WO1997049992A1 - Verwendung eines trägermaterials zur probenvorbereitung und detektion bei gentechnischen analysenverfahren - Google Patents

Verwendung eines trägermaterials zur probenvorbereitung und detektion bei gentechnischen analysenverfahren Download PDF

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WO1997049992A1
WO1997049992A1 PCT/EP1997/003332 EP9703332W WO9749992A1 WO 1997049992 A1 WO1997049992 A1 WO 1997049992A1 EP 9703332 W EP9703332 W EP 9703332W WO 9749992 A1 WO9749992 A1 WO 9749992A1
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WO
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carrier material
affinity
carrying
solid phase
pcr
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PCT/EP1997/003332
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Christoph Erhardt
Peter Miethe
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Abion Beteiligungs- Und Verwaltungsgesellschaft Mbh
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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    • G01N33/545—Synthetic resin

Definitions

  • the present invention relates to a use according to claim 1.
  • Analytical methods which use methods of genetic engineering or other methods based on genes, such as are described, for example, in “Profitmg from Gene-based Diagnostics”, CTB International Publishing Inc., Maplewood 1996, ISBN 1-887566-04-x , such as Amplification reactions by means of molecular biological methods, such as, for example, the polymerase chain reaction (PCR) or hybridization methods such as, for example, the "branched DNA” system with detection amplification by means of multiply branched and labeled connections of the complementary DNA, have become important analytical tools.
  • the amplification methods are known for their sensitivity. For example, PCR is one of the most sensitive analytical methods and has considerable potential for future analytical systems.
  • Another disadvantage of the amplification reactions currently used is that they are disturbed by inhibitors. For example, in analytical tests from whole blood, a polymerase chain reaction is not possible without switching off the inhibitors.
  • the technical problem on which the invention is based is to avoid the above-mentioned disadvantages of the prior art and to enable direct virus detection even with very low titers of the free virus. Furthermore, inhibitors of the amplification reactions are to be switched off.
  • PCT / EP 97/00405 relates to a carrier material in the form of a shaped body, loose fillings of the sorbent material in particle form, in the form of a gel or as a dispersion for the preparation of samples which are examined using genetic engineering analysis methods, the carrier material carries at least one component for carrying out solid phase assays and is permeable to a fluid.
  • the carrier material is characterized in that it has an average pore diameter of 0.1 to 100 ⁇ m, no or a very low non-specific sorption capacity for affective has materials.
  • the carrier material is standardized by the proviso that the component on a specific unit volume of the carrier material for carrying out solid phase assays (affectionate material) has its complementary component with the single homogeneous flow of a certain amount of a dilute solution of the complementary component in one certain concentration of this complementary amount binds specifically in such an amount that fluctuates between several statistically relevant loading processes by a loading value ⁇ 40% and that the bound amount during several subsequent flow-through processes of suitable liquids on the carrier material, such as blockages of specific or non-specific ones Adsorption sites, washing of the carrier material loaded with the component for carrying out solid phase assays, and addition of affinity-reactive materials, remain constant in the range mentioned.
  • the use according to the invention now enables a simple machine-readable detection system, for example for PCR results, to be developed with, in particular, hydrophilic carrier materials in combination with DNA probes and sensitive dyes, as are described in particular in WO 97/19354.
  • the carrier material which can be used according to the invention is operated, for example, as an analytical enrichment column with high specificity, selectivity and high degree of enrichment.
  • a Sample for example from a larger sample quantity than is directly required for the PCR or from pooled samples, to enrich a sought-after agent, such as a virus, and nucleic acids not searched for by a washing step, as well as substances containing DNA / RNA or other interfering substances such as, for example Remove inhibitors.
  • a sought-after agent such as a virus
  • nucleic acids not searched for by a washing step as well as substances containing DNA / RNA or other interfering substances such as, for example Remove inhibitors.
  • different agents can also be enriched from a (larger) sample without additional sampling and, if necessary, separately amplified by separating the layers before the elution.
  • the elution of the corresponding devices in which the support materials according to the invention are arranged is preferably carried out directly with the start buffer of the respective method, e.g. the polymerase chain reaction in a corresponding reaction vessel.
  • This pre-cleaning immunoaffinity treatment increases the selectivity of amplification reactions, in particular the PCR test, so that the high sensitivity of this method can be exploited in an ideal way.
  • This variant also ensures band amplification of the amplified DNA in corresponding electrophoresis gels or a deepening of color in the detection in devices according to the invention, or even enables reliable detection in the extremely low concentration range, as the exemplary embodiment shows.
  • the measuring range for standardized PCR amplification is defi ned by at least two orders of magnitude shifted to lower concentrations (standardized Sampling) .
  • the device according to the invention for sample preparation (enrichment and / or purification) and for subsequent detection (qualitative and / or quantitative) supplements the actual PCR, it is used, for example, when using branched DNA ("branched DNA” ) is used as the exclusive device, ie the virus sought (or the DNA sought if required) is enriched in a device according to the invention. After that, the detection is carried out either directly with a branched multi-marked Affinity partner, or the virus is eluted and digested and accordingly bound and detected in a second device according to the invention.
  • branched DNA branched DNA
  • Inhibitors of the amplification reaction are also removed by the use of the sorbents according to the invention.
  • a device that can be used according to the invention with the carrier materials that can be used according to the invention can, after amplification of the samples, also be used to quantify the corresponding nucleic acid, e.g. DNA.
  • the carrier material is used for the quantification, which in the first step binds the nucleic acid (DNA) generated in the amplification reaction (PCR).
  • the quantitative detection with highly sensitive dyes, which are used, for example, is then carried out using DNA probes, preferably biotinylated DNA probes. coupled with streptavidin.
  • the carrier material which can be used according to the invention for carrying out a solid phase assay can be in the form of a shaped body, loose fillings, a sorbent material in particle form, which is explained in more detail in PCT / EP 97/00405, in the form of a gel or as a dispersion.
  • the carrier material carries at least one component for carrying out solid phase assays and is also permeable to a fluid.
  • the carrier material has an average pore diameter of 0.1 to 100 ⁇ m, the pore in the case of corresponding materials being understood to mean the interspace between particulate particles and not the porosity of the surface of the corresponding particle.
  • the carrier material has no or only very low non-specific sorption ability for affinity materials. In contrast, it has a high affinity for certain components which are complementary to the affinity material arranged on the carrier material.
  • the carrier material according to the invention is standardized by the proviso that the component located on a certain bulk volume of the carrier material for carrying out solid phase assays (affinity material) is its complementary component with a single homogeneous flow of a certain amount of a certain solution of this complementary component in a certain concentration of this complementary component, specifically in such an amount that it fluctuates between several statistically relevant loading processes by an average loading value of at most + 40%.
  • the fluctuation is in particular not more than ⁇ 30%, preferably + 20% and in particular preferably not more than + 10%.
