DE19500862A1

DE19500862A1 - Reaktionssäulen für simultane Mehrfachmessung und Verfahren zur Bestimmung von Verbindungen

Info

Publication number: DE19500862A1
Application number: DE19500862A
Authority: DE
Inventors: Ursula Erhardt; Christoph Erhardt
Original assignee: ABION oHG
Current assignee: Abion Beteiligungs und Verwaltungs GmbH
Priority date: 1994-01-13
Filing date: 1995-01-13
Publication date: 1995-07-20
Anticipated expiration: 2015-01-14
Also published as: JPH09507577A; EP0739487A1; DE19500862C2; AU5882994A; WO1995019569A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Reaktionssäulen für Messungen durch Affinitätstests mit zumindest einem Trägerbett.

Affinitätschromatographie ist eine Technologie, die in der präparativen Reinigung von Biomolekülen breite Anwendung findet. Dabei wird die spezifische Wechselwirkung zwischen dem zu bestimmenden Molekül und dem komplementären Bindungspartner genutzt. In der allgemeinen praktischen Anwendung dieser Methoden wird eine Probe, die das zu reinigende Biomolekül enthält, auf eine Chromatographiesäule aufgegeben, die, gebunden auf einem festen Trägermaterial, einen komplementären Bindungspartner enthält. Beispiele komplementärer Bindungspartner sind Enzyme und ihre Substrate, Antikörper und Antigene oder Haptene und komplementäre DNA- oder RNA-Einzelketten.

In der Immunaffinitätschromatographie zur Quantifizierung wird die Wechselwirkung zwischen einem Antigen oder einem Hapten und dem komplementären Antikörper verwendet.

Der Nachweis von mehr als einer Komponente in einer Testprobe ist aber noch immer ein großes Problem, weil normalerweise der getrennte Nachweis jeder Verbindung in einem separaten Test erforderlich ist. Solche Nachweismethoden wurden vorgezogen, da sie Bestimmungen mit strenger Qualitätsgarantie für jeden zu bestimmenden Analyten zulassen.

Mittlerweile werden Labors mit dem Problem konfrontiert, daß sie eine zunehmende Zahl von Tests rechtzeitig und bei niedrigen Kosten durchführen müssen. So sind zum Beispiel die Testanforderungen in Blutbanken dramatisch gestiegen, da der Human-T-Virus Typ 1 (HTLV-1), die Human-Immundefizienz-Viren 1 und 2 (HIV-1 und HIV-2) und der Hepatitis-C- Virus (HCV) zur Liste der Agentien zugefügt wurden, auf die Spenderblut in diesen Labors bezüglich Anwesenheit oder Einwirkung getestet werden.

Deshalb gibt es einen Bedarf an einer schnellen, simultanen Analyse mehrerer Komponenten oder Parameter aus nur einer Probe bei kleinem Probenvolumen und in kurzer Zeit.

Außerdem sollte eine solche Analyse auch möglich sein, wenn störende Komponenten anwesend sind, was sowohl in den Bereichen Umwelt- und Nahrungsmittelanalyse als auch in der medizinischen Diagnostik oft vorkommt. Besonders in der Medizin sind Kurzzeit- Analyse, kleines Probevolumen, Selektivität, Präzision und automatische Durchführung erforderlich. Diese Forderungen können mit bereits bekannten Methoden der immunologischen Analyse nicht voll realisiert werden. Der aktuelle Stand der Technik schlägt für dieses Problem mehrere Lösungsmethoden vor, die zum größten Teil ineffizient sind.

Beim augenblicklichen Stand der Technik gibt es hauptsächlich zwei verschiedene Vorgehensweisen. Die erste Gruppe beschreibt modifizierte ELISA-Plattentests, die einerseits für Mehrfachmessungen verwendet werden können, die aber andrerseits einige Nachteile haben. Die andere Gruppe beinhaltet Testmethoden, deren Grundlage die Säulenchromatographie ist. Solche Methoden gibt es nur für Einzelanalysen, nicht für Mehrfachanalysen.

So beschreibt die WC-A-91/13354 eine Durchflußimmunsensor-Methode und einen Apparat zur Durchführung dieser Methode. Die Methode zum Nachweis einer Zielverbindung enthält die Schritte Bereitstellung eines zielspezifischen Antikörpers, Sättigung der Antikörper-Bindungsstellen mit einer markierten Form der Zielverbindung, Durchfluß einer die Zielverbindung enthaltenden Flüssigkeit am Antikörper vorbei, mögliche Verdrängung des markierten Antigens durch die Zielverbindung und Nachweis des ersetzten, markierten Antigens.

Der Nachteil dieser Methode nach dem Stand der Technik ist, daß sie nicht für Mehrfachmessungen verwendet werden kann. Es ist nur eine kompetitive Methode. Ein weiterer Nachteil ist, daß die Verdrängung des markierten Antigens unter Nichtgleichgewichtsbedingungen geschieht. Die Nichtgleichgewichtsreaktion hängt stark von der Durchflußgeschwindigkeit, die über eine Pumpe geregelt wird, und von der Temperatur ab. So können falsche Signale durch hohe Temperatur oder organische Lösungsmittel verursacht werden. Deshalb ist eine zweite Kontrollsäule mit nichtspezifischen Agentien zur Erzeugung eines Kontrollsignals erforderlich, um zu sehen, ob falsche Signale in der Testsäule erzeugt werden. Mit der Methode nach diesem Stand der Technik sind nur qualitative Analysen und Einzelmessungen möglich. Nach Erzeugung eines Signals wird der Austauschbereich in der Säule ersetzt oder regeneriert, und es wird darauf hingewiesen, daß ein klares positives Signal noch erzeugt wird, wenn eine 250 ng- Probe zugegeben wird nach mehreren vorausgegangenen Antigenauftragungen. Aus diesen Aussagen kann abgeleitet werden, daß die Methode nach dem Stand der Technik keine quantitative Bestimmung von Komponenten ergibt. Die Beziehung zwischen dem Meßwert und der Konzentration ist nicht linear. Der Detektor für den Durchflußschritt wird deshalb nur auf einen bestimmten Analyten eingestellt. Dieses Problem bei Einzelmessungen macht eine Mehrfachmessung unmöglich.

Die EP-A-0 473 065 beschreibt einen Test für den simultanen Nachweis der Anwesenheit von einem oder mehreren Analyten in einer Testprobe. Die Analyten werden auf verschiedenen Festphasen gebunden, und die Anwesenheit von einem oder mehreren Analyten wird bestimmt über den Nachweis eines Signals, das von analyt-spezifischen Indikatorreagentien erzeugt wird. Dieser Test ist ein modifizierter ELISA-Plattentest, der lange Inkubationszeiten erfordert und schwierig ist bezüglich der Temperaturkontrolle.

