DE10239568A1

DE10239568A1 - Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in einer Testflüssigkeit sowie zur Blutgruppenbestimmung

Info

Publication number: DE10239568A1
Application number: DE2002139568
Authority: DE
Inventors: Jörg Spindler
Original assignee: Deutsches Rotes Kreuz Blutspendendienst Baden-Wurt Gemeinnu GmbH
Current assignee: Deutsches Rotes Kreuz Blutspendendienst Baden-Wurt Gemeinnu GmbH
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2004-03-04
Also published as: EP1532454A2; WO2004019038A2; CA2495728C; AU2003260413A1; CA2495728A1; WO2004019038A3; AU2003260413A8

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen, wie zur Blutgruppenbestimmung, Antikörper-Suchtest, Serumgegenprobe sowie zur Infektionsserologie, in einer Testflüssigkeit durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei die Antigene bzw. die Antikörper oder die spezifischen Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger gebunden sind und das dergestalt hergestellte Probengemisch einem Inkubationsschritt ausgesetzt wird, wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw. den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist. Eine vorbestimmte Menge des inkubierten Probengemisches wird auf eine vorbestimmte Menge eines Gemisches eines Puffers, Einbettpuffer, mit Partikeln, Puffer-Partikel-Gemisch, abgekürzt PP-Gemisch, welches sich innerhalb eines Nachweisgefäßes befindet, zugegeben, wobei der Einbettpuffer die Eigenschaft aufweist, den Abstand zwischen den einzelnen Partikeln innerhalb des PP-Gemisches zu minimieren und anschließend das Nachweisgefäß einer Zentrifugation unterworfen wird zur Sichtbarmachung der Reaktion des Probengemisches im Nachweisgefäß, wobei das PP-Gemisch die Positivreaktion fördert.

Description

Technisches Gebiet:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen, wie zur Blutgruppenbestimmung, Antikörper-Suchtest, Serumgegenprobe sowie zur Infektionsserologie, in einer Testflüssigkeit durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei die Antigene bzw. die Antikörper oder die spezifischen Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger gebunden sind und das dergestalt hergestellte Probengemisch einem Inkubationsschritt ausgesetzt wird, wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw. den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Stand der Technik:
Menschliche Blutgruppensubstanzen, aber auch eine Vielzahl von anderen in einem Organismus gebildeten Substanzen, werden durch spezifische Antigen-Antikörper-Reaktionen nachgewiesen. Diese Reaktion ist detektierbar über eine Vernetzung, d.i. Agglutination, von Antigenen (Ag), Antikörpern (Ak) und bestimmten Trägersubstanzen, die Antigene oder Antikörper tragen, zu einem makroskopisch erfaßbaren optisch nachweisbaren Komplex, dem Agglutinat.
Beispiele sind die erythrozytenseitige Blutgruppenbestimmung sowie die Serumgegenprobe. Bei der erstgenannten werden an die Membran des Spendererythrozyten gebundene Blutgruppen-Antigene durch Reaktion mit Antiseren nachgewiesen, die Antikörper als spezifische Bindungspartner enthalten. Die Antikörper sind bekannt (Such-Antikörper), die sich in einer Testflüssigkeit befinden, zum Beispiel Testantikörper-Aufschwemmung, und die unbekannte Erythrozyten (unbekannte Antigene) enthält. Die Agglutination wird durch Reaktion von Antigen und Antikörper hervorgerufen. Damit kann das System ABO und RH und darüber hinaus noch eine Vielzahl von Antigenen bestimmt werden. Bei der Serumgegenprobe sind die Erythrozyten bekannt, die bekannte Antigene (Such-Antigene) aufweisen. Die Testflüssigkeit, zum Beispiel Serum, beinhaltet die unbekannten körpereigenen Antikörper (sog. Isoagglutinine), welche durch Reaktion mit den Test-Erythrozyten nachgewiesen werden. Damit kann ebenfalls die Blutgruppe, jedoch nur ABO, bestimmt werden, Biotest, Lexikon der Immunologie, 2. Aufl., Medical Service München, Seite 36, 37.
Diese Technik arbeitet mit nativen Mikrotiterplatten mit Rundboden, wobei in die Vertiefungen der Platte eine Serie von verschiedenen Antiseren, insbesondere Anti-A, Anti-B, Anti-D und Rhesuskontrollserum, zur Bestimmung der Blutgruppe im ABO-System, einpipettiert und mit den zu testenden Erythrozyten in verdünnter Form versetzt wird. Nach einer Inkubationszeit von wenigstens 20 Minuten wird die Platte anzentrifugiert und vorsichtig aufgeschüttelt. Die Gesamtbearbeitungszeit beträgt cirka 40 Minuten. Eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion ist als Agglutinat sichtbar, eine negative Reaktion ist als eine aufgeschwemmte Erythrozytensuspension gegeben. Die Serumgegenprobe arbeitet in ähnlicher Weise.
Das Verfahren ist nur aufwendig automatisierbar und liefert oft keine Eindeutigkeit. Die Zuverlässigkeit der Detektion einer positiven Reaktion hängt von der Stärke der Antikörper-Antigen-Bindung ab: bei schwachen Bindungen können die agglutinierten Erythrozyten durch äußere Störungen, insbesondere durch das Aufschütteln, wieder getrennt und somit fälschlich als negative Reaktion diagnostiziert werden. Aus diesem Grunde ist wegen des eventuell fehlenden klaren Reaktionsbildes die automatische Unterscheidung zwischen positiver und negativer Reaktion, z.B. mittels automatischer photometrischer Auswertung, praktisch nicht möglich, sondern muß von einer erfahrenen Bedienperson vorgenommen oder zumindest visuell überprüft werden und ist deshalb sehr zeitaufwendig.
Durch die EP 0363510 A ist die sog. Solid-Phase-Technik zum Auffinden von irregulären Antikörpern bekannt geworden, welche auf kodierter Mikrotiterplattform ohne Gel basiert. Diese benötigt mehrfache aufwendige Wasch- und Zentrifugierschritte. Die Gesamtabarbeitungszeit, Inkubation 20 Min, Zentrifugation, Waschschritte, beträgt cirka 40 Min. Die positiven Ergebnisse sind als Monolayer (Rasen), die negativen Ergebnisse als Knopf am Plattenboden zu sehen. Bedingt durch diese Schritte sowie die lange Dauer ist eine Flexibilität der Abarbeitung der Proben und somit Automatisation schlecht gegeben. Außerdem kann mit dieser Technik nur bedingt und mit großem Aufwand die AB0-Rh und Serumgegenprobe abgearbeitet werden.