  • the bound amount remains constant in the mentioned range even in the case of several subsequent flow-through processes of suitable other liquids on the carrier material. Again, eluting liquids are not suitable.
  • Blocking steps of specific or unspecific adsorption sites in particular washing of the carrier material loaded with the component for carrying out solid phase assays, further affinity binding steps for marking and / or reinforcement, etc. are particularly suitable as further flow-through processes.
  • the carrier material according to the invention is advantageous because it can be manufactured relatively easily, without great expenditure of time and equipment, and in particular also easily by the user himself, from easily available components, namely, on the one hand, from the sorbent according to PCT / EP 97 / 00405 and the affinity material or materials used for Carrying out a solid phase assay are required as well as a flow-through vessel.
  • buffer solutions can also be offered, which can be used to load the carrier material.
  • the carrier material which can be used according to the invention is obtainable by loading the sorption material according to PCT / EP 97/00405 in a single flow through a certain amount of at least one solution with a certain concentration of at least one component for carrying out solid phase assays. It is further preferred that the carrier material carries at least one component for carrying out solid phase assays of the carrier material and that free unspecific sorption sites of the carrier material are blocked.
  • the carrier material which can be used according to the invention in particular carries an affinity material composed of molecules, groups of molecules or particles with affine properties for other substances.
  • the affinity material is particularly selected from the group of enzymes, substrates which interact with enzymes, antibodies, antigens, such as high-molecular substances or pollen or other allergens, haptens, biotin or streptavidin, nucleic acids from RNA or DNA Type, especially those that can be hybridized with other nucleic acids, receptor or ligands of a receptor, viruses, bacteria, cells, cell organs, blood cells, particles, such as colloidal particles of metals, metal oxides, polymers or combinations of the affinity materials mentioned.
  • the carrier material according to the invention can also be produced from the carrier material according to the invention by bringing the analyte (s) into contact with the carrier material without prior modification with non-specific material.
  • the device for use according to the invention is preferably a hollow body, in the lumen of which one or more of the carrier materials which can be used according to the invention are arranged are. If one or more carrier materials with different components for solid phase assays are arranged in the device, this is done in such a way that a homogeneous flow through the hollow body, in particular the areas with carrier material, is ensured. In particular, there should be no edge effects or other areas in which the flow is faster or slower than at other points. This property is essentially determined by the standardization of the carrier material. In addition, an exact fit of the sorption or carrier material with the most exact geometric shape possible (cylinder with cross section corresponding to the cross section of the flow-through vessel) is important according to the invention.
  • the sorption and / or carrier materials can be fixed in the form of loose fillings or gels by means of devices arranged in the lumen of the hollow body. These devices preferably have a homogeneous flow behavior for a fluid, in particular solutions with analytes, furthermore the devices have in particular only a low own or preferably no unspecific sorption capacity for affinity materials.
  • a process for the production of the support material which can be used according to the invention is based on the fact that the support material which can be used according to the invention is treated with one or more affinity materials, in each case essentially in solution with a specific concentration in a certain amount of liquid. This can be done on the one hand in a batch process, on the other hand and preferably, however, in a homogeneous flow in a hollow body with an inlet and outlet opening, in which the carrier material is arranged.
  • the latter procedure has the advantage that a standardized carrier material with a high, uniform loading in relation to the concentration used is obtained in a very short time and without any outlay on equipment.
  • a comparable loading in the batch process takes a very long time, since initially only outer areas of the sorbent are loaded in the difference for the flow-through method, in which the entire material, ie also the inner surface, comes into contact with the affinity material quickly.
  • the latter procedure enables the carrier material to be produced directly by the user in a simple manner.
  • the corresponding carrier material can also be produced in larger batches and then in devices for carrying out solid phase assays.
  • free sorption points of the carrier material are blocked with corresponding substances which are inert in the solid phase assay to be carried out. If necessary, the carrier material is washed one or more times.
  • the carrier material and pure preliminary product can be found in PCT / EP 97/00405.
  • the homogeneous flow relevant according to the invention is correlated with a uniform pore structure, particularly with regard to the adsorbing inner surface, over the surface of the support materials, but also over their cross section, i.e. in the direction of flow.
  • a uniform pore structure particularly with regard to the adsorbing inner surface, over the surface of the support materials, but also over their cross section, i.e. in the direction of flow.
  • Such a symmetrical, homogeneous pore structure is advantageous.
  • HBV hepatitis B virus
  • HDV hepatitis D virus
  • Round frit made of polyethylene, 5 mm in diameter, 5 mm in height, precise in shape for the cross section of a flow-through vessel, punched out of filter plates which were produced by sintering from polyethylene powder with a narrow particle size distribution by sieving (particle size below 250 ⁇ m); Nominal pore size 50 ⁇ m (bubble point),
  • Pore size distribution with Coulter porometer from 5.492 to 138.6 ⁇ m, average pore size 13.64 ⁇ m, 1.063% of the pore number over 27.5 ⁇ m, 15.45% over 15.92 ⁇ m (Abion GmbH, Irishlich, Germany); round, tapered, empty flow-through vessels in the lower part according to DE 4126436 AI, diameter 5 mm, capacity for sample solutions via a 5 mm high frit attached to the upper end of the conical part, approx. 0.8 ml (from Abion GmbH , Irishlich, Germany);
  • the volume of the carrier material was 80 ⁇ l
  • HBV-IgG bound to the carrier material was 40 ⁇ g.
  • a conventional PCR for HBV-DNA and HDV-RNA is described below in comparison with a treatment on the carrier material to be used according to the invention.
  • the reaction mixture contained 10 ul of a PCR buffer (105 mM Tris HCl, pH 8.8, 81.5 mM ammonium sulfate, 30 mM magnesium dichloride, 0.5% nonidet P40 - Tween 20), 4 ul of each dNTP mixture, 5 units Taq Polymerase (Biomaster, Moscow), each 200 pM of the primer were added.
  • the primers were selected using the PRIMER MASTER 1.0 computer program and flanked the surface gene region of 359 bp.
  • the PCR was carried out in 30 cycles using the following temperature profile: 93 ° C, 1 min, 58 ° C, 1 min, 72 ° C, 1.2 min.
  • the amplified fragments were analyzed in agarose gels and stained with ethidium bromide.
  • 100 ⁇ l of serum were diluted with an equal volume of a w-500 buffer containing 50 mM Tris HCl, pH 8.0, 150 mM sodium chloride, 0.1% sodium azide, 0.5% Tween 20 and on a column described above loaded with the carrier material to be used according to the invention.
  • the virus parmules were washed with 100 ⁇ l of a denaturing solution containing 50 mM Tris HCl, pH 8.0, 1% SDS, 25 mM EDTA, eluted.
  • the eluate was collected in an Eppendorf tube and incubated 30 mm at a temperature of 60 ° C. Thereafter, it was precipitated with ethanol.
  • the pellet was collected by centrifugation, washed twice with 70% ethanol and dissolved in 100 ul water.