Die WO-A-92/12255 beschreibt Tests für die Bestimmung vieler Analyte, die in einer Testprobe enthalten sein könnten, wofür verschiedene kurzlebige und langlebige Chemilumineszenz-Marker verwendet werden, das erzeugte Chemilumineszenz-Signal integriert wird, und über den Zeitverlauf die kurzlebigen und die langlebigen Komponenten des erzeugten Signals unterschieden werden. Außerdem werden Testkits beschrieben, die diese kurzlebigen und langlebigen Chemilumineszenz-Verbindungen enthalten. Diese Methode beschreibt ebenfalls einen ELISA-Plattentest mit langen Inkubationszeiten und schwieriger Temperaturkontrolle.

Schließlich beschreiben die DE-A-42 08 732 und die DE-C-41 26 436 des Anmelders Reaktionssäulen für die Festphasen-Immunanalytik und eine Methode zur Bestimmung von über Immunreaktionen nachweisbaren Komponenten. Diese Säulen sind einfach in der Handhabung, arbeiten im Durchflußverfahren, brauchen nur kurze Reaktionszeiten und bewirken quantitative Reaktionen. Nach einer grundsätzlichen Standardisierung der entsprechenden Charge der Säulen erfordern sie weder eine vorherige Kalibrierung oder Regenerierung noch eine Referenzstandard-Messung.

Mit einer solchen Säule können alle bekannten Reaktionen (wie ELISA-Platten- oder Immunblotting-Reaktionen) einfacher und schneller oder präziser durchgeführt und leicht automatisiert werden. Aber mit den bekannten Reaktionssäulen kann nur eine Komponente bestimmt werden.

Deshalb war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Reaktionssäule für die simultane Mehrfachbestimmung zur Verfügung zu stellen, die eine schnelle Durchführung der simultanen qualitativen oder quantitativen Analyse mehrerer Komponenten oder Parameter mit Festphasen-Affinitätsanalyse ermöglicht, und die dieselben Vorteile hat wie die oben beschriebenen Säulen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch eine Reaktionssäule für die simultane Mehrfachmessung über Affinitätstests mit zumindest einem Trägerbett mit zumindest einer darauf gebundenen affinitätsreaktiven Komponente pro Trägerbett und einem Volumen pro Trägerbett von bis zu 600 µl.

Vorzugsweise besteht das Trägerbett aus einem festen porösen Material oder einem Gel.

Bevorzugt wird das Trägerbett zwischen zwei porösen Trenneinrichtungen gelagert. Die Reaktionssäule kann Komponenten für verbindungsspezifische Affinitätsreaktionen oder Komponenten für gruppenspezifische Affinitätsreaktionen oder beides enthalten. Diese Verbindungen können immunreaktiv sein. Auf jedem Trägerbett kann zumindest eine reaktive Komponente für gruppen- und/oder verbindungsspezifische Reaktion aufgebracht sein.

Die erfindungsgemäße Reaktionssäule wird mit einem Trägerbett und einer Reaktivkomponente in konfektionierter und standardisierter Form hergestellt, was den sofortigen Gebrauch der Säule ohne weitere Kalibrierungsschritte oder Referenzmessungen erlaubt. Die Konfektionierung erfolgt nach der quantitativen Reaktion.

Die reaktiven Komponenten für gruppenspezifische Affinitätsreaktionen und für verbindungsspezifische Affinitätsreaktionen haben vorzugsweise eine solche Beladungsdichte, daß die Verbindungen während des kontrollierten Durchflusses der flüssigen Probe, bevor sie das Trägerbett verläßt, quantitativ an das Trägerbett gebunden werden.

Die quantitativ gebundenen Verbindungen sind die zu bestimmenden Verbindungen oder eine sie enthaltende Gruppe oder affinitätsreaktive sekundäre Bindungspartner für die Verbindungen, die in beliebiger sinnvoller Reihenfolge und Zahl von Schritten auf die Säule aufgegeben werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die reaktiven Komponenten auf dem Trägerbett Protein A, Protein B, Protein G, Protein M, ein Immunglobulin oder eine Gruppe von Immunglobulinen oder ein Antigen oder eine Gruppe von Antigenen.

Andere spezifische Bindungspaare können sein Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nucleotid-Sequenzen, Effektor- und Rezeptor-Moleküle, Cofaktoren und Enzyme, Enzyminhibitoren und Enzyme u.ä.

Außerdem können zu spezifischen Bindungspaaren auch Partner gehören, die Analoge der originalen spezifischen Bindungspartner sind, z. B. ein Analyt-Analog. Immunreaktive spezifische Bindungspartner sind außerdem Antigene, Antigen-Fragmente; Antikörper und Antikörper-Fragmente, monoklonal und polyklonal; und deren Komplexe, einschließlich den mit rekombinanten DNA-Methoden hergestellten. Außerdem ist beim Antigen und bei der Gruppe von Antigenen Hapten eingeschlossen.

Das Trägermaterial kann ausgewählt werden aus der Gruppe enthaltend polymere Zucker, Polymere, polymermodifizierte organische oder anorganische Trägermaterialien, poröse Metalle, Metalloxide und Legierungen, Gläser, Silikate und keramische Materialien. Als polymerer Zucker kann Agarose verwendet werden.

Die reaktive Komponente kann kovalent oder auf irgendeine Weise sorptiv an das Trägermaterial gebunden sein.

Als obere und untere Trenneinrichtungen von einem oder mehreren Trägerbetten können poröse Fritten oder Membranen verwendet werden. Die Fritten haben eine Porosität von 0,2 µm bis 100 µm und bestehen aus Plastik, z. B. Polyethylen, Metall oder Glas. Als Plastikmaterial kann Polyethylen oder Teflon verwendet werden, als Metall poröses Aluminium oder rostfreier Stahl.

Das Säulenmaterial kann darüber hinaus ausgewählt werden aus der Gruppe enthaltend Plastikmaterialien, Metalle und natürliche Materialien, z. B. Polyethylen, Polypropylen und/oder Polystyrol als Plastikmaterial.

Die entgegengesetzten Enden der Reaktionssäulen können so geformt sein, daß sie Male Female-Verbindungen ermöglichen für eine Serienverbindung mehrerer Reaktionssäulen.

Das Trägerbett hat bevorzugt ein Volumen von 30-50 µl.

In speziellen Fällen, wenn Verbindungen anwesend sind, die die Affinitätsreaktion stören, kann die Reihenfolge der Trägerbetten so festgelegt werden, daß die Verbindung, die die Affinitätsreaktion einer anderen Verbindung stört, quantitativ in einem oberen Trägerbett gebunden wird, während die Affinitätsreaktion der anderen Verbindung in einem unteren Trägerbett erfolgt.

In einer bevorzugten Ausführung können zusätzliche Betten oder Zonen ober- und unterhalb der Meß-Trägerbetten eingefügt werden, wie z. B. Filtriereinrichtungen oder Zonen zur Probenreinigung oder -behandlung, zusätzliche Reaktionszonen für die Vorbereitung der Affinitätsbindungsreaktion, oder Kontrollzonen für die Kontrolle des Probenauftrags, des Probendurchflusses und der aufgegebenen Chemikalien.

