DE69632826T2

DE69632826T2 - Nukleinsaeure erkennung von hepatitis gb virus

Info

Publication number: DE69632826T2
Application number: DE69632826T
Authority: DE
Inventors: L. Ronald MARSHALL; Cynthia Jou; N. John SIMONS; P. Thomas LEARY; Scott A. MUERHOFF; M. Suresh DESAI; K. Isa MUSHAHWAR
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1995-08-14
Filing date: 1996-08-14
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2016-08-15
Also published as: EP0845048B1; JP4237823B2; ATE270345T1; JPH11510705A; DE69632826D1; EP0845048A1; ES2231822T3; CA2229142A1; WO1997007246A1; US5709997A

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft allgemein den Hepatitis GB-Virus und im Speziellen Nucleinsäure-Sonden und ein Primer-Paar, das zum Nachweis des Hepatitis GB-C-Virus (HGBV-C) nützlich ist.
Mehrere Reihen von epidemiologischen und Laborgutachten haben auf das Vorhandensein von mehr als einem parenteral übertragenen non-A-, non-B-(NANB)-Hepatitis-Erreger hingewiesen, einschließlich mehrerer Anfälle von akuter NANBH bei Benutzern intravenöser Drogen, unterschiedlicher Inkubationszeiten bei Patienten, bei denen nach einer Transfusion NANBH auftrat, des Ergebnisses von Kreuz-Immunitätstests (cross-challenge experiments) bei Schimpansen, der ultrastrukturellen Leberpathologie infizierter Schimpansen und der charakteristischen Resistenz der mutmaßlichen Erreger gegenüber Chloroform. J. L. Dienstag, Gastroenterology 85: 439–462 (1983); J. L. Dienstag, Gastroenterology 85: 743–768 (1983); F. B. Hollinger et al., J. Infect. Dis. 142: 400–407 (1980); D. W. Bradley in F. Chisari, Hrsg., Advances in Hepatitis Research, Masson, New York, S. 268–280 (1984); und D. W. Bradley et al., J. Infect. Dis. 148: 254–265 (1983).
Der Nachweis von Hepatitis C-Virus (HCV)-Antikörpern in Spenderproben eliminiert heutzutage 70 bis 80% des mit NANBH infizierten Bluts im Blutversorgungssystem. Somit hat der Nachweis von HCV die Übertragung von Hepatitis aufgrund von NANB-Hepatitis-Erregern nicht vollkommen verhindert. H. Alter u. al., New Eng. J. Med. 321: 1494–1500 (1989). Neueste Veröffentlichungen haben auch die Frage aufgeworfen, ob posttransfusionelle Hepatitis (post-transfusion hepatitis, PTH) und gemeinschaftlich erworbene akute und/oder chronische Hepatitis, die nicht mit PTH zusammenhängt, auf zusätzliche Hepatitis-Erreger zurückzuführen ist. Zum Beispiel haben Beobachter bei 181 Patienten, überwacht in einer klinischen Prospektivstudie, die in Frankreich von 1988 bis 1990 durchgeführt wurde, insgesamt 18 Fälle von PTH festgestellt. Bei 13 dieser 18 Patienten fiel der Test auf HCV-Antikörper, Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigene (hepatitis B virus surface antigen, HBsAg), Hepatitis B-Virus (HBV)- und HCV-Nucleinsäuren negativ aus. Die Autoren spekulierten über die mögliche Bedeutung eines Nicht-A-, Nicht-B-, Nicht-C-Erregers bei der Entstehung von PTH. V. Thiers et al., J. Hepatology 18: 34–39 (1993). Auch hingen bei 1.476 Patienten, die in einer anderen in Deutschland von 1985 bis 1988 durchgeführten Studie überwacht wurden, 22 Fälle von dokumentierten PTH-Fällen nicht mit einer HBV- oder HCV-Infektion zusammen. T. Peters et al., J. Med. Virol. 39: 139–145 (1993).