  • the HBV-DNA was then amplified by means of PCR. 30 ⁇ l of the DNA solution were amplified in 50 ⁇ l PCR reaction mixture.
  • Serum RNA was obtained by acidic guadinium thiocyanate phenol / chloroform extraction. The following reagents were successively added to 100 ⁇ l of the serum
  • the suspension obtained was shaken vigorously and cooled on ice for 5 mm.
  • the sample was centrifuged at 10,000 g for 20 min at 4 ° C.
  • the aqueous phase was extracted with an equal volume of chloroform and the aqueous phase obtained was precipitated with a volume of isopropanol.
  • the RNA pellet was dissolved in 50 ⁇ l water and treated with diethyl pyrocarbonate.
  • RNA obtained was added to 17 ul reverse transcription (RT) mixture.
  • This mixture contained 4 ⁇ l of a 5 ⁇ RT buffer (250 mM Tris HCl, pH 8.3, 250 mM potassium chloride, 50 mM magnesium dichloride, 50 mM DTT, 2.5 mM spermidine), 2 ⁇ l 10 mM per deNTP, 1 ⁇ l (100 ng) of random hexanucleotides, 0.5 ⁇ l (20 units) HPRI (from Promega) and 9.5 ul water.
  • the mixture was heated at 94 ° C for 3 minutes and then cooled on ice. After denaturation, 1 ul (10 units) AMV reverse transcriptase (Promega) and 0.5 ul (20 units) HPRI were added.
  • the cDNA synthesis was carried out at 37 ° C for 45 min.
  • 10 ul of the cDNA were amplified in 50 ul of the PCR reaction mixture containing 10 ml of a 5-fold PCR buffer (150 mM Tris HCl, pH 8.8, 81.5 mM ammonium sulfate, 0.5% nonidet P40 - Tween 20), 4 ⁇ l of 10 mM of the respective dNTP, 1 ⁇ l (5 units) of Taq polymerase (Biomaster), 1 ⁇ l (200 pM) of each backward or forward primer contained.
  • the PCR was carried out in 40 cycles, the following temperature profile being maintained: 94 ° C., 1 minute, 57 ° C., 1 minute, 72 ° C., 1.2 minutes.
  • the amplified fragments were analyzed in an agarose gel and stained with ethidium bromide.
  • 100 ⁇ l of the serum was diluted with an equal volume of 150 mM sodium chloride and loaded onto the column described above. After washing the column with 500 ⁇ l of a solution of 150 mM sodium chloride, the virus particles were eluted with 200 ⁇ l of denaturing solution containing 3.2 M guanidium thiocyanate, 20 mM sodium citrate, pH 7.0, 0.4% sarcosyl. The eluate was collected in Eppendorf tubes, mixed well with 2 mM sodium acetate, pH 4, 0 and 2 ⁇ l 2-mercaptoethanol and then precipitated with ethanol.
  • RNA pellet After centrifuging the RNA pellet, it was dissolved in 20 ⁇ l of water and 10 ⁇ l of the RNA solution was used in the reverse transcription reaction (RT reaction).
  • RT reaction reverse transcription reaction
  • the RT reaction and the PCR were carried out as described above.
  • the examples show the following result:
  • the DNA was extracted from 10 HBV PCR positive and 5 HBV PCR negative subjects according to the standard method of DNA isolation. These were used with the carrier material to be used according to the invention in corresponding columns. The amplification of these DNA samples showed the presence of specific fragments in a total of 10 cases. Amplification of the DNA samples, which had been isolated according to the standard method, gave no specific fragments.
  • HBV-DNA and HDV-RNA that have been extracted using the carrier material with purified virus particles to be used according to the invention can be used for PCR tests in amounts equivalent to 100 ⁇ l. In this case, an increase in the synthesis efficiency is observed.
  • RNA samples from anti-HD positive and HDV RNA negative patients were examined.
  • 500 ⁇ l of each serum were applied to columns which contained the carrier material to be used according to the invention, RNA was collected from viral particles and extracted using the phenol-chloroform method, followed by ethanol precipitation. The total amount of RNA isolated was subjected to the reverse transcript reaction and half of the RT Mixtures used in the PCR. The sera were tested in parallel in the standard RT-PCR assay. Specific HDV genome fragments were observed in three samples which were treated using the support materials used in columns according to the invention, whereas no specific fragments could be determined in samples according to the standard assay.

Abstract

Verwendung eines Trägermaterials in Form eines Formkörpers, loser Schüttungen des Sorptionsmaterials in Partikelform, in Form eines Gels oder als Dispersion zur Vorbereitung und Detektion von Proben, die mit gentechnischen Analyseverfahren untersucht werden, wobei das Trägermaterial mindestens eine Komponente zur Durchführung von Festphasenassays trägt und für ein Fluidum durchlässig ist; das Trägermaterial einen mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis 100 νm aufweist; das Trägermaterial keine oder eine sehr niedrige unspezifische Sorptionsfähigkeit für Affinitätsmaterialien hat; das Trägermaterial standardisiert ist durch die Maßgabe, daß die auf einem bestimmten Einheitsvolumen des Trägermaterials befindliche Komponente zur Durchführung von Festphasenassays (Affinitätsmaterial) ihre komplementäre Komponente beim einmaligen homogenen Durchfluß einer bestimmten Menge einer verdünnten Lösung der komplementären Komponente in einer bestimmten Konzentration dieser komplementären Menge spezifisch in einer solchen Menge bindet, die zwischen mehreren statistisch relevanten Beladungsvorgängen um einen Beladungswert ± 40 % schwankt; und daß die gebundene Menge bei mehreren anschließenden Durchströmungsvorgängen geeigneter Flüssigkeiten an dem Trägermaterial, wie Blockierungen spezifischer oder unspezifischer Adsorptionsstellen, Waschungen des mit der Komponente zur Durchführung von Festphasenassays beladenen Trägermaterials sowie Zuführung von affinitätsreaktiven Materialien, in dem genannten Bereich konstant bleibt.

Description

Verwendung eines Träσermaterials zur ProbenVorbereitung und Detektion bei αentechnischen Analvsenverfahren
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung gemäß Patentanspruch 1.
Analytische Verfahren, die sich der Methoden der Gentechnik oder anderer Verfahren auf Genbasis bedienen, wie sie z.B in "Profitmg from Gene-based Diagnostics" , CTB International Publishing Inc., Maplewood 1996, ISBN 1-887566-04-x beschrie¬ ben werden, wie z.B. Amplifizierungsreaktionen mittels molekularbiologischer Methoden, wie beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder Hybπdisierungsmethoden wie beispielsweise das "Branched DNA" System mit Nachweis- Verstärkung durch vielfach verzweigte und markierte Verbin¬ dungen der komplementären DNA, sind wichtige analytische Werkzeuge geworden. Die Amplifikationsmethoden sind für ihre Sensitivitat bekannt. So ist beispielsweise die PCR eine der sensitivsten Analysemethoden und besitzt ein erhebliches Potential für künftige Analytiksysteme. Paradoxerweiεe ist in diesem Falle allerdings die extrem hohe Sensitivitat auch nachteilig, da damit eine eingeschränkte Selektivität bei hohem Anteil an Fremd-DNA m der Probe sowie sogenannte "Side Contammations" aus der Umgebung zu beobachten sind Oft schließt sich eine aufwendige Detektion und Interpretation dei Versuchsergebnisse an. Desweiteren wirkt sich auf die Verbreitung der PCR ein geringer Automatlonsgrad hemmend aus.