Die Erfindung beinhaltet außerdem eine Methode zur Bestimmung von Verbindungen, die über eine Affinitätsreaktion bestimmt werden können, wobei eine zu analysierende Probe auf eine wie oben beschriebene Reaktionssäule aufgegeben wird und die zu bestimmenden Verbindungen oder eine sie enthaltende Gruppe quantitativ durch die komplementäre reaktive Komponente in der Reaktionssäule gebunden werden, wobei die zu bestimmenden Komponenten danach mit bekannten Bestimmungsmethoden bestimmt werden nach bekannten Affinitätstestverfahren in der Reaktionssäule.

Eine Affinitätsreaktion kann schon vorher verwendet werden, um die komplementäre Reaktivkomponente selbst in der Säule zu binden, die mit einer komplementären Reaktivkomponente zu dieser komplementären Reaktivkomponente beladen ist (siehe Beispiel 3). Dadurch wird eine flexiblere Anwendung der Säule ermöglicht, d. h. für verschiedene Tests und für die Testentwicklung, einschließlich dem Verbergen der tatsächlichen Anwendung des Endnutzers gegenüber dem Säulenhersteller.

Solche Methoden können sein sekundäre Affinitätsreaktionen in der Reaktionssäule zur Markierung und/oder Verstärkung und die Bestimmung in der Säule oder die Bestimmung nach der Elution.

Außerdem sind Affinitätsreaktionen von markierten Verbindungen möglich, die mit den zu bestimmenden Verbindungen konkurrieren, sowie die Bestimmung in der Flüssigkeit, die die Säule direkt verläßt, direkt in der Säule oder nach der Elution.

Als Marker werden Fluoreszenz- und/oder Enzymmarker verwendet.

In einer bevorzugten Ausführung ist die durch die gruppenspezifische Komponente gebundene Gruppe die Gruppe der Immunglobuline G und/oder M.

In einer weiteren Ausführungsform kann eine Lösung von einheitlich mit einem Enzym oder einem Fluoreszenzmarker markierten komplementären Antigenen aufgegeben werden für die qualitative Bestimmung der Anwesenheit von irgendeinem der speziellen Immunglobuline G und/oder M. Für die quantitative oder differenzierte qualitative Bestimmung spezieller Immunglobuline G und/oder M kann eine Lösung von verschieden markierten Antigenen aufgegeben werden, und die Antigene werden durch Affinitätsreaktionen in direktem Verhältnis zur Menge an gebundenen korrespondierenden Immunglobulinen G und/oder M gebunden.

Die verschiedenen Antigenmarker sind verschiedene Enzym- oder Fluoreszenzmarker für jedes komplementäre Antigen.

Außerdem können Kontroll-Affinitätsreaktionen in den jeweiligen Trägerbetten zur Kontrolle des Probenauftrags und -durchflusses sowie der Qualität der verwendeten Reagentien verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführung kann die Reaktionssäule direkt mit dem die zu testende Flüssigkeit enthaltenden Behälter oder einem Blutbehälter, insbesondere seiner Füllvorrichtung, verbunden werden und verbunden bleiben zum Zweck einer sicheren Probennahme und Testanwendung. Das Testergebnis kann dadurch zum Zeitpunkt der Verwendung gesehen werden.

Wegen der grundsätzlichen Standardisierung und Konfektionierung der Säulen kann die Methode ohne Kalibrierung und Regeneration des Trägerbetts und der komplementären reaktiven Komponente durchgeführt werden. Zusätzlich können nach Probenaufgabe auf das Reaktionsgefäß kleine Saug- und Druckkräfte angewendet werden zum schnelleren Ablauf. Außerdem kann ein Automat verwendet werden für automatische Probennahme, Probenaufgabe und/oder Messung.

Mit einer Reaktionssäule und der Methode der Erfindung ist es möglich, z. B. qualitativ oder quantitativ alle oder spezifische Immunglobuline der Klassen IgG, IgM, IgA und/oder IgE in Körperflüssigkeiten zu bestimmen.

Außerdem ist eine ohne Beachtung einer angewandten genauen Temperaturkontrolle und einer Temperatur- und Zeitabhängigkeit die schnelle Durchführung eines Immuntests im bevorzugten Durchflußverfahren möglich, der einfach zu handhaben ist, der nicht nur keine präzisen Inkubationszeiten, sondern überhaupt keine Inkubationszeiten benötigt, und der fertig für den Gebrauch ist ohne vorherige Kalibrierung und Regeneration und ohne simultane Messungen mit Referenzstandardproben.

In der medizinischen Diagnostik ist es oft wichtig, für einen oder mehrere Parameter eine schnelle und einfache Ja/Nein-Aussage ohne weitere Differenzierung zu erhalten, aber bei sehr niedrigen Konzentrationen, d. h. der Test muß so präzise sein wie ein quantitativer.

Die Frage ist, ob eine oder mehrere Infektionen (HIV, HBV, HCV usw.) vorliegen, eine von mehreren Drogen, eins von mehreren Dopingmitteln oder eins von mehreren allergieverursachenden Allergenen. Mit der Reaktionssäule entsprechend der Erfindung ist eine solche qualitative und auch quantitative Analyse in einfacher und effizienter Weise möglich.

Die beschriebene Methode unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reaktionssäule ist viel einfacher als gewohnte Verfahren und erlaubt eine schnelle quantitative und qualitative Bestimmung. Dies wird zum Teil dadurch ermöglicht, daß die Bestimmung der zu bestimmenden Komponente keine vorherige Kalibrierung oder Regenerierung des in der Säule verwendeten Trägerbettes erfordert und daß keine Serien-Referenzmessungen von Standardlösungen nötig sind.

Die einfache Handhabung ist eine Konsequenz der Möglichkeit, Proben und andere Lösungen mit gewöhnlicher Laborausrüstung oder mit einem Pipettierautomaten aufzubringen.

Die vorliegende Methode kann schnell unter dem Einfluß der Gravitationskraft durchgeführt werden ohne die Anwendung von Hochdruck auf die Reaktionssäule nach dem Auftrag der Probe. Aber kleine Saug- oder Druckkräfte können für eine schnellere Durchführung angewendet werden, z. B. durch Zentrifugieren oder Pumpen. Das kann für Trägerbetten mit großem Strömungswiderstand wichtig sein, um die Durchflußzeit und damit die Testzeit klein zu halten.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die zu analysierende Probe auf eine Reaktionssäule mit mehreren verschiedenen immunologisch reaktiven Komponenten aufgetragen. Die zu bestimmenden Verbindungen werden durch die komplementäre(n) immunologisch reaktive(n) Komponente(n) zurückgehalten. Danach werden die Verbindungen, wie in der DE-C-41 26 436 beschrieben, quantitativ oder qualitativ über Fluoreszenz und/oder eine Farbreaktion im Trägerbett, in der die Säule nach Probenlösungsaufgabe verlassenden Flüssigkeit oder nach der Elution bestimmt. Für die quantitative Bestimmung können verschiedene Marker am Antigen oder am Antikörper oder an weiteren komplementären Bindungspartnern verwendet werden.