Vor Kurzem wurde über eine neue Familie von Flaviviren, nachgewiesen bei Patienten mit klinisch diagnostizierter Hepatitis, berichtet. Diese neue Familie von Viren wurde als „GB"-Viren bezeichnet, nach den Initialen des ersten Patienten, der mit dem Virus infiziert wurde. Über diese Viren wurde von J. N. Simons et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3401–3405 (1995), und J. N. Simons et al., Nature Medicine 1(6): 564–569 (1995) berichtet. Zurzeit werden Studien durchgeführt, um die klinische und epidemiologische Bedeutung dieser Viren zu ermitteln.
Das gesamte HGBV-B-Genom wurde am 12. April 1995 in der GenBank-Datenbank, Zugriffsnummer U22304, offenbart. Simons J. N. et al., The Lancet, Band 345, Nr. 8963, 10. Juni 1995, S. 1453–54, behandelt die neuen GB-Hepatitisviren. Muerhoff, A. S. et al., Journal of Virology, Band 69, Nr. 9, September 1995, S. 5621–30, offenbart den genomischen Aufbau der GB-Viren A und B. EP-A-0 745 129, angemeldet am 14. Februar 1995 und veröffentlicht am 17. August 1995, offenbart Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen des Hepatitis GB-Virus, die für eine Vielzahl diagnostischer und therapeutischer Anwendungen nützlich sind. EP-A-0 763 114, angemeldet am 19. Mai 1995 und veröffentlicht am 30. November 1995, betrifft die Charakterisierung und Isolierung des neu entdeckten Hepatitis G-Virus und offenbart eine Familie von cDNS-Kopien von Abschnitten des Hepatitis G-Virusgenoms.
Der Nachweis von HGBV in Untersuchungsproben kann verbessert werden durch die Verwendung von DNS-Hybridisierungstests, die DNS-Oligomere als Primer und Nachweissonden nutzen. Da die Menge von DNS-Targetnucleinsäure in einer Untersuchungsprobe minimal sein kann, wird die Target-DNS normalerweise vervielfältigt und dann nachgewiesen. Verfahren zum Vervielfältigen und Nachweisen einer Targetnucleinsäure-Sequenz, die in einer Untersuchungsprobe vorliegen kann, sind im Fachgebiet gut bekannt. Solche Verfahren schließen die Polymerasekettenreaktion (Polymerase chain reaction, PCR), beschrieben in U.S. Patents 4,683,195 und 4,683,202, die Ligasekettenreaktion (ligase chain reaction, LCR), beschrieben in EP-A-320 308, die Gap-LCR (GLCR), beschrieben in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-439 182 und im U.S. Patent Nr. 5,427,930, die Multiplex-LCR, beschrieben in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 93/20227, u. ä ein. Diese Verfahren werden sowohl auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik als auch auf den Gebieten der Genetik, Molekularbiologie und Biochemie weit verbreitet angewandt.
Es wäre vorteilhaft, DNS-Oligomersonden bereit zu stellen, die von HGBV abgeleitet sind, und Diagnostika und Testkits, die diese Sonden verwenden. Solche Sonden könnten die Möglichkeiten der medizinischen Fachwelt, akute und/oder chronische Virushepatitis genauer zu diagnostizieren, in hohem Maße verbessern und für sicherere Blut- und Organspenden sorgen, indem Nicht-A-, Nicht-B- und Nicht-C-Hepatitis in diesen Blut- und Organspenden nachgewiesen wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert neue Hepatitis GB-Virus-C (HGBV-C)-DNS-Oligomersonden und Primer. Die Sonden der Erfindung, die spezifisch sind für Hepatitis GB-Virus C (HGBV-C) 5' NTR, sind gewählt aus, der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-ID-NR. 3, SEQUENZ-ID-NR. 4 und SEQUENZ-ID-NR. 5. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die ein Primer-Paar umfasst, das spezifisch für HGBV-C 5' NTR ist und aus SEQUENZ-ID-NR. 1 und SEQUENZ-ID-NR. 2 besteht. Ein Test gemäß der Erfindung zum Nachweis der Anwesenheit von HGBV-C-Targetnucleotiden in einer Untersuchungsprobe umfasst Folgendes:

a. In-Kontakt-Bringen einer Untersuchungsprobe, von der vermutet wird, dass sie eine Target-HGBV-C-Nucleotidsequenz enthält, mit dem HGBV-C-Primer-Paar von SEQUENZ-ID NR. 1 und SEQUENZ-ID NR. 2, um eine Mischung zu bilden;
b. In-Kontakt-Bringen des Reaktionsgemischs mit mindestens einer HGBV-C-Sonde, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-ID NR. 3, SEQUENZ-ID NR. 4 und SEQUENZ-ID NR. 5;
c. Nachweis des Vorhandenseins des HGBV-C-Targetnucleotids in der Untersuchungsprobe.

