigene oder bestimmte Verbindungen derselben undurchlässig ist und andere Bestandteile der Testsubstanz durch die Membran hindurch treten können. Die Testsubstanz umfasst dabei eine zu untersuchende Körperflüssigkeit oder einen Bestandteil einer solchen zu untersuchende Körperflüssigkeit, sowie vorgegebene, spezifi- sehe Bindungspartner für in der Körperflüssigkeit nachzuweisende Antikörper und/oder Antigene oder für eine Blutgruppe. Die vorgegebenen, spezifischen Bindungspartner können auch nachträglich in die Testsubstanz eingebracht werden, oder sie können beispielsweise in der Membran oder an deren Oberfläche oder auch an der Oberfläche der verwendeten Reaktionsgefäße gebunden sein.
Der typischerweise unterhalb der Membran liegende Bereich des Behälters ist an seiner Oberfläche mit einer Nachweissubstanz beschichtet, oder enthält eine solche. Die Nachweissubstanz umfasst typischerweise so genannte Fangkörper, Anti-IgG, die dazu dienen, durch die Membran hindurchgetretene, in Bezug auf das Testergebnis positive oder negative Bestandteile der Testsubstanz derart zu binden, dass sich am typischerweise V- oder U-förmig ausgebildeten Boden des Behälters oder Reaktionsgefäßes ein bestimmtes, das Testergebnis wiedergebendes Sedimentationsbild ergibt. Beispielsweise ergibt sich bei einem positiven Testergebnis ein gleichmäßiger Rasen auf den schrägen Wänden des Behälters, wohingegen bei einem negativen Ergebnis eine knopfförmige Ablagerung am tiefsten Punkt des Behälters erfolgt. Ebenso ist bekannt, Rasen und knopfförmige Ablagerung genau umgekehrt auszubilden.
Aus der WO 02/45858 A2 ist bekannt, dass die Membran aus einer beispiels- weise biologischen Substanz besteht, deren Permeabilität durch eine beispielsweise der Testflüssigkeit zusetzbare chemische Substanz veränderbar ist. Darüber hinaus ist aus WO 02/45858 A2 bekannt, das Hindurchtreten beispiels- weise der Antikörper und/oder Antigene durch die Membran durch Aufbringen einer im Wesentlichen senkrecht zur Membran wirkenden, zur Membran hin gerichteten externen Kraft auf die Testsubstanz zu unterstützen und somit zu beschleunigen. Die gerichtete externe Kraft wird dabei durch eine Zentrifuge, durch Gravitation, durch ein mittels eines Permanentmagneten erzeugtes Magnetfeld oder eine Kombination hieraus aufgebracht. Bei der Verwendung von Magnetkraft ist es hierzu bekannt, die Erythrozyten mittels einer magnetisch beeinflussbaren Substanz zu präparieren, so dass die Erythrozyten im Prinzip durch die wirkende Magnetkraft angezogen werden.
Nachteilig hieran ist, dass die Anschaffung einer Zentrifuge kostspielig ist, weshalb Zentrifugen nicht überall verfügbar sind und ein solches Verfahren somit nicht überall durchführbar ist. Darüber hinaus weisen Verfahren, die einen Zentri- fugationsschritt aufweisen den Nachteil auf, dass sie nur schlecht automatisierbar sind, also in Bezug auf eine Automatisierung der Schritte beginnend beim Einbringen der Testsubstanz in einen hierfür vorgesehenen Behälter über das Zentrifugieren bis hin zu einer automatischen Auswertung des Testergebnisses mittels einer Kamera einen sehr hohen technischen Aufwand benötigen.
Aus der DE 10061515 A1 ist bekannt, ein Gel in Form von feinen Kügelchen, so genannten Beads, als Membran zu verwenden. Nach der Reaktion beispielsweise von in der Testsubstanz enthaltenen Antikörpern und/oder Antigenen mit einem vorgegebenen, spezifischen Bindungspartner können diese durch das Gel unter Einwirkung einer durch eine Zentrifuge aufgebrachte senkrecht zur Membran hin wirkende, externe Kraft hindurchwandern. Nachteilig hieran ist, dass auch hier eine Zentrifuge mit den bereits oben angeführten Nachteilen benötigt wird.
Aus der DE 10239568 A1 ist darüber hinaus bekannt, den Abstand zwischen den
Beads eines Gels durch Zugabe eines Geleinbettpuffers zu minimieren. Hierdurch wird eine hohe, zur Membran hin gerichtete Kraft benötigt, damit einzelne
Bestandteile der Testflüssigkeit das Gel durchdringen können. Eine solch hohe Kraft kann nur durch eine Zentrifuge aufgebracht werden, verbunden mit den oben genannten Nachteilen.