Wenn die Konzentration der zu analysierenden Verbindungen sehr niedrig ist, kann eine Probenanreicherung durch Auftrag von, wenn vorhanden, größeren Mengen Probenflüssigkeit erfolgen. Außerdem kann für die Bestimmung von niedrigen Konzentrationen spezifischer Antikörper, statt einer Säulenbeladung mit komplementären Antigenen von niedrigem Molekulargewicht mit den korrespondierenden Problemen in der dreidimensionalen Struktur des Trägerbetts, eine Säulenbeladung mit einem Antikörper oder einer Gruppe von Antikörpern erfolgen, die komplementär zu der entsprechenden Klasse oder den entsprechenden Klassen von Antikörpern ist (z. B. zu Human-IgG und/oder -IgM und/oder -IgA) oder eine entsprechende gruppenspezifisch reaktive Komponente oder entsprechenden gruppenspezifisch reaktive Komponenten wie Protein A oder G. Mit einer solchen Säule ist es möglich, eine ganze Gruppe von Komponenten zurückzuhalten. In einem weiteren Schritt wird dann eine Lösung mit einem Antigen oder mit Antigenen der zu analysierenden Komponenten auf die Säule aufgetragen.

Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß die Empfindlichkeit höher ist, daß es besser angepaßt werden kann, und daß ein Säulentyp für verschiedene Multi- oder Einzeltests verwendet werden kann. Die spezifische Art des Tests wird durch die Antigene bestimmt, die nachher auf die Säule aufgegeben werden. Das ist aus ökonomischen Gründen effektiver.

Außerdem können mehrere getrennte Trägerbettvolumina mit verschiedenen immunologischen und anderen reaktiven Komponenten übereinander in einer oder mehreren Reaktionssäulen verwendet werden. Dabei werden verschiedene Trenneinrichtungen in der Säule verwendet, z. B. Membranen oder Fritten oder mehrere Trägerbetten mit verschiedenen Materialien zwischen porösen Trenneinrichtungen.

Die Verwendung verschiedener Trägerbetten erlaubt die Durchführung verschiedener Verfahren wie im Folgenden beschrieben.

Für eine Probe mit mehreren zu analysierenden Komponenten wird eine Reaktionssäule verwendet mit einer Zahl getrennter Trägerbetten entsprechend der Zahl der Komponenten. Diese Trägerbetten sind mit einer oder mehreren komplementären Reaktivpartnern für die zu analysierende Verbindung oder Gruppe von Verbindungen beladen. Während des Probendurchflusses wird die korrespondierende Verbindung im entsprechenden Trägerbett zurückgehalten und zum Beispiel mit einer Farbreaktion nachgewiesen. Störende ähnliche Verbindungen mit hohen Affinitäts-Bindungskonstanten werden quantitativ in den oberen Trägerbetten abgefangen und bei Bedarf bestimmt. Im (In den) unteren Trägerbett(en) folgt die Bestimmung der Verbindung(en) mit der (den) niedrigeren Affinitätskonstante(n).

Wenn ein Gelbett, das für eine oder mehrere erforderliche Reaktivkomponenten gebraucht wird, mit einer oder mehreren anderen benötigten Reaktivkomponenten inkompatibel ist, werden die Reaktionen in verschiedenen geeigneten Gelbetten in einer Säule durchgeführt. Auch ein simultaner Test für kleine und große Komponenten (Antikörper/Antigene, Bakterien oder Viren) ist möglich, wenn ein oberes Gelbett den größeren Komponenten zugeordnet wird wie in der DE-A-42 08 732 beschrieben.

Wenn wichtige Tests durchgeführt werden, wie Infektionstests in der Medizin oder Toxizitätstests in der Lebensmittelanalyse, werden Kontrollfelder im oberen und unteren Teil der Säule eingefügt. Die obere Negativkontrolle prüft den exakten Durchfluß der Probe, die untere Positivkontrolle prüft, ob die reaktiven Verbindungen korrekt auf die Säule aufgegeben wurden, und ob die Probe auf die Säule aufgegeben wurde und die verwendeten Reagentien von guter Qualität sind.

Nach der Durchführung des Tests verbleibt die Reaktionssäule an der getesteten Probe, was für Blutbanken interessant sein dürfte. Die Testsäule kann vor dem Test mit dem Blutbehälter verbunden werden, z. B. über ein T-Stück zwischen dem Behälter und der Vene des Blutspenders. Der Test wird dann nach der Entnahme des Blutes durchgeführt mit dem Blut, das noch im Verbindungsschlauch enthalten ist. Die Testsäule verbleibt am Blutbehälter, so daß das Testergebnis jederzeit ohne Dokumentationsfehler zu erkennen ist.

Abb. 1 zeigt die Reaktionssäule entsprechend der Erfindung. Die Säule hat n Trägerbetten und wird für simultane Mehrfachmessungen verwendet. 1, 2, 3, . . ., n bezeichnen die verschiedenen Trägerbetten mit den darin gebundenen Reaktionskomponenten. 11, 12, 13, 14, 15, . . ., n′ sind Trenneinrichtungen.

Abb. 2 zeigt die Standardkurve für die simultane Bestimmung von Tetanus- und Diphtherie-Antikörpertitern (siehe Tabelle 2 und Beispiel 2).

Abb. 3 zeigt die Standardkurve für Antikörper in Schlachtvieh (siehe Tabelle 3 und Beispiel 3).

Die folgenden Beispiele zeigen bevorzugte Ausführungen der Erfindung.

Beispiele Herstellung von Säulen mit durch Fritten getrennten Gelbetten

Handelsübliche Cyanbromid-aktivierte vernetzte Agarose (Sepharose 4b, Pharmacia, Uppsala, Schweden) wurde 15 Minuten in 0,001 M HCl gequollen und auf einer Glasfritte mit 0,001 M HCl gewaschen. 1 ml einer Lösung von 2 mg des entsprechenden Antikörpers (oder der entsprechenden Antikörper), des Antigens (oder der Antigene) oder von Protein G in Kopplungspuffer (0,1 M NaCO3-0,5 M NaCl-pH 8,3) und 1 ml der suspendierten Agarose wurden zwei Stunden bei Zimmertemperatur im Overheadmixer zu einer Agarose mit homogen gekoppeltem Antikörper gemischt. Der Grad der Antikörper- oder Antigen- Kopplung, d. h. Menge des gebundenen durch Menge des zugegebenen Antikörpers bzw. Antigens, wurde mit Protein-UV-Absorption der Suspension bei 280 nm (mit einem Kontron- Uvikon-Photometer) als nahezu 100% bestimmt. Danach wurde die Antikörper- bzw. Antigen- bzw. Protein G-gekoppelte Suspension auf einer Glasfritte mit Blockierungspuffer zurückgepuffert (0,1 M Tris-0,5 M NaCl-pH 8,0). Nach zweistündiger Blockierung im Overheadmixer bei Zimmertemperatur wurde die Suspension wieder auf eine Fritte gebracht und viermal jeweils mit einer Folge von 3 Puffern gewaschen (0,1 M Essigsäure 0,5 M NaCl-pH 4,0/Kopplungspuffer/Blockierungspuffer). In jede der Polypropylen-Säulen entsprechend Figur 1, in die an den unteren Enden Polypropylenfritten 11 mit einer Porosität von 2 µm eingesetzt worden waren, wurden vorsichtig 60 µl der Agarosesuspension gegeben. Die Suspensionen wurden dann vorsichtig mit je 500 µl Waschpuffer überschichtet (0,01 M Tris-0,15 M NaCl-0,005% Tween 20-pH 8,0). Das ergab schließlich nach 1 Stunde Sedimentation Agarosegel-Trägerbetten von etwa 30 µl. D.H. die Beladungsdichte lag bei etwa 60 µg Antikörper, Antigen oder Protein G pro 30 µl endgültigem Agarosebett, entsprechend einem Kopplungsgrad von etwa 100%. Die Antikörper-Bindungskapazitäten pro 30 µl Sepharosebett lagen bei etwa 20 µg für Antikörper-beladene bzw. bei 200 µg für Protein G-beladene Trägerbetten. Die Betten wurden vorsichtig mit zweiten oberen Fritten 12 geschlossen. Im Falle von Multifeld- Säulen ergab diese erste Prozedur das entsprechende unterste Trägerbett 1, und sie wurde vorsichtig wiederholt für jedes der weiteren benötigten Trägerbetten über dem ersten (Betten 2-n, Abschlußfritten 13-n′).