Aus der EP 0305337 A1 ist zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern ein Verfahren zur optischen Sichtbarmachung von Komplexen von trägergebundenen Antigenen mit Antikörpern in Reaktionsgefäßen bekannt geworden, welche ID-Gel-Technik genannt wird. Diese benützt sechs parallele, mit Gel-Beads gefüllte Säulen in Form einer Karte. Im oberen Bereich oberhalb der Säule befindet sich ein zur Aufnahme der Probe dienendes, größeres Behältnis. Zwischen der unteren, mit Gel gefüllten Säule und dem oberen Behältnis muß bei Befüllung mit der Probe ein Luftpolster verbleiben; es erfolgt eine Ruhe-Inkubationsphase von 15 Min bei 37 Grad C; die anschließende Zentrifugationszeit der Karte beträgt 10 Minuten bei 85xg. Das Ergebnis wird durch eine seitliche Betrachtung der Säule abgelesen. Bei positiver Reaktion befinden sich die Agglutinate auf dem Gel der Säule oder im Gel der Säule flockig verteilt. Bei einer negativen Reaktion befinden sich die Erythrozyten in kompakter Form am Boden der Säule. Eine Verkürzung der Inkubationszeit ist nicht möglich, weil die Proben nicht mechanisch bewegt werden dürfen, weil sonst die Probe während der Inkubationsphase direkt mit dem Gel in Kontakt käme und dadurch eine falsch-negative Reaktion angezeigt würde. Auch kann die g-Zahl nicht erhöht und damit die Zentrifugationszeit nicht erniedrigt werden, weil sonst ebenfalls eine falsch-negative Reaktion angezeigt würde. Ebenso sind für die Serumgegenprobe und AB0-RH System gesonderte Karten notwendig, wie für die Unterscheidung von zum Beispiel IgG und IgM gesonderte Säulen einer Karte notwendig sind. Bedingt durch die noch immer lange Inkubations- und Zentrifugationszeit und der Kartenform sowie gesonderter Säulen für die einzelnen Bestimmungen ist diese Technik für eine Vollautomation nicht gut geeignet. Auch ist die Versendung der Karten zu den Kunden problematisch, da das Gel bei einem Aufdemkopfstehen der Säulen aus denselben herauslaufen kann. Zu erwähnen ist noch, dass eine Pipettierung des Gels aufgrund der hohen Viskosität und deren Verklebung nachträglich in die Säule problematisch ist.
Der EP 0849595 B1 , welche auf der EP 0305337 A1 aufbaut, ist zu entnehmen, dass (Zitat)"kommerziell erhältliche Standartpartikel mit einem Durchmesser von 3–7,5 μm nur unvollständig in die Gelmatrix sedimentieren, während größere, 11,9 μm, bzw. kleinere synthetische Partikel < 1 μm nur schwach in das Gel eindringen konnten. Eine Erhöhung der Parameter Zentrifugationsdauer, von 10 Min bis auf 50 Min bzw. Zentrifugationsgeschwindigkeit von 1030 bis 1300 rpm brachte zwar eine bessere, aber immer noch keine vollständige Sedimentation. Selbst wenn durch diese beiden Maßnahmen eine optimale Sedimentation hätte erreicht werden können, so ist doch eine Veränderung/Erhöhung der Zentrifugationsdauer und -geschwindigkeit aus folgenden gründen sehr nachteilig: 1. Das Verfahren der EP 0849595 B1 soll ein im Vergleich zu vergleichbaren Methoden besonders zeitunaufwendiges Verfahren erlauben. Bei einer möglichen Zentrifugationsdauer von 50 Min würde sich die angestrebte Testdauer von 20 Minuten inklusive Inkubation damit verdreifachen. 2. Wie dem Fachmann bekannt ist, verringert sich die Sensitivität in Gel-Zentrifugationsverfahren mit steigender Zentrifugationsgeschwindigkeit" (Zitat Ende). Zum Nachweis der Reaktion wird eine 10 minütige Zentrifugation bei 85 g angewandt.
Der Zweck der Erfindung liegt darin, eine neue Methode für die AB0- sowie RH-Bestimmung, für die Serumgegenprobe sowie für den Antikörpersuchtest anzugeben, welche den modernen Anforderungen des Marktes entspricht, nämlich eine flexible und schnelle automatische Abarbeitung der Proben über einen Vollautomaten mit Notfalleingabe für Patienten und Spender anzugeben. Dazu muß die Abarbeitungszeit möglichst kurz sein, was bedeutet, dass die Inkubationszeit höchsten 5 bis 7 Minuten möglichst separat in einer Platte und die Zentrifugationszeit 2 bis 4 Minuten ebenso separat in einer Reaktionsplatte betragen darf, welche noch die Anforderung erfüllen müssen, dass diese individuell beschickt werden können. Ebenso dürfen keine Waschschritte vorhanden sein. Um Notfallpatienten vorziehen zu können, muß bei einer Notfalleingabe zusätzlich gewährleistet sein, dass die inkubierenden Patientenseren oder -plasmen, welche keine Priorität besitzen, auch längere Zeit ohne negative Beeinflussung der Ergebnisse, bis zirka 40 Minuten, inkubieren können, so dass ein Notfallpatient zwischendurch schnell abgearbeitet werden kann; anschließend wird die normale Routine wieder abgearbeitet. Ebenso muß die Abarbeitung der Proben mit möglichst gleichen Basisreagenzien durchgeführt werden können wie auch die einfache Versandfähigkeit der Reagenzien gewährleistet sein muß.
Technische Aufgabe:
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Vermeidung der Nachteile des Standes der Technik ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen, wie zur Blutgruppenbestimmung, Antikörper-Suchtest, Serumgegenprobe sowie zur Infektionsserologie, mit hoher Empfindlichkeit anzugeben, das in einfacher Weise durchführbar ist und zu einem hohen Grad an Automatisierung geführt werden kann, und das insbesondere in sehr kurzer Reaktionszeit zu höchst zuverlässigen Testergebnissen der Proben führen soll; es soll eine automatische Abarbeitung der Proben mittels eines Automaten möglich sein. Ebenso sollen Notfalleingaben von Untersuchungsproben von Notfallpatienten möglich sein, ohne dass dadurch eine Beeinträchtigung der übrigen Proben erfolgt.
Offenbarung der Erfindung sowie deren Vorteile:
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren der eingangs genannten Gattung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine vorbestimmte Menge des inkubierten Probengemisches auf eine vorbestimmte Menge eines Gemisches eines Puffers, Einbettpuffer, mit Partikeln, Puffer-Partikel-Gemisch, abgekürzt PP-Gemisch genannt, welches sich innerhalb eines Nachweisgefäßes befindet, zugegeben wird, wobei der Einbettpuffer die Eigenschaft aufweist, den Abstand zwischen den einzelnen Partikeln innerhalb des PP-Gemisches zu minimieren und anschließend das Nachweisgefäß einer Zentrifugation unterworfen wird zur Sichtbarmachung der Reaktion des Probengemisches im Nachweisgefäß, wobei das PP-Gemisch die Positivreaktion fördert.
In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung des Verfahrens besteht der Einbettpuffer aus einer wässrigen Lösung aus Dextran [(C₆H₁₀O₅)_n] und/oder Polyethylenglycol [HO(C₂H₄O)_nH], wobei vorteilhaft zur Herstellung sämtlicher wässrigen Lösungen Laborwasser (Aqua bidest) verwendet wird. In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung des Verfahrens wird der wässrigen Lösung aus Dextran [(C₆H₁₀O₅)_n] und/oder Polyethylenglycol [HO(C₂H₄O)_nH] Glycocoll (H₂NCH₂COOH) (Glycin) und/oder Trisodiumcitrat (C₆H₅O₇Na₃) zugegeben.
In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens wird der vorgenannten Lösung oder den vorgenannten Lösungen zur Haltbarmachung ein antibakterielles und/oder antivirales Mittel, wie Natriumazid (NaN₃) oder Antibiotika, zugesetzt. Dadurch ist der Einbettpuffer lange haltbar und stabil, zum Beispiel 1 Jahr. Der Puffer ist bei Zimmertemperatur lagerfähig, vorzugsweise sollte er für längere Lagerzeiten bei Kühlschranktemperaturen gelagert werden.
Der Einbettpuffer besitzt den Vorteil, dass bei der Verwendung von Dextran die kolloidale Lösung des Dextrans die Zwischenräume zwischen den Partikeln nach der Herstellung des Puffer-Partikel-Gemisches, PP-Gemisch, verkleinert. Diese Tatsache rührt offensichtlich von den Ketten des Dextrans her. Dadurch ist es möglich, beim Zentrifugierschritt mit einer viel höheren Gravitation (g) zu arbeiten. Und zwar kann der Zentrifugierschritt bei einer Beschleunigung von cirka 80xg bis 20.000xg während einer Zentrifugierzeit von 0,1 Minuten bis < 10 Minuten, bevorzugt 1.000xg bis 4.000xg während einer bevorzugten Zentrifugierzeit zwischen 1 Minute bis 5 Minuten, insbesondere 1.900 bis 2.600xg bei 2 Minuten, durchgeführt werden.