Desweiteren tritt nachteilig in Erscheinung, daß bei Proben, die in großer Verdünnung vorliegen, es nicht garantiert ist, daß eine zu verstärkende oder mit Markierungsverstarkung nachzuweisende Nuklemsaure überhaupt in der gezogenen und der Amplifikation zugeführten Probe vorhanden ist. So liegt beispielsweise ein Virustiter bei vielen Erkrankungen, insbesondere bei in Behandlung befindlichen Viruserkran¬ kungen, so niedrig, daß eine sichere Beurteilung der Frage, ob noch Viren im Patienten vorhanden sind oder nicht, mittels der zu Verfügung stehenden Untersuchungsmethoden zum direkten Nachweis des Virus nicht möglich ist. Dies ist darauf zurück¬ zuführen, daß bei einer Untersuchung das entnehmbare Volumen einer Blutprobe regelmäßig nicht sehr groß ist (Poissonbe- reich) .
Ein weiterer Nachteil der zur Zeit angewendeten Ampliflka- tionsreationen besteht darin, daß sie durch Inhibitoren gestört werden. So ist beispielsweise bei analytischen Untersuchungen aus Vollblut eine Polymerasen-Kettenreaktion ohne Ausschalten der Inhibitoren nicht möglich.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht darin, die oben genannten Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden und den direkten Virusnachweis auch bei sehr geringen Titern des freien Virus zu ermöglichen. Des weiteren sollen Inhibitoren der Amplifikationsreaktionen ausgeschaltet werden.
Überraschenderweise lassen sich die oben genannten Nachteile durch die erfindungsgemäße Verwendung des in der PCT/EP 97/00405 genannten Trägermaterials vermeiden. Die PCT/EP 97/00405 betrifft ein Trägermaterial in Form eines Formkör- pers, loser Schüttungen des Sorptionsmaterials in Partikel- form, m Form eines Gels oder als Dispersion zur Vorbereitung von Proben, die mit gentechnischen Analyseverfahren unter¬ sucht werden, wobei das Trägermaterial mindestens eine Komponente zur Durchführung von Festphasenassays tragt und für ein Fluidum durchlässig ist. Das Trägermaterial ist dadurch gekennzeichnet, daß es einen mittleren Porenαurch- messer von 0,1 bis 100 μm aufweist, keine oder eine sehr niedrige unspezifιsche Sorptionsfähigkeit für Affmitats- materialien hat. Ferner ist das Trägermaterial standardisiert durch die Maßgabe, daß die auf einem bestimmten Einheitsvolu¬ men des Trägermaterials befindliche Komponente zur Durchfüh¬ rung von Festphasenassays (Affmitatsmaterial) ihre komple¬ mentäre Komponente beim einmaligen homogenen Durchfluß einer bestimmten Menge einer verdünnten Lösung der komplementären Komponente in einer bestimmten Konzentration dieser komple¬ mentären Menge spezifisch in einer solchen Menge bindet, die zwischen mehreren statistisch relevanten Beladungsvorgängen um einen Beladungswert ± 40% schwankt und, daß die gebundene Menge bei mehreren anschließenden Durchströmungsvorgängen geeigneter Flüssigkeiten an dem Trägermaterial, wie Blockie¬ rungen spezifischer oder unspezifischer Adsorptionsstellen, Waschungen des mit der Komponente zur Durchführung von Festphasenassays beladenen Trägermaterials sowie Zuführung von äffinitätsreaktiven Materialien, in dem genannten Bereich konstant bleibt.
Die erfindungsgemäße Verwendung ermöglicht nun, mit insbeson¬ dere hydrophilen Trägermaterialien m Kombination mit DNA- Sonden und empfindlichen Farbstoffen, wie sie insbesondere in der WO 97/19354 beschrieben sind, ein einfaches maschinen¬ lesbares Detektionssystem z.B. für PCR-Ergebnisse zu entwick¬ eln. Dabei wird das erfindungsgemäß verwendbare Trägermate¬ rial z.B. als analytische Anreicherungssäule mit hoher Spezifität, Selektivität und hohem Anreicherungsgrad betrie¬ ben. Unter Einsatz von zu der gesuchten Nuklemsäure affinen Substanzen, wie vorzugsweise monoklonalen Antikörpern, gegebenenfalls aber auch nach dem Aufschluß des gesuchten Agens mit Hilfe von Antisense- Nukleinsäuren oder Oligonuk- leotiden, die mit der gesuchten Nuklemsäure zumindest teilweise hybridisieren, wird es möglich, aus einer Probe, beispielsweise aus einer größeren Probenmenge als direkt für die PCR benotigt oder aus gepoolten Proben, ein gesuchtes Agens, wie beispielsweise ein Virus, anzureichern, und durch einen Waschschritt nicht gesuchte Nukleinsäuren sowie DNA/RNA haltige Substanzen oder andere störende Substanzen wie z.B. Inhibitoren zu entfernen. Durch mehrere Schichten des Träger¬ materials mit unterschiedlichen Affinitätspartnern lassen sich aus einer (größeren) Probe ohne zusätzliche Probennahme auch verschiedene Agentien anreichern und bei Bedarf durch Trennung der Schichten vor der Elution getrennt amplifizie- ren.
Die Elution der entsprechenden Vorrichtungen, in denen die erfindunsgemäßen Trägermaterialien angeordnet sind, erfolgt vorzugsweise direkt mit dem Startpuffer der jeweiligen Metho¬ de, z.B. der Polymerase-Kettenreaktion in ein entsprechendes Reaktionsgefäß. Diese Immunoaffinitätsbehandlung sorgt durch Vorreinigung für eine erhöhten Selektivität von Amplifika- tionsreaktionen, insbesondere des PCR-Tests, wodurch in idealer Weise die hohe Sensitivitat dieser Methode ausgenutzt werden kann. Diese Variante sorgt dabei auch für eine Banden¬ verschärfung der amplifizierten DNA in entsprechenden Elek¬ trophorese-Gelen oder für eine Farbvertiefung beim Nachweis in erfindungsgemäßen Vorrichtungen, oder sie ermöglicht sogar erst den sicheren Nachweis im extrem niedrigen Konzentra¬ tionsbereich, wie das Ausführungsbeispiel zeigt. Bei Verwen¬ dung von Trägermaterialien mit hoher Beladung des affinen Reaktionspartnerε, die auch aus größeren Probenmengen quan¬ titativ die gesamte Menge an vorhandenem Agens bindet, wird der Meßbereich für standardisierte PCR-Amplifikation defi¬ niert um mindestens zwei Größenordnungen zu geringeren Konzentrationen verschoben (standardisierte Probenahme) .