Die HGBV-Sonde kann an eine signalerzeugende Verbindung oder ein Hapten konjugiert werden. Diese signalerzeugende Verbindung wird gewählt aus der Gruppe bestehend aus einer chemilumineszenten Verbindung, einer Fluoresceinverbindung und einem Enzym. Das Hapten wird gewählt aus der Gruppe bestehend aus Adamantan, Carbazol, Fluorescein und Biotin. Die Reaktion kann auf einem festen Träger durchgeführt werden. Die Sonde und der Primer können jeweils an ein anderes Hapten, wie z. B. Adamantan und Carbazol, gebunden werden, und die Bindung kann entweder am 5'-Ende, am 3'-Ende, oder sowohl am 5'-Ende als auch am 3'-Ende stattfinden; oder mehr als ein Hapten kann an das 5'- oder das 3'-Ende oder in deren Nähe gebunden werden. Außerdem kann die Reaktion durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert werden.
Außerdem wird ein Testkit zum Nachweis von Target-HGBV-C-Nucleotid in einer Untersuchungsprobe bereitgestellt, das Folgendes umfasst:

a. einen Behälter, der ein Primer-Paar enthält, das spezifisch für ein HGBV-C-Targetnucleotid ist, worin das Primer-Paar SEQUENZ-ID NR. 1 und SEQUENZ-ID NR. 2 ist;
b. einen Behälter, der mindestens eine Sonde enthält, die spezifisch für HGBV-C ist, worin die HGBV-C-Sonde gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-ID NR. 3, SEQUENZ-ID NR. 4 und SEQUENZ-ID NR. 5.

Die HGBV-Sonde kann an ein Hapten oder eine signalerzeugende Verbindung konjugiert werden. Diese signalerzeugende Verbindung wird gewählt aus der Gruppe bestehend aus einer chemilumineszenten Verbindung, einer Fluoresceinverbindung und einem Enzym. Das Hapten wird gewählt aus der Gruppe bestehend aus Adamantan, Carbazol, Fluorescein und Biotin. Die Reaktion kann auf einer festen Phase durchgeführt werden. Die Reaktion kann durch ein Verstärkungsverfahren wie z. B. PCR verstärkt werden. Die Sonde und der Primer können jeweils an ein verschiedenes Hapten gebunden sein, wie z. B. Adamantan und Carbazol, und die Bindung kann entweder am 5'-Ende, am 3'-Ende oder sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende stattfinden; oder mehr als ein Hapten kann entweder an das 5'- oder das 3'-Ende oder in deren Nähe gebunden werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das die Schritte des bevorzugten Prüfverfahrens der Erfindung beschreibt.
2 ist ein Diagramm des Reaktionskomplexes.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert DNS-Oligomersonden und ein Primer-Paar, Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit der HGBV-Target-Nucleotidsequenzen unter Verwendung dieser Sonden und des Primer-Paars und Testkits, die für ein Verfahren wie das oben beschriebene nützlich sind.
