AT395434B - Verbessertes verfahren zum nachweis von nucleinsaeuren und reagenzienkombination und besteck zu seiner durchfuehrung - Google Patents

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Description

AT 395 434 B
Die Erfindung betrifft ein schnelles und empfindliches Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mit Hilfe von Hybridisierungstechniken, bei dem die Detektorsonden als modifizierte Primer in Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebaut werden, bevor die Hybridisierungsreaiktion durchgeführt wird. Außerdem betrifft die Erfindung eine Reagenzienkombination und ein Besteck zur Durchführung dieses Verfahrens. S Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mit Hilfe von
Hybridisierungstechniken, bei dem die Einfangsonden als modifizierte Primer in Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäuren eingebaut werden, bevor die Hybridisierungsreaktion durchgeführt wird. Die Erfindung betrifft ferner eine Reagenzienkombination und ein Besteck zur Durchführung dieses Verfahrens.
Bei Hybridisierungsreaktionen wird ein markiertes Oligo- oder Polynukleotid, d. h. das Sondenmolekül, über 10 Basenpaarungen an eine nachzu weisende Nukleinsäure angelagert. Verschiedene Hybridisierungsverfahren wurden zum Nachweis von Nukleinsäuren verwendet. Bei direkten Hybridisierungsverfahren befindet sich die Probe entweder in Lösung oder sie ist an einen festen Träger gebunden. Die nachzuweisende Nukleinsäure wird mit einem markierten Sondenmolekül nachgewiesen.
Die US-PS 4 486 539 beschreibt ein Sandwich-Hybridisierungs-Verfahren. Bei diesem Verfahren werden zwei 15 getrennte Sondenmoleküle verwendet. Eines davon ist eine Detektorsonde. Sie ist markiert und wird zum Nachweis verwendet Die andere ist eine Einfangsonde. Sie ist an einem festen Träg« immobilisiert und dient der Abtrennung der nachzuweisenden Nukleinsäure vom Reaktionsgemisch.
Das Hybridisierungsverfahren in Lösung wird in der GB-OS 2 169 403 beschrieben. Bei diesem Verfahren werden zwei verschiedene Sondenmoleküle verwendet, die sich in derselben Lösung befinden. Die Detektorsonde 20 wird mit einer nachweisbaren Markierung markiert. Die Einfangsonde wird mit einer Gruppe versehen, die eine Affinität für einen anderen Bestandteil aufweist. Nach der Hybridisierung wird das zwischen der Einfangsonde, der nachzuweisenden Nukleinsäure und der Detektorsonde gebildete Hybrid aus der Hybridisierungslösung mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares abgetrennt
Die enzymatisch katalysierte DNA-Polymerisation, bei der die Nukleotidsequenz eines vorgegebenen 25 Nukleinsäurestranges, d. h. einer Matrize, exaktkopiert wird und dabei der komplementäre Strang synthetisiert wird, ist aus dem Stand der Technik gut bekannt; vgl. z. B. Komberg, „DNA replication“, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 221 - 225 und 670 - 679,1980, und Maniatis et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 122,1982. Diese biologische Vermehrung wirdbei Hybridisierungs-Nachweisverfahren verwendet, also in Nachweisverfahren, bei denen der nachzuweisende Mikroorganismus gezüchtet und dadurch 30 seine DNA vor der Durchführung des Tests angereichert wird; vgl. z. B. Woo, Methods Enzymol. 68 (1979), S. 389, und US-PS 4 358 535. Spezifische DNA-Sequenzen lassen sich auch in lebenden Zellen amplifizieren, z. B. durch Verwendung geeigneter Arzneistoffe; vgl. z. B. Clewell und Helinski, J. Bacteriol. 110 (1972), S. 1135, und EP-A 55 742. Eine noch spezifischere DNA-Anreicherung wird in der EP-A175 689 beschrieben. Dabei wild die nachzuweisende Nukleinsäure mit einem Plasmid-Replikon verbunden und in eine geeignete Zelle eingeführt. Eine 35 weitere Methode wird in der EP-A 201184 beschrieben. Dabei wird die Primer-abhängige DNA-Synthese in einer in vitro-Reaktion zur Amplifikation der nachzuweisenden DNA benützt. In der EP-A 200 362 wird ein Verfahren zum Nachweis amplifizierter Nukleinsäure-Sequenzen vorgeschlagen, das jedoch insbesondere zur Durchführung von Reihenuntersuchungen nicht schnell, empfindlich und einfach genug ist
Dementsprechend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein schnell und einfach durchführbares Verfahren 40 zum Nachweis von geringen Nukleinsäure-Konzentrationen bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Bereitstellung eines Hybridisierungsverfahrens gelöst, bei dem entweder die Detektorsonden oder die Einfangsonden als modifizierte Primer wirken, die in die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure während einer matrizenabhängigen Polymerisationsreaktion vor der Durchführung der Hybridisierung eingebaut werden, bei dem also die nachzuweisende Nukleinsäure amplifiziert wird. 45 Im erfindungsgemäßen Verfahren wird mindestens ein Primer benötigt, der immer modifiziert ist. Wenn die
Detektorsonden als Primer bei der Polymerisationsreaktion dienen, weisen die Primer mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierungodermindestens eine spezifischeStelleauf,an diemindestenseinegeeignete,nachweisbare Markierung gebunden werden kann.
In einer anderen Ausführungsform werden die Einfangsonden als Primer bei der Polymerisationsreaktion 50 verwendet Dabei weisen die Primer mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine geeignete Stelle auf, an die mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.
DieErfindungbetrifftaucheineReagenzienkombinationundeinBesteckzur Durchführungdeserfindungsgemäßen Verfahrens. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die Reagenzienkombination in einem unterteilten Behälter. 55 Durch die Verwendung der Detektor- oder Einfangsonden als Primer in einer Polymerisationsreaktion ist es möglich, die Empfindlichkeit der Hybridisierungsreaktion um mehrere Größenordnungen gegenüber Nachweisverfahren zu steigern, bei denen die nachzuweisende Nukleinsäure direkt gemessen wird. Außerdem wird -2-
AT 395 434 B erfindungsgemäß ein bequemes Verfahren zur Durchführung der Hybridisierungsreaktion in Lösung bereitgegestellt, so daß die Hybridmoleküle einfach und schnell aus der Hybridisierungslösung nach der Hybridisierungsieaktion abgetrennt werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders brauchbar zur Diagnose bestimmter Krankheiten, die mit S üblichen Verfahren nur sehr schwer zu diagnostizier»! sind. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet zur Identifizierung von Cytomegalie-Viren und HIV- bzw. AIDS-Viren. Die Figuren zeigen:
Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz der modifizierten Primer (Pa und P5) und der selektiven Sondenmoleküle (Sj und S2), die in den Beispielen 1 bis 3 verwendet werden. Ferner zeigt sie die relativen Stellen der modifizierten Primer (Pa und P5) und der selektiven Sondenmoleküle (Sj und S2) in der in diesem Fall nachzuweisenden 10 Nukleinsäure. Die durchgehenden Linien (A und B) bezeichnen die beiden nachzuweisenden Stränge, die in beiden
Richtungen weitergehen. Die Pfeilspitzen an den Primern (Pa und P|,) bezeichnen die Richtung, in der sie während der Polymerisation verlängert werden.
Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz der modifizierten Primer (Pa und Pj,) und des selektiven Sondenmoleküls (S), die in Beispiel 4 verwendet werden. Ferner zeigt sie die relativen Stellen der modifizierten Primer (Pa und P|,) und IS des selektiven Sondenmoleküls (S) in der in diesem Falle nachzuweisenden Nukleinsäure. Die Linie (A) bezeichnet die RNA und ihre identischen DNA-Kopien und die Linie (B) zeigt die komplementären DNA-Kopien. Die Pfeilspitzen an den Primern (Pa und Pjj) bezeichnen die Richtung, in der sie bei der Polymerisation verlängert werden.
Präparation von Sondenmolekülen 20 Die erfindungsgemäß verwendeten Sondenmoleküle sind Oligo- oder Polynukleotide. Sie können synthetisch oder halbsynthetisch hergestellt werden, je nach dem, welche Herstellungsweise für die als Primer zu verwendenden Sondenmoleküle bevorzugt wird. Außerdem lassen sich die Sondenmoleküle durch DNA-Rekombinationsverfahren oder aus unmittelbar aus der Natur isolierten Nukleinsäuren herstellen. Ein Sondenmolekül kann an einen geeigneten Vektor gebunden werden. Es kann gegebenenfalls Vektorteile enthalten. Eine Reihe erfindungsgemäß verwendbarer 25 Primer und Sondenmoleküle ist im Handel erhältlich.
Die Detektorsonden als modifizierte Primer
In einem der erfindungsgemäßen Verfahren sind die Detektorsonden Oligo- oder Polynukleotide, die an die nachzuweisende Nukleinsäure über Basenpaarungen gebunden werden und als Prim» für eine matrizenabhängige, 30 enzymatische Nukleinsäuresynthese dienen. Wesentlich ist, daß die als Detektorsonde wirkenden Primer mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweisen, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann.