Während bei der PCR-Methode die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Probenvorbereitung (Anreicherung und/oder Reinigung) und zur anschließenden Detektion (qualitativ und/oder quantita¬ tiv) die eigentliche PCR ergänzt, wird sie z.B. bei der Verwendung von verzweigter DNA ("branched DNA") als aus¬ schließliche Vorrichtung verwendet, d.h. der gesuchte Virus (oder bei Bedarf die gesuchte DNA) wird in einer erfindungs¬ gemäßen Vorrichtung angereichert . Danach erfolgt entweder direkt der Nachweis mit einem verzweigten multi-markierten Affinitätspartner, oder der Virus wird eluiert und aufge¬ schlossen und in einer zweiten erfindungsgemäßen Vorrichtung entsprechend gebunden und nachgewiesen.
Durch den erfindungsgemäßen Einsatz der Sorptionsmittel werden auch Inhibitoren der Amplifikationsreaktion entfernt.
Eine erfindungsgemäß verwendbare Vorrichtung mit den er¬ findungsgemäße verwendbaren Trägermaterialien kann nach erfolgter Amplifikation der Proben auch zur Quantifizierung der entsprechenden Nukleinsäure, z.B. DNA, herangezogen werden.
Im Sinne eines Immunoassays wird das Trägermaterial für die Quantifizierung eingesetzt, das im ersten Schritt die in der Amplifikationsreaktion (PCR) entstandene Nukleinsäure (DNA) bindet. Über DNA-Sonden, vorzugsweise biotinylierte DNA- Sonden, wird anschließend der quantitative Nachweis mit hochempfindlichen Farbstoffen, die z.B. mit Streptavidin gekoppelt sind, durchgeführt. Insbesondere vorteilhaft an dieser Verfahrensweise ist, daß durch den Einsatz des genannten erfindungsgemäß verwendbaren Trägermaterialε eine automatisierbare Anreicherung und/oder Quantifizierung erreicht werden kann.
Das erfindungsgemäß verwendbare Trägermaterial zur Durch¬ führung eines Festphasenassays kann in Form eines Formkör¬ pers, loser Schüttungen, eines Sorptionsmaterials in Par¬ tikelform, das in der PCT/EP 97/00405 näher erläutert wird, in Form eines Gels oder als Dispersion vorliegen. Das Träger¬ material trägt mindestens eine Komponente zur Durchführung von Festphasenassays und ist ebenfalls für ein Fluidum durch¬ lässig. Das Trägermaterial weist einen mittleren Porendurch¬ messer von 0,1 bis 100 μm auf, wobei als Pore bei entspre¬ chenden Materialien der Zwischenraum zwischen partikelförmi- gen Teilchen verstanden wird und nicht die Porosität der Oberfläche des entsprechenden Partikels. Das Trägermaterial weist keine oder nur sehr geringe unspezifische Sorptions¬ fähigkeit für Affinitätsmaterialien auf . Hingegen weist es eine hohe Affinität für bestimmte zu den auf dem Trägermate¬ rial angeordneten Affinitätsmaterial komplementäre Komponen¬ ten auf .
Das Trägermaterial gemäß der Erfindung ist standardisiert durch die Maßgabe, daß die auf einem bestimmten Emheits- volumen des Trägermaterials befindliche Komponente zur Durchführung von Festphasenassays (Affinitätsmaterial) ihre komplementäre Komponente, bei einmaligem homogenen Durchfluß einer bestimmten Menge einer bestimmten Lösung dieser kom¬ plementären Komponente in einer bestimmten Konzentration dieser komplementären Komponente, spezifisch in einer solchen Menge bindet, daß diese zwischen mehreren statistisch rele¬ vanten Beladungsvorgängen um einen mittleren Beladungswert um höchstens + 40% schwankt. Die Schwankung beträgt insbeson¬ dere nicht mehr als ± 30%, vorzugsweise + 20% und insbesonde¬ re bevorzugt nicht mehr als + 10%. Die gebundene Menge bleibt auch bei mehreren anschließenden Durchströmungsvorgängen geeigneter anderer Flüssigkeiten an dem Trägermaterial in dem genannten Bereich konstant. Nicht geeignet sind wiederum eluierende Flüssigkeiten.
Als weitere Durchströmungsvorgänge kommen insbesondere Blockierungsschritte spezifischer oder unspezifischer Adεorptionsstellen, insbesondere Waschungen des mit der Komponente zur Durchführung von Festphasenassays beladenen Tragermaterials, weitere Affinitätsbindungsschritte zur Markierung und/oder Verstärkung etc. in Betracht.
Das erfindungsgemäße Trägermaterial ist vorteilhaft, da eε relativ einfach ohne großen Zeit- und apparativen Aufwand und insbesondere auch leicht beim Anwender selbst hergestellt werden kann, aus leicht zur Verfügung zu stellenden Komponen¬ ten, nämlich zum einen aus dem Sorptionsmittel gemäß PCT/EP 97/00405 sowie dem oder den Äffinitätsmaterialien, die zur Durchführung eines Festphasenassays benötigt werden sowie einem Durchflußgefäß. Darüber hinaus können auch Pufferlösun¬ gen mit angeboten werden, die zur Beladung des Trägermate¬ rials verwendet werden können. Das erfindungsgemäß verwend¬ bare Trägermaterial ist erhältlich durch Beladen des Sorp- tionsmaterials gemäß PCT/EP 97/00405 im einmaligen Durchfluß einer bestimmten Menge von mindestens einer Lösung mit einer bestimmten Konzentration mindestens einer Komponente zur Durchführung von Festphasenassays. Weiterhin ist bevorzugt, daß das Trägermaterial mindestens eine Komponente für die Durchführung von Festphasenassays des Trägermaterials trägt und freie unspezifisohe Sorptionsstellen des Trägermaterials blockiert sind.
Das erfindungsgemäß verwendbare Trägermaterial trägt ins¬ besondere ein Affinitätsmaterial aus Molekülen, Molekül¬ gruppen oder Teilchen mit affinen Eigenschaften zu anderen Substanzen. Das Affinitätsmaterial ist insbesondere ausge¬ wählt aus der Gruppe der Enzyme, mit Enzymen in Wechselwir¬ kung tretenden Substraten, Antikörpern, Antigenen, wie hochmolekularen Substanzen oder Pollen oder anderen Allerge¬ nen, Haptenen, Biotin oder Streptavidin, Nucleinsäuren vom RNA- oder DNA-Typ, insbesondere solche, die hybridisierbar mit anderen Nucleinsäuren sind, Rezeptor oder Liganden eines Rezeptors, Viren, Bakterien, Zellen, Zellorga-nellen, Blutkör¬ perchen, Teilchen, wie kolloidalen Teilchen von Metallen, Metalloxiden, Polymeren oder Kombinationen der genannten Affinitätsmaterialien. Das erfindungsgemäße Trägermaterial kann aus dem erfindungsgemäßen Trägermaterial auch dadurch hergestellt werden, daß der oder die Analyten mit dem Trägermaterial in Kontakt gebracht werden, ohne daß eine vorherige Modifikation mit nicht spezifischem Material erfolgt .