Aus der EP 1064557 B1 ist ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in einer Testflüssigkeit sowie zur Blutgruppenbestimmung durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner bekannt, wobei das Antigen bzw. der Antikörper oder der spezifische Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden oder an einen Träger gebunden ist und wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern, den entsprechenden spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist. Hierbei wird eine viskose Substanz als Membran verwendet, mit der ein Behälter beschichtet wird und in dem die viskose Substanz eine homogene Schicht bildet, welche eine feine Vernetzung bzw. Gitterstruktur ausbildet. In den Behälter wird anschließend ein vorbestimmtes Volumen der Testflüssigkeit auf die viskose Substanz zugefügt, wobei der spezifische Bindungspartner entweder der Testflüssigkeit oder der viskosen Substanz zugesetzt ist oder eine weitere Flüssigkeit, die den spezifischen Bindungspartner enthält, vor oder nach Zufügen der Testflüssigkeit dem Gefäß zugefügt wird. Die Analyse, ob eine Antikörper-Antigen-Reaktion stattgefunden hat, wird anhand des Sedimentationsbildes optisch durch eine Bedienungsperson oder automatisch mittels eines Photometers oder mittels einer Video- oder CCD-Kamera oder eines Fluormeters vorgenommen. Der Behälter weist hierbei einen sich von oben nach unten verjüngenden Querschnitt auf. Das Hindurchtreten von Bestandteilen der Test- flüssigkeit bzw. von Reaktionsprodukten aus Bestandteilen der Testflüssigkeit und deren spezifischer Bindungspartner durch die viskose Substanz erfolgt dabei ausschließlich unter Einwirkung der Schwerkraft, bis sich in der Grenzschicht zwischen der schrägen Wandung des Behälters und der homogenen Schicht aus der viskosen Substanz das auch als Agglutinat bezeichnete, sichtbare Sediment ausbildet, wobei eine insbesondere auf der schrägen Wandung des Gefäßes sich flächig ausbildende Agglutinatschicht auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion hinweist und ein insbesondere im Bereich des tiefsten Punktes des Bodens bzw. der schrägen Wandung des Gefäßes sich bildende, räumlich gerinfügig ausgedehnte Ablagerung auf eine negative Reaktion ohne Antigen/Antikörper- Komplex hinweist. Nachteilig hieran ist, dass das Verfahren aufgrund der Sedimentationsbildung allein aufgrund der Schwerkraft sehr lange dauert.
Zusammengefasst ist festzuhalten, dass der Stand der Technik den Nachteil aufweist, dass insbesondere das Aufbringen einer Kraft mittels einer Zentrifuge aufgrund der hohen Anschaffungskosten kostspielig und nicht überall verfügbar ist. Weiterhin ist nachteilig, dass sich durch Gravitation oder mittels eines Magnet- feldes allein keine so hohen Kräfte, wie mit einer Zentrifuge, aufbringen lassen, wodurch der Vorgang des Hindurchtretens lange dauert oder gar unmöglich ist.
Technische Aufgabe der Erfindung:
Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, hier Abhilfe zu schaffen.
Offenbarung der Erfindung und deren Vorteile:
Die Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale des Anspruchs 1 sowie durch die
Merkmale des Anspruchs 11.
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in einer Testsubstanz. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die folgenden Verfahrensschritte:
- Auf- oder Einbringen einer vorzugsweise Fangkörper umfassenden Nachweissubstanz auf oder in einen vorzugsweise V- oder U-förmigen Bodenbereich eines Behälters,
- Aufteilen des Behälters in mindestens zwei Bereiche durch Anordnen mindestens einer für bestimmte Bestandteile oder Verbindungen derselben einer Testsubstanz durchlässigen, semipermeablen Membran in dem Behälter, wobei ein erster Bereich zur Aufnahme der Testsubstanz vorgesehen ist, und ein zweiter Bereich die Nachweissubstanz enthält,
- Herstellen und Einbringen der Testsubstanz in den hierfür vorgesehenen Bereich, - Aufbringen einer zumindest auf einzelne Bestandteile der Testsubstanz einwirkenden, ein Hindurchtreten von Bestsandteilen der Testsubstanz durch die Membran beschleunigenden, im Wesentlichen in Richtung zur Membran hin gerichteten ersten Kraft, sowie - Aufbringen einer mindestens auf die Membran einwirkenden, vorzugsweise innerhalb einer vorzugsweise im Wesentlichen senkrecht zu der ersten Kraft verlaufenden Ebene wirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen zweiten Kraft.
Die Verfahrensschritte Aufteilen des Behälters in zwei Bereiche und Auf- oder Einbringen einer Nachweissubstanz in den hierfür vorgesehenen Bereich können auch in umgekehrter Reihenfolge ausgeführt werden, ohne den Kern der Erfindung zu verlassen.
Die Membran kann aus einem festen Material, wie Gel, oder beispielsweise aus einem Gel in Form von feinen Kügelchen, so genannten Beads, oder aus einem anderen Material, wie Glas oder Acryl, bestehen, zwischen denen bestimmte Bestandteile oder Verbindungen der Testsubstanz hindurchtreten können.
Die Testsubstanz umfasst eine zu untersuchende Körperflüssigkeit oder einen Bestandteil einer solchen Körperflüssigkeit, wie beispielsweise Blut, Serum oder dergleichen, sowie vorgegebene, spezifische Bindungspartner für in der Körperflüssigkeit nachzuweisende Antikörper und/oder Antigene oder eine Blutgruppe. Die Testsubstanz kann beispielsweise durch Inkubation mit der Körperflüssigkeit oder einem Bestandteil einer Körperflüssigkeit hergestellt werden. Die Antikörper und/oder Antigene oder die zu bestimmenden Blutgruppen reagieren mit einem in der Testsubstanz enthaltenen oder nachträglich in diese eingebrachten vorgegebenen spezifischen Bindungspartner. Eine durch diese Reaktion entstehende Verbindung ist in der Lage, die Membran zu durchdringen. Dabei ist grundsätzlich denkbar, dass die vorgegebenen, spezifischen Bindungspartner oder andere in der Testsubstanz enthaltene Stoffe erst nach dem Einbringen der Testsubstanz in den Behälter zugegeben werden. Die Nachweissubstanz kann flüssig oder fest sein und beispielsweise eine Beschichtung eines Teils der Behälteroberfläche umfassen, welche mit bestimmten durch die Membran hindurch getretenen Bestandteilen der Testflüssigkeit beispielsweise eine chemische Verbindung eingeht, so dass bei- spielsweise bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw. den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild innerhalb des Behälters, beispielsweise auf der Oberfläche einer Fangkörper umfassenden festen Nachweissubstanz, detektierbar ist. So ist beispielsweise denkbar, dass die Membran eine solche Beschichtung überdeckt. Der abgetrennte zweite Bereich umfasst dabei beispielsweise nur die Beschichtung in Form einer Fangkörper umfassenden Nachweissubstanz.