Für Lagerung und Versand wurden die Säulen an den unteren Spitze mit Kappen verschlossen, etwa 100 µl Waschpuffer in jede Säule über der obersten Fritte eingefüllt, und die oberen Enden der Säulen wurden ebenfalls mit Kappen verschlossen.

Fluoreszenz-Messungen

Der Fluoreszenz-Detektor Kontron SFM 25 wurde mit einer normalisierten Lösung kalibriert, Rinderserumalbumin in PBS-Puffer (0,01 M Na2HPO4-0,01 M NaH2PO4-0,15 M NaCl- 0,005% Tween 20-pH 7,2), stabilisiert mit 0,1% Natriumazid . .

Beispiel 1 Differentialdiagnose der Frühphase bzw. der chronischen Phase der Lyme-Krankheit

Borrelia burgdorfii, die in Europa und den USA durch Zeckenbisse verbreitet wird, verursacht die chronische Lyme-Krankheit (Erythema (chronicum) migrans). Für den therapeutischen Ansatz und die Überwachung ist die Diagnose der Krankheitsphase wichtig. Dies kann qualitativ (Abschnitt a) oder quantitativ (Abschnitt b) geschehen.

a) Qualitative Unterscheidung zwischen anti-Borrelia burgdorfii-Antikörpern der Klassen IgG und IgM mit integriertem Negativ-Kontrollfeld Reagentien

- Waschpuffer (0,01 M Tris-0,15 M NaCl-0,05% Tween 20-pH 8,0)
- Substratpuffer (1 mg/ml Paranitrophenylphosphat, PNPP, in 1,0 M Diethanolamin-0,5 mM MgCl2-pH 9,8)
- Lösung von Borrelia b.-Antigen, isoliert von Borrelia b.-Stämmen, markiert mit alkalischer Phosphatase (10 µg/ml in Waschpuffer)

Säule mit Trägerbetten 1-3

3 30 µl CnBr-aktivierte Sepharose 4b, beladen mit 60 µg kovalent gekoppeltem Rinderserumalbumin (Sigma)
2 30 µl CnBr-aktivierte Sepharose 4b, beladen mit 60 µg kovalent gekoppeltem monoklonalem Maus-anti-human-IgM-Antikörper (Sigma)
1 30 µl CnBr-aktivierte Sepharose 4b, beladen mit 60 µg kovalent gekoppeltem monoklonalem Maus-anti-human-IgG-Antikörper (Sigma).

Testdurchführung

50 µl von 1 : 10-Verdünnungen von Humanserum-Proben in Waschpuffer wurden auf Säulen des beschriebenen Typs aufgegeben, jeweils gefolgt von 750 µl Waschpuffer, 500 µl der Lösung von phosphatase-markiertem Borrelia b.-Antigen, noch einmal 750 µl Waschpuffer und zuletzt 200 µl Substratpuffer. Nach Inkubation bis zum Auftreten einer leicht gelblichen Färbung im oberen Kontrollfeld 3 (etwa 10 Minuten Inkubationszeit für die Enzymreaktion, nicht für die Affinitätsreaktion!) blieben beide Testfelder farblos (oder wurden leicht gelblich) bei Negativproben. Bei Positivproben mit nur IgG, d. h. Proben alter Erkrankungen, entwickelte sich nur in den unteren Testfeldern 1 der jeweiligen Säulen eine signifikant starke dunkelgelbe Färbung, während das in beiden Testfeldern 1 und 2 bei Proben mit IgG und IgM geschah, d. h. bei Proben frischer Infektionen.

Tabelle 1

b) Quantitative Bestimmung von anti-Borrelia b.-IgM und -IgG Reagentien

- Waschpuffer (0,01 M Tris-0,15 M NaCl-0,05% Tween 20-pH 8,0)
- Elutionspuffer (0,1 M NaOH-0,15 M NaCl-0,05% Tween 20-pH 13,0)
- gemischte Lösung von 10 µg/ml FITC-markiertem (Fluorescein isothiocyanat) monoklonalem Maus-anti-human-IgG-Antikörper und von 10 µg/ml monoklonalem, TRITC-markiertem (Rhodaminisothiocyanat) Maus-anti-human-IgM-Antikörper in Waschpuffer (beide von Sigma)
- Säule mit Trägerbett 1
1 30 µl CnBr-aktivierte Sepharose 4b, beladen mit 60 µg kovalent gekoppeltem Borrelia b.-Antigen.

Testdurchführung

Auf Säulen des beschriebenen Typs wurden 50 µl 1 : 10-Verdünnungen von Humanserum- Proben in Waschpuffer aufgegeben, gefolgt von 750 µl Waschpuffer, von 500 µl der Antikörper-Mischlösung, und von weiteren 750 µl Waschpuffer. Nach der Elution mit 750 µl Elutionspuffer in Küvetten wurden die relativen Fluoreszenzen bei 490/520 nm bzw. 555/585 nm bestimmt. Die lineare Beziehung zwischen den relativen Fluoreszenzen und den Konzentrationen von verschiedenen Verdünnungen einer Humanserum-Probe wird als Standardlinie für alle weiteren Messungen mit Säulen verwendet, die aus derselben Herstellungscharge Antigen-gekoppelter Agarose stammen.

Die Standardisierung dieser linearen Basislinie wurde durch Vergleich mit Fluoreszenz- Messungen der Gesamt-IgG- bzw. -IgM-Mengen durchgeführt, die in anti-human-IgG- bzw. anti-human-IgM-Säulen zurückgehalten wurden (unter Berücksichtigung der verschiedenen Null-Fluoreszenzdaten von Lösungen mit keinem IgG/IgM bzw. keinem anti-Borrelia b.- IgG/IgM auf den verschiedenen Säulentypen).

Beispiel 2

Quantitative Titer von Tetanus- und Diphtherie-Antikörpern als Maß des Impfstatus, d. h. als Grundlage der Entscheidung ob Impfung (eine oder beide) nötig sind.