Aufgrund der Tatsache, dass das PP-Gemisch die Sichtbarmachung der Positivrekation fördert und stabilisiert, richtet sich die Zentrifugationszeit und die Gravitation im Wesentlichen nur danach, nach welcher Zeit und bei welcher Gravitation, g-Zahl, eine negative Reaktion eindeutig nachzuweisen ist. Das bedeutet, dass in diesem Fall die g-Zahl erhöht werden kann, um die Zentrifugationszeit weiter herabzusetzen. Das ist beim Stand der Technik nicht möglich, weil zum Beispiel bei der ID-Gel-Technik ein enges Fenster an g-Zahl, 85xg, und Zentrifugationszeit, 10 Min., zwingend notwendig ist.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass das PP-Gemisch die Positivreaktion bzw. die Sichtbarmachung der Monolayerschicht entscheidend fördert. Denn die mit IgG beladenen Erythrozyten werden unter hohem Druck bei Verwendung von kodierten Gefäßen an die mit Anti-IgG kodierte Wandung gedrückt und festgehalten. Bedingt durch das PP-Gemisch bzw. den Einbettpuffer sind die räumlichen Abstände der beteiligten Reaktionspartner bzw. Partikel sehr gering, weshalb die hohe g-Zahl benötigt wird, wodurch aber auch die Zentrifugierzeit herabgesetzt wird. Selbst bei einer g-Zahl von 2500 und einer Zentrifugierzeit von > 10 Minuten blieb die Positivreaktion des Monolayers stabil erhalten. Das heißt, bedingt durch das PP-Gemisch bzw. den Einbettpuffer, bleiben über einen großen Gravitationsbereich, xg, die Ergebnisse praktisch unverändert.
Des Weiteren besitzt der Einbettpuffer den Vorteil, die Bindung zwischen Anti-IgG und IgG-Ery-Komplex zu fördern und zu stabilisieren, nämlich die Bindung zwischen Fab/Fc-Teil der Antikörper. Somit entsteht positiv ein ausgeprägter Rasen: Plastikwandung/Anti-IgG/IgG-Ery-Komplex. Das PP-Gemisch hat des Weiteren den Vorteil, dass diese Monolayerschicht stabil bleibt und festgehalten wird. Das bedeutet des Weiteren, dass eine erhöhte Empfindlichkeit für den Nachweis von Antikörpern gegeben ist.
Zum Beispiel hat die marktführende Standardmethode, die ID-Gel-Technik, als Referenzmethode beim Nachweis von irregulären Antikörpern, welche bekannt sind, von 95 Patientenseren im Vergleich zum erfindungsgemäßen Verfahren eine Sensitivität 87,2% gegenüber von 98% bei der Erfindung. Die Spezifität von 104 negativen Patienten entsprach bei der ID-Gel-Technik 97%, beim Gegenstand der Erfindung 93%. Das ist deshalb plausibel, weil, je sensitiver ein Test ist, umso geringer ist dessen Spezifität. Selbstverständlich ist es möglich, durch Feineinstellung die Balance zwischen Sensitivität und Spezifität optimal bzw. im gewünschten Maß einzustellen, wie durch Feineinstellung des Dextrans durch Konzentrationsänderung oder durch dosierte Zugabe von Albumin, vorzugsweise RS.
Im Folgenden ist ein Testergebnis einer Refenzmethode des Standes der Technik gegenüber der Erfindung wiedergegeben:
Die Titer der Spalte 3 beruhen auf einer Inkubationszeit von 5 Min und einer Zentrifugationszeit von 2 Min bei 2054 g; das PP-Gemisch ist durch die Zufügung von Albumin fein eingestellt. Die Titer der Spalte 3 beruhen auf einer Inkubationszeit von 15 Min und einer Zentrifugationszeit von 4 Min bei 2054 g; das PP-Gemisch lag in der erfindungsgemäßen Grundeinstellung mit Dextran ohne Albumin vor.
Als Ergebnis aus diesen Tests ist hinsichtlich der Erfindung zu entnehmen, dass, entgegen dem Stand der Technik in der EP 0849595 B1 , sich bei der Erfindung die Sensitivität mit steigender Zentrifugationsgeschwindigkeit bzw. größer werdendem g und somit verkürzter Zentrifugationszeit nicht verringert. Ebenso liegt auch bei abgekürzter Inkubationszeit die Sensitivität immer noch wesentlich über derjenigen der Referenzmethode. Bei der Benutzung einer Zentrifugation von 2.500xg bei 2 Min Zentrifugationszeit sind die Ergebnisse völlig vergleichbar.
Aufgrund der durch den Einbettpuffer bedingten sehr geringen Abstände der Partikel voneinander sind beim Nachweis von irregulären IgM-Antikörpern keine Zusätze von Anti-IgM jeglicher Art notwendig, so dass weder eine Kodierung der Gefäßwandung, noch eine solche der Partikel, Beads, oder als Einmischung mit Anti-IgM erforderlich ist; die räumliche Struktur von Ery/IgM/Ery-Komplex ist zu groß, so dass der Komplex bei der Zentrifugation entweder auf dem PP-Gemisch verbleibt oder im PP-Gemisch stecken bleibt.
Gleiches gilt, wenn keine kodierten Gefäße verwendet werden, sondern entweder die Partikel, Beads, kodiert sind oder die Fänger-Antikörper direkt dem PP-Gemisch zugegeben werden.
In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens wird ein PP-Gemisch verwendet, welches eine derart geringe Viskosität aufweist, dass das PP-Gemisch in flüssiger oder pastöser Form vorliegt, welche gegenüber dem Stand der Technik die Pipettierung des PP-Gemisches mittels Stepper oder Pipette in das Nachweisgefäß gestattet.
In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens werden als Partikel innerhalb des Puffer-Partikel-Gemisches Beads verwendet. Vorzugsweise werden als Beads Acryl, Gelatine, Polyacrylamide, Solid nets, Silica, Ficoll, Percoll, Phtalate-Ester, Agarose oder Dextran-Gel verwendet. Die Partikel, vorzugsweise die Beads, weisen einen Durchmesser zwischen 1 μm bis 300 μm, vorzugsweise einen Beads-Trockendurchmesser zwischen 1 μm bis 300 μm, auf. In einer bevorzugten Ausgestaltung hat sich die Verwendung des Dextran-Gels SEPHADEX G-50 superfine, insbesondere zwischen 20 μm bis 50 μm zur Herstellung des PP-Gemisches als vorteilhaft erwiesen. Auch SEPHADEX-Beads zwischen 20 μm bis 300 μm sind geeignet und können verwendet werden. Es hat sich gezeigt, dass Beads, welche eine Fraktionierung des Dextrans vornehmen können, am besten geeignet sind.