Die vorliegende Erfindung liefert Testkits, die Reagenzien enthalten, die zum Nachweis der Anwesenheit und/oder der Menge von Polynucleotiden verwendet werden können, die aus HGBV-C gewonnen werden. Diese für den Test eingesetzten Reagenzien können in Form eines Testkits mit einem oder mehreren Behältern, wie z. B. Phiolen oder Flaschen, bereitgestellt werden, wobei jeder Behälter ein separates Reagens, wie z. B. eine Nucleinsäure-Sonde oder eine Mischung aus Nucleinsäure-Sonden enthält, die im Test verwendet werden. Andere Komponenten, wie z. B. Puffer, Vergleichsproben u. ä., die Personen mit grundlegenden Fachkenntnissen bekannt sind, können in solchen Testkits eingeschlossen sein.
Der Begriff „Hepatitis GB-Virus" oder „HGBV", wie hierin verwendet, bezeichnet kollektiv eine Virusspezies, die Nicht-A-, Nicht-B-, Nicht-C-, Nicht-D-, Nicht-E-Hepatitis oder möglicherweise andere Krankheiten in Säugetieren wie dem Menschen verursacht, und abgeschwächte Stämme oder defekte schädigende Partikel, die daraus abgeleitet sind. Diese können akute Virushepatitis einschließen, die durch verseuchte Nahrungsmittel, Trinkwasser u. Ä. übertragen wird; Hepatitis aufgrund von HGBV, übertragen durch Mensch-zu-Mensch-Kontakt (einschließlich sexueller Übertragung, respiratorischer und parenteraler Wege) oder durch Gebrauch intravenöser Drogen. Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen es, Individuen zu identifizieren, die mit HGBV infiziert sind. Im Einzelnen werden die HGBV-Isolate speziell als „HGBV-A", „HGBV-B" und „HGBV-C" bezeichnet. Wie hierin beschrieben, besteht das HGBV-Genom aus RNS. Die Analyse der Nucleotidsequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz des HGBV zeigt, dass Viren dieser Gruppe eine Genomorganisation haben, die derjenigen der Flaviridae-Familie ähnlich ist. Auf der primären, aber nicht ausschließlichen Grundlage von Ähnlichkeiten in der Genomorganisation hat das International Committee on the Taxonomy of Viruses empfohlen, dass diese Familie aus drei Genera bestehe: Flavivirus, Pestivirus und der Hepatitis C-Gruppe. Ähnlichkeitsuntersuchungen auf Aminosäureebene zeigen, dass die Hepatitis GB-Virus-Subklone in ihrer Sequenz eine gewisse, wenn auch geringe, Ähnlichkeit mit dem Hepatitis C-Virus aufweisen. Es ist jetzt gezeigt worden, dass HGBV-C kein Genotyp von HCV ist. Siehe z. B. EP-A-0 736 601.
Die Begriffe „Ähnlichkeit" und/oder „Identität" werden hierin verwendet, um den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei Polynucleotiden oder Polypeptidsequenzen zu beschreiben. Die Techniken zum Nachweis von „Ähnlichkeit" und/oder „Identität" von Aminosäuresequenzen sind im Fachgebiet gut bekannt und schließen z. B. Folgendes ein: die direkte Bestimmung der Aminosäuresequenz und ihren Vergleich mit den hierin bereitgestellten Sequenzen; die Bestimmung der Nucleotidsequenz des genomischen Materials des mutmaßlichen HGBV (normalerweise über ein cDNS-Intermediat) und die Bestimmung der darin codierten Aminosäuresequenz und den Vergleich der entsprechenden Bereiche. Im Allgemeinen bezeichnet „Identität" die genaue Entsprechung von entweder der Nucleotidsequenz von HGBV zu derjenigen eines anderen Stamms (bzw. anderer Stämme) oder der Aminosäuresequenz von HGBV mit derjenigen eines anderen Stamms (bzw. anderer Stämme) an der entsprechenden Stelle in jedem Genom. Auch ist im Allgemeinen mit „Ähnlichkeit" die genaue Entsprechung einer Aminosäuresequenz von HGBV zu derjenigen eines anderen Stamms (bzw. anderer Stämme) an der entsprechenden Stelle gemeint, worin die Aminosäuren identisch sind oder ähnliche chemische und/oder physikalische Eigenschaften haben, wie z. B. Ladung oder Hydrophobie. Die Programme, die im Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8, verfügbar sind (erhältlich von der Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, 53711), z. B. das GAP-Programm, sind in der Lage, sowohl die Identität als auch die Ähnlichkeit zwischen zwei Polynucleotid- oder zwei Polypeptidsequenzen zu berechnen. Weitere Programme zur Berechnung von Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen sind im Fachgebiet bekannt.