Tetanus-Impfungen werden meist bei Verletzungen als Prophylaxe durchgeführt. Bei (schon oder noch) bestehendem ausreichendem Impfschutz des Patienten kann die Impfung einen anaphylaktischen Schock sogar mit tödlichem Ausgang verursachen. Die Bestimmung des Impfstatus kann außerdem auch vor der Anwendung der kombinierten Impfstoffe für Tetanus und Diphtherie wichtig sein (letztere nimmt in Osteuropa wieder zu), d. h. für die Entscheidung, ob nur ein Impfstoff statt beiden angewendet werden soll.

Reagentien

- Waschpuffer (0,01 M Tris-0,15 M NaCl-0,05% Tween 20-pH 8,0)
- Elutionspuffer (0,1 M NaOH-0,15 M NaCl-0,05% Tween 20-pH 13,0)
- gemischte Lösung von 10 µg/ml Tetanustoxoid, markiert mit FITC, und von 10 µg/ml Diphthterie-Toxoid, markiert mit TRITC, in Waschpuffer (beide Toxoide warfen kommerzielle Impfstoffe)
- Tetanus-Standardserum
- Diphtherie-Standardserum (Die beiden Standards vom Statens Serum Institute, Kopenhagen, Dänemark, wurden als Referenzen für die Standardisierung verwendet.)
- Normalisierungslösung für FITC (10 ng/ml Fluorescein in Waschpuffer) und
- Normalisierungslösung für TRITC (10 ng/ml Rhodamin in Waschpuffer).

Säule mit Trägerbett 1

1 30 µl CnBr-aktivierte Sepharose 4b, beladen mit 60 µg kovalent gekoppeltem Protein G.

Testdurchführung

Die Standardseren wurden in Waschpuffer auf die Konzentrationen 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 und 0,1 IU/ml (IU = internationale Einheiten) verdünnt (siehe Tabelle 2 und Abb. 2).

Patientenproben von Patienten verschiedenen Alters wurden verwendet. Die Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen eines kommerziellen ELISA-Tests verglichen (Merlin Diagnostik, Deutschland) (siehe Tabelle 2).

Tabelle 2

Auf Säulen des beschriebenen Typs wurden die Standardlösungen bzw. 200 µl der verdünnten Humanserumproben (20 µl Humanserum mit 180 µl Waschpuffer) aufgegeben, gefolgt von 750 µl Waschpuffer, dann von 250 µl der Antigen-(Toxoid-)-Mischlösung, und zuletzt wieder von 750 µl Waschpuffer. Nach Elution mit 750 µl Elutionspuffer in Küvetten wurde die relative Fluoreszenz bei 490/520 nm bzw. 555/585 nm bestimmt.

Die Messungen wurden zweimal wiederholt, einen und zwei Tage später, mit derselben Präzision unter Verwendung der normalisierten Standardlinie des ersten Tages.

Beispiel 3 a) Quantitative Analyse von (verbotenen) Antibiotika in Schlachtvieh, z. B. von Chloramphenicol, Tetracyclin und Sulfometazin

Im Moment werden Antibiotika in Nahrungsmitteln meist mit bakteriologischen Inhibierungstests bestimmt. Diese brauchen normalerweise mehr als 4 Tage. Deshalb ist eine schnelle Methode erwünscht, die Ergebnisse wenn möglich sogar vor dem Schlachten liefert.

Reagentien

- Waschpuffer (0,01 M Tris-0,15 M NaCl-0,05% Tween 20-pH 8,0)
- Elutionspuffer (0,1 M NaOH-0,15 M NaCl-0,05% Tween 20-pH 13,0)
- gemischte Antikörperlösung von jeweils 10 µg/ml in Waschpuffer von
- - polyklonalem Kaninchen-anti-Chloramphenicol,
- - polyklonalem Kaninchen-anti-Tetracyclin und
- - polyklonalem Kaninchen-anti-Sulfometacin
(hergestellt mit konventioneller Hapten-Immunisierung)
- gemischte Lösung von jeweils 10 µg/ml markiertem Antigen in Waschpuffer für die qualitative und quantitative Analyse:
- - Chlormaphenicol-FITC,
- - Tetracyclin-TRITC und
- - Sulfometazin-Phycocyanin
- Normalisierungslösung für FITC (10 ng/ml Fluorescein in Waschpuffer)
- Normalisierungslösung für TRITC (10 ng/ml Rhodamin in Waschpuffer)
- Normalisierungslösung für Phycocyanin (10 ng/ml Phycocyanin in Waschpuffer).

Säule mit Trägerbett 1

Testdurchführung

Zur Kalibrierung werden 1 ng/ml Chloramphenicol, Tetracyclin und Sulfometacin zu Rinderserum-Proben gegeben, für die mit HPLC und bakteriologischen Inhibierungstests geprüft wurde, daß sie frei von diesen Antibiotika waren.

Auf Säulen des beschriebenen Typs wurden 250 µl der gemischten Antikörperlösung aufgegeben. Für die Kalibrierung und den Nachweis der Anreicherungsmöglichkeit der beschriebenen Säulen wurden auf diese 750 µl der Antibiotika-freien Probe bzw. 750 µl der vorbereiteten Antibiotika-Lösungen (0,75 ng von jedem Antibiotikum absolut) bzw. 1500, 2250, 3750 oder 7500 µl dieser Lösung (1,5, 2,25, 3,75 oder 7,5 ng von jedem Antibiotikum absolut) aufgegeben bzw. 750 µl zentrifugierte Serumproben von Rinderblut. Dann wurden nach 750 µl Waschpuffer 250 µl der gemischten Fluoreszenz-markierten Lösung zugegeben, gefolgt wieder von 750 µl Waschpuffer. Nach Elution mit 750 µl Elutionspuffer in Küvetten wurde die Fluoreszenz bei 490/520 bzw. 555/585 bzw. 650/880 nm bestimmt.

Die Messungen wurden zweimal wiederholt, einen und zwei Tage später, und dieselbe normalisierte Standardlinie wurde verwendet (siehe Tabelle 3 und Abb. 3).

b) qualitativ (ja/nein)

Wie in Tabelle 3, zweiter Abschnitt, letzte zwei Spalten "Bestätigung", gezeigt, kann die normalisierte Fluoreszenz auch nur für die qualitative Evaluierung verwendet werden, d. h. ob die Probe verbotene Antibiotika dieser Gruppe enthält.

Ein schnelles qualitatives Screening wurde auch unter Verwendung von Enzym-Markierung durchgeführt. Das Verfahren war dasselbe wie in a) bis zum letzten Waschschritt vor der Elution, aber unter Verwendung einer Mischlösung mit gleich Phosphatase-markierten statt von unterschiedlich Fluoreszenz-markierten Antigenen. Dann wurde Substratpuffer zugefügt, gefolgt von einer Inkubationszeit von 10 Minuten. Die Evaluierung wurde durch Vergleich der Säulen mit aufgegebenen Proben mit einer Kontrollsäule mit aufgegebener Negativprobe durchgeführt. Die Säulen mit positiven Proben waren alle nur leicht gelblich, verglichen mit der signifikant dunkelgelben Farbe der Säulen mit Negativproben und der Kontrollsäule.