Ein SEPHADEX G-50, nämlich SEPHADEX G-50-50 superfine, besitzt einen Fraktionsrange von Dextran zwischen 500 und 10.000 MWt, und Globularproteine von 1.500 bis 30.000 MWt. Zum Aufschwemmen (Swelling) der Beads wird bei SEPHADEX G-50-50 superfine 9–11 mLiter/Gramm Beads Flüssigkeit benötigt. Je weniger Flüssigkeit zum Aufschwemmen der Beads benötigt wird, um so größer wird die benötigte Grundzentrifugation. Zum Beispiel wird bei der Verwendung von SEPHADEX G-25-50 superfine mit Globular-Protein 1.000–5.000 MWt, Dextrans: 100 bis 5.000 MWt sowie zum Aufschwemmen der Beads 4–6mL/-Gramm Beads, eine höhere Gravitation bei gleichbleibender Zentrifugationszeit, zum Beispiel 2 Minuten, benötigt, wobei die Beadsgröße unverändert ist, nämlich 20 μm bis 50 μm beträgt. Mitentscheidend ist somit die Swellingzahl der Beads, die Fraktionsrange der Proteine und Dextrans (angegeben in Molgewicht MWt). Wenn die Swellingzahl sowie die Fraktionsrange größer gewählt werden, zum Beispiel Dextran-Gel SEPHADEX G-100-50 superfine gewählt wird, wird bei gewünschter gleichbleibender Zentrifugationszeit eine geringere Gravitation benötigt. Das bedeutet, dass bei geringer werdendem Fraktionsrange des Dextrans oder der Globularproteine die g-Zahl der Zentrifugation bei gleichbleibender Zentrifugationszeit erhöht wird und umgekehrt.
In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen, wie zur Blutgruppenbestimmung, Antikörper-Suchtest, Serumgegenprobe sowie zur Infektionsserologie, in einer Testflüssigkeit durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei die Antigene bzw. die Antikörper oder die spezifischen Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger gebunden sind und das dergestalt hergestellte Probengemisch einem Inkubationsschritt ausgesetzt wird, wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw. den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, besteht dasselbe darin, dass eine vorbestimmte Menge des inkubierten Probengemisches auf eine vorbestimmte Menge eines Gemisches eines Puffers, Einbettpuffer, mit Partikeln, Puffer-Partikel-Gemisch, abgekürzt PP-Gemisch, welches sich innerhalb eines Nachweisgefäßes befindet, zugegeben wird, wobei der Einbettpuffer die Eigenschaft aufweist, den Abstand zwischen den einzelnen Partikeln innerhalb des PP-Gemisches zu minimieren und anschließend das Nachweisgefäß einer Zentrifugation unterworfen wird zur Sichtbarmachung der Reaktion des Probengemisches im Nachweisgefäß, wobei das PP-Gemisch die Positivreaktion fördert, wobei der Einbettpuffer aus einer wässrigen Lösung aus Dextran [(C₆H₁₀O₅)_n] und/oder Polyethylenglycol [HO(C₂H₄O)_nH] hergestellt ist, welchem Einbettpuffer Glycocoll (H₂NCH₂COOH) (Glycin) und/oder Trisodiumcitrat (C₆H₅O₇Na₃) zugegeben werden kann, wobei als Partikel in den Einbettpuffer Beads gegeben werden, welche Dextran-Gel SEPHADEX G-50 superfine mit einem Trockendurchmesser von 20 μm bis 50 μm sind, wobei anschließend zur Sichtbarmachung einer Reaktion der Zentrifugierschritt bei einer Beschleunigung von 1900 bis 2.600xg bei zirka 2 Minuten Zentrifugierzeit durchgeführt wird.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird das Probengemisch einem Inkubationsschritt unterworfen, welcher bevorzugt in einem Inkubator durchgeführt wird und zwischen 1 Minute bis 40 Minuten dauert, wobei während der Inkubation eine Zwangsdurchmischung der Testflüssigkeit erfolgt. Eine permanente Zwangsdurchmischung ist in der Immunhämatologie nicht Stand der Technik. Diese Zwangsdurchmischung wird bevorzugt durch Schütteln oder Rühren der Testflüssigkeit erzielt. Die Zwangsdurchmischung verkürzt die Inkubationszeit und beschleunigt dadurch die Reaktionszeit der Antigen-Antikörperreaktion wie auch die Zwangsdurchmischung die Empfindlichkeit des Verfahrens erhöht. Beim Antikörpersuchtest hat sich vorzugsweise eine Inkubationszeit von 5 bis 7 Min, bei der Blutgruppenbestimmung eine solche von 1 bis 5 Min und bei der Serumgegenprobe eine solche von 2 bis 3 Min als vorteilhaft erwiesen. Damit bietet sich eine Standardisierungszeit von 5 Min an, so dass Blutgruppenbestimmung, Antikörpersuchtest und Serumgegenprobe mit demselben PP-Gemisch und ein und derselben Gravitationszahl sowie gleicher Zentrifugationszeit wie auch mit ein und demselben Gefäß, zum Beispiel Mikrotiterplatten, durchgeführt werden können.
Zur Durchführung des Inkubationsschrittes sowie der Zwangsdurchmischung kann dem Probengemisch bzw. den Erythrozyten Liss und/oder modifiziertes Liss zugesetzt werden. Hierbei kann Liss ohne oder modifiziert mit Rinderalbumin verwendet werden. Es wird folgendes Lis auf der Basis von Laborwasser verwendet:
Natriumclorid, bevorzugt 1,788 g/Liter
Dinatriumhydrogenphosphat Na₂HPO₄, bevorzugt 0,204 g/Liter
Kaliumdihydrogenphosphat KH₂PO₄, bevorzugt 0,233 g/Liter
Glycin H₂NCH₂COOH bevorzugt 18 g/Liter
Thymerosal C₉H₂HGO₂SNA bevorzugt 0,20 g/Liter (Konservierungsmittel) ergibt Liss mit 0,03 Mol bei einem ph-Wert von zirka 6,7.
Von diesem Liss-Puffer werden zum Beispiel 4 mLiter plus 0,5 mLiter Laborwasser plus 0,5 mLiter 22%-tiges Rinderalbumin genommen und ergeben modifiziertes Liss.
In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahren wird zur Feineinstellung der Reaktion dem PP-Gemisch Albumin, wie BS-Serum, zugegeben wie auch gleichzeitig oder unabhängig davon die Dextrankonzentration entsprechend angepaßt werden kann. In der vorangegangenen Tabelle ist zum Beispiel in Spalte 3 eine Feineinstellung des PP-Gemisches über Rinderalbumin erfolgt.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung werden bei der Anwendung derselben auf die Infektionsserologie statt Erythrozyten als vorgegebene spezifische Bindungspartner mit Proteinen kodierte, eingefärbte Beads verwendet, welche ungefähr das spezifische Gewicht der Erys aufweisen. Hierzu werden vorteilhaft Standardpartikel – auch im Gegensatz zum Stand der Technik der EP 0849595 B1 – mit einem Durchmesser von 3 μm bis 7,5 μm benutzt, welche in vorteilhafter Weise eingefärbt worden sind. Anschließend wird dieses Reaktionsgemisch, welches den zu bestimmenden Analyten enthält, zur Sichtbarmachung der Reaktion auf das PP-Gemisch gegeben.
In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahren wird das Probengemisch in einem gesonderten Reaktionsgefäß zur Reaktion gebracht und anschließend das Probengemisch auf das PP-Gemisch innerhalb des Nachweisgefäßes aufgebracht. Aufgrund der Verwendung von zwei Gefäßen, nämlich Reaktionsgefäß und Nachweisgefäß, ist eine größere Flexibilität des Verfahrens gegeben, außerdem kann die permanente Zwangsbewegung des Probengemisches durchgeführt werden. Diese Ausgestaltung ist besonders für eine automatische Abarbeitung von Proben geeignet, weil, während die erste Platte inkubiert, bei einem Notfall in diese Platte eine individuelle Nachbeschickung erfolgen kann, welche Probe anschließend nach der kurzen Inkubationszeit von 5 Minuten in der zweiten Platte oder einem Streifen für den Zentrifugenschritt weiter bearbeitet werden kann, hingegen die auf die übrigen Proben der ersten Platte einwirkende verlängerte Inkubationszeit keine negativen Auswirkungen auf die nachfolgenden Ergebnisse hat.