Die im Wesentlichen in Richtung zur Membran hin gerichteten ersten Kraft kann beispielsweise durch Gravitation, durch eine Zentrifuge oder durch ein Magnetfeld erzeugt werden, wobei erfindungsgemäß aufgrund der hohen Anschaffungskosten auf eine Zentrifuge verzichtet wird und vorzugsweise ausschließlich Gravitations- und/oder Magnetkräfte eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist gegenüber dem Stand der Technik den Vorteil auf, dass durch das Aufbringen einer mindestens auf die Membran einwirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen und im Wesentlichen quer zur ersten Kraft wirkenden zweiten Kraft ein Hindurchtreten von bestimmten Bestandteilen oder deren Verbindungen mit einem vorbe- stimmten, spezifischen Bindungspartner allein durch Schwerkraft oder eine magnetische Kraft innerhalb einer überschaubaren, kurzen Zeit möglich ist. Dies ist deshalb möglich, da die auf die Membran einwirkende, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderliche zweite Kraft die Membran in eine Schwingungsbewegung versetzt, wodurch sich insbesondere an den Umkehrpunkten der Schwingungsbewegung Lücken zwischen den die Membran bildenden Molekülen oder Teilchen bilden, bzw. der Abstand zwischen den Molekülen oder Teilchen der Membran zunimmt bzw. durch die bei der Schwingungsbewegung auftretenden Beschleunigungen die Anpresskraft zwischen den einzelnen Molekülen oder Teilchen der Membran kurzzeitig verringert wird, so dass die gewünschten Bestandteile oder deren Verbindungen, angetrieben von der ersten, gerichteten Kraft leichter vom ersten Bereich des Behälters durch die Membran hindurch in den zweiten Bereich des Behälters gelangen können. Indem die Ebene, innerhalb der die in ihrer Richtung zeitlich veränderliche zweite Kraft wirkt, im Wesentlichen normal bzw. normal zu der auf die Testflüssigkeit einwirkenden externen Kraft verläuft, wird eine Verringerung der Anpresskräfte zwischen den Molekülen oder Teilchen der Membran erreicht ohne die überwiegende Bewe- gungsrichtung von bestimmten Bestandteilen der Testsubstanz beim Hindurchtreten durch die Membran zu beeinflussen.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die zeitlich veränderliche Kraft sowohl in ihrer Richtung, als auch in ihrem Betrag veränderlich ist. So ist beispielsweise denkbar, die Membran in eine harmonische Schwingung zu versetzen, angeregt beispielsweise durch eine harmonische, auf die Membran einwirkende in ihrer Richtung zeitlich veränderliche zweite Kraft. Bei einer harmonischen Schwingung nehmen die Beschleunigung ebenso wie die Bewegungsgeschwindigkeit sinus- bzw. cosinusförmig stetig zu und ab.
Eine zusätzliche vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die zeitlich veränderliche, zweite Kraft auf den gesamten Behälter einschließlich der Membran einwirkt und in ihrer Stärke und zeitlichen Veränderung der Richtung so bemessen ist, dass beispielsweise ein für einen Nachweis erforderliches Sedi- mentationsbild hierdurch unbehelligt bleibt. Ein Einwirken der in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen zweiten Kraft auf die Membran ist so am einfachsten zu verwirklichen.
Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die Membran ein Gel in Form von feinen Kügelchen, so genannten Beads, als
Gelschicht umfasst. Besteht die Membran aus Beads, so ist es möglich, dass die in ihrer Richtung zeitlich veränderliche zweite Kraft direkt, beispielsweise durch Ultraschall oder ein wechselndes Magnetfeld, auf die Beads einwirkt, wodurch sich aufgrund der individuellen Schwingungen der Beads ständig Lücken zwischen diesen auftun, bzw. an mehreren Stellen gleichzeitig Anpresskräfte zwischen den Beads verringert werden, wodurch ein Hindurchtreten von bestimmten Bestandteilen der Testsubstanz durch die Membran deutlich beschleunigt wird. Bei Einsatz eines, vorzugsweise wechselnden, Magnetfeldes sind beispielsweise die in der Testsubstanz befindlichen Erythrozyten sowie die Beads mit ferromagnetischen Partikeln beschichtet.
Dabei ist denkbar, dass das Gel darüber hinaus einen Stoff umfasst, der in einem Ruhezustand der Membran einen minimalen Abstand zwischen den Beads sicherstellt. Hierdurch wird der Vorteil erreicht, dass außer den für einen Nachweis gewünschten Bestandteilen der Testflüssigkeit keine anderen Bestandteile durch das Gel hindurchtreten können und eine sehr gute Aufreinigung der durch die Beads hindurchtretenden Bestandteile der Testflüssigkeit sichergestellt wird.
Eine andere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die zeitlich veränderliche Kraft durch Schütteln, Rütteln oder dergleichen aufgebracht wird. Alternativ oder zusätzlich hierzu kann die zeitlich veränderliche Kraft durch Ultraschall aufgebracht werden. Ebenso ist denkbar, dass die zeitlich veränderliche Kraft alternativ oder zusätzlich zu den oben angegebenen Möglichkeiten durch ein zeitlich veränderliches Magnetfeld aufgebracht wird. Im letztgenannten Fall ist denkbar, die Membran oder Bestandteile derselben oder Bestandteile der zu untersuchenden Testflüssigkeit mit ferromagnetischem Material zu dotieren, so dass das zeitlich veränderliche Magnetfeld direkt auf die Membran einwirken kann.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die erste Kraft eine magnetische Anziehungskraft umfasst. In diesem Fall sind die
Erythrozyten mit ferromagnetischen Partikel behaftet, so dass die Erythrozyten durch ein auf sie einwirkendes Magnetfeld in die Richtung desselben beschleunigt werden. Darüber hinaus ist denkbar, dass die erste Kraft die Schwerkraft umfasst.