Als Markierunglassen sich verschiedeneradioaktivelsotope oder radioaktivmarkierte Verbindungen verwenden. Die Markierungssubstanz kann auch fluoreszieren, lumineszieren, lichtemittieren oder enzymatisch oder 35 immunologisch nachweisbar sein. Es lassen sich auch Markierungen verwenden, die auf der Affinität von Biotin zu
Avidin oder Streptavidin beruhen, Lanthanid-Chelate, Ferritin- und Häm-Verbindungen. Weitere Beispiele sind immunologisch nachweisbare Haptene, wie AAF und AIF(Acetoxyacetylfluorenderivate).DieIdentifizieningkann auch mit Hilfe von vermittelnden Molekülen, z. B. Proteinen, durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren hängt nicht von der verwendeten Markierung ab. Alle gegenwärtig bekannten 40 Markierungssubstanzen, die für die Hybridisierung von Nukleinsäuren geeignet sind, lassen sich verwenden. Es ist jedoch wesentlich, daß die Markierung aus einer Gruppe von Markierungen ausgewählt wird, die nicht die Funktion des Primers stören, sofern die Detektorsonden als Primer verwendet werden. Der als Detektorsonde verwendete Primer muß so mit der Markierung versehen werden, daß die Nukleinsäure-Polymerase den Primer immer noch als solchen erkennt. 45
Die Einfangsonden als modifizierte Primer
In einem anderen erfmdungsgemäßen Verfahren sind die Einfangsonden Oligo- oder Polynukleotide, die an die nachzuweisendeNukleinsäure über Basenpaarungen gebunden werden undalsPrimer bei einer matrizenabhängigen, enzymatischen Nukleinsäuresynthese wirken. Wesentlich ist, daß die als Einfangsonde wirkenden Primer minde-50 stens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle auf weisen, an die mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann. Das Teil oder die Teile des Affinitätspaares lassen sich auch über ein vermittelndes Molekül an den als Einfangsonde wirkenden Primer binden. Die einzigen Bedingungen sind, daß sich das Hybrid aus der Hybridisierungslösung mit Hilfe des Affinitätspaares abtrennen läßt und daß die Funktion des Primers nicht beeinträchtigt wird. 55 Das Teil des Affinitätspaares ist ein Bestandteil mit einer Affinität für einen anderen Bestandteil. Beispiele solcher Affinitätspaare sind Biotin - Avidin oder Streptavidin, ein Schwermetallderivat - eine Thiogruppe, verschiedene Homopolynucleotide, wie Poly dG - Poly dC, Poly dA - Poly dT und Poly dA - Poly U. Es lassen sich -3-
AT 395 434 B aber auch andere Paare von Verbindungen verwenden, vorausgesetzt, daß sie eine ausreichende Affinität für die spezifischeBindung des modifizierten, als Einfangsonde wirkenden Primers, der in die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäureeingebaut ist, an den festen Träger aufweisen. Geeignete Affinitätspaare sind auch in immunologischen Verfahren verwendete Liganden und Konjugate. 5
Die selektive Einfangsonde
In einem der erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die Detektorsonde als Primer verwendet wird, wird eine selektive Einfangsonde benötigt, um die selektive Abtrennung der Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure zu ermöglichen, in die die modifizierten Primer eingebaut sind. Wesentlich ist, daß die Einfangsonden ausreichend 10 homolog zur nachzuweisenden Nukleinsäure sind, um ihre spezifische Hybridisierung mit den Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure zu gestatten und dadurch die selektive Abtrennung und den Nachweis der als Detektorsonde wirkenden Prima: zu ermöglichen, die in die Kopien dar nachzuweisenden Nukleinsäure eingebaut sind. IS Die selektive Detektorsonde
In einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die Einfangsonden als modifizierte Primer verwendet werden, wird eine selektive Detektorsondebenötigt, um den Nachweis der Kopien der nachzuweisendenNukleinsäuren zu ermöglichen, in die die modifizierten Primer eingebaut sind. Wesentlich ist, daß die Detektorsonde ausreichend homolog zur nachzuweisenden Nukleinsäure ist, um spezifisch mit dieser zu hybridisieren und dadurch die 20 nachzuweisende Nukleinsäure selektiv zu identifizieren. Die Detektorsonden können geeignete, nachweisbare Markierungen aufweisen, beispielsweise die vorstehend genannten.
Reagenzienkombinationen
Die Detektorsonde als modifizierter Primer 25 Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reagenzienkombination, enthaltend mindestens einen modifizierten
Primer, der mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann, und mindestens eine selektive Einfangsonde, die mindestens ein Teil eines Affinitätspaaies oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann. 30
Die Einfangsonde als modifizierter Primer
Die vorliegendeEifindung betrifftauch eineReagenzienkombination enthaltend mindestens einen modifizierten Primer, der mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaaies oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann, und mindestens eine selektive 35 Detektorsonde, die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann.
Die Erfindung beschreibt auch ein für den Nachweis von Nukleinsäure geeignetes Besteck. Das Besteck enthält, gegebenenfalls verpackt in einen unterteilten Behälter, eine der vorstehend genannten Reagenzienkombinationen in Verbindungmitmindestens einem derfolgendenReaktantenoderder folgenden Einrichtungen, diebeimTestverfahren 40 benötigt werden, d. h. gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend mindestens ein Reagens zur matrizenabhängigen Polymerisation, gegebenenfalls ein Gefäß mit den vier Desoxynucleosidtriphosphaten, gegebenenfalls eine für die Durchführung der Polymerisation undder Hybridisierung geeigneteEinrichtung, gegebenenfalls eine zum Abtrennen der Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignete Einrichtung, und gegebenenfalls eine zum Nachweis der Markierung geeignete Einrichtung. Die bevorzugten Einrichtungen und Reaktanten werden nachstehend näh«1 45 erläutert.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden zunächstmindestens zwei modifiziertePrimer zu einer denaturierten Probenlösung zugegeben. Beide Primer sind entweder als Detektorsonde oder als Einfangsonde wirkende Primer. Dabei lagern sich die modifizierten Primer jeweils an den komplementären Strang der nachzuweisendenNukleinsäure, d. h. die Matrize, an. Nach der Zugabe eines Enzyms, das matrizenabhängig Nukleinsäure synthetisiert, werden die 50 Primer verlängert. Dieses Verfahren schreitetin vitro mithoher Ausbeute fort Dabei werden neueNukleinsäurestränge geschaffen, die mehrere tausend Nukleotide lang sein können, sofern die gewählten Bedingungen dafür geeignet sind.
Durch Verwendung eines Überschusses der modifizierten Primer kann der Vorgang wiederholt werden, um komplementäre Kopien der neu synthetisierten Stränge herzustellen, die somit identische Kopien der zunächst 55 verwendeten Matrizen darstellen. Durch Wiederholung dieses Vorgangs wird eine Reaktionskaskade eingeleitet, durch die die nachzuweisende Nukleinsäure vervielfältigt wird. Dieser Vorgang läßt sich so oft wie gewünscht wiederholen, um die gewünschte Nachweisempfindlichkeit zu erhalten. In Fällen, in denen die Konzentration der
AT 395 434 B nachzuweisenden Nukleinsäure nicht extrem niedrig ist, reicht eine Vervielfältigung aus, um die Nukleinsäure nachweisbar zu machen.
Es ist auch möglich, lediglich einen modifizierten Primer beim erfindungsgemäßen Verfahren zu verwenden. In diesem Fall wird die Vervielfältigung jedoch nicht so wirksam sein, wie bei der Verwendung von mindestens zwei 5 Primern, da keine Reaktionskaskade eingeleitet wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann sowohl DNA als auch RNA bestimmt werden. Falls jedoch die zu bestimmende Nukleinsäure eine RNA ist, ist es bequemer, zunächst eine entsprechende cDNA-Kopie der RNA mit einer reversen Transkriptase anzufertigen und sodann das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen.
Nachdem die modifizierten Primer in die Kopien der zu bestimmenden Nukleinsäuren eingebaut sind, wird das 10 Reaktionsgemisch mit einem geeigneten selektiven Sondenmolekül versetzt, das die zu bestimmende Sequenz und ihre Kopien erkennt, und die Hybridisierung wird unter Bedingungen durchgeführt, die für den gewünschten Hybridisierungsvorgang geeignet sind.
Bei der Hybridisierungsreaktion wird je nach Wahl der modifizierten Primer entweder eine selektive Einfangsonde oder eine selektive Detektorsonde mit den Kopien der zu bestimmenden Nukleinsäure hybridisiert, die 1S nunmehr in vielfachen Mengen gegenüber der Ausgangssituation vorliegt.
Falls die ursprüngliche Probe die nachzuweisende Sequenz enthält, hybridisiert das selektive Sondenmolekül mit den neu synthetisierten Kopien der zu bestimmenden Nukleinsäure. Es wird ein Hybrid zwischen dem kopierten Molekül, in das der modifizierte Primer eingebaut ist, und dem selektiven Sondenmolekül gebildet Die gebildeten Hybride lassen sich erfindungsgemäß aus der Hybridisierungslösung in einfacher Weise mit Hilfe des Teils des 20 Affinitätspaares abtrennen, die entweder an dem als Einfangsonde wirkenden Primer oder an der seleküven Einfangsonde befestigt ist. Während der Fraktionierung bleiben die Hybride, die einen solchen Einfangteil aufweisen, an einem festen Träger mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares haften. Die Menge der selektiven Detektorsonde oder des als Detektorsonde wirkenden Primers, die am Träger haften bleibt, kann in an sich bekannter Weise direkt am Trägermaterial oder nach der Elution im Eluat bestimmt werden. Die ermittelte Menge der 25 Markierung ist ein Maß für die Menge der zu bestimmenden Nukleinsäure.