Selbstverständlich ist es ebenso möglich, bei der Verwendung von kodierten Gefäßen das Probengemisch vor der Inkubation direkt auf das im Gefäß befindliche PP-Gemisch zu geben; hierbei findet eine Zwangsbewegung des Probengemisches nicht statt. Die für die Durchführung des Verfahrens verwendeten Nachweisgefäße zur Aufnahme des PP-Gemisches können sowohl Rundboden- oder Spitzboden- oder Flachbodengefäße als auch Säulen sein.
In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens wird ein hochmolekulares Dextran verwendet. Das Dextran weist ein Molgewicht ungefähr von 100 bis 40.000.000 g/Mol, vorzugsweise von 2.000.000 (2μ10⁶) g/Mol, auf und liegt in einem Bereich zwischen 0,1Gramm/Liter bis 500 Gramm/Liter, vorzugsweise 5Gramm/Liter bis 40Gramm/Liter, insbesondere von 20Gramm/Liter, im Einbettpuffer vor.
In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens weist das Polyethylenglycol ein Molgewicht ungefähr von 50 bis 40.000 g/Mol, vorzugsweise 3500–4500 g/Mol, auf und liegt in einem Bereich zwischen 1Gramm/Liter bis 100Gramm/Liter, bevorzugt zwischen 10Gramm/Liter bis 70Gramm/Liter, insbesondere 40 g/L, im Einbettpuffer vor.
In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens liegt das Glycocoll (Glyzin) in einem Bereich zwischen 1g/Liter bis 100g/Liter, bevorzugt l0Gramm/Liter bis 25Gramm/Liter, insbesondere 18,0168 Gramm/Liter, im Einbettpuffer vor.
In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens liegt das Trisodiumcitrat (C₆H₅O₇Na₃) in einem Bereich zwischen 0,01Gramm/ Liter bis 10Gramm/Liter, bevorzugt 1Gramm/Liter bis 5Gramm/Liter, insbesondere 2,581 g/L, im Einbettpuffer vor.
In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens kann sich, in allen Varianten, der Einbettpuffer in einem ph-Bereich von 4 bis 9, bevorzugt von 6,9 bis 7,1, befinden.
In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens wird zur Haltbarmachung dem PP-Gemisch Natriumazid (NaN₃) zugefügt, welches in einem Bereich zwischen 0,01g/-Liter bis l0Gramm/Liter, bevorzugt zwischen 0,5Gramm/Liter bis 2Gramm/-Liter, insbesondere 1 g/L, vorliegt.
Für den Antikörpersuchtest mittels des PP-Gemisches hat sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Innenwandungen der Nachweisgefäße mit Proteinen kodiert sind, insbesondere mit Anti-IgG, Anti-IgA, Anti-IgM, Protein A, Protein G und/oder mit einer Mischung derselben. Der in bekannter Weise bei positiver Reaktion entstehende Rasen ist erfindungsgemäß äußerst stabil, die Reaktion ist äußerst sensitiv. Außerdem hat sich gezeigt, dass derartig präparierte Platten vakuumverpackt oder unter Schutzgas verpackt in einfachster Weise zu versenden und im Kühlschrank lange Zeit zu lagern sind.
In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Fangproteine, zum Beispiel Anti-IgG, stabilisiert werden. Zur Stabilisierung der an den Innenwandungen der Nachweisgefäße befindlichen Proteine werden Stabilisierungssubstanzen verwendet, wie Triton X-100 oder Albumin oder Casein oder Gelatine oder Tween 20 oder Mischungen derselben innerhalb eines Puffers. Diese bekannten Puffer mit den genannten Substanzen, welche in der ELISA-Technik zum Blocken von unspezifischen Reaktionen (falsch positiv oder erhöhter Background) verwendet werden, dienen hier zur mechanischen Stabilisierung der Proteine und somit zur Sichtbarmachung der positiven Reaktion. Eine Erklärung ist, dass die Stabilisierungssubstanzen die Fangproteine einhüllend umgeben, so dass die Fangproteine bei der hohen Zentrifugationszahl mechanisch nicht weggebogen oder verschoben werden können. Diese Stabiliierung kann entweder sofort nach der Kodierung oder erst vor der Verwendung der kodierten Gefäße durchgeführt werden. Hierzu hat sich gezeigt, dass, wenn keine Stabilisierung der Fangproteine stattfindet, bei Durchführung des Verfahrens keine vernünftig positive Reaktion nachzuweisen ist, obwohl eine derartige Reaktion aufgrund der Versuchsbedingungen zu erwarten gewesen wäre.
In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahren ist das gesonderte Reaktionsgefäß zur Reaktion des Probengemisches während der Inkubation mit einer Membran nach unten verschlossen, wobei Reaktionsgefäß und Nachweisgefäß, in welchem sich das PP-Gemisch befindet, ineinander bzw. aufeinander fügbar sind und zur Sichtbarmachung der Reaktion das Reaktionsgefäß in bzw. auf das Nachweisgefäß gefügt wird und beide gemeinsam zentrifugiert werden, wobei während der Zentrifugation der beiden Gefäße die Membran des Reaktionsgefäßes wenigstens teilweise für das Probengemisch durchlässig wird und dieses in das Nachweisgefäß eintritt.
Diese Ausgestaltung unter Verwendung einer Membran, welche den Boden des Reaktionsgefäßes bildet, ist insbesondere vorteilhaft für eine manuelle Abarbeitung von Proben. Denn bei einer manuellen Abarbeitung der Proben entfällt der Pipettierschritt zum Einpipettieren des Reaktionsgemisches in das Nachweisgefäß. In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahren sind Reaktionsgefäß und Nachweisgefäß ein und dasselbe Gefäß sowohl zur Durchführung der Inkubation und Reaktion als auch des Nachweises der Reaktion, wobei das Gefäß in zwei Teile geteilt ist und sich im unteren Teil des Gefäßes das PP-Gemisch befindet, welches durch eine Membran abgedeckt ist, und oberhalb derselben im oberen Teil sich der Reaktionsraum für die Reaktion des Probengemisches während der Inkubation befindet. Während der nachfolgenden Zentrifugation des Gefäßes wird die Membran wenigstens teilweise für das Probengemisch durchlässig. Diese Ausgestaltung hat die allgemeinen Vorteile, dass das verwendete Gel oder PP-Gemisch in das Gefäß schon eingefüllt sein kann und durch die Membran zuerst einmal sicher verschlossen ist. Der weitere Vorteil besteht darin, dass nunmehr mit ein und demselben Gefäß der Inkubationsschritt mit der Zwangsbewegung des Probengemisches durchgeführt werden kann.
Bei dieser Ausgestaltung eines Probengefäßes mit einer Membran kann das Gefäß praktisch beliebig geformt sein, zum Beispiel eine Spitzboden- oder Rundboden- oder Flachboden-Mikrotiterplatte oder eine Säule sein. Eine Spitzboden- oder Rundboden-Mikrotiterplatte oder Streifen wird von oben oder unten ausgewertet; eine Säule oder Flachbodenplatte oder Streifen wird seitlich ausgewertet.
Die Anwendung einer Membran kann ebenso auf beliebige Partikel-Tests, zum Beispiel Gel-Tests, angewendet werden. Ein derartiges Behältnis zur Durchführung eines Verfahrens zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen, wie zur Blutgruppenbestimmung, Antikörper-Suchtest, Serumgegenprobe sowie zur Infektionsserologie, in einer Testflüssigkeit durch Reaktion mit einem vorge gebenen spezifischen Bindungspartner, wobei die Antigene bzw. die Antikörper oder die spezifischen Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger gebunden sind und das dergestalt hergestellte Probengemisch einem Inkubationsschritt ausgesetzt wird, wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw. den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Behältnis, welches ein Rundboden- oder Spitzboden- oder Flachbodengefäß oder eine Säule ist, durch eine Membran in zwei Kammern getrennt ist, nämlich in eine obere und eine untere Kammer, wobei die Membran die in der unteren Kammer befindliche Nachweisschicht, zum Beispiel ein Gel, zur optischen Sichtbarmachung einer stattgefundenen Reaktion abdeckt und die obere Kammer den Reaktionsraum für die Aufnahme und Reaktion des Probengemisches darstellt, wobei durch einen Zentrifugationsschritt die Membran wenigstens teilweise durchlässig wird und dadurch das Probengemisch vom Reaktionsraum in den Nachweisraum gelangt.