Ein aus der Nucleotidsequenz von HGBV-C abgeleitetes Polynucleotid wird nicht notwendigerweise physikalisch aus der Nucleotidsequenz von HGBV abgeleitet sein, sondern kann auf jede beliebige Art hergestellt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf chemische Synthese, Replikation oder reverser Transkription oder Transkription, die auf der Information beruhen, die von der Basensequenz in dem(n) Bereich(en) bereitgestellt werden, aus denen das Polynucleotid abgeleitet wird.
Die Begriffe „Polynucleotid", „Oligomer" und „Oligonucleotid" werden hierin austauschbar verwendet.
Der Begriff „Polynucleotid", wie hierin verwendet, bezeichnet, eine polymere Form von Nucleotiden beliebiger Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Dieser Begriff betrifft nur die Primärstruktur des Moleküls. Somit schließt der Begriff doppel- und einzelsträngige DNS sowie doppel- und einzelsträngige RNS ein. Er schließt auch Modifikationen, entweder durch Methylierung und/oder durch Kappung, sowie unmodifizierte Formen des Polynucleotids ein.
Der Begriff „Individuum", wie hierin verwendet, bezeichnet Wirbeltiere, insbesondere Mitglieder der Säugetierspezies, und schließt Haustiere, Sporttiere, Primaten und Menschen ein; Genauer bezeichnet der Begriff Tamarine und Menschen.
Der Begriff „Untersuchungsprobe" bezeichnet eine Komponente des Körpers eines Individuums, welche die Quelle des Analyten ist. Diese Komponenten sind im Fachgebiet gut bekannt. Diese Untersuchungsproben schließen biologische Proben ein, die mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung, die hierin beschrieben sind, getestet werden können, und sie schließen menschliche und tierische Körperflüssigkeiten ein, wie z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Zerebrospinal-Flüssigkeit, Urin, Lymphflüssigkeiten und verschiedene externe Absonderungen des Respirations-, Darm- und Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, weiße Blutkörperchen, Myelome u. Ä., biologische Flüssigkeiten wie z. B. Zellkultur-Überstände, Festgewebeproben und Festzellproben.
„Gereinigtes HGBV" bezieht sich auf eine Zubereitung von HGBV, das von den Zellbestandteilen isoliert wurde, mit denen der Virus normalerweise verbunden ist, und von anderen Arten von Viren, die im infizierten Gewebe anwesend sein können. Die Techniken zum Isolieren von Viren sind den Fachleuten bekannt und schließen z. B. Zentrifugation und Affinitätschromatographie ein.
„PNA" bezeichnet eine „Peptidnucleinsäure", die in einem Verfahren wie z. B. einem hierin beschriebenen Test verwendet werden kann, um das Vorhandensein eines Targets zu ermitteln. PNAs sind neutral geladene Anteile, die gegen RNS-Targets oder DNS gerichtet sein können. PNA-Sonden, verwendet in Tests anstelle von z. B. den DNS-Sonden der vorliegenden Erfindung, bieten Vorteile, die mit DNS-Sonden nicht zu erreichen sind.