Die Vorrichtung zur erfindungsgemäßen Verwendung ist vorzugs¬ weise ein Hohlkörper, in dessen Lumen eines oder mehrere der erfindungsgemäß verwendbaren Trägermaterialien angeordnet sind. Sind ein oder mehrere Trägermaterialien mit unter¬ schiedlichen Komponenten für Festphasenassays in der Vor¬ richtung angeordnet, so erfolgt dies in der Weise, daß ein homogenes Durchströmen des Hohlkörpers, insbesondere der Bereiche mit Trägermaterial, gewährleistet ist. Es sollen also insbesondere keine Randeffekte auftreten oder andere Bereiche gebildet werden, in denen der Durchfluß schneller oder langsamer ist, als an anderen Stellen. Diese Eigenschaft ist im wesentlichen durch die Standardisierung des Trager¬ materials bestimmt. Außerdem ist ein exaktes Einpassen des Sorptions- bzw. Trägermaterials mit möglichst exakter geome¬ trischer Form (Zylinder mit Querschnitt entsprechend dem Querschnitt des Durchflußgefäßeε) erfindungsgemäß wichtig. Die Sorptions- und/oder Trägermaterialien können ι_n Form loser Schüttungen oder Gele mittels im Lumen des Hohlkörpers angeordneten Einrichtungen fixiert sein. Diese Einrichtungen weisen vorzugsweise ein homogenes Durchströmverhalten für ein Fluidum, insbesondere Lösungen mit Analyten auf, des- weiteren haben die Einrichtungen insbesondere ein nur geringes eigenes oder vorzugsweise kein unspezifischeε Sorptionsvermögen für Affinitätsmaterialien.
Ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäß verwend¬ baren Tragermaterials geht davon aus, daß das erfindungsgemäß verwendbare Trägermaterial mit einem oder mehreren Äffini¬ tätsmaterialien jeweils im wesentlichen in Lösung mit bestim¬ mter Konzentration in einer bestimmten Flüssigkeitsmenge behandelt wird. Dies kann zum einen im Batch-Verfahren erfolgen, andererseits und bevorzugt jedoch im homogenen Durchfluß in einem Hohlkörper mit Ein- und Auslaßöffnung, in dem das Trägermaterial angeordnet ist. Letztere Vorgehens¬ weise hat den Vorteil, daß in sehr kurzer Zeit und ohne apparativen Aufwand ein standardisiertes Trägermaterial mit im Verhältnis zur eingesetzten Konzentration hoher, gleichmä¬ ßiger Beladung erhalten wird. Eine vergleichbare Beladung im Batch-Verfahren dauert sehr lange, da zunächst nur äußere Bereiche des Sorptionsmittels beladen werden im Unterschied zum Durchflußverfahren, bei dem das gesamte Material, d.h. auch die innere Oberfläche, schnell mit dem Affmitätεmate- rial in Berührung kommt. Außerdem ermöglicht letztere Vor¬ gehensweise, daß die Herstellung des Tragermaterials m einfacher Weise beim Anwender direkt erfolgen kann. Ist dies jedoch nicht erwünscht, kann das entsprechende Trägermaterial auch m größeren Ansätzen hergestellt werden und dann m Vor¬ richtungen zur Durchführung von Festphasenassays verbracht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform deε erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen Trager¬ materials sind freie Sorptionsstellen des Tragermaterials mit entsprechenden Substanzen, die sich im durchzuführenden Festphasenassay inert verhalten, blockiert. Gegebenenfalls wird das Trägermaterial ein oder mehrmals gewaschen.
Weitere spezifische Ausführungsformen, des Tragermaterials und reines Vorprodukt sind aus der PCT/EP 97/00405 entnehm¬ bar.
Der erfindungsgemäß relevante homogene Durchfluß, den die erfindungsgemäß verwendbaren Trägermateriallen gewährleisten müssen, ist korreliert mit einer gleichförmigen Porenstruk- tur, besonders bezüglich der adsorbierenden inneren Ober¬ flache, über die Fläche der Trägermatenalien, aber auch über deren Querschnitt, d.h. in Richtung des Durchflusses. Eine solche symmetrische, homogene Porenεtruktur ist vorteilhaft. Es ist jedoch auch möglich, asymmetrische Porenstrukturen zu verwenden, mit in Durchflußrichtung gesehen z.B. zuerst kleineren Poren, um eine größere innere Oberfläche zur Ver¬ fügung zu stellen, gefolgt von größeren Poren, damit die Durchflußgeεchwindigkeit nicht zu klein wird.
Das Sorptionεmaterial zur Herstellung des erfindungsgemäß verwendbaren Tragermaterials sowie weitere Eigenschaften und Vorteile αeε Tragermaterials ergeben sich aus der PCT/EP 97/00405 sowie WO 97/19354 auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Die Erfindung wird nachstehend weiter erläutert .
Beispiel 1
Polymerase-Kettenreaktion mit HBV (Hepatitis B Virus) und HDV (Hepatitis D Virus) .
Materialien:
Runde Fritte aus Polyethylen, 5 mm Durchmesser, 5 mm Höhe, formgenau für den Querschnitt eines Durchflußgefäßes, ge¬ stanzt aus Filterplatten, die durch Sintern aus Polyethylen- pulver mit enger Korngrößenverteilung durch Aussieben herge¬ stellt wurden (Korngröße unter 250 μm) ; Nenn-Porengröße 50 μm (Bubble Point) ,
Porengrößenverteilung mit Coulter Porometer von 5,492 bis 138,6 μm, mittlere Porengröße 13,64 μm, 1,063% der Porenzahl über 27,5 μm, 15,45% über 15,92 μm (Abion GmbH, Jülich, Deutschland) ; runde im unteren Teil konisch verlaufende, leere Durchflußge¬ fäße gemäß DE 4126436 AI, Durchmesser 5 mm, Fassungsvermö¬ gen für Probenlösungen über eine am oberen Ende des konischen Teils angesetzte, 5 mm hohe Fritte, ca. 0, 8 ml (Firma Abion GmbH, Jülich, Deutschland) ;
Das Volumen des Trägermaterials betrug 80 μl;
Die Beladung mit Affinitätskomponente Maus-anti-HDV- bzw.
HBV-IgG am Trägermaterial gebunden) betrug 40 μg.