Im allgemeinen Fall kann das Behältnis auch aus zwei gesonderten Gefäßen bestehen, wobei das erste Gefäß nach unten durch die Membran verschlossen ist und zur Aufnahme des Probengemisches und Durchführung gegebenenfalls einer Inkubation und der Reaktion dient, und das zweite Gefäß die Nachweisschicht, zum Beispiel ein Gel, enthält und zur Sichtbarmachung der Reaktion dient und die beiden Gefäße ineinander bzw. aufeinander fügbar sind und beide Gefäße gemeinsam zentrifugiert werden, wobei während der Zentrifugation der beiden Gefäße die Membran des Reaktionsgefäßes wenigstens teilweise für das Probengemisch durchlässig wird und dieses dadurch in das Nachweisgefäß eintritt. In beiden Fällen kann natürlich eine Zwangsbewegung des Probengemisches während der Inkubation erfolgen.
Die Membran kann aus Kunststoff oder Kautschuk oder aus einer Gummimischung bestehen oder ein Latex oder ein Gel sein.
Beispiele zur Durchführung des Verfahrens sind nachfolgend beschrieben. In der Zeichnung zeigen.
1 ein V-Boden-Gefäß, beispielsweise in einer Mikrotiterplatte, mit einer Membran
2 ein Rundbodengefäß einer Mikrotiterplatte mit einer Membran
3 ein V-Boden-Gefäß mit einem unterhalb einer Membran befindlichen Stachel zum Durchstechen der Membran und
4 ein V-Boden-Gefäß mit einem oberhalb einer Membran angeordneten, nach unten beweglichen Stachel zum Durchstechen der Membran.
Im nachfolgenden Beispiel wird von kodierten Gefäßen ausgegangen. Zur Verwendung kommen vorzugsweise handelsübliche V-Boden-ELISA-Platten, welche in 12- oder 8-ter Riegel unterteilt sein können. Ein Kodierungspuffer wird mit spezifischen Proteinen, wie Anti-IgG, im Verhältnis von cirka 1:800 mit PbS-Puffer verdünnt und eine Lösung hergestellt. In ein jedes Gefäß werden von der genannten Lösung cirka 50yLiter einpippetiert. Das Gefäß wird einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur unterworfen. Die Lösung bzw. restliche Lösung aus Kodierpuffer und spezifischen Proteinen wird entfernt und es wird ein PbS-Puffer, welcher eine zirka 1%tige Rinderlösung enthält, von 200yLiter in jedes Gefäß hinzugefügt.
Das Gefäß wird während einer bis 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wonach zum Beispiel ein Auswaschen des Gefäßes mittels eins Waschpuffers erfolgt, in welchem zum Beispiel Tween 20 und Rinderalbumin enthalten sind. Das Gefäß ist nunmehr als kodiertes Gefäß fertig präpariert und steht zur weiteren Verwendung als Nachweisgefäß zur Verfügung. Diese sind nach einer Vakuum- oder Schutzgasverpackung sehr lange haltbar. Mit einer dergestalt kodierten Platte kann ein Arbeitsablauf für einen Antikörper-Suchtest, zum Beispiel Antikörper-Suchzellen von 1, 2 und 3, wie folgt durchgeführt werden:
In gesonderte Reaktionsgefäße, welche unbehandelte, handelsübliche V-Bodengefäße, Mikrotiterplatte, sein können, werden 3mal 25μLiter Serum oder Plasma plus 50 μLiter Suchzellensuspension 1,2,3 zu 0,3%±0,1% eingegeben, wobei die Arbeitsverdünnung mit modifiziertem Liss-Puffer erfolgt. Die Gefäße werden bei cirka 37Grad Celsius und gleichzeitig bei einer Schüttelfrequenz zwischen 700±25 UpM während 5 Minuten inkubiert und ein Probengemisch erzeugt. Während der Inkubation wird das Puffer-Gel-Gemisch mittels eines Steppers von 50 μLiter in die Nachweisgefäße einpippetiert; danach werden jeweils 50μLiter des Probengemisches auf das PP-Gemisch in den Nachweisgefäßen einpippetiert. Die Nachweisgefäße werden einem Zentrifugierschritt während cirka 2 Minuten bei cirka 20548 unterworfen. Anschließend wird das Reaktionsergebnis innerhalb der Nachweisggefäße optisch ausgewertet entweder visuell oder automatisch. Eine positive Reaktion zeigt sich als Monolayer, Rasen, eine negative als Knopf. Da es sich um eine Mikrotiterplatte handelt, wird das Ergebnis entweder durch Aufsicht von oben oder unten abgelesen.
Die mit Anti-IgG kodierte Platte zeigt einmal IgG-Antikörper und aufgrund des PP-Gemisches gleichzeitig auch eventuell vorhandene IgM-Antikörper an. Bei einer positiven Reaktion kann eine selektive Unterscheidung, ob IgG- und/oder IgM-Antikörper vorliegen, folgendermaßen vorgenommen werden, indem eine zweite, unkodierte Platte mit PP-Gemisch benutzt und der Test nochmals durchgeführt wird. Wird eine negative Reaktion mit der zweiten Platte erhalten, dann liegt ein IgG-Antikörper vor. Erscheint eine positive Reaktion gleich der kodierten Platte, dann liegt ein IgM-Antikörper vor.
Wenn die Reaktion in der zweiten Platte gegenüber derjenigen in der ersten Platte schwächer ausfällt, dann liegt eine Mischform von IgG- und IgM-Antikörper vor. Ebenso wird keine Kodierung von Anti-C3d benötigt, da der Nachweis so empfindlich ist, dass die wenigen Komplement bildenden IgG-Antikörper zum Nachweis ausreichen. Falls keine IgM-Antikörper wegen eventueller unspezifischer Reaktionen gewünscht werden, können reduzierende, bekannte Agenzien, zum Beispiel Natriumdithionit, zur Reduktion bzw. Herabsetzung der IgM-Antikörper genommen werden.
Beispielsweise werden zur AB0-RH-Bestimmung sowie zusätzlich zur Durchführung der Serumgegenprobe wiederum eine unbehandelte Mikrotiterplatte als Reaktionsgefäß verwendet. Es werden in dieselbe

a) 50μLiter AntiA (Biotest Clone: A003 IgM) einer mittels Liss-Puffer hergestellten Lösung von 1:100 50μLiter AntiB (Biotest Clone: B005 IgM) einer mittels Liss-Puffer hergestellten Lösung von 1:100 50μLiter AntiD einer mittels Liss-Puffer hergestellten Lösung von 1:30 50μLiter RH mono-Control einer mittels Liss-Puffer hergestellten Lösung 1:30 einpippetiert,
b) es werden jeweils 25μLiter einer 0,6±0,2%tigen Erythrozyten-Patientensuspension, in welcher Liss-Puffer enthalten ist, auf die vorgenannt beschickten vier Gefäße aufpippetiert (das ist für die AB0-RH-erythrozytenseite Bestimmung notwendig)
c) es wird 4mal 50μLiter Plasma (Serumgegenprobe) in weitere vier Reaktionsgefäße einpippetiert,
d) es werden jeweils 25μLiter einer 0,6±0,2%tigen Suspension, in welcher Liss-Puffer enthalten ist, mit A1-Zellen, A2-Zellen, B-Zellen und 0-Zellen hergestellt und in die Reaktionsgefäße einpippetiert,
e) die Probenmischungen werden während cirka 2 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur zwischen 18 bis 25 Grad Celsius und gleichzeitig bei einer Schüttelfrequenz zwischen 700 ± 25 UpM inkubiert,
f) in acht unbehandelte, unkodierte Nachweisgefäße werden 8mal jeweils 25μLiter PP-Gemisch mittels eines Steppers einpippetiert,
g) nunmehr werden je 50μLiter der Probenmischungen in die Nachweisgefäße auf das PP-Gemisch einpippetiert,
h) die Nachweisgefäße werden einem Zentrifugierschritt während cirka 2 Minuten bei cirka 20548 unterworfen und die Reaktionsergebnisse visuell oder automatisch ausgewertet. Eine negative Reaktion zeigt sich als Knopf; eine positive Reaktion zeigt sich entweder auf oder innerhalb des PP-Gemisches, was aber den Eindruck eines Rasens erweckt. Da es sich um eine Mikrotiterplatte handelt, wird das Ergebnis entweder durch Aufsicht von oben oder unten abgelesen.