Ein zweiter Gegenstand der Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung eines oben beschriebenen Verfahrens. Eine solche erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst
- einen Behälter mit mindestens einem mit einer vorzugsweise Fangkörper umfassenden Nachweissubstanz versehenen, vorzugsweise V- oder U- förmigen Bodenbereich, - mindestens eine den Behälter in mindestens zwei Bereiche unterteilende, für bestimmte Bestandteile oder Verbindungen einer Testsubstanz durchlässige, Membran, wobei ein erster Bereich zur Aufnahme einer Testsubstanz vorgesehen ist, und ein zweiter Bereich die Nachweissubstanz enthält, - Mittel zum Aufbringen einer zumindest auf einzelne Bestandteile der
Testflüssigkeit einwirkenden ersten, im Wesentlichen in Richtung zur Membran hin wirkenden externen Kraft, sowie
- Mittel zum Aufbringen einer zumindest auf einzelne Teile oder Moleküle der Membran einwirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen, vorzugsweise quer zur ersten Kraft wirkenden zweiten
Kraft, mit Ausnahme einer Zentrifugalkraft.
Die Mittel zum Aufbringen einer zumindest auf einzelne Teile oder Moleküle der Membran einwirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen, vor- zugsweise quer zur ersten Kraft wirkenden zweiten Kraft können erfindungsgemäß
1. einen handelsüblichen Schüttler bzw. Rüttler und/oder
2. Ultraschall und/oder
3. eine Magnetisierung der Membran oder von Teilen derselben umfassen.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass die Membran aus einem Gel in Form von feinen Kügelchen, so genannten Beads, besteht. Hierbei ist denkbar, dass die Beads magnetisiert werden, um die zweite Kraft durch ein wechselndes Magnetfeld aufzubringen.
In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht die Membran aus einem Gel in Form von feinen Kügelchen, so genannten Beads, wobei zum Nachweis der gesuchten Antikörper und/oder der gesuchten Antigenen entweder die Beads oder der V- oder U-förmige Bodenbereich des Behälters mit Fangantikörpern und/oder mit Fangantigenen beschichtet ist.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist das Mittel zum Aufbringen einer zumindest auf einzelne Teile oder Moleküle der Membran einwirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen, zweiten Kraft ein Schüttler oder ein Ultraschallschwinger oder ein elektromagnetisches Wechselfeld und die durchlässige, Membran ist von der zweiten Kraft beaufschlagbar.
Wege zur Ausführung der Erfindung:
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder
Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung läuft wie folgt ab:
Eine Testsubstanz oder Testflüssigkeit wird unter Verwendung einer zu untersuchenden Körperflüssigkeit oder eines Bestandteils einer solchen Körperflüssigkeit hergestellt. Die Testsubstanz umfasst einen vorgegebenen spezifischen Bindungspartner für einen nachzuweisenden Antikörper oder für ein nachzuweisendes Antigen oder für eine bestimmte Blutgruppe. Unter Verwendung eines Behälters für eine einzelne Probe, in welchen ein Gel in Form von feinen Kügelchen, Beads, eingebracht ist, welches den Behälter in zwei Bereiche unterteilt, einen zur Aufnahme der Testflüssigkeit und einen zur Aufnahme einer Fangkörper umfassenden Nachweissubstanz, findet in der Testflüssigkeit eine Reaktion mit dem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner statt, wobei die Antigene bzw. die Antikörper oder die spezifischen Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger, der auch der Behälter sein kann, gebunden sind.
Der die Testflüssigkeit enthaltende Behälter wird einem Inkubationsschritt in einem Inkubator, sowie anschließend einem Agglutinationsschritt ausgesetzt.
Während des Agglutinationsschritts wirkt eine erste, im Wesentlichen senkrecht zur Oberfläche des Gels hin gerichtete externe Kraft auf die Testsubstanz oder auf einzelne Bestandteile der Testsubstanz ein. Gleichzeitig wirkt eine zweite, zumindest in ihrer Richtung, vorzugsweise jedoch in Betrag und Richtung, zeitlich veränderliche Kraft auf das Gel oder auf einzelne Teile des Gels ein, um ein
Hindurchtreten der nachzuweisenden Antigene bzw. Antikörper bzw. den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern durch das Gel zu beschleunigen.
Die zweite Kraft wirkt dabei senkrecht zur ersten Kraft. Bei positiver Antigen- Antikörper-Reaktion bildet sich auf den Fangkörpern am Behälterboden ein
Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw. den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern, an die die Antigene bzw.
Antikörper gebunden sind, welches optisch als Sedimentationsbild innerhalb des
Behälters detektierbar ist. Das Sedimentationsbild ergibt sich dadurch, dass beispielsweise bei in der Testflüssigkeit enthaltenen Antikörpern oder Antigenen diese nach Reaktion mit den vorgesehenen spezifischen Bindungspartnern durch das Gel hindurchtreten, und auf einer beispielsweise auf einen V- oder U- förmigen Bodenbereich des Behälters aufgetragenen Nachweissubstanz anhaften. Dieses Anhaften ist durch ein rasenartiges Sedimentationsbild erkennbar. Sind keine Antikörper oder Antigene in der Testsubstanz enthalten, bildet sich kein Rasen aus und es entsteht ein Sedimentationsbild mit einer knopfförmigen Ablagerung an der tiefsten Stelle des Behälterbodens.