Diese Vorteile schließen Herstellbarkeit, Markierung in großem Umfang, Reproduzierbarkeit, Stabilität, Unempfindlichkeit gegenüber Änderungen der Ionenstärke und Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau ein, der in Verfahren vorliegt, die DNS oder RNS verwenden. Diese PNAs können mit solchen signalerzeugenden Verbindungen markiert werden wie Fluorescein, Radionucleotiden, chemilumineszenten Verbindungen u. Ä. PNAs oder andere Nucleinsäuren-Analoge wie z. B. Morpholinoverbindungen können somit in Testverfahren anstelle von DNS oder RNS verwendet werden. Obwohl hierin Tests beschrieben sind, die DNS-Sonden verwenden, liegt es innerhalb des Erfahrungsbereichs des Routiniers, dass PNAs oder Morpholinoverbindungen für RNS oder DNS substituiert werden können, mit entsprechenden Änderungen bei Bedarf in Testreagenzien.
„Feste Phasen" („feste Träger") sind den Fachleuten bekannt und schließen die Wände von Vertiefungen eines Reaktionsbehälters, Reagenzgläser, Polystyrolkügelchen, Magnetkügelchen, Nitratcellulosestreifen, Membranen, Mikropartikel wie z. B. Latexpartikel, rote Blutkörperchen von Schafen (oder anderen Tieren), Duracyten und andere ein. Der „feste Träger" ist nicht entscheidend und kann von einem Fachmann ausgewählt werden. So sind Latexpartikel, Mikropartikel, magnetische oder nicht magnetische Kügelchen, Membranen, Plastikrohre, Wände von Mikrotiter-Vertiefungen, Glas- oder Siliziumchips, rote Blutkörperchen von Schafen (oder anderen geeigneten Tieren) und Duracyten alles geeignete Beispiele. Geeignete Verfahren zur Immobilisierung von Sonden auf festen Trägern schließen ionische, hydrophobe, kovalente Interaktionen u. Ä. ein. „Fester Träger", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jedes Material, das unlöslich ist oder durch eine anschließende Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Der feste Träger kann aufgrund seiner immanenten Fähigkeit ausgewählt werden, das Einfangreagens anzuziehen und zu immobilisieren. Alternativ kann der feste Träger einen zusätzlichen Rezeptor enthalten, der die Fähigkeit hat, das Einfangreagens anzuziehen und zu immobilisieren. Der zusätzliche Rezeptor kann eine geladene Substanz einschließen, die eine entgegengesetzte Ladung gegenüber dem Einfangreagens selbst oder einer geladenen Substanz hat, die an das Einfangreagens konjugiert ist. Als weitere Alternative kann das Rezeptormolekül jedes beliebige spezifische Bindungsglied sein, das auf dem festen Träger immobilisiert (mit ihm verbunden) ist und das die Fähigkeit hat, das Einfangreagens durch eine spezifische Bindungsreaktion zu immobilisieren. Das Rezeptormolekül ermöglicht die indirekte Bindung des Einfangreagens an ein festes Trägermaterial vor oder während der Durchführung des Tests. Der feste Träger kann somit ein Kunststoff, derivatisierter Kunststoff, magnetisches oder nicht magnetisches Metall, eine Glas- oder Siliziumoberfläche eines Testrohrs, eine Mikrotiter-Vertiefung, eine Folie, ein Kügelchen, Mikropartikel, Chip, rote Blutkörperchen von Schafen (oder anderen geeigneten Tieren), Duracyten und andere Konfigurationen sein, die Personen mit normalen Fachkenntnissen bekannt sind.