Im folgenden wird eine konventionelle PCR für HBV-DNA und HDV-RNA beschrieben im Vergleich mit einer Behandlung an dem erfindungsgemäß zu verwendenden Trägermaterial. Standairdver- fahren zur HDV Genomdetektion mittels PCR. Isolierung der DNA aus Serum
Zu 100 μl Aliquots des Serums wurden 16 μl eines Denatuπe- rungspuffers enthaltend eine 100 mM Tris HC1, pH 8, 0, 2% (Gewicht/Volumen) gegeben. Zur Molekulargewichtsbestimmung wurden 1. λ/Bst El Molekulargewichtsmarker zugefügt. Das Serum wurde analysiert. Positiven Kontrollfragmenten wurden neben SDS, 50 mM EDTA hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wurde 30 mm bei 60°C inkubiert, gefolgt von einer Phenol-Chloro¬ form-Extraktion. Die Nukleinsäure wurde mit Ethanol präzipi- tiert, durch Zentrifugation gesammelt, zweimal mit 70%ιgem Ethanol gewaschen und in 100 μl Wasser gelöst.
PCR der HBV-DNA
30 μl der DNA-Lösung wurde in 50 μl PCR-Reaktionsmischung ampliflziert. Die Reaktionsmischung enthielt 10 μl eines PCR- Puffers (105 mM Tris HCl, pH 8,8, 81,5 mM Ammoniumsulfat, 30 mM Magnesiumdichlorid, 0,5% nonidet P40 - Tween 20), 4 μl jeder dNTP Mischungen, 5 Einheiten Taq-Polymerase (Biomaster, Moskau) , jeweils 200 pM des Primers wurden zugegeben. Die Primer wurden mit Hilfe des Computer-Programms PRIMER MASTER 1.0 ausgewählt und flankierten die Oberflächen Genregion von 359 bp. Die PCR wurde m 30 Zyklen durchgeführt unter Verwen¬ dung des folgenden Temperaturprofils: 93°C, 1 min, 58°C, 1 min, 72°C, 1,2 min. Die amplifizierten Fragmente wurden in Agarose-Gelen analysiert und mit Ethidiumbromid angefärbt.
HBV-Genom-Detektion mittels Verwendung des erfindungsgemäß verwendbaren Trägermaterials
Isolierung von DNA aus Serum
100 μl Serum wurden mit einem gleichen Volumen eines w-500 Puffers enthaltend 50 mM Tris HCl, pH 8,0, 150 mM Natrium- chlorid, 0,1% Natriumazid, 0,5% Tween 20 verdünnt und auf eine weiter oben beschriebene Säule mit dem erfindungsgemäß zu verwendenden Trägermaterial geladen. Nach Waschen der Säule mit 500 μl des w-500 Puffers wurden die Virusparmkel mit 100 μl einer denaturierenden Lösung, die 50 mM Tris HCl, pH 8,0, 1% SDS, 25 mM EDTA, enthielt, eluiert . Das Eluat wurde in einem Eppendorf-Gefäß gesammelt und 30 mm bei einer Temperatur von 60°C inkubiert Danach prazipitierte man mit Ethanol. Das Pellet wurde mittels Zentrifugation gesammelt, zweimal mit 70% Ethanol gewaschen und in 100 μl Wasser gelöst . Danach erfolgte die Amplifikation der HBV-DNA mittels PCR Dabei wurden 30 μl der DNA-Lösung in 50 μl PCR-Reak- tionsmischung ampliflziert .
Standardverfahren der RT (reverse Transcriptase) PCR zur Detektion des HDV-Genoms
RNA aus Serum wurde mittels der sauren Guadiniumthiocyanat- Phenol/Chloroform-Extraktion gewonnen. Zu 100 μl des Serums wurden die folgenden Reagenzien nacheinander zugegeben-
1) Denaturierungslösung aus 4 M Guadiniumthiocyanat, 25 mM Natriumeitrat, pH 7,0, 0,5% Sarcosyl,
2) 50 μl 2M Natriumacetat, pH 4,0,
3) 3 μl 2-Mercaptoethanol,
4) 10 μg tRNA,
5) 550 μl wassergesättigtes Phenols und 100 μl Chloroform.
Die erhaltene Suspension wurde intensiv geschüttelt und 5 mm auf Eis gekühlt. Die Probe wurde 20 min bei 4°C bei 10.000 g zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahiert und die erhaltene wäßrige Phase mit einem Volumen Isopropanol präzipitiert. Nach Zentrifuga- tion und Behandlung mit 70%igem kalten Ethanol wurde das RNA- Pellet in 50 μl Wasser gelöst und mit Diethylpyrocarbonat behandelt .
cDNA-Synthese und PCR
2 μl der erhaltenen Serum RNA wurde zu 17 μl reverser Trans- criptions(RT) -Mischung gegeben. Diese Mischung enthielt 4 μl eines 5 x RT Puffers (250 mM Tris HCl, pH 8,3, 250 mM Kalium- chlorid, 50 mM Magneεiumdichlorid, 50 mM DTT, 2,5 mM Sper- midin) , 2 μl 10 mM je deε dNTP, 1 μl (100 ng) von Random Hexanukleotiden, 0,5 μl (20 Einheiten) HPRI (von Promega) und 9,5 μl Wasser. Die Mischung wurde 3 min bei 94°C erwärmt und dann auf Eis gekühlt. Nach Denaturierung wurden 1 μl (10 Einheiten) AMV reverse Transcriptase (Promega) und 0,5 μl (20 Einheiten) HPRI hinzugefügt. Die cDNA-Synthese wurde 45 min bei 37°C durchgeführt.
10 μl der cDNA wurden in 50 μl der PCR-Reaktionsmischung amplifiziert, die 10 ml eines 5fach PCR-Puffers (150 mM Tris HCl, pH 8,8, 81,5 mM Amoniumsulfat, 0,5% nonidet P40 - Tween 20) , 4 μl 10 mM des jeweiligen dNTP, 1 μl (5 Einheiten) Taq- Polymerase (Biomaster), 1 μl (200 pM) jedes Rück- bzw. Vor- wärts-Primers enthielt. Die PCR wurde in 40 Zyklen durchge¬ führt, wobei folgendes Temperaturprofil eingehalten wurde: 94°C, 1 min, 57°C, 1 min, 72°C, 1,2 min. Die amplifizierten Fragmente wurden in einem Agarose-Gel analysiert und mit Ethidiumbromid angefärbt .