Vor der Fraktionierung wird die Lösung gegebenenfalls verdünnt, um die Bedingungen vorteilhaft für das Affinitätspaar zu beeinflussen. Sodann wird die Lösung mit dem festen Träger in Berührung gebracht. Der zu verwendende Träger kann beispielsweise eine Affmitätschromatographiesäule, ein Filter, eine Plastikoberfläche oder eine Glasoberfläche sein. Günstige Einrichtungen zur Durchführung der Abtrennung sind unterschiedliche 30 Typen von Mikrotiterplatten, Eintauchsystemen oder magnetischen Teilchen. Es ist aber auch möglich, die Abtrennung in Teströhrchen oder mit Körnchen durchzuführen.
Als Trägermaterial kann für die Affinitätschromatographiesäulebeispielsweise ein natürliches oder synthetisches Polymer, wie die Cellulose, Polyacrylamid, Polystyrol, Dextran oder Agarose, verwendet werden. DieseMaterialien können auch als Suspensionen in einem Teströhrchen eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform 35 werden Teströhrchen verwendet, an deren innerer Oberfläche das andere Teil des Affinitätspaares gebunden ist Eine
Voraussetzung für das ausgewählte Material ist, daß es die Bindung eines Bestandteils mit Affinität zu dem Teil des Affinitätspaares gestattet, an den als Einfangsonde wirkenden Primer oder die selektive Einfangsonde gebunden ist.
Es ist nicht erforderlich, das Teil oder die Teile des Affinitätspaares an den als Einfangsonde wirkenden Primer zu Beginn der Polymerisation zu binden. Auch ist es nicht notwendig, die nachweisbare Markierung an den als 40 Einfangsonde wirkenden Primer vor der Polymerisation zu binden. Sie können auch nach der Polymerisation an den modifizierten Primer angelagert oder gebunden werden, der in die Kopien da- nachzuweisenden Nukleinsäure eingebaut ist. Wenn beispielsweise die nachweisbare Markierung bei den Hybridisierungsbedingungen nicht beständig ist, kann sie auch nach der Hybridisierung der selektivenEinfangsondemit denKopien der nachzuweisenden Nukleinsäure zugegeben werden. 45 Wenn die Detektorsonden als modifizierte Primer wirken, die in die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebaut sind, läßt sich das Hybrid aus dem Reaktionsgemisch mit Hilfe selektiver Einfangsonden abtrennen, die an festen Trägem immobilisiert sind. Bei einem derartigen Verfahren wird die Reaktionsgeschwindigkeit dadurch begrenzt, daß die nachzuweisende Nukleinsäure und ihre Kopien, in die die als Detektorsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit der selektiven Einfangsonde hybridisieren müssen, die an einem festen Träger immobilisiert ist. 50 Deshalb wird bei der vorliegenden Erfindung die Hybridisierung in Lösung bevorzugt Falls das Verfahren jedoch mit einer immobilisierten Einfangsonde durchgeführt wird, wird das am festen Träger gebildete Hybrid gewaschen, und die Menge der Markierung am Trägermaterial wird in an sich bekannter Weise gemessen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. 55 Beispiel 1
Nachweis von Cvtomeealievinis-DNA mit als modifizierte Primer wirkenden Detektorsonden
In diesem erfindungsgemäßen Beispiel wird als nachzuweisende Nukleinsäure das rekombinante Plasmid -5-
AT 395 434 B pBR322/CMV Hindin L verwendet. Dieses enthält ein 12,3 kbFragmentdes Cytomegalievirus-Genoms (CMV, AD 169, ATCC VR-538). Die beiden als Detektorsonde verwendeten Primer (Pa und Pj,) (vgl. Fig. 1) haben eine Länge von 20 Nukleotiden und wurden in an sich bekannter Weise mit einem automatischen DNA-Synthesegerät synthetisiert. Sie entsprechen zwei Regionen der CMV-spezifi sehen Insertion, die 111 Nukleotide voneinander entfernt sind. Die beiden selektiven Einfangsonden S j und S2 (vgl. Fig, 1) erkennen Bereiche in jedem der beiden DNA-Stränge, die zwischen den beiden als Detektorsonde wirkenden Primern liegen. Die als Detektorsonde wirkenden Primer (Pa und Ρ^) werden mit ^2P an ihren 5-Enden so markiert, daß ihre spezifische Aktivität 4x10^ CPM/pg beträgt. Die Markierung wird in an sich bekannter Weise mit Polynukleotidkinase und Gamma-^P-ATP durchgeführt; vgl. Maniatis et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
Die 3'-Enden der Einfangsonden werden mit biotinylierten Nukleotiden versehen. Dabei wird Bio 11-dUTP (BRL) und eine terminale Transferase (Promega Biotech.) verwendet; vgl. Riley et al., DNA 5 (4) (1986), S. 333 -337. Das nachzuweisende Plasmid wird durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert. DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, wurde bei Boehringer-Mannheim und Streptavidin-Agarose bei BRL gekauft.
Mit diesen Reagenzien wird das folgende Experiment durchgeführt:
Es werden vier unterschiedliche Reaktionen durchgeführt, die 0,10^, 10^ und 108 Moleküle des nachzuweisenden Plasmids enthalten. Dies entspricht 0,2 x IO'™, 2 x IO**8 bzw. 2x10'^ Mol. Weitere Bestandteile des Gesamtreaktionsvolumens von 50 μΐ sind 2 pMol der beiden Primer, 0,5 mM von jedem der vier Desoxy-nuldeosidtriphosphate (d. h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2,50 mM NaCl und 10 mM Dithiothreitol. Das Reaktionsgemisch wird 2 Minuten auf 100 °C erhitzt und dann 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wird 1 μ1(1 Einheit) DNA-Polymerase zugegeben. Das Gemisch wird nochmals 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Das Auf kochen und das anschließende Anlagem der als Detektorsonde wirkenden Primer sowie die Inkubation mit der DNA-Polymerase bei 37 °C ist ein DNA-Synthesezyklus. Bei diesem Experiment wird der Reaktionszyklus entweder nur einmal durchgeführt oder 5 oder 15 mal wiederholt Nach dem letzten Reaktionszyklus wird die Probe nochmals auf 100 °C erhitzt Sodann werden 100 pMol der selektiven Einfangsonde und 0,9M NaCl, 20 mM EDTA, 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5) und 0,1 % Natriumdodecylsulfat zugegeben. Das Gesamtvolumen beträgt 100 μΐ. Die angegebenen Konzentrationen sind die Endkonzentrationen. Das Gemisch wird sodann 1 Stunde bei 50 °C inkubiert Nach dieser Hybridisierungsreaktion werden200μΐ einer 25 %igen Suspension von Streptavidin-Agarose in IM NaCl, 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5) und 1 mM EDTA zugegeben. Es wird 15 Minuten bei 37 °C in einem Rotationsmischer inkubiert, damit die biotinylierten Moleküle an die Streptavidin-Agarose binden können. Die Agarose wird kurz abzentrifugiert und der Überstand wird abgebaut Sodann wird die Agarose einmal mit gepufferter IMNaCl-Lösung und zweimal mit einer Lösung enthaltend 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat und 0,2 % Natriumdodecylsulphat (pH 8) bei 37 °C gewaschen. Sodann wird die durch die gebildeten Hybride an die Agarose gebundene Radioaktivität mit einem Zählgerät bestimmt Das Isolierungs- und Waschverfahren der die biotinylierten Markierungen enthaltenden DNA-Hybride erfolgt wie in der GB-A 2169 403.
Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle I zusammengefaßt. Aus Tabelle I ergibt sich, daß bei einem einzigen DNA-Synthesezyklus nur dann genügend Radioaktivität für den Nachweis eingebaut wird, wenn hohe Ausgangskonzentrationen der nachzuweisenden Nukleinsäure vorliegen. Werden jedoch 15 DNA-Synthesezyklen durchgeführt, lassen sich selbst sehr geringe Mengen dies»' nachzuweisenden Nukleinsäure nachweisen. Bei ein» großen Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure und 15 DNA-Synthesezyklen wird dieReaktion durch die Menge des als Detektorsonde wirkenden Primers begrenzt.
Tabelle!
Menge der nachzuweisenden ^P-Aktivität in den gesammelten Hybriden a) weisenden Nukleinsäure (Mol) (CPM über Hintergrund) ®) 1 5 15 Anzahl der DNA-Synthesezyklen 0 0 0 0 2xl0-20 ND ND 650 2xl0‘18 ND 300 11000 2 x 10'16 700 13000 36000 -6-
AT 395 434 B a) Mittelwert aus zwei Messungen b) ND: nicht nachweisebar (weniger als zweimal soviel Radioaktivität wie die mitüeie Hintergrundaktivität) Beispiel 2
Bestimmung von Cvtotnegalievirus-DNA mit Einfangsonden als modifizierte Primer Bei diesem erfmdungsgemäßen Beispiel werden die Einfangsonden als Primer verwendet Bis auf die nachfolgend genannten Abweichungen werden die gleichen Reagenzien wie in Beispiel 1 verwendet Die als Einfangsonde wirkenden Primer (Pa und Pj,) (vgl. Fig. 1) werden nicht mit ^P markiert Statt dessen werden ihre 5'-Enden mit einem Biotinrest versehen. Diese chemische Modifizierung wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, vgl. Cholletund Kawashima,Nucleic AcidsResearch, 13 (1985), S. 1529 -1541. Diebeiden selektiven Sondenmoleküle (Sj und S2) (vgl. Fig. 1) werden in diesem Experiment an ihren 5-Enden markiert Sie werden als Detektorsonden verwendet. Ihre spezifischen Aktivitäten sind 2 x 10^ bzw. 2,5 x 10^ cpm/pg.