Zusätzlich ist denkbar, dem Behälter eine vorbestimmte Menge eines Gemisches eines Puffers, Geleinbettpuffer, mit dem Gel, Puffer-Gel-Gemisch, zuzugeben, wobei das Puffer-Gel-Gemisch eine derart geringe Viskosität aufweist, dass es in flüssiger Form vorliegt, welche die Pipettierung des Puffer-Gel-Gemisches mittels Stepper oder Pipette in das Mikrogefäß gestattet, und wobei der Geleinbettpuffer die Eigenschaft aufweist, den Abstand zwischen den einzelnen Beads innerhalb des Puffer-Gel-Gemisches zu minimieren.
Wichtig ist hervorzuheben, dass das erfindungsgemäße Verfahren bei Verwendung eines Gels in Form von Beads als Membran weder einen Waschschritt, noch einen Zentrifugationsschritt benötigt, sondern dass gerade derartige Schritte erfindungsgemäß vermieden werden.
Ein Waschschritt ist nach dem Stand der Technik beispielsweise nötig, um freie Antikörper, die während der Inkubation nicht mit Antigenen eine Bindung eingegangen sind, aus der Testsubstanz auszuwaschen.
Um einen Waschschritt auszuschließen werden Beads, vorzugsweise SEPHADEX-Beads, aufgeschwemmt mit Puffer, auch als Gel Beads oder auch als Gelverfahren bekannt, verwendet. Die Aufschwemmung befindet sich in den einzelne Behälter bildenden Kavitäten einer Mikrotiter-Platte (Mt-Platte).
Sephadex Beads sind sehr gut geeignet, um eine Aufreinigung, also eine
Trennung von Such-Erythrozyten und in der Testflüssigkeit enhaltenen ungebundenen Antikörpern und Antigenen durchzuführen.
Die Testflüssigkeit, die Such-Erythrozyten mit Serum und freie Antikörper enthält, schwimmt nach dem Transfer auf den Sephadex Beads. Damit die in der Testflüssigkeit enthaltene Such-Erythrozyten Aufschwemmung durch die Sephadex Beats kommt, ist nach dem Stand der Technik zwingend ein Zentrifugationsschritt vonnöten. Dabei erfolgt eine Aufreinigung der Such- Erythrozyten. Die Such-Erythrozyten werden dabei von der Aufschwemmung, welche freie Antikörper und Proteinanteile enthält, getrennt. Auf Grund der Zentrifugalkraft gehen die Such-Erythrozyten durch die Lücken der Beads, während die flüssigen Serum Anteile der Testflüssigkeit darauf liegen bleiben. Wenn die Such-Erythrozyten zusätzlich magnetisiert sind können sie mittels magnetischer Kraft angezogen werden. Da die magnetische Kraft und/oder die Gravitation zu gering ist, können diese Erythrozyten nach dem Stand der Technik nur durch niedrig viskose homogene Flüssigkeiten gezogen werden. Das bedeutet, die hervorragenden Aufreinigungseigenschaften der Sephadex Beats kann nicht genutzt werden. Die Such-Erythro- zyten bleiben oben auf den Sephadex Beats liegen, da Gravitations- und Magnetkräfte nicht ausreichen, diese durch alle Lücken zu ziehen. Somit müsste trotzdem ein Zentrifugationsschritt eingesetzt werden. Damit ist aber die äußerst aufwendige Magnetisierung der Such-Erythrozyten überflüssig.
Bei Benutzung von Beads müssen deshalb nach dem Stand der Technik teure, große und unhandliche Zentrifugen eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß wird diese Problematik umgangen, indem beispielsweise unter permanenter Magnetkraft und gleichzeitigem sanftem, vorsichtigem Schütteln kurzzeitig immer neue Lücken zwischen den Beads entstehen, durch die die Such-Erythrozyten zwischen den Beads hindurchschlüpfen können. Die nur geringe auf die Such-Erythrozyten einwirkende Erdgravitation wird durch das Schütteln überlagert. Das sanfte vorsichtige Schütteln ist so gestaltet, dass die Beads nur leicht verschoben werden. Dabei kommt es zu keiner Vermischung mit Serum und den darin vorkommenden Antikörpern. Das bedeutet das Serum schwimmt immer oben auf den Beads und kommt nicht mit dem Boden der mit der Nachweissubstanz in Form von Fangkörpern kodierten Fläche in Berührung. Somit werden nur die Such-Erythrozyten auf Grund der magnetischen Anziehungskraft mit Hilfe eines Permanentmagneten zwischen den Sephadex Beads hindurchgezogen. Bei diesem Hindurchschlüpfen durch die Sephadex Beads erfolgt somit gleichzeitig ein Aufreinigungsschritt.
Der Aufreinigungsschritt ist wesentlich, da somit auf einen nach dem Stand der Technik erforderlichen Waschschritt verzichtet werden kann. An der Bodenwandung der Mt-Platte haftet nur eine bestimmte Menge von die Nachweissubstanz bildenden Fangkörpern, die hier als Anti-IgG Fänger- Antikörper ausgebildet sind. Würde beim Hindurchtreten der Such-Erythrozyten durch die Sephadex Beads keine Aufreinigung erfolgen, würden die Fänger- Antikörper zum größten Teil von den freien im Serum befindlichen Antikörpern aufgebraucht werden. Die Menge der ungebundenen IgG-Antikörper in der Testflüssigkeit sind mengenmäßig deutlich größer, als die Menge der Such- Erythrozyten, beladenen mit spezifischen Antikörpern. Damit würde sich ohne den Aufreinigungsschritt kein Rasen, der eine positive Reaktion anzeigt, ausbilden.
Im Detail läuft ein Antikörper-Suchtest unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wie folgt ab:
A) In drei Kavitäten einer mit Anti-IgG Fangkörpern kodierte, bevorzugt als Rundbodenplatte ausgeführten Reaktionsplatte, die mehrere, jeweils einen U-för- migen Behälter bildende Kavitäten aufweist, werden 0,025 ml aufgeschwemmte Sephadex Beads eingefüllt. Anstelle der U-förmige Kavitäten aufweisenden Rundbodenplatte kann auch ein V-Boden verwendet werden.