Isolierung der HDV-RNA mit dem erfindungsgemäß verwenbaren Trägermaterial
100 μl des Serums wurden mit einem gleichen Volumen von 150 mM Natriumchlorid verdünnt und auf die oben beschriebene Säule geladen. Nach Waschen der Säule mit 500 μl einer Lösung von 150 mM Natriumchlorid wurden die Viruspartikel mit 200 μl denaturierender Lösung enthaltend 3,2 M Guanidiumthiocyanat, 20 mM Natriumeitrat, pH 7,0, 0,4% Sarcosyl eluiert. Das Eluat wurde in Eppendorf-Röhrchen gesammelt, zusammen mit 2 mM Natriumacetat, pH 4 , 0 und 2 μl 2-Mercaptoethanol, gut ge¬ mischt und dann mit Ethanol präzipitiert. Nach Zentrifugation des RNA-Pellets wurde dieses in 20 μl Wasser gelöst und 10 μl der RNA-Lösung in der reverεe Transcriptionsreaktion (RT- Reaktion) verwendet. Die RT-Reaktion und die PCR wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die Beispiele zeigen folgendes Ergebnis :
Die DNA wurde aus 10 HBV PCR positiven und 5 HBV PCR negati¬ ven Versuchspersonen extrahiert gemäß der Standardmethode der DNA-Isolation. Diese wurden mit dem erfindungsgemäß zu verwendenden Trägermaterial in entsprechenden Säulen verwen¬ det . Die Amplifikation dieser DNA-Proben zeigte Anwesenheit spezifischer Fragmente in insgesamt 10 Fällen. Amplifikation der DNA-Proben, welche gemäß der Standardmethode isoliert worden war, ergaben keine spezifischen Fragmente.
Erfindungsgemäß zu verwendende Trägermaterialien für die Analyse von Proben mit niedrigen Virustiter
HBV-DNA und HDV-RNA, die extrahiert wurden unter Anwendung des erfindungsgemäß zu verwendenden Trägermaterials mit gereinigten Viruspartikeln, kann für PCR-Untersuchungen in Mengen äquivalent 100 μl verwendet werden. In diesem Fall wird eine Zunahme der Synthese-Effizienz beobachtet.
25 Patienten mit nicht detektierbarer HBV-DNA gemäß Stan¬ dardverfahren, die therapeutisch behandelt worden waren, wurden untersucht. 1.000 μl jedes Serums wurden auf Säulen mit dem erfindungsgemäß zu verwendenden Trägermaterial geladen. Die DNA wurde ohne Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert . Die Gesamtmenge der isolierten DNA wurde in die PCR-Reaktion überführt. Unter 25 negativen Proben wurden 5 HBV-DNA positive Sera gefunden.
Desweiteren wurden sechs Serumproben von Anti-HD-positiven und HDV-RNA-negativen Patienten untersucht. In diesem Falle wurden 500 μl jedes Serums auf Säulen aufgetragen, die das erfindungsgemäß zu verwendende Trägermaterial enthielten, RNA wurde aus viralen Partikeln gesammelt und mit der Phenol- Chloroform-Methode extrahiert, gefolgt von Ethanol-Präzipita- tion. Die Gesamtmenge der isolierten RNA wurde der reversen Transcriptaεe-Reaktion unterzogen und die Hälfte des RT- Gemisches in der PCR eingesetzt. Die Seren wurden parallel im Standard RT-PCR-Assay getestet. Spezifische HDV-Genomfrag- mente wurden in drei Proben beobachtet, welche unter Anwen¬ dung der in Säulen verbrachten erfindungsgemäß verwendbaren Trägermaterialien behandelt waren, wohingegen keine spezifi¬ schen Fragmente in Proben gemäß Standardassay ermittelt werden konnten.
Entsprechende Ergebnisse werden durch eine Detektion erhal¬ ten, bei dem die Säulen mit einer DNA-Sonde beladen sind und der Nachweis mit einer zweiten DNA, die mit ABION RED® mar¬ kiert, erfolgt. Dabei zeigt sich keine Rotfärbung bei nor¬ maler PCR Durchführung und eine deutliche Rotfärbung bei vorheriger Anreicherung.
Dadurch wird erkennbar, daß die Anwendung der Säulen mit den erfindungsgemäß zu verwendenden Trägermaterial es erlauben, Templets für die PCR in schneller und einfacher Weise zu erhalten und Faktoren der PCR und RT-Inhibition zu vermeiden. Insbesondere vorteilhaft ist, daß die gesamte Templet-Isolie¬ rung binnen einer Stunde durchführbar ist und nicht die Verwendung des sonst üblichen Laborzubehörs benötigt.
Die erfindungsgemäß beschriebene Verwendung für Selektion spezifischer HBV und HDV viraler Partikel führt zu einer erhöhten PCR-Detektionseffizienz.

Claims

Patentansprüche
Verwendung eines Trägermaterials in Form eines Formkör- perε, loser Schüttungen des Sorptionsmaterials in Partikelform, in Form eines Gels oder als Dispersion zur Vorbereitung und Detektion von Proben, die mit gentechnischen Analyseverfahren untersucht werden, wobei das Trägermaterial mindestens eine Komponente zur Durchführung von Festphasenassays trägt und für ein Fluidum durchlässig ist das Trägermaterial einen mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis 100 μm aufweist, das Trägermaterial keine oder eine sehr niedrige unspe¬ zifische Sorptionsfähigkeit für Affinitätsmaterialien hat, das Trägermaterial standardisiert ist durch die Ma߬ gabe, daß die auf einem bestimmten Einheitsvolumen des Trägermaterials befindliche Komponente zur Durchführung von Festphasenassays (Affinitätsmaterial) ihre komple¬ mentäre Komponente beim einmaligen homogenen Durchfluß einer bestimmten Menge einer verdünnten Lösung der kom¬ plementären Komponente in einer bestimmten Konzentra¬ tion dieser komplementären Menge spezifisch in einer solchen Menge bindet, die zwischen mehreren statistisch relevanten BeladungsVorgängen um einen Beladungswert ± 40% schwankt und, daß die gebundene Menge bei mehreren anschließenden Durchströmungsvorgängen geeigneter Flüssigkeiten an dem Trägermaterial, wie Blockierungen spezifischer oder unspezifischer Adsorptionsstellen, Waschungen des mit der Komponente zur Durchführung von Festphasenassays beladenen Tragermaterials sowie Zuführung von affini¬ tätsreaktiven Materialien, in dem genannten Bereich konstant bleibt .
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gentechnische Analyseverfahren ein Amplifikations- verfahren, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) , oder Hybridisierungsmethoden wie beispielsweise das "Branched DNA"-Verfahren ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 und/oder 2 zur Anreicherung von zu amplifizierenden Nukleinsäuren.
4. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Erhöhung der Selektivität und Sensitivitat der Amplifikation von Nukleinsäuren in Proben in denen die zu untersuchenden Nukleinsäuren in geringer Konzentra¬ tion vorhanden sind.
5. Verwendung nach Anspruch 5 zur Vermeidung des Pois- εonbereichε bei Probenaufnahme aus Systemen, in denen die gewünschte Nukleinsäure nur in geringer Konzentra¬ tion vorhanden ist.
6. Verwendung nach Anspruch 1 bis 5 zur Ausschaltung von Inhibitoren der gentechnischen Analyseverfahren.
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