Die Reaktionsgemische haben die in Beispiel 1 beschriebene Zusammensetzung. Die biotinylierten, als Einfangsonde wirkenden Primer, werden jedoch in lOfacher Menge zugefügt, d. h. 20 pM pro Reaktion. Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden 1,5 oder 15 DNA-Synthesezyklen durchgeführt Sodann worden die Proben auf 100 °C erhitzt und 0,5 pM von jedem der 32p-markierten Sondenmoleküle (Sj und S2) werden zugegeben. Die Hybridisierung wird unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Die Hybride werden sodann an Streptavidin-Agarose gesammelt, gewaschen und die ^-Aktivität wird wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Tabellen
Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure (Mol) 32p.Aktivität in den gesammelten Hybriden a) (CPM über Hintergrund)**) 1 5 15 Anzahl der DNA-Synthesezyklen 0 0 0 0 2 x 10‘20 ND ND 800 2 x IO*18 ND 400 13000 2xl0*16 300 11000 54000 a) Mittelwert aus zwei Messungen b) ND: nicht nachweisbar (vgl. Beispiel 1)
Beispiel 3
Nachweis von Cvtomegalievirus-DNA aus klinischen Proben mit Einfangsonden als modifizierte Primer
In diesem Beispiel wird gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung klinischer Proben geeignet ist Dies erfolgt durch den Nachweis von CMV aus dem Urin eines Kindes, das bekanntermaßen an einer Cy tomegalievirus-Infektion leidet. Der Urin eines gesunden Kindes wird dabei als Kontrolle verwendet Aus zwei Proben mit jeweils 10 ml Urin wird die Gesamt-DNA isoliert nach der Vorschrift von Virtanen et al., J. Clin. Microbiol.20(6) (1984), S. 1083 -1088. Die in 20μ1 H2O gelösten DNA’s werden als nachzuweisendeNukleinsäure in gemäß Beispiel 2 ausgeführten Reaktionen verwendet Nach 10 DNA-Synthesezyklen wird die Probe mit dem markierten, selektiven Sondenmolekül versetzt Sodann wird die Hybridisierung durchgefiihrt und die Hybride werden gesammelt. Die DNA aus dem Urin des Patienten zeigt in den Hybriden eine deutlich erhöhte Radioaktivität, während die des gesunden Kindes lediglich Hintergrund-Radioaktivität zeigt. Die tatsächlichen cpm-Werte sind 2300 bzw. 240.
Beispiel 4
Nachweis von SFV fSemliki Forest-VirusVRNA mit Einfangsonden als modifizierte Primer
Beispiel 4 zeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch für den Nachweis von RNA geeignet ist. Als Modellsystem wird SFV (Semliki Forest-Virus)-RNA verwendet
Die verwendeten Reagenzien sind zwei S’-biotinylierte, als Einfangsonde wirkende Primer (vgl. Fig. 2), die wie -7-
AT 395 434 B in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurden, eine einzige S'-^^P-markierte, selektive Detektorsonde, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, reverse Transkriptase (Promega Biotech) und DNA-Polymerase, Klenow-Fragment (Boehringer Mannheim).
Der erste Schritt beim Nachweis der SFV-RNA ist die Synthese ein» cDNA-Kopie. In 20 μΐ Reaktionsgemisch 5 sind 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 10 mM MgClj, 10 mM Dithiothreitol, 0,5 mM von jedem der vier Desoxynukleosidtriphosphate, 0,5 pg t-RNA, 10 pg SFV-RNA, 10 pM als Einfangsonde wirkender Primer (Pa) und 100 Einheiten reverse Transkriptase enthalten. Dieses Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei 37 °C inkubiert Sodann wird das Gemisch 5 Minuten auf 100 °C erhitzt und bei Umgebungstemperatur abgekühlt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit 50 pl einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 10 mM Dithiothreitol, 10 pM des als Einfangsonde wirkend» Primers (Pjj) und mit 0,5 mM von jedem der vier
Desoxynukleosidtriphosphate versetzt Die Temperatur wird auf 37 °C erhöht. Nach 5 Minuten wird 1 Einheit DNA-Polymerase zugegeben. Es wird 10 Minuten inkubiert und das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten auf 100 °C erhitzt Sodann wird das Reaktionsgemisch auf 37 °C abgekühlt Insgesamt werden 5 DNA-Synthesezyklen durchgeführt. Nach einem letzten Denaturierungsschritt werden 0,1 pMol (1,2 x 10^ cpm) der selektiven Detektorsonde in 80 μΐ 15 lMNaCl,50mMEDTA, 50 mMNatriumphosphat(pH7,5)und0,l%Natriumdodecylsulfatzugegeben. Die Lösung wird 2 Stunden bei 55 °C inkubiert Anschließend werden die Hybride gesammelt und wie in Beispiel 1 beschrieben gewaschen.
Als negative Kontrolle für die Reaktionen wird eine identische Probe in gleicher Weise behandelt, jedoch ohne Zugabe derreversen Transkriptase. Die Probe, in der ausgehend von der RNA mitreverser Transkriptaseeine cDNA-20 Kopie hergestellt wurde, ergibt eine -^P-Aktivität von 420 cpm in den eingefangenen Hybriden, während die negative Kontrolle lediglich 50 cpm ergibt
Beispiel 5
Vergleich verschiedener Methoden zum Nachweis von vervielfältigter DNA 25 In diesem Beispiel werden drei Methoden zum Nachweis von vervielfältigter DNA verglichen. Es werden die
Reagenzien und das Vervielfältigungsverfahren von Beispiel 1 und 2 verwendet Jedoch weiden als selektive Einfang- oder Detektorsemden M13-Clone verwendet, die etwa 100 Nukleotide zwischen den Primern erkennen.
Die M13-Clone werden durch Subclonierung eines Haein-Restriktionsfiagmentes des rekombinanten Plasmids pBR322/CMVHindIIILindenPhagen VektorM13mpl0in üblicher Weiseerhalten. Die als selektiveEinfangsonden 30 zu verwendenden M13-Clone werden unter Verwendung von Photoprobe®-Biotin (Vector Laboratories) mitBiotin modifiziert Die als selektive Detektorsonden zu verwendenden M13-Clone werden mit ^P-dCTP unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Primer-Verlängerung markiert so daß die spezifische Aktivität 2 x 10** cpm/pg beträgt; vgl. Hu und Messing, Gene 17 (1982), S. 271 - 277.
Jetzt werden 10 Vervielfältigungszyklen von 3 x 1(? Molekülen (0,5 x 10*^ Mol) des linearisierten Plasmids 35 pBR322/CMV Hindin L durchgeführt. Zum Nachweis nach der Methode 1 und 2 werden jeweils 2 pMol der ^P- markierten, als Detektorsonde wirkenden Primer (Pa und P^) verwendet Das Vervielfältigungsverfahren wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt Zum Nachweis nach der Methode 3 werden 25 pMol der biotinylierten als Einfangsonde wirkenden Primer im Vervielfältigungsverfahren verwendet Dabei wird die Reaktion wie in Beispiel 2 beschrieb» durchgeführt 40
Ergebnisse der Nachweismethode 1;
Verwendungeiner selektiven Einfangsonde zum Einsammeln der in Lösung mit den Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure gebildet» Hybride.
Bei dies» Nachweismethode werden biotinylierte selektive M13 Einfangsonden zum Einsammeln der ver-45 vielfältigten DNA-Fragmente verwendet Nach dem letzten Vervielfältigungszyklus wird das Prob»gemisch auf 100 °C erhitzt und mit jeweils 2 x 10P Molekül» der biotinylierten, selektiven Anfangssonden sowie mit NaCl (0,6 M), EDTA (5 mMol) Natriumphosphat (20 mMol) und SDS (0,1 %) versetzt. Angegeben sind die Endkonzentrationen in einem Endvolum» von 100 μΐ. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 65 °C inkubiert Die gebildeten Hybride werden an Streptavidin-Agarose wie in Beispiel 1 beschrieben, abgetrennt jedoch wird 50 zusätzlich zweimal jeweils 1 Minute bei 50 °C mit 15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat und 0,2 % SDS gewaschen.
Die Radioaktivität d» abgetrennten Hybride wird gemessen.
Nachweismethode 2:
Verw»dung von vor der Hybridisierung mit den Kopien d» nachzuweisenden Nukleinsäure-immobilisierten, 55 selektiven Einfangsonden.