B) Eine bei einem Volumen von 0,025 ml 0,6% spezifische Testzellen mit Testzellen 1 ,2,3 mit 0,025ml Patientenserum umfassende Testflüssigkeit kommt in drei Kavitäten einer Mischplatte. Diese werden unter starkem permanentem Mischen, was beispielsweise durch Schütteln erfolgen kann, 5 bis 15 Minuten bei 37°C inkubiert.
C) Anschließend wird das inkubierte Gemisch auf die Sephadex-Beads der Reaktionsplatte transferiert. Diese Platte kommt auf einen Permanentmagneten. Unter gleichmäßigem vorsichtigem Schütteln über ca. 2 bis 3 Minuten gehen die in der Testflüssigkeit enthaltenen Such-Erythrozyten durch die Beads. Eine negative Reaktion ist durch eine knopfförmige Sedimentation an der tiefsten Stelle der U-förmigen Kavität erkennbar, eine positive Reaktion durch eine Rasenbildung (Fangkörper sind zum Beispiel Anti-IgG und können unterschiedliche Antigene sein). Der Schritt B kann entfallen indem die Zellen 1 ,2,3 mit Serum gleich auf die befüllte Reaktionsplatte einpipettiert werden. Diese wird dann 15 Min bei 37° C ohne permanentes Mischen inkubiert. Anschließend kommt die Reaktionsplatte auf den Permanentmagneten. Unter gleichmäßigem vorsichtigen Schütteln über ca. 2 bis 3 Min gehen die Such-Erythrozyten durch die Beads. Auch hier ist eine negative Reaktion durch einen Knopf und eine positive Reaktion durch einen Rasen erkennbar (Fangkörper sind zum Beispiel Anti-IgG). Der sich hieraus ergebende Vorteil ist, dass der Schritt B einschließlich des Transfers von der Mischplatte auf die Reaktionsplatte entfallen kann.
Grundsätzlich sind drei verschiedene Ansätze denkbar, damit eine erfindungsgemäße, kurzzeitige Lückenbildung zwischen den Beads auftritt:
1. durch einen handelsüblichen Schüttler oder Rüttler 2. durch Ultraschall und
3. durch eine Magnetisierung der Beads.
In den Fällen 1. und 2. werden die Beads vorzugsweise größer als die Erythrozyten gewählt; im Fall 3. werden die Beads vorzugsweise kleiner als die Erythro- zyten gewählt. Im letzten Fall werden die Beads über ein wechselndes elektromagnetisches oder wechselndes permanentmagnetisches Feld in Bewegung gebracht. Da die, beispielsweise ebenfalls magnetisierten, Such-Erythrozyten größer und schwerer sind als die Beads, reagieren sie träger auf das wechselnde Magnetfeld, das die Beads in Schwingung versetzt. Oder es können unterschiedlich gerichtete Magnetfelder aufgebracht werden, so dass nur das auf die magnetisierten Such-Erythrozyten, zum Beispiel in senkrechter Richtung einwirkende Magnetfeld, welches durch einen unterhalb des Bodens des Behälters befindlichen Dauermagneten erzeugt wird, dieselben in Richtung zum Boden des Behälters beschleunigt. Das auf die magnetisierten Beads einwirkende wechselnde Magnetfeld bewegt diese, zum Beispiel nur horizontal, hin und her. Da die Such-Erythrozyten auf Grund ihrer größeren Oberfläche darüber hinaus zahlenmäßig mit mehr magnetischen Nanopartikeln besetzt sind, reagieren sie stärker auf das konstante, gerichtete Magnetfeld des Permanentmagneten, wodurch sie schneller sind in ihrer Bewegung in Richtung auf den Permanentmagneten zu, als in Richtung des wechselnden Magnetfeldes. Damit kommt es zu einer Trennung der magnetisierten Such-Erythrozyten gegenüber den magneti- sehen Beads. Die magnetisierten Such-Erythrozyten befinden sich anschließend näher am Permanentmagneten. Darüber hinaus wird ein weiterer Trennungseffekt erreicht, wonach sich die großen Partikel der Such-Erythrozyten am Behälterboden gegenüber den kleineren Partikeln separieren. Es hat sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, wenn die Schüttelbewegung in abrupten Umkehr- punkten endet, so dass in den Umkehrpunkten für eine sehr kurze Zeit eine hohe Beschleunigung vorhanden ist.
Prinzipiell können entweder die Beads oder das Gel, worunter die Membran im allgemeinen Sinn zu verstehen ist, mit Fangantikörpern und/oder mit Fanganti- genen zum Nachweis der gesuchten Antikörper und/oder der gesuchten Antigenen beschichtet oder durchmischt sein. Oder der U- oder V-förmige Boden des Behälters ist in bekannter Weise mit Fangantikörpern und/oder mit Fangantigenen beschichtet. Die spezifischen, bekannten Fangantikörper, nämlich Proteine als Antikörper, oder Antigene können somit entweder an der Gefäßwandung im unteren Bereich des Behälters oder auf den Beads selbst sich befinden (kodierte Beads) oder sie können lose zwischen den Beads angeordnet sein.
Wichtig ist hervorzuheben, dass es grundsätzlich denkbar ist, die oben genannten drei Methoden zu kombinieren.
Ein Beispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und anschließend beschrieben. In der Zeichnung ist ein Behälter 1 in drei zeitlich unterschiedlichen Phasen a), b) und c) gezeigt.