Beispiel 4

Simultaner qualitativer Test für mehrere gegen verschiedene Epitope einer oder mehrerer infektiöser Mikroorganismen gerichtete IgG- und IgM-Antikörper mit integrierten Kontrollfeldern, insbesondere einem Positivkontrollfeld zur Kontrolle der Probenaufgabe; dargestellt am Beispiel von HIV-1.

Screening-Tests für Infektionen (die mit nur einer Säule simultan für mehrere Infektionen entsprechend Beispiel 2 durchgeführt werden können, aber mit nur einer Markierung für alle verschiedenen Antigene für die zu nachzuweisenden Antikörper, d. h. ohne Unterscheidung zwischen verschiedenen Antikörpern) können nicht für endgültige Entscheidungen verwen det werden. Zur Bestätigung und Klärung von positiven Ergebnissen und außerdem für die Diagnose der aktuellen Phase der Krankheiten ist eine qualitative oder sogar quantitative Bestimmung von verschiedenen Antikörper nötig. (Die quantitative Bestimmung kann auch mit einer Säule entsprechend Beispiel 2 durchgeführt werden, wobei verschiedene Markierungen für verschiedene Antigene verwendet werden).

Tabelle 3.1

(Der zur Zeit verwendete Bestätigungstest (vor allem in Blutbanken), Western Blot, hat mehrere Nachteile, z. B. gibt es keine integrierte Kontrolle, ob der Test wirklich aufgegeben wurde (weil er mit Negativproben wie ohne Probenaufgabe weiß bleibt), weil es ein manueller Test ist, der nicht automatisiert werden kann, weil er viel Zeit braucht, und weil die Interpretation der Ergebnisse viel Erfahrung erfordert.

Reagentien

- Waschpuffer (0,01 M Tris-0,15 M NaCl-0,05% Tween 20-pH 8,0)
- Substratpuffer (1 mg/ml PNPP (Paranitrophenylphosphat) in 1,0 M Diethanolamin-0,5 mM MgCl2-pH 9,8)
- Antikörpermischlösung mit 10 µg/ml Maus-anti-human-IgG und 10 µg/ml Maus-anti-human-IgM, markiert mit alkalischer Phosphatase, in Waschpuffer

Säule mit Trägerbetten 1-5

5 30 µl CnBr-aktivierte Sepharose 4b, beladen mit 60 µg kovalent gekoppeltem Rinderserumalbumin (Negativkontrolle für nichtspezifische Bindung)
4 30 µl CnBr-aktivierte Sepharose 4b, beladen mit 60 µg HIV-I- Peptiden der p24-Region
3 30 µl CnBr-aktivierte Sepharose 4b, beladen mit 60 µg HIV-I- Peptiden der gp41-Region
2 30 µl CnBr-aktivierte Sepharose 4b, beladen mit 60 µg HIV-I- Peptiden der gp120-Region
1 30 µl CnBr-aktivierte Sepharose 4b, beladen mit 60 µg kovalent gekoppeltem monoklonalem Maus-anti-human-IgG (Positivkontrolle für die Humanserum-Probenaufgabe und den Probendurchfluß) (Antikörper von Sigma, HIV-I-Peptide von Saxon Biochemicals, Hannover, Deutschland)

Testdurchführung

500 µl Lösung (250 µl Humanserum, verdünnt mit 250 µl Waschpuffer) wurden auf Säulen des beschriebenen Typs aufgegeben, gefolgt von jeweils 750 µl Waschpuffer, dann von 300 µl der gemischten Sekundärantikörperlösung, und wieder von 750 µl Waschpuffer. Dann wurden 300 µl Substratpuffer aufgegeben, und die Säulen wurden für etwa 6 Minuten inkubiert, bis das obere Negativkontrollfeld leicht gelblich gefärbt war (Inkubationszeit für die Enzymreaktion, nicht für die Affinitätsreaktion).

Negativkontrollfeld 5:
Dieses Feld wurde immer leicht gelblich bei korrekt durchgeführten Tests und intakten Säulen (Testbedingung), aber dunkelgelb bei falsch gelagerten Säulen (Probe 12).

Positivkontrollfeld 1:
Nach der Enzyminkubationszeit war das Positivkontrollfeld 5 bei allen Humanserumproben dunkelgelb, d. h. die Proben waren aufgegeben worden und korrekt durchgeflossen. Mit der falschen Kaninchenserumprobe 11 wurde dieses Feld leicht gelblich wie das obere Kontrollfeld.

Bestätigungsfelder 2-4:
Bei den HIV-negativen Proben 1-5 wurden die Testfelder nur leicht gelblich. Alle positiven Proben bewirkten eine dunkelgelbe Färbung in wenigstens einem Antigentestfeld. Die Proben 6 und 7 waren von Patienten mit HIV-positiven Screening-Tests und negativen Western Blot-Tests, die Proben 8-10 waren Western Blot-bestätigt HlV-positiv.

Tabelle 4

Claims

1. Reaktionssäule für simultane Mehrfachmessungen via Affinitätstest mit zumindest einem Trägerbett, wobei zumindest eine affinitätsreaktive Komponente an jedes Trägerbett gebunden ist und das Volumen jedes Bettes bis zu 600 µl beträgt.

2. Reaktionssäule nach Anspruch 1, wobei sich das Trägerbett zwischen zwei porösen Trenneinrichtungen befindet.

3. Reaktionssäule nach Anspruch 1 oder 2, wobei zumindest eine reaktive Komponente eine Komponente für eine verbindungsspezifische Affinitätsreaktion ist.

4. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei zumindest eine reaktive Komponente eine Komponente für eine gruppenspezifische Affinitätsreaktion ist.

5. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die zu analysierende Komponente immunologisch reaktiv ist.

6. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei das Trägerbett ein festes poröses Material oder ein Gel ist.

7. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei das Trägerbett und die reaktiven Komponenten für die Affinitätsreaktionen konfektioniert und standardisiert sind, wodurch der sofortige Gebrauch der Säule ohne Kalibrierungsschritte oder Referenzmessungen ermöglicht wird.

8. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 7, wobei die reaktive(n) Komponente(n) für gruppenspezifische Affinitätsreaktionen eine solche Ladungsdichte hat (haben), daß die Verbindungen während des kontrollierten Durchflusses der flüssigen Probe quantitativ an das Trägerbett gebunden werden, bevor sie die Säule verläßt.

9. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 8, wobei die reaktive(n) Komponente(n) für verbindungsspezifische Affinitätsreaktionen eine solche Ladungsdichte hat/haben, daß die Verbindung(en) quantitativ an das Trägerbett gebunden wird/werden während des kontrollierten Durchflusses der flüssigen Probe, bevor sie die Säule verläßt.

10. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 8, wobei die quantitativ gebundenen Verbindungen die zu bestimmenden Verbindungen sind, oder eine Gruppe/Gruppen, die sie enthält/enthalten, und/oder affinitätsreaktive (sekundäre) Bindungspartner für die Verbindungen, wobei diese alle auf die Säule in beliebiger sinnvoller Reihenfolge und Zahl von Schritten aufgegeben werden.

11. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 10, wobei die reaktiven Komponenten Protein A, Protein B, Protein G, Protein M, ein Immunglobulin oder eine Gruppe von Immunglobulinen, ein Antigen oder eine Gruppe von Antigenen sind.

12. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 11, wobei das Antigen und die Gruppe von Antigenen Hapten(e) einschließt.

13. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 12, wobei das Trägermaterial ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend polymere Zucker, Polymere, Polymer-modifizierte organische oder anorganische Trägermaterialien, poröse Metalle, Metalloxide und Legierungen, Gläser, Silikate oder keramische Materialien.

14. Reaktionssäule nach Anspruch 13, wobei Agarose als polymerer Zucker verwendet wird.

15. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 14, wobei die Reaktivkomponente an das Trägerbett kovalent oder durch irgendeine Art sorptiver Bindung gebunden ist.

16. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 2 bis 15, wobei poröse Fritten oder Membranen als obere und/oder untere Trenneinrichtungen verwendet werden.

17. Reaktionssäule nach Anspruch 16, wobei die Fritten eine Porosität von 0,2 µm bis 100 µm haben.

18. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 16 und 17, wobei die Fritten aus Plastikmaterial, Metall oder Glas bestehen.

19. Reaktionssäule nach Anspruch 18, wobei Polyethylen oder Teflon als Plastikmaterial bzw. poröses Aluminium oder rostfreier Stahl als Metall verwendet werden.

20. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 19, wobei das Säulenmaterial ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend Plastikmaterial, Metalle und Naturstoffe.

21. Reaktionssäule nach Anspruch 20, wobei Polyethylen, Polypropylen und/oder Polystyrol als Plastikmaterial verwendet werden.

22. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 21, wobei die entgegengesetzten Enden der Reaktionssäulen für Male-Female-Steckverbindungen geformt sind für In-Reihe- Schaltung von mehreren Reaktionssäulen.

23. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 22, wobei das Trägerbett ein Volumen von 30 bis 50 µl hat.

24. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 23, wobei die Reihenfolge der Trägerbetten so arrangiert ist, daß eine Verbindung, die die Affinitätsreaktion einer anderen Verbindung stört, quantitativ in einem oberen Trägerbett gebunden wird, während die Affinitätsreaktion der anderen Verbindungen in einem unteren erfolgt.

25. Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 24, wobei zusätzliche Betten oder Zonen integriert werden oberhalb oder unterhalb der Meß-Trägerbetten, wie z. B.

- Filtriereinrichtungen oder Zonen für Probenreinigung und -behandlung,
- zusätzliche Reaktionszonen für die Vorbereitung der Affinitätsbindungsreaktion oder
- Kontrollzonen für die Kontrolle der Probenaufgabe, des Probendurchflusses und der verwendeten Chemikalien.

26. Verfahren für die Bestimmung von Verbindungen, die über eine Affinitätsreaktion bestimmt werden können, wobei die zu analysierende Probe auf eine Reaktionssäule nach den Ansprüchen 1 bis 25 aufgegeben wird und die zu analysierenden Komponenten oder eine Gruppe/Gruppen, die sie enthält/enthalten, quantitativ durch die komplementäre(n) Reaktivkomponente(n) in der Reaktionssäule gebunden werden, wobei die zu analysierenden Komponenten danach über Bestimmungsmethoden bestimmt werden direkt in der Säule, in der nach Aufgabe direkt durch die Säule geflossenen Flüssigkeit oder nach direkter Elution oder nach Affinitätstest-Verfahren in der Säule.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei vor der Probenaufgabe (ein) affinitätsreaktive(r) sekundäre(r) Bindungspartner oder (eine) (markierte) kompetitive Komponente(n) auf die Reaktionssäule aufgegeben wird/werden, die alle Affinitätsbindungsstellen in zumindest einem der Trägerbetten absättig(t)(en).

28. Verfahren nach den Ansprüchen 26 oder 27, wobei die Affinitätstest-Verfahren sind

- sekundäre bzw. tertiäre Affinitätsreaktion(en) in der Reaktionssäule zur Markierung und/oder Verstärkung und Bestimmung in der Säule, in der direkt nach Aufgabe durch die Säule geflossenen Flüssigkeit oder nach Elution oder
- Affinitätsreaktionen von zu zu bestimmenden Verbindungen kompetitiven, markierten Verbindungen und Bestimmung direkt in der Säule, in der direkt nach Aufgabe durch die Säule geflossenen Flüssigkeit oder nach Elution.

29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei Fluoreszenz- und/oder Enzymmarker verwendet werden.

30. Verfahren nach den Ansprüchen 26 und 27, wobei von der gruppenspezifischen Komponenten in der Reaktionssäule gebundene Gruppe die Gruppe der Immunglobuline A und/oder G und/oder M ist.

31. Verfahren nach den Ansprüchen 26 bis 30, wobei gleich markierte komplementäre Antigene oder sekundäre Antikörper mit einem Enzym- oder Fluoreszenzmarker für alle komplementären Antigene oder sekundären Antikörper verwendet werden für die qualitative Bestimmung der Anwesenheit von irgendeinem von speziellen Immunglobuline A und/oder G und/oder M oder ihrer komplementären Antigene.

32. Verfahren nach den Ansprüchen 26 bis 31, wobei verschieden markierte Antigene oder sekundäre Antikörper verwendet werden zur quantitativen oder differenzierten qualitativen Bestimmung spezieller Immunglobuline A und/oder G und/oder M oder ihrer korrespondierenden Antigene.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die verschiedenen Marker verschiedene Enzym und/oder Fluoreszenzmarker für jedes komplementäre Antigen oder jeden komplementären sekundären Antikörper sind.

34. Verfahren nach den Ansprüchen 26 bis 33, wobei Kontroll-Affinitätsreaktionen in entsprechenden Trägerbetten verwendet werden zur Kontrolle von Probenaufgabe und -durchfluß und der Qualität der verwendeten Reagentien.

35. Verfahren nach den Ansprüchen 26 bis 34, wobei die Reaktionssäule direkt mit dem Behälter der zu testenden Flüssigkeit oder einem Blutbehälter verbunden ist und bleibt für eine sichere Probennahme und Testzuordnung, speziell mit einer direkten Verbindung zur Fülleinrichtung des Behälters.

36. Verfahren nach den Ansprüchen 26 bis 35, wobei die Bestimmung durchgeführt wird ohne Kalibrierung nach einer grundsätzlichen Kalibrierung aller Säulen mit Trägerbetten aus einer Herstellungscharge, ohne Referenzmessungen und ohne Regenerierung des Trägerbetts und der verwendeten Reaktivkomponente.

37. Verfahren nach den Ansprüchen 26 bis 36, wobei nach Probenaufgabe kleine Sog- oder Druckkräfte auf die Reaktionssäule ausgeübt werden können zur schnelleren Durchführung.

38. Verfahren nach den Ansprüchen 26 bis 37, wobei ein Automat zur automatischen Probennahme, Probenaufgabe und/oder Messung verwendet wird.