Bei dies» Methode werden immobilisierte, selektive Ml 3-Sondenmoleküle zum Einfangen der vervielfältigten DNA verw»det Nach den letzten Vervielfältigungszyklus w»den die Proben auf 100 °C erhitzt Sodann werden
AT 395 434 B sie mitNaCl (0,6 M), Natriumcitrat (60 mM), Ficoll® (0,02 %), Poly vinylpyrrolidon (0,02 %), Rinderserumalbumin (0,02 % und denaturierter Heringspermien-DNA (0,2 mg/ml) versetzt Wie angegeben, sind die Endkonzentrationen in einem Endvolum«! von 100 |d. Sodann wird jede Probe mit ein« Nitrocellulosefilterscheibe versetzt, an der 5 x 1010 Moleküle von jedem der selektiven Sondenmoleküle nach dem in der US-PS 4 486 539 beschriebenen S Verfahren immobilisiert sind. Das Gemisch wird 2 oder 18 Stunden bei 65 °C mit Filtern inkubiert. Nach der Hybridisierung weiden die Filter zweimal jeweils 20 Minuten bei 50 °C mit 15 mM NaCl, l,5mMNatriumcitratund 0,2 % SDS gewaschen und die an die Filter gebundene Radioaktivität wird gemessen.
Nachweismethode 3: 10 Verwendung ein« selektiven Detektorsonde zum Nachweis.
Bei dies« Methode werden 32p.maikierte, selektive M13-Detektorsonden zum Nachweis der vervielfältigten DNA verwendet. Die Hybride werden mit Hilfe der als Anfangsonde wirkenden Primer abgetrennt, die an ihren 5'-Enden gemäß Beispiel 2 biotinyliert sind. Die vervielfältigt«! Proben w«den auf 100 °C erhitzt und mit 2 x 10® Molekülen (2x 10^ cpm) von jedem d« 32p-markierten, selektiven Sondenmoleküle wie bei Nachweis-IS methode 1 mit Salzen versetzt. Die Hybridisierung und die Abtrennung der gebildeten Hybride wird gemäß Nach weismethode 1 durchgeführt.
Die bei den drei Nachweismethoden erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle m zusammengefaßt und v«glichen.
Die Methoden 1 und 3 haben den Vorteil einer höheren Hybridisi«ungsgeschwindigkeit in Lösung, v«glichen 20 zur Filt«hybridisierung bei d« Methode 2. Die höchste 32p-Aktivität wird bei der Methode 3 «halten, da die selektive Detektorsonde viele 32p-Atome pro Molekül enthält.
Tabelle ΙΠ 25 Methode Primer Selektives Hybridisierungs- 32p-Aktivi- M13-Sonden- zeit tat in den molekül Std. Hybridmole-kühlen (cpm) a) 30 1 32p-markierter biotinylierte 2 870 Primer als Detektorsonde Einfangsonde 35 2 dto. immobilisierte 2 43 Einfangsonde 18 920 3 biotinylierter 32p-markierte 2 7800 40 Primer als Einfangsonde Detektorsonde a) Mittel aus drei Messungen (cpm über Hintergrund) 45
Beispiel 6
Vervielfältigung von Cvtomegalievirus-DNA mit biotinvliertem als Detektorsonde wirkenden Primern und indirekte Bestimmung mit Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase
Bei diesem Beispiel wird die Vervielfältigung des CMV-Plasmids (pBR322/CMV Hindlll L) mit den als 50 Detektorsonde wirkenden, biotinylierten Primern (Pa und P^) gemäß Beispiel 2 durchgeführt. Die in Beispiel 5 beschriebenen M13-Clone werden mit Sulfongruppen modifiziert und als selektive Einfangsonden verwendet. Die gebildeten Hybride werden in den Bohrungen von Mikrotiterplatten abgetrennt, die mit Disulfon-modifizierte DNA erkennenden Antikörpern beschichtet sind. Der Nachweis der gebildeten Hybride wird schließlich mit einem Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat durchgeführt, das die Biotinreste der Primermoleküle nachweist. 55 Die M13-Clone werden durch eine Sulfonierungsreaktion modifiziert. Dabei werden die von der Firma Orgenics
Ltd (Yavne, Israel) empfohlenen Reagenzien und V«fahren verwendet Polystyrol-Mikrotiterplatten (Nunc, Dänemark) werden mit 10 pg/ml IgG in 10 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH 9,6) über Nacht bei 4 °C beschichtet -9-

Claims (9)

  1. AT 395 434 B Das IgG wurde durch Reinigung eines monoclonalen Antikörpers gegen mit Sulfongruppen modifizierte DNA erhalten (QrgenicsLtd.)· Reaktionsgemische «ithalten 3 x 10^ Moleküle des linearisierten Plasmids pBR322/CMV Hindin L oder Kontrollen ohne Plasmid und 25 pMol von jedem der biotinylierten Primer (Pa und Pjj) weiden unter den in Bei-5 spiel 1 beschrieben«! Bedingungen 10 Vervielfältigungszyklen unterworfen. Die Proben werden auf 100 °C erhitzt und dann mit jeweils 2 x 1θ" Molekülen von jeder der sulfonierten, selektiven Einfangsonden zusammen mit den in Beispiel 5 für die Methode I angegebenen Reagenzien versetzt Das Gemisch wird 2 Stunden bei 65 °C inkubiert, mit 100 μΐ 0,2% Tween 20 verdünnt und in die beschichteten Mikrotiterplatten überführt Die Hybride w«den 2 Stunden bei 37 °C an die Bohrungen der Mikrotiterplatte 10 gebunden. Das Reaktionsgemisch wird v«worfen und die Bohrungen werden jeweils 3 mal mit 0,1 % Tween 20 in 0,15 molar Natriumchlorid, 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5) (PBS) gewaschen. Es werden 200 μΐ eines Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugats (Amersham, UK) zugesetzt, das 1: 2000 in einer lprozentigen Rinderserumalbumin-Lösung mit 0,1 % Tween 20 in PBS verdünnt ist Die Bohrungen der Mikrotiteiplatte werden 45 Minuten bei 37 °C inkubiert Auf diese Weise wird viermal gewaschen. Sodann werden 200 μΐ einer 15 Substratlösung, bestehend aus 0,46 mg/ml o-Phenylendiamin, 0,01 %Η2θ2ΐηΟ,1 M Natriumacetatpuffer (pH 5,0) zugegeben. Nach 15 Minuten bei 22° wird die Umsetzung durch Zugabe von 50 μΐ 2N H2SO4 gestoppt und die Absorption des farbigen Reaktionsprodukts bei 492 nm wird mit einem Photospektrometer gemessen. Diese Abtrennungs- und Nachweisverfahren wurden bereits von Syvänen et al in Nucleic Acids Res. 14 (1986), S. 5037 · 5048 beschrieben. Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle IV zusammengefaßt 3 x 10^ Moleküle 20 (0,5 x 10-18 Mol) des nachzuweisenden Plasmids sind nach 10 Vervielfältigungszyklen deutlich nachweisbar. 25 Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure (Mol) Absorption bei 492 nm a) 0,5 x IO*18 0,348 30 0 0,120 a) Mittelwert aus drei Messungen. 35 PATENTANSPRÜCHE 40 1. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung, dadurch gekennzeichnet, daß man dabei als 45 Einfangsonden modifizierte Primer verwendet die in Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebaut werden und sodann die Kopien durch mindestens eine selektive Detektorsonde nachweist
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 50 (a) mindestens einen Primer der nachzuweisenden Nukleinsäure mit mindestens einem Teil eines Affinitätspaares oder mit mindestens einer spezifischen Stelle bereitstelh, an der mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann; (b) denoderdiealsEinfangsondewirkendenPrimermitdereinzelsträngigen,nachzuweisendenNukleinsäureunter Bedingungen reagieren läßt die eine matrizenabhängige Polymerisationsreaktion gestatten; 55 (c) die einzelsträngig«! Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure, in die die als Einfangsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit einer Detektorsonde hybridisiert die selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisiert; -10- AT 395 434 B (d) die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure, in die die als Einfangsonde wirkenden Primer eingebaut sind mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares abtrennt; und (e) vorliegende selektive Detektorsonden nachweist, die mit den Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisiert haben. 5
  3. 3. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung, bei dem man als Detektorsonden modifizierte Primer verwendet, die in Kopien demachzuweisendenNukleinsäuren eingebaut werden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäuren, in die die modifizierten Primer eingebaut sind, zuerst mit mindestens einer selektiven Einfangsonde hybridisiert, das gebildete Hybrid mit Hilfe der Einfangsonde abtrennt, 10 und sodann das vorliegende Hybrid nachweist
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) mindestens einen Primer der nachzuweisenden Nukleinsäure mit mindestens einer nachweisbaren Markierung 15 oder mindestens einer spezifischen Stelle bereitstellt an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann; (b) den oder die als Detektorsonde wirkenden Primer mit der einzelsträngigen, nachzuweisenden Nukleinsäure unter Bedingungen reagieren läßt, die eine matrizenabhängige Polymerisationsreaktion gestatten; (c) die einzelsträngigen Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure, in die die als Detektorsonde wirkenden Primer 20 eingebaut sind, mit einer Einfangsonde hybridisiert, die selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisiert; (d) die Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure, in die die als Detektorsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit Hilfe der selektiven Einfangsonde abtrennt; und (e) vorliegende Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäuren nachweist. 25
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die selektive Einfangsonde mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestenseinespezifischeStelleaufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.