Für eine erste Anwendungsvariante sind die folgenden Bedingungen einzuhalten: Unter dem Behälter 1 ist drehbar ein Permanentmagnet 2 angeordnet, welcher gemäß dem Prinzip des Rührfischmagneten um eine seiner Achsen, Vorzugs- weise um diejenige mit dem größten Trägheitsmoment, zu rotieren imstande ist. Bei einer Mehrzahl von Behältern befindet sich unter jedem Behälter ein solcher Permanentmagnet. Der konkav gewölbte Boden 3 des Behälters 1 ist innen mit Fangantikörpern oder -antigenen beschichtet. Im Behälter 1 befinden sich als Membran oder als sogenannte graduelle Schicht Beads 4, welche in etwa die Größe von 1μm bis 2μm Durchmesser aufweisen und von festerem Zustand sind. Des Weiteren sind die Beads 4 mit einer ferromagnetischen Substanz magne- tisiert, z.B. an ihrer Oberfläche, die in etwa 25 μm2 beträgt. Somit sind die Beads entsprechend leicht. Des Weiteren haben die zum Einsatz in einer Testflüssigkeit 7 gelangenden Erythrozyten 5 meist die Form eines Diskus mit einem Durchmesser von etwa 7,5 bis 8,7 μm; die Oberfläche hat etwa die Fläche von 136μm2. Die Erythrozyten 5 sind ebenfalls auf der Oberfläche magnetisiert, vorzugsweise mit einer ferromagnetischen Substanz. Zum Beispiel werden zur Magnetisierung der Erythrozyten magnetische Nanopartikel von ca. 200nm der Firma. Ademtech eingesetzt. Die Erythrozyten weisen noch den Vorteil auf, dass diese flexibel sind und somit besser durch Lücken hindurchwandern können.
Mit der Bezugsziffer 6 ist in Figur 1a ein Ultraschallschwinger gekennzeichnet, welcher ebenfalls zum Aufbringen der zweiten Kraft F verwendet werden kann. In diesem Fall ist vorzugsweise der unter dem Boden des Behälters 1 befindliche Dauermagnet 2 in Figur 1 a als ortsfester Magnet mit einem permanenten Magnetfeld aufzufassen, welches als erste Kraft auf die mit einer ferromagnetischen Substanz beladenen Erythrozyten und/oder Beads einwirkt.
Nunmehr werden die mit einem Puffer aufgeschwemmten, vorbenannten Beads in Behälter gefüllt, zum Beispiel in diejenigen einer Rundboden-MT-Platte, welche im konkaven Bodenbereich mit Anti-IgG beschichtet ist. Darauf werden die in einer Testflüssigkeit 7 aufgeschwemmten Erythrozyten 5 gegeben, welche mit IgG-Antikörper beladen sind. Auf diese Weise werden alle Kavitäten beschickt.
Diese Rundboden-MT-Platte wird auf eine 96-Magnetplatte aufgesetzt, welche die Größe einer MT-Platte hat, so dass sich unter jeder Kavität am Boden ein Permanentmagnet mit Magnetausrichtung Südpol und Nordpol befindet. Die Magneten werden um ihre Achse mittels eines Motors gedreht, wodurch ein permanent-magnetisches Wechselfeld erzeugt wird. Ebenso ist aber gleichzeitig die permanente Anzugskraft von ferromagnetischen Materialien hin zum Magneten gegeben.
Durch das permanent-magnetisches Wechselfeld geraten die Beats in eine rotierende Schwingbewegung. Dabei entstehen größer und kleiner werdende Lücken zwischen den Beads, was man als Wellen unterschiedlicher Dichte inter- pretieren kann. Die schwereren und somit trägeren aber flexibleren Erythrozyten können dadurch die sich öffnenden, und schließenden, Lücken zwischen den Beads in Richtung des Magneten passieren. Die Flüssigkeit der Erythrozyten, innerhalb der dieselben auf die Beads aufgefüllt worden sind, bleibt als Schicht oben auf den Beads erhalten. Somit erhält man eine Trennung bzw. Aufreinigung der Erythrozyten. Sobald die Erythrozyten am Boden angekommen sind, bleiben sie bei einer positiven Reaktion an der Bodenwand hängen und bilden einen Rasen; oder die Erythrozyten sammeln sich bei negativer Reaktion in Form eines Knopfes in der Mitte des Bodens des Behälters.
Bei der Verwendung eines sich bewegenden Permanentmagneten zur Erzeugung eines permanent-magnetischen Wechselfeldes wird der Magnet in der Richtung gedreht, in der die größte wechselnde Feldänderung im Bereich des Bodens des Behälters bewirkt wird.
Für die Blutgruppenbestimmung kann die folgende Variante zur Erzielung einer Agglutination in der Membran durchgeführt werden.
A: In die Beads, welche eine graduelle Schicht darstellen und deren Größe zwischen 20μm bis 50μm beträgt, werden zu je 25μl freie IgM-Antikörper zum Nachweis der Blutgruppen eingemischt, nämlich zum Beispiel Beads mit Anti-A oder Anti-B oder Anti-D. Diese Mischung wird anschließend in eine Rundbodenplatte A1 , A2, A2 usw. einpipettiert. B: Darauf werden 25μl 0,6% magnetisierte aufgeschwemmte Erythrozyten von unbekannter Blutgruppe aufgegeben. Es erfolgt eine Inkubation von ca. 5 Minuten bis 10 Minuten.
Anschließend wird die vorbenannte Rundbodenplatte auf eine statische 96- Magnetenvorrichtung aufgestellt, so dass sich wiederum, wie oben beschrieben, sich unter jeder Kavität ein Dauermagnet befindet. Rundbodenplatte und Magnetenvorrichtung bilden eine statische Einheit. Diese statische Einheit wird nun mechanisch geschüttelt bzw. gerüttelt, zum Beispiel mittels einer Rüttelvorrichtung.