Ein Testkit besteht zum Beispiel aus den folgenden Komponenten:
Mit Anti-IgG kodierte Platte (Nachweisplatte)
Flasche mit PP-Gemisch
Flasche mit modifiziertem Lis
3 Flaschen mit je Testzellen 1, 2, 3
handelsübliche Reaktionsplatte
Ein besonderer Vorteil eines derartigen Testkits liegt in der einfachsten Versandfähigkeit und in seiner Flexibilität.
In den 1 und 2 sind je ein V-Boden-Gefäß 1 und ein Rundbodengefäß 3 mit einer Membran 2 bzw. 4 gezeigt, welche an der Gefäßwandung oberhalb des V-Bodens bzw. des Rundbodens über den gesamten Querschnitt befestigt ist und das Gefäß in zwei voneinander getrennte Teile trennt. Unterhalb der Membran 2, 4 innerhalb des Gefäßes 1 bzw. 2 befindet sich das PP-Gemisch 5.
Hinsichtlich der verwendeten Membran 2, 4 sind die folgende Ausgestaltungsbeispiele gegeben. Eine Membran 2, 4 aus Latex kann durch eine vorherige Perforation, vorzugsweise mit einem Durchmesser von 6 bis 8 μm, durchlässig gemacht werden. Da Latex sehr flexibel ist, sind diese Löcher im Ruhezustand geschlossen. Bei einer Zentrifugation von zum Beispiel 2.500xg eines Gefäßes, welches vorher mit einer Probenmischung von 50 μLiter befüllt worden ist, hat diese Probenmischung ein Gewicht von zirka 125 g, welches ausreicht, die Membranöffnungen aufzuweiten und die Probenmischung bzw. die Erythrozyten passieren zu lassen.
Oder eine Latexmembran 2, 4 hat eine geringe Membrandicke und ist dergestalt vorgespannt, dass sie bei der Zentrifugation des Gefäßes 1, 2 schon bei einem Gewicht von einigen 10g reißt.
Die 3 und 4 zeigen zwei weitere Möglichkeiten der Ausführung. Innerhalb eines V-Boden-Gefäßes 6 ist oberhalb des V-Bodens eine Latexmembran 7 über den gesamtem Querschnitt des Gefäßes 6 angeordnet und zwar vorgespannt. Unterhalb der Latexmembran 7 befindet sich – neben dem PP-Gemisch 5 – an der schrägen Wandung des V-Bodens ein Stachel 8, welcher in Richtung der Membran aufragt und bis zur Membran 7 reicht.
Der Stachel kann auch durch eine scharfe Kante gebildet sein, welche an der Wandung des V-Bodens direkt unterhalb der Membran ausgebildet ist.
Während der Zentrifugation bombiert die Membran 7 aufgrund der Fliehkraft in Richtung des Bodens des Gefäßes nach unten und dringt in den Stachel 8 ein oder drückt auf die Kante und wird so zum Reißen gebracht.
4 zeigt ein weiteres V-Boden-Gefäß 9 mit einer Membran 10, welche oberhalb des V-Bodens über den gesamtem Querschnitt des Gefäßes 9 gespannt ist. Oberhalb der Membran 10 ist an der Wandung des Gefäßes 9 ein beweglicher Stachel 11 angeordnet, welcher bis zur Membran 10 reicht. Weist dieser beispielsweise ein Gewicht von 0,5 g auf, so ergibt sich bei einer Zentrifugation von 2.500xg ein Stachelgewicht von 1.250 g, so dass die Membran durchstoßen und so zum Reißen gebracht wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist spezifisch und sehr sensitiv. Es ist einsetzbar für die vollständige Blutgruppenbestimmung, den Antikörpersuchtest sowie die Kreuzprobe. Es ist ein Einschrittzentrifugationsverfahren, welches keiner Waschschritte bedarf. Eine vollständige Blutgruppenbestimmung und ein Antikörpersuchtest ist innerhalb von 7 Minuten möglich, weshalb insbesondere das Verfahren notfalltauglich ist. Aufgrund der variablen Inkubationszeiten ist das Verfahren notfalltauglich und für eine Halb- und Vollautomation sehr gut geeignet. Aufgrund der identischen Basisreagenzien, Inkubationszeiten und Zentrifugationszeiten ist die komplette Blutgruppenbestimmung mit Serumgegenprobe, Antikörpersuchtest und Kreuzprobe auf einer Mikrotiterplatte möglich. Ebenso ist es möglich, auf derselben Mikrotiterplatte Infektionsserologie, wie zum Beispiel Hepatitis B, mitabzuarbeiten.