  6. 6. Reagenzienkombination zum Nachweis von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Be standteile enthält: (a) mindestenseinenmodifiziertenPrimereinernachzuweisendenNukleinsäure.dermindestenseinenachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung 35 gebunden werden kann; und (b) mindestens eine Einfangsonde, die in der Lage ist, selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure zu hybridisieren, und mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.
  7. 7. Reagenzienkombination zum Nachweis von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Be standteile enthält: (a) mindestens einen modifizierten Primer einer nachzuweisenden Nukleinsäure, der mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestenseine spezifischeStelleaufweist,an diemindestensein Teil eines Affinitätspaares 45 gebunden werden kann; und (b) mindestens eine Detektorsonde, die in der Lage ist, selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure zu hybridisieren, und mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann.
  8. 8. Besteck zum Nachweis von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Bestandteile enthält: (a) mindestenseinenmodifiziertenPrimereinernachzuweisendenNukleinsäure,dermindestenseinenachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle auf weist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann; 55 (b) mindestens eine Einfangsonde, die in der Lage ist, selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure zu hybridisieren, und mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann; -11- AT 395 434 B (c) gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend mindestens ein Reagens zur matrizenabhängigen Polymerisation; (d) gegebenenfalls ein Gefäß mit den vier-Desoxynucleosidtriphosphaten; (e) gegebenenfalls eine Einrichtung zur Durchführung der Polymerisation und der Hybridisierung; (f) gegebenenfalls eine Einrichtung zum Abtrennen der Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure; und (g) gegebenenfalls eine Einrichtung zum Nachweis der Markierung.
  9. 9. Besteck zum Nachweis von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Bestandteile enthält: (a) mindestens einen modifizierten Prim»- der nachzuweisenden Nukleinsäure, der mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindestenseinespezifischeStelleaufweist, an diemindestensein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann; (b) mindestens eine Detektorsonde, die in der Lage ist, selektiv mit der nachzuweisenden Nukleinsäure zu hybridisieren, und die mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann; (c) gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend mindestens ein Reagens zur matrizenabhängigen Polymerisation; (d) gegebenenfalls ein Gefäß mit den vier Nukleosidtriphosphaten; (e) gegebenenfalls eine Einrichtung zur Durchführung der Polymerisation und der Hybridisierung; (f) gegebenenfalls eine Einrichtung zur Abtrennung der Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure; und (g) gegebenenfalls eine Einrichtung zum Nachweis der Markierung. Hiezu 1 Blatt Zeichnung -12-
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Families Citing this family (171)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5753433A (en) * 1909-12-05 1998-05-19 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the sensitive detection of nucleic acids
DE4038804A1 (de) * 1990-10-09 1992-04-16 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
FI80476C (fi) * 1987-10-09 1990-06-11 Orion Yhtymae Oy Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning.
CA1325761C (en) * 1987-12-25 1994-01-04 Takanori Oka Method of detecting an intended nucleic acid in a sample
JPH0775560B2 (ja) * 1987-12-25 1995-08-16 湧永製薬株式会社 検体中の目的核酸の検出法
WO1989009281A1 (en) * 1988-03-25 1989-10-05 Akzo N.V. Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid
US5817797A (en) * 1988-06-01 1998-10-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Sequencing DNA; a modification of the polymerase chain reaction
AU629845B2 (en) * 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US5858652A (en) * 1988-08-30 1999-01-12 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
CA2002076A1 (en) * 1988-11-21 1990-05-21 Brent A. Burdick Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids
GB8827160D0 (en) * 1988-11-21 1988-12-29 Apothekernes Lab Detection & quantitative determination of rna & dna
IL92474A (en) * 1988-11-29 1994-04-12 Orion Yhtymae Oy Reaction method and combination for determining nucleotide sequences
US5536648A (en) * 1988-12-09 1996-07-16 Amrad Corporation Limited Amplified DNA assay using a double stranded DNA binding protein
ATE169341T1 (de) * 1988-12-09 1998-08-15 Amrad Corp Ltd Amplifizierter dns-assay
CA2004326A1 (en) * 1988-12-23 1990-06-23 Nanibushan Dattagupta Assay of sequences using amplified genes
ATE142272T1 (de) * 1989-01-19 1996-09-15 Behringwerke Ag Nukleinsäure-amplifikation unter verwendung eines einzelprimers
DK0457824T4 (da) * 1989-02-13 2004-10-11 Geneco Pty Ltd Detektion af en nukleinsyresekvens eller en ændring deri
US5856092A (en) * 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
CA2011818A1 (en) * 1989-03-17 1990-09-17 Fred T. Oakes Methods for purification, amplification and detection of a nucleic acid
CA2013317A1 (en) * 1989-04-17 1990-10-17 Fred T. Oakes Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids
EP0478630B1 (de) * 1989-06-12 1993-09-01 Cis Bio International Verfahren zum nachweis von spezifischen sequenzen von nukleinsäuren und ihre verwendungen
GB8920097D0 (en) * 1989-09-06 1989-10-18 Ici Plc Amplification processes
US5196305A (en) * 1989-09-12 1993-03-23 Eastman Kodak Company Diagnostic and amplification methods using primers having thymine at 3' end to overcome primer-target mismatch at the 3' end
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
US6013431A (en) 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
IL97222A (en) * 1990-02-16 1995-08-31 Orion Yhtymae Oy Method and Responder for Determining Special Changes to Nucleotide
US5387505A (en) * 1990-05-04 1995-02-07 Eastman Kodak Company Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage
NZ240079A (en) * 1990-10-09 1993-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the detection of a nucleic acid or part thereof
EP0566670A4 (en) * 1990-12-17 1993-12-08 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
DE4106251A1 (de) * 1991-02-28 1992-09-03 Boehringer Mannheim Gmbh Nachweis von bakterien mit hilfe einer nukleinsaeureamplifikation
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
US5888819A (en) * 1991-03-05 1999-03-30 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through primer extension
CA2065719A1 (en) 1991-04-30 1992-10-31 John B. Findlay Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle
US5387510A (en) * 1991-10-02 1995-02-07 Eastman Kodak Company Detection of amplified nucleic acid using secondary capture oligonucleotides and test kit
IT1252295B (it) * 1991-11-15 1995-06-08 Schiapparelli Diagnostici Ismu Metodo per rivelare acidi nucleici e relativo kit diagnostico
WO1993013227A1 (en) * 1991-12-23 1993-07-08 Chiron Corporation Cmv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
US5863724A (en) * 1994-04-13 1999-01-26 Baylor College Of Medicine Methods of screening for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy
US5658729A (en) * 1994-10-11 1997-08-19 The University Of British Columbia Method, reagent and kit for evaluating susceptibility to premature atherosclerosis
DE4421901A1 (de) * 1994-06-23 1996-01-04 Bayer Ag Ein DNA-Schnelltest zum Nachweis von chinolonresistenten Staphylococcus aureus Erregern in klinischem Probenmaterial
US5705366A (en) * 1994-09-15 1998-01-06 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor
US5654141A (en) * 1994-11-18 1997-08-05 Thomas Jefferson University Amplification based detection of bacterial infection
US5856096A (en) * 1995-09-20 1999-01-05 Ctrc Research Foundation Rapid and sensitive assays for detecting and distinguishing between processive and non-processive telomerase activities
AU2320597A (en) 1996-03-19 1997-10-10 Molecular Tool, Inc. Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide
US6132954A (en) * 1996-08-20 2000-10-17 Baylor College Of Medicine Methods of screening for agents that delay a cell cycle and compositions comprising era and an analogue of wild-type era
US6071493A (en) 1996-09-20 2000-06-06 Baylor College Of Medicine Method of screening for an agent that inhibits mononuclear phagocyte-plaque component complex formation
US6043283A (en) * 1996-09-20 2000-03-28 Baylor College Of Medicine Tyramine compounds and their neuronal effects
US6482795B1 (en) 1997-01-30 2002-11-19 Myriad Genetics, Inc. Tumor suppressor designated TS10q23.3
US6262242B1 (en) 1997-01-30 2001-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor suppressor designated TS10Q23.3
US6713300B1 (en) 1997-02-27 2004-03-30 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid and amino acid sequences for ATP-binding cassette transporter and methods of screening for agents that modify ATP-binding cassette transporter
IL122147A0 (en) * 1997-11-10 1998-04-05 Technion Res & Dev Foundation Method for labeling polynucleotides
WO1999031248A1 (en) 1997-12-18 1999-06-24 Ecogen, Inc. INSECT-RESISTANT TRANSGENIC PLANTS AND METHODS FOR IMPROVING δ-ENDOTOXIN ACTIVITY AGAINST TARGET INSECTS
US6673914B1 (en) 1998-01-22 2004-01-06 John Wayne Cancer Institute Human tumor-associated gene
US20020147143A1 (en) 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
DE19824900B4 (de) 1998-06-04 2006-05-04 Roche Diagnostics Gmbh DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex
US6743906B1 (en) 1998-10-02 2004-06-01 Board Of Regents, The University Of Texas PPP2R1B is a tumor suppressor
US6468523B1 (en) 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
CN1230444C (zh) 1998-11-16 2005-12-07 德克萨斯州立大学董事会 含有hiv细胞毒t淋巴细胞表位的hiv多肽或肽或其多聚核苷酸表达构建体的用途
US6432642B1 (en) 1999-01-15 2002-08-13 Pe Corporation (Ny) Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection
US6156515A (en) * 1999-02-09 2000-12-05 Urocor, Inc. Prostate-specific gene for diagnosis, prognosis and management of prostate cancer
CA2368194A1 (en) 1999-04-30 2000-11-09 University Of Florida Adeno-associated virus-delivered ribozyme compositions and methods of use
US6838444B1 (en) 1999-06-01 2005-01-04 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for the therapeutic use of an atonal-associated sequence for deafness, osteoarthritis, and abnormal cell proliferation
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
EP1278855B1 (de) 2000-04-21 2008-03-12 Corixa Corporation Verbindungen und verfahren zur behandlung und diagnose von chlamydia-infektionen
DE60134158D1 (de) 2000-06-28 2008-07-03 Corixa Corp Zusammensetzungen und verfahren für therapie und diagnose von lungenkrebs
JP4813746B2 (ja) 2000-07-10 2011-11-09 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 染色体３ｐ２１．３遺伝子は腫瘍サプレッサーである
JP2005504513A (ja) 2001-05-09 2005-02-17 コリクサ コーポレイション 前立腺癌の治療及び診断のための組成物及び方法
JP4338402B2 (ja) 2001-05-22 2009-10-07 ユニバーシティ オブ シカゴ Ｎ４ウイルス一本鎖ｄｎａ依存的ｒｎａポリメラーゼ
EP1436423A4 (de) 2001-09-19 2005-04-13 Intergenetics Inc Genetische analyse zur stratifizierung des krebsrisikos
EP1908851A3 (de) 2001-09-19 2008-06-25 Intergenetics Incorporated Genetische Analyse zur Stratifizierung eines Krebsrisikos
ES2205998B1 (es) * 2001-12-14 2005-08-16 Consejo Sup. Investig. Cientificas. Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv).