Bei einer negativen Reaktion wandern die magnetisierten Erythrozyten durch die sich öffnenden - und wieder schließenden und wieder öffnenden - Lücken zwischen den Beads, in denen sich freie Anti-A, IgM befinden, in Richtung zum Magneten und sammeln sich in der Mitte des Bodens in Form eines Knopfes an der tiefsten Stelle. Die Erythrozyten tragen nicht das spezifische Antigen A auf ihrer Oberfläche.
Eine positive Reaktion wird nachgewiesen, wenn sich auf den Oberflächen der Erythrozyten viel Antigen A befindet, so dass es mit den im Gel (Beads) befindlichen Anti-A IgM Antikörpern zu einer stabilen Vernetzung kommt. Diese bleiben dann aufgrund der Netzbildung auf dem Gel liegen. Bei einer geringeren Antigendichte werden sie in die Beads einwandern, aber eine räumliche Zusammenballung, nämlich Agglutination, bilden, die nicht mehr die Lücken zwischen den Beads passieren kann und somit stecken bleibt. Dies kann visuell als eine räumlich große Wolke in der Sicht von oben oder seitlich auf den Behälter erkannt werden. Die mit Antigen A beladenen Erythrozyten können nicht an die tiefste Stelle wandern.
Gewerbliche Anwendbarkeit:
Die Erfindung ist insbesondere im Bereich des Nachweises von Antikörpern und/oder Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung gewerblich anwendbar.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung in einer Testsubstanz, umfassend die Verfahrensschritte: - Auf- oder Einbringen einer Nachweissubstanz auf oder in einen vorzugsweise V- oder U-förmigen Bodenbereich eines Behälters,
Aufteilen des Behälters in mindestens zwei Bereiche durch Anordnen mindestens einer für bestimmte Bestandteile einer Testsubstanz durchlässigen Membran in dem Behälter, wobei ein erster Bereich zur Aufnahme der Test- Substanz vorgesehen ist, und ein zweiter Bereich die Nachweissubstanz enthält,
Einbringen der Testsubstanz in den hierfür vorgesehenen Bereich, sowie Aufbringen einer zumindest auf einzelne Bestandteile der Testsubstanz einwirkenden, ein Hindurchtreten von Bestandteilen der Testsubstanz durch die Membran beschleunigenden, im Wesentlichen in Richtung zur Membran hin gerichteten ersten Kraft, gekennzeichnet durch den Verfahrensschritt:
Aufbringen einer mindestens auf die Membran einwirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen, im Wesentlichen quer zu der ersten Kraft gerichteten zweiten Kraft.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die zeitlich veränderliche Kraft sowohl in ihrer Richtung, als auch in ihrem Betrag veränderlich ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zeitlich veränderliche, zweite Kraft auf den gesamten Behälter einschließlich der Membran einwirkt und in ihrer Stärke und zeitlichen Veränderung der Richtung so bemessen ist, dass beispielsweise ein für einen Nachweis erforderliches Sedimentationsbild hierdurch unbehelligt bleibt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran ein Gel in Form von feinen Kügelchen, so genannten Beads, als Gelschicht oder Beads aus Glas oder Acryl oder anderen Materialien umfasst.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel darüber hinaus einen Stoff umfasst, der in einem Ruhezustand der Membran einen minimalen Abstand zwischen den Beads sicherstellt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zeitlich veränderliche Kraft durch Schütteln oder Rütteln oder dergleichen aufgebracht wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zeitlich veränderliche Kraft durch Ultraschall aufgebracht wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zeitlich veränderliche Kraft durch ein zeitlich veränderliches Magnetfeld aufgebracht wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran und/ oder die Erythrozyten mit einem ferromag netischen Material dotiert ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Kraft eine magnetische Anziehungskraft umfasst.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Kraft die Schwerkraft umfasst.
12. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , gekennzeichnet durch
- einen mindestens einen mit einer Nachweissubstanz versehenen vorzugsweise V- oder U-förmigen Bodenbereich umfassenden Behälter, - mindestens eine den Behälter in mindestens zwei Bereiche unterteilende, für bestimmte Bestandteile oder Verbindungen einer Testsubstanz durchlässige, Membran, wobei ein erster Bereich zur Aufnahme einer Testsubstanz vorgesehen ist, und ein zweiter Bereich die Nachweissubstanz enthält,
- Mittel zum Aufbringen einer zumindest auf einzelne Bestandteile der Testflüssigkeit einwirkenden ersten, im Wesentlichen in Richtung zur Membran hin wirkenden externen Kraft sowie
- Mittel zum Aufbringen einer zumindest auf einzelne Teile oder Moleküle der Membran einwirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen, zweiten Kraft, mit Ausnahme einer Zentrifugalkraft.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran aus einem Gel in Form von feinen Kügelchen, so genannten Beads, besteht, wobei zum Nachweis der gesuchten Antikörper und/oder der gesuchten Antigenen entweder die Beads oder der V- oder U-förmige Bodenbereich des Behälters mit Fangantikörpern und/oder mit Fangantigenen beschichtet ist oder die Beads oder die Membran mit Fangantikörpern und/oder mit Fangantigenen durchmischt sind.
14. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum Aufbringen einer zumindest auf einzelne Teile oder Moleküle der Membran einwirkenden, zumindest in ihrer Richtung zeitlich veränderlichen, zweiten Kraft ein Schüttler oder Rüttler oder ein Ultraschallschwinger oder ein elektromagnetisches Wechselfeld oder ein wechselndes magnetisches Feld ist und die durchlässige Membran, vorzugsweise eine Schicht aus Beads, von der zweiten Kraft beaufschlagbar ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 oder 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Beads mit ferromagnetischen Partikeln beschichtet sind.
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