Es wird erwogen und liegt innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung, dass die feste Phase auch ein beliebiges geeignetes poröses Material mit ausreichender Porosität umfassen kann, um den Zutritt durch Erkennungs-Antikörper zu ermöglichen, und mit geeigneter Oberflächenaffinität, um Antigene zu binden. Mikroporöse Strukturen werden im Allgemeinen bevorzugt, aber Materialien mit Gelstruktur im hydratisierten Zustand können ebenfalls verwendet werden. Solche nützlichen festen Träger schließen Folgendes ein, ohne darauf beschränkt zu sein: natürliche polymere Kohlenhydrate und deren synthetisch modifizierte, vernetzte oder substituierte Derivate, wie z. B. Agar, Agarose, quervernetzte Alginsäure, substituierte und quervernetzte Guar Gummis, Celluloseester, vor allem mit Salpetersäure und Carbonsäuren, gemischte Celluloseester und Celluloseether; natürliche Polymere, die Stickstoff enthalten; synthetische Polymere, die mit geeignet porösen Strukturen hergestellt werden können, wie z. B. Vinylpolymere; poröse anorganische Materialien, wie z. B. Sulfate, oder Karbonate von Erdalkalimetallen und Magnesium, einschließlich Bariumsulfat, Kalziumsulfat, Kalziumcarbonat, Silikate von Alkali und Erdalkalimetallen, Aluminium und Magnesium; und Aluminium- oder Siliziumoxide oder Hydrate, wie z. B. Ton, Tonerde, Talk, Kaolin, Zeolith, Kieselgel oder Glas (diese Materialien können als Filter mit den oben genannten polymeren Materialien verwendet werden); und Mischungen oder Copolymere der oben genannten Klassen, wie z. B. Pfropfcopolymere, die gewonnen werden durch die Initialisierung der Polymerisation synthetischer Polymere auf einem bereits vorhandenen natürlichen Polymer. Alle diese Materialien können in geeigneten Formen verwendet werden, wie z. B. Filmen, Folien oder Platten, oder sie können auf geeignete inerte Träger beschichtet oder gebunden oder laminiert werden, wie z. B. Papier, Glas, Kunststofffilme oder Textilgewebe.
Die poröse Struktur von Nitrozellulose hat hervorragende Absorptions- und Adsorptionseigenschaften für eine große Vielzahl von Reagenzien. Nylon besitzt ähnliche Eigenschaften und ist ebenfalls geeignet. Es wird beabsichtigt, dass solche porösen festen Träger, wie hierin beschrieben, vorzugsweise in Form von Folien mit einer Dicke von 0,01 bis 0,5 mm, vorzugsweise ungefähr 0,1 mm, vorliegen. Die Porengröße kann innerhalb großer Bandbreiten variieren und beträgt vorzugsweise von ungefähr 0,025 bis 15 μm, insbesondere von ungefähr 0,15 bis 15 μm. Die Oberflächen solcher Träger können durch chemische Prozesse aktiviert werden, welche zu einer kovalenten Bindung des Antigens oder Antikörpers mit dem Träger führen. Die irreversible Bindung des Antigens oder Antikörpers wird jedoch im Allgemeinen durch Adsorption im porösen Material durch wenig verstandene hydrophobe Kräfte erzielt. Geeignete feste Träger sind auch im U.S.-Patent 5,281,540 beschrieben.
Das „Indikatorreagens" umfasst eine „signalerzeugende Verbindung" (auch „Label" genannt), die in der Lage ist, ein messbares Signal zu erzeugen, und ein messbares Signal erzeugt, das durch externe Mittel detektierbar ist, die mit einem spezifischen Bindungsglied für HGBV konjugiert (daran gebunden) sind. „Spezifisches Bindungsglied", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Glied eines spezifischen Bindungspaares. Das heißt, zwei verschiedene Moleküle, wobei eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Das Indikatorreagens ist nicht nur ein Antikörperglied eines spezifischen Bindungspaares für HGBV, sondern kann auch ein Glied eines beliebigen spezifischen Bindungspaares sein, einschließlich entweder Hapten-Anti-Hapten-Systeme, wie z. B. Biotin oder Anti-Biotin, Avidin oder Biotin, ein Kohlenhydrat oder ein Lektin, eine komplementäre Nucleotidsequenz, einen Effektor oder ein Rezeptormolekül, ein Enzym-Cofaktor und ein Enzym, ein Enzyminhibitor oder ein Enzym und dergleichen. Weiterhin können spezifische Bindungspaare Glieder einschließen, die Analoga der ursprünglichen spezifischen Bindungsglieder sind, z. B. ein Analyt-Analogon. Ein immunoreaktives spezifisches Bindungsglied kann ein Antikörper oder ein Fragment davon, ein Antigen oder ein Fragment davon oder ein Antikörper-Antigen-Komplex sein, einschließlich derjenigen, die von rekombinanten DNS-Molekülen gebildet werden, der bzw. das die Fähigkeit hat, entweder an HGBV zu binden wie in einem Sandwich-Test, an das Einfangreagens wie in einem Kompetitivtest, oder an das zusätzliche spezifische Bindungsglied wie in einem indirekten Test.