EP2224012B1 (de) 2001-12-17 2013-01-30 Corixa Corporation Zusammensetzungen und Verfahren zur Therapie und Diagnose von entzündlicher Darmerkrankung
CA2474910A1 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Sequitur, Inc. Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US6916474B2 (en) 2002-07-15 2005-07-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibodies with increased affinities for anthrax antigens
AU2003258168B2 (en) 2002-08-12 2009-10-29 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions concerning poxviruses and cancer
AU2002951411A0 (en) 2002-09-16 2002-09-26 The University Of Sydney Genotype screen
BRPI0406628A (pt) 2003-01-06 2005-12-06 Corixa Corp Determinados compostos de fosfato de aminoalquil glucosaminida e seu uso
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
EP1604040B1 (de) 2003-03-07 2010-10-13 Rubicon Genomics, Inc. Amplifikation und analyse von gesamtgenom- und gesamttranskriptom- bibliotheken, die durch ein dns-polymerisierungsverfahren produziert wurden
ATE554166T1 (de) 2003-07-25 2012-05-15 Life Technologies Corp Verfahren und zusammensetzungen zur herstellung von rna aus einer fixierten probe
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
NZ551782A (en) 2004-06-03 2010-03-26 Athlomics Pty Ltd Agents and methods for diagnosing stress
WO2006017724A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-16 Becton, Dickinson And Company Sequences and methods for detection of cytomegalovirus
ATE469245T1 (de) 2004-09-14 2010-06-15 Univ Colorado Auf genetischem targeting basierendes verfahren zur behandlung mit bucindolol
PL1859330T3 (pl) 2005-01-28 2013-01-31 Univ Duke Urządzenia i sposoby manipulacji kropelkami na płytkach obwodów drukowanych
JP5187847B2 (ja) 2005-05-06 2013-04-24 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 核酸標的の捕獲方法
US20090264305A1 (en) 2005-07-07 2009-10-22 Athlomics Pty Ltd. Polynucleotide Marker Genes and their Expression, for Diagnosis of Endotoxemia
US7494788B2 (en) 2005-07-11 2009-02-24 Molecular Kinetics, Inc. Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
CN102260742A (zh) 2005-10-21 2011-11-30 基因信息股份有限公司 用于使生物标志产物水平与疾病相关联的方法和装置
US20090317421A1 (en) 2006-01-18 2009-12-24 Dominique Missiakas Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins
EP2007905B1 (de) 2006-03-15 2012-08-22 Micronics, Inc. Integrierte nukleinsäuretests
ES2551892T3 (es) 2006-09-15 2015-11-24 Ottawa Health Research Institute Rhabdovirus oncolítico
US8067179B2 (en) 2006-11-30 2011-11-29 Research Development Foundation Immunoglobulin libraries
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
EP2191001B1 (de) 2007-04-09 2016-06-08 University of Florida Research Foundation, Inc. Raav-vektorzusammensetzungen mit tyrosin-modifizierten capsidproteinen und verwendungsverfahren
WO2008137475A2 (en) 2007-05-01 2008-11-13 Research Development Foundation Immunoglobulin fc libraries
EP2341929B1 (de) 2008-10-06 2017-01-25 University Of Chicago Zusammensetzungen und verfahren im zusammenhang mit bakteriellen emp proteinen
WO2011127032A1 (en) 2010-04-05 2011-10-13 University Of Chicago Compositions and methods related to protein a (spa) antibodies as an enhancer of immune response
PL2414387T3 (pl) 2009-04-03 2016-06-30 Univ Chicago Kompozycje i sposoby związane z wariantami białka A (SpA)
WO2010124058A1 (en) 2009-04-22 2010-10-28 Indiana University Research And Technology Corporation Compositions for use in the treatment of chronic obstructive pulmonary diseases and asthma
CN102686728B (zh) 2009-06-29 2018-09-18 卢米耐克斯公司 具有发夹构象的嵌合引物及其使用方法
EP2272979A1 (de) 2009-06-30 2011-01-12 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Verfahren zum Testen einer Person, die eine Prädisposition für Krebs aufzuweisen scheint
MY160472A (en) 2009-07-17 2017-03-15 Bioatla Llc Simultaneous, integrated selection and evolution of antibody/protein performance and expression in production hosts
US9409983B2 (en) 2009-07-23 2016-08-09 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases
WO2011032088A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Arca Biopharma, Inc. Polymorphisms in the pde3a gene
DK2477499T3 (en) 2009-09-14 2018-06-06 Sillajen Biotherapeutics Inc COMBINATION CANCER THERAPY WITH ONCOLYTIC VACCINIA VIRUS
WO2011070440A2 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
WO2011079273A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Arca Biopharma, Inc. Methods and compositions for cardiovascular diseases and conditions
CA2786569C (en) 2010-01-29 2019-04-09 Micronics, Inc. Sample-to-answer microfluidic cartridge
PT2561067T (pt) 2010-04-23 2019-02-04 Univ Florida Composições de ciclase raav-guanilato e métodos para tratar a amaurose congénita 1 de leber (acl1)
KR20130093084A (ko) 2010-07-02 2013-08-21 더 유니버시티 오브 시카고 단백질 Ａ(ＳｐＡ) 변이체와 관련된 조성물 및 방법
SG10201902596TA (en) 2010-07-16 2019-04-29 Bioatla Llc Novel methods of protein evolution
US9095540B2 (en) 2010-09-09 2015-08-04 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens
EP2455485A1 (de) 2010-11-19 2012-05-23 Anagnostics Bioanalysis GmbH Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren
CA2824277C (en) 2011-01-04 2021-08-31 Jennerex, Inc. Generation of antibodies to tumor antigens and generation of tumor specific complement dependent cytotoxicity by administration of oncolytic vaccinia virus
US8952132B2 (en) 2011-02-07 2015-02-10 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin FC polypeptides
WO2012158238A2 (en) 2011-02-28 2012-11-22 University Of Iowa Research Foundation Anti-müllerian hormone changes in pregnancy and prediction ofadverse pregnancy outcomes and gender
EP2683835B1 (de) 2011-03-08 2017-01-11 King Abdullah University Of Science And Technology Molekulares biomarker-set zur früherkennung von eierstockkrebs
EP2694534B1 (de) 2011-04-08 2018-06-20 Evaxion Biotech ApS Proteine und nukleinsäuren zur verwendung für impstoffe gegen staphylococcus aureus
US8945588B2 (en) 2011-05-06 2015-02-03 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides
WO2012167382A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
EP2723365A1 (de) 2011-06-21 2014-04-30 Oncofactor Corporation Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung und diagnose von krebs
WO2013036799A2 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving nkg2d inhibitors and cancer
EP2766388A1 (de) 2011-10-12 2014-08-20 Møller, Niels Iversen Peptide aus campylobacter jejuni und ihre verwendung bei der impfung
WO2013096798A2 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Amplification of a sequence from a ribonucleic acid
CA2861387A1 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Invenra, Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
EP3805395A1 (de) 2012-04-26 2021-04-14 University Of Chicago Staphylokokken-coagulase-antigene und verfahren zu deren verwendung
WO2014034753A1 (ja) * 2012-08-31 2014-03-06 東レ株式会社 標的核酸の検出方法
ES2730690T3 (es) 2012-12-07 2019-11-12 Suppremol Gmbh Estratificación y tratamiento de pacientes que padecen púrpura trombocitopénica idiopática
KR102102123B1 (ko) 2012-12-21 2020-04-20 퍼킨엘머 헬스 사이언시즈, 아이엔씨. 유체 공학 회로 및 관련 제조 방법
CN107824233B (zh) 2012-12-21 2020-06-30 珀金埃尔默健康科学有限公司 用于微流体用途的低弹性膜
WO2014100725A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Micronics, Inc. Portable fluorescence detection system and microassay cartridge
WO2014116721A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
EP2958994B1 (de) 2013-02-21 2019-05-29 Turnstone Limited Partnership Impfstoffzusammensetzung
WO2014182844A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Micronics, Inc. Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching
CN105189784B (zh) 2013-05-07 2020-06-30 珀金埃尔默健康科学有限公司 用于制备和分析核酸的装置
CA2911303C (en) 2013-05-07 2021-02-16 Micronics, Inc. Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions
US20150098940A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity, and Intensity and Flare
US20160368952A1 (en) 2013-12-03 2016-12-22 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