Claims

Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen, wie zur Blutgruppenbestimmung, Antikörper-Suchtest, Serumgegenprobe sowie zur Infektionsserologie, in einer Testflüssigkeit durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei die Antigene bzw. die Antikörper oder die spezifischen Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger gebunden sind und das dergestalt hergestellte Probengemisch einem Inkubationsschritt ausgesetzt wird, wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw. den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß eine vorbestimmte Menge des inkubierten Probengemisches auf eine vorbestimmte Menge eines Gemisches eines Puffers, Einbettpuffer, mit Partikeln, Puffer-Partikel-Gemisch, abgekürzt PP-Gemisch, welches sich innerhalb eines Nachweisgefäßes befindet, zugegeben wird, wobei der Einbettpuffer die Eigenschaft aufweist, den Abstand zwischen den einzelnen Partikeln innerhalb des PP-Gemisches zu minimieren und anschließend das Nachweisgefäß einer Zentrifugation unterworfen wird zur Sichtbarmachung der Reaktion des Probengemisches im Nachweisgefäß, wobei das PP-Gemisch die Positivreaktion fördert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Einbettpuffer aus einer wässrigen Lösung aus Dextran [(C₆H₁₀O₅)_n] und/oder Polyethylenglycol [HO(C₂H₄O)_nH] besteht.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der wässrigen Lösung aus Dextran [(C₆H₁₀O₅)_n] und/oder Polyethylenglycol [HO(C₂H₄O)_nH] Glycocoll (H₂NCH₂COOH) (Glycin) und/oder Trisodiumcitrat (C₆H₅O₇Na₃) zugegeben wird.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche 2 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Haltbarmachung der Lösung ein antibakterielles und/oder antivirales Mittel, wie Natriumazid (NaN₃) oder Antibiotika, zugesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das PP-Gemisch eine derart geringe Viskosität aufweist, dass es in flüssiger oder pastöser Form vorliegt, welche die Pipettierung des PP-Gemisches mittels Stepper oder Pipette in das Nachweisgefäß gestattet.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Partikel innerhalb des Puffer-Partikel-Gemisches Beads verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Beads Acryl, Gelatine, Polyacrylamide, Solid nets, Silica, Ficoll, Percoll, Phtalate-Ester, Agarose oder Dextran-Gel verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Inkubationsschritt zwischen 1 Minute bis 40 Minuten, insbesondere 5 Minuten, dauert, wobei während der Inkubation eine Zwangsdurchmischung der Testflüssigkeit erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zwangsdurchmischung der Testflüssigkeit durch Schütteln oder Rühren erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Zentrifugierschritt bei einer Beschleunigung von cirka 80xg bis 20.000xg sowie während einer Zentrifugierzeit von 0,1 Minuten bis < 10 Minuten, bevorzugt 1.000xg bis 4.000xg, sowie während einer bevorzugten Zentrifugierzeit zwischen 1 Minute bis 5 Minuten, insbesondere 1900 bis 2.600xg bei 2 Minuten, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zur Feineinstellung der Reaktion dem PP-Gemisch Albumin, wie BS-Serum, zugegeben und/oder die Dextrankonzentration entsprechend angepaßt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Beads mit einem Trockendurchmesser zwischen 1 μm, bis 300 μm, insbesondere SEPHADEX G-50 superfine, insbesondere 20 μm bis 50 μm zur Herstellung des PP-Gemisches verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Probengemisch in einem gesonderten Reaktionsgefäß zur Reaktion gebracht und anschließend das Probengemisch auf das PP-Gemisch innerhalb des Nachweisgefäßes aufgebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das gesonderte Reaktionsgefäß zur Reaktion des Probengemisches während der Inkubation mit einer Membran nach unten verschlossen ist, wobei Reaktionsgefäß und Nachweisgefäß, in welchem sich das PP-Gemisch befindet, ineinander bzw. aufeinander fügbar sind und zur Sichtbarmachung der Reaktion das Reaktionsgefäß in bzw. auf das Nachweisgefäß gefügt wird und beide gemeinsam zentrifugiert werden, wobei während der Zentrifugation der beiden Gefäße die Membran des Reaktionsgefäßes wenigstens teilweise für das Probengemisch durchlässig wird und dieses in das Nachweisgefäß eintritt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass Reaktionsgefäß und Nachweisgefäß ein und dasselbe Gefäß sowohl zur Durchführung der Inkubation und Reaktion als auch des Nachweises der Reaktion sind, welches in zwei Teile geteilt ist, wobei im unteren Teil des Gefäßes das PP-Gemisch sich befindet, welches durch eine Membran abgedeckt ist, und oberhalb derselben im oberen Teil sich der Reaktionsraum für die Reaktion des Probengemisches während der Inkubation befindet, wobei während der nachfolgenden Zentrifugation des Gefäßes die Membran wenigstens teilweise für das Probengemisch durchlässig wird.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran aus Kunststoff oder Kautschuk oder Gummimischung oder Latex oder Gel besteht.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweisgefäße zur Aufnahme des PP-Gemisches Rundboden- oder Spitzboden- oder Flachbodengefäße oder Säulen sind.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Dextran ein Molgewicht ungefähr von 100 bis 40.000.000, vorzugsweise von 2.000.000 (2⋅10⁶) g/Mol, aufweist und in einem Bereich zwischen 0,1Gramm/-Liter bis 500Gramm/Liter, vorzugsweise 5Gramm/Liter bis 40Gramm/Liter, insbesondere 20Gramm/Liter im Einbettpuffer vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenglycol ein Molgewicht ungefähr von 50 bis 40.000 g/Mol aufweist, vorzugsweise 3500–4500 g/Mol, aufweist und in einem Bereich zwischen 1Gramm/Liter bis 100Gramm/Liter, bevorzugt zwischen l0Gramm/Liter bis 70Gramm/Liter, insbesondere 40 g/L, im Einbettpuffer vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Glycocoll (Glyzin) in einem Bereich zwischen 1g/Liter bis 100g/Liter, bevorzugt l0Gramm/Liter bis 25Gramm/Liter, insbesondere 18,0168 Gramm/-Liter, im Einbettpuffer vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 2, 3, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Trisodiumcitrat (C₆H₅O₇Na₃) in einem Bereich zwischen 0,01Gramm/-Liter bis 10Gramm/Liter, bevorzugt 1Gramm/Liter bis 5Gramm/Liter, insbesondere 2,581 g/L, im Einbettpuffer vorliegt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Einbettpuffer sich in einem ph-Bereich von 4 bis 9, bevorzugt von 6,9 bis 7,1, befindet.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Natriumazid (NaN₃) in einem Bereich zwischen 0,01g/Liter bis 10Gramm/Liter, bevorzugt zwischen 0,5Gramm/Liter bis 2Gramm/Liter, insbesondere 1 g/L, vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Innenwandungen der Nachweisgefäße mit Proteinen kodiert sind, insbesondere mit Anti-IgG, Anti-IgA, Anti-IgM, Protein A, Protein G und/oder mit einer Mischung derselben.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass zur Stabilisierung der an den Innenwandungen der Nachweisgefäße befindlichen Proteine Stabilisierungssubstanzen, wie Triton X-100 oder Albumin oder Casein oder Gelatine oder Tween 20 oder mit Mischungen derselben, verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass entweder in das PP-Gemisch Proteine eingemischt oder die Beads mit Proteinen kodiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Einsatz in der Infektionsserologie, dadurch gekennzeichnet, dass als vorgegebene spezifische Bindungspartner mit Proteinen kodierte, eingefärbte Beads verwendet werden. ( ungefähr das spez. Gewicht der Erys).
Verfahren nach Anspruch 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass zur Durchführung des Inkubationsschrittes sowie der Zwangsdurchmischung der Testflüssigkeit dieser Liss und/oder modifiziertes Liss zugesetzt wird.
Behältnis zur Durchführung eines Verfahrens zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen, wie zur Blutgruppenbestimmung, Antikörper-Suchtest, Serumgegenprobe sowie zur Infektionsserologie, in einer Testflüssigkeit durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei die Antigene bzw. die Antikörper oder die spezifischen Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger gebunden sind und das dergestalt hergestellte Probengemisch einem Inkubationsschritt ausgesetzt wird, wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern bzw. den spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass ein Behältnis, welches ein Rundboden- oder Spitzboden- oder Flachbodengefäß oder eine Säule ist, durch eine Membran in zwei Kammern getrennt ist, nämlich in eine obere und eine untere Kammer, wobei die Membran die in der unteren Kammer befindliche Nachweisschicht zur optischen Sichtbarmachung abdeckt und die obere Kammer den Reaktionsraum für die Aufnahme und Reaktion des Probengemisches darstellt, wobei durch einen Zentrifugationsschritt die Membran wenigstens teilweise durchlässig wird.
Behältnis nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Behältnis aus zwei gesonderten Gefäßen besteht, wobei das erste Gefäß nach unten durch die Membran verschlossen ist und zur Aufnahme des Probengemisches und Durchführung gegebenenfalls einer Inkubation und der Reaktion dient, wobei das zweite Gefäß die Nachweisschicht enthält und zur Sichtbarmachung der Reaktion dient und die beiden Gefäße ineinander bzw. aufeinander fügbar sind und beide Gefäße gemeinsam zentrifugiert werden, wobei während der Zentrifugation der beiden Gefäße die Membran des Reaktionsgefäßes wenigstens teilweise für das Probengemisch durchlässig wird und dieses in das Nachweisgefäß eintritt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Verwendung von Dextran-Gel als Beads bei geringer werdendem Fraktionsrange des Dextrans oder der Globularproteine die g-Zahl der Zentrifugation bei gleichbleibender Zentrifugationszeit erhöht wird und umgekehrt.