WO2015105888A1 (en) 2014-01-07 2015-07-16 Bioatla, Llc Proteins targeting orthologs
CN106795473A (zh) 2014-06-11 2017-05-31 精密公司 用于核酸分析的具有集成的测定对照的微流体盒及设备
WO2016075305A2 (en) 2014-11-13 2016-05-19 Evaxion Biotech Aps Peptides derived from acinetobacter baumannii and their use in vaccination
SG11201704660YA (en) 2014-12-08 2017-07-28 Berg Llc Use of markers including filamin a in the diagnosis and treatment of prostate cancer
WO2016113252A2 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting klebsiella pneumoniae
AU2016219511B2 (en) 2015-02-09 2020-11-12 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin Fc polypeptides displaying improved complement activation
EP3070178B1 (de) 2015-03-20 2020-02-12 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren zur diagnose von brustkrebs
WO2017005670A1 (en) 2015-07-04 2017-01-12 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting pseudomonas aeruginosa
RU2018105835A (ru) 2015-07-17 2019-08-19 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Способы амплификации последовательностей нуклеиновых кислот
US10526408B2 (en) 2015-08-28 2020-01-07 Research Development Foundation Engineered antibody FC variants
WO2017144523A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
WO2017214068A1 (en) 2016-06-05 2017-12-14 Berg Llc Systems and methods for patient stratification and identification of potential biomarkers
WO2018127545A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Evaxion Biotech Aps Vaccines targeting pseudomonas aeruginosa
EP3574114B1 (de) 2017-01-26 2022-06-29 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarker für die krankheitsaktivität, die intensität und das auftreten von systemischem lupus erythematodes
US20210349088A1 (en) 2018-10-18 2021-11-11 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers For A Systemic Lupus Erythematosus (SLE) Disease Activity Immune Index That Characterizes Disease Activity
WO2020083904A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Evaxion Biotech Aps Vaccines targeting m. catharrhalis
EP3931206A1 (de) 2019-02-27 2022-01-05 Evaxion Biotech ApS Impfstoffe gegen h. influenzae
SG11202111824UA (en) 2019-04-30 2021-11-29 Larimar Therapeutics Inc Frataxin-sensitive markers for determining effectiveness of frataxin replacement therapy
ES2960366T3 (es) 2019-08-09 2024-03-04 Univ Freiburg Albert Ludwigs Método para diagnosticar cáncer de mama
US20230050225A1 (en) 2020-01-06 2023-02-16 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting Neisseria gonorrhoeae
CN115989415A (zh) 2020-06-30 2023-04-18 健肺生命人工智能公司 用于检测肺癌的方法
WO2022047359A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Berg Llc Protein biomarkers for pancreatic cancer
WO2022216846A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Berg Llc Protein markers for estrogen receptor (er)-positive-like and estrogen receptor (er)-negative-like breast cancer
IL307530A (en) 2021-04-06 2023-12-01 Bpgbio Inc Estrogen receptor-like (ER) breast cancer protein markers LUMINAL A (LA) and LUMINAL B1 (LB1)
IL307528A (en) 2021-04-06 2023-12-01 Bpgbio Inc Protein markers for the prognosis of breast cancer progression
AU2022307747A1 (en) 2021-07-05 2024-01-25 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae
WO2023196937A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring frataxin replacement therapy
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023240201A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring progression and treatment of leigh syndrome
WO2023239940A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3546312A1 (de) * 1985-01-02 1986-07-10 Orion-yhtymä Oy, Espoo Verfahren zur identifizierung von nucleinsaeuren
EP0200362A2 (de) * 1985-03-28 1986-11-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Amplifikation, zum Nachweis und/oder zur Klonierung von Nukleinsäuresequenzen
EP0237362A1 (de) * 1986-03-13 1987-09-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren und Ausstattung zur Bestimmung von spezifischen Nukleotid-Variationen und genetischen Polymorphismen in Nukleinsäuren
EP0238332A2 (de) * 1986-03-19 1987-09-23 Cetus Corporation Flüssiges Hybridisationsverfahren und Satz zum Nachweis der Anwesenheit von Nukleinsäuresequenzen in Proben

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2422956A1 (fr) * 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
US4302204A (en) * 1979-07-02 1981-11-24 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Transfer and detection of nucleic acids
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
BG36086A1 (en) * 1982-01-19 1984-09-14 Glbov Method for inducing interferon
CA1223831A (en) * 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
US4605735A (en) * 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
NO843838L (no) * 1983-09-26 1985-03-27 Ortho Diagnostic Systems Inc Fremgangsmaate for detektering av nukleinsyre
US4749647A (en) * 1984-06-22 1988-06-07 Genetic Systems Corporation Polymerization-induced separation assay using recognition pairs
US4743562A (en) * 1984-08-21 1988-05-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Purified human cytomegalovirus protein
US4563417A (en) * 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes
US4883750A (en) * 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
CA1272443A (en) * 1985-02-22 1990-08-07 Nanibhushan Dattagupta Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences
CA1278755C (en) * 1985-03-15 1991-01-08 William J. Knowles Labelling of oligonucleotides
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB8509367D0 (en) * 1985-04-12 1985-05-15 Amersham Int Plc Nucleic acid hybridisation
US4751177A (en) * 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
GB8515276D0 (en) * 1985-06-17 1985-07-17 Amersham Int Plc Nucleic acid sequencing
US4851331A (en) * 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3546312A1 (de) * 1985-01-02 1986-07-10 Orion-yhtymä Oy, Espoo Verfahren zur identifizierung von nucleinsaeuren
EP0200362A2 (de) * 1985-03-28 1986-11-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Amplifikation, zum Nachweis und/oder zur Klonierung von Nukleinsäuresequenzen
EP0237362A1 (de) * 1986-03-13 1987-09-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren und Ausstattung zur Bestimmung von spezifischen Nukleotid-Variationen und genetischen Polymorphismen in Nukleinsäuren
EP0238332A2 (de) * 1986-03-19 1987-09-23 Cetus Corporation Flüssiges Hybridisationsverfahren und Satz zum Nachweis der Anwesenheit von Nukleinsäuresequenzen in Proben

Also Published As

Publication number Publication date
JPS63243875A (ja) 1988-10-11
HUT50868A (en) 1990-03-28
IE61664B1 (en) 1994-11-16
SE8800864D0 (sv) 1988-03-10
FI94429B (fi) 1995-05-31
FR2613077B1 (de) 1994-11-10
GB2202328A (en) 1988-09-21
US5989817A (en) 1999-11-23
IL102154A0 (en) 1993-01-14
NL194922B (nl) 2003-03-03
DE3807994C2 (de) 1998-08-27
DK129588A (da) 1988-09-12
NO881064D0 (no) 1988-03-10
PT86937A (pt) 1989-03-30
ATA64388A (de) 1992-05-15
AU1193788A (en) 1988-09-15
JP3244500B2 (ja) 2002-01-07
DD272664A5 (de) 1989-10-18
BE1003990A5 (fr) 1992-07-28
FI880994A (fi) 1988-09-12
CA1338207C (en) 1996-04-02
US5476769A (en) 1995-12-19
LU87153A1 (fr) 1988-08-23
IL102154A (en) 1994-04-12
DK175384B1 (da) 2004-09-20
AU622104B2 (en) 1992-04-02
FR2613077A1 (fr) 1988-09-30
NO881064L (no) 1988-09-12
CH677285A5 (de) 1991-04-30
IE880697L (en) 1988-09-11
NL8800594A (nl) 1988-10-03
GB2202328B (en) 1991-07-03
GR1000315B (el) 1992-06-25
DK129588D0 (da) 1988-03-10
GR880100139A (en) 1989-01-31
IL85480A0 (en) 1988-07-31
NL194922C (nl) 2003-07-04
SE8800864L (sv) 1988-09-12
NO172909C (no) 1993-09-22
NZ223700A (en) 1990-04-26
FI94429C (fi) 1995-09-11
ES2006377A6 (es) 1989-04-16
FI880994A0 (fi) 1988-03-03
SE500262C2 (sv) 1994-05-24
HU202583B (en) 1991-03-28
NO172909B (no) 1993-06-14
DE3807994A1 (de) 1988-09-22
IT8819722A0 (it) 1988-03-10
GB8805681D0 (en) 1988-04-07
IT1216048B (it) 1990-02-22
PT86937B (pt) 1995-03-01

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