Die verschiedenen erwogenen „signalerzeugenden Verbindungen" (Labels) schließen Chromogene, Katalysatoren wie z. B. Enzyme, lumineszierende Verbindungen wie z. B. Fluorescein und Rhodamin, chemilumineszierende Verbindungen wie z. B. Dioxetane, Acridiniums, Phenanthridiniums und Luminol, radioaktive Elemente und direkte visuelle Label ein. Beispiele für Enzyme schließen alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, beta-Galaktosidase und dergleichen ein. Die Auswahl eines bestimmten Labels ist nicht entscheidend, aber es wird die Fähigkeit haben, entweder alleine oder in Verbindung mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen ein Signal zu erzeugen.
Der Begriff „Detektionslabel" bezeichnet ein Molekül oder eine Komponente, welche eine Eigenschaft oder ein Charakteristikum besitzt, das in der Lage ist detektiert zu werden. Ein Detektionslabel kann direkt detektierbar sein, z. B. mit Radioisotopen, Fluorophoren, Chemiluminophoren, Enzymen, kolloidalen Partikeln, fluoreszierenden Mikropartikeln und dergleichen; oder ein Label kann indirekt detektierbar sein, z. B. mit spezifischen Bindungsgliedern. Es versteht sich, dass direkte Label möglicherweise zusätzliche Komponenten erfordern, wie z. B. Substrate, Triggerreagenzien, Licht u. Ä., um den Nachweis des Labels zu ermöglichen. Wenn indirekte Label zum Nachweis verwendet werden, werden sie typischerweise in Verbindung mit einem Konjugat benutzt. Ein „Konjugat" ist typischerweise ein spezifisches Bindungsglied, das mit einem direkt nachweisbaren Label verbunden oder daran gekoppelt wurde. Ähnlich wie bei der Synthese von Festträger-Reagenzien sind Kupplungs-Zusammensetzungen zum Synthetisieren eines Konjugats im Fachbereich gut bekannt und können z. B. jedes chemische und/oder physikalische Mittel einschließen, das die spezifische Bindungseigenschaft des spezifischen Bindungsglieds oder die nachweisbare Eigenschaft des Labels nicht zerstört.
Der Begriff „Hapten", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Halbantigen oder Nicht-Protein-Bindungsglied, das die Fähigkeit hat, an einen Antikörper zu binden, aber nicht die Fähigkeit hat, eine Antikörperbildung auszulösen, außer wenn es an ein Trägerprotein gekoppelt ist. Beispiele für Haptene schließen Biotin, Avidin, Adamantan, Fluorescein und Carbazol ein.
„Analyt", wie hierin verwendet, ist die nachzuweisende Substanz, die in der Untersuchungsprobe vorliegen kann.
Ausführungsformen, die Verfahren zum Einfangen von Ionen nutzen, um einen immobilisierbaren Reaktionskomplex mit einem negativ geladenen Polymer zu immobilisieren, beschrieben in EP-A-0326100 und EP-A-0406473, können gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um eine schnelle immunochemische Reaktion in der Lösungsphase auszulösen. Ein immobilisierbarer Immunkomplex wird vom Rest der Reaktionsmischung abgetrennt, und zwar durch ionische Interaktionen zwischen dem negativ geladenen Polyanion-Immunkomplex und der vorbehandelten, positiv geladenen porösen Matrix, und wird nachgewiesen mit Hilfe verschiedener oben beschriebener signalerzeugender Systeme, einschließlich derjenigen, die in Messungen chemilumineszenter Signale beschrieben sind, wie in EP-A-0 273 115 beschrieben.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können außerdem für die Verwendung in Systemen angepasst werden, die die Mikropartikel-Technologie nutzen, einschließlich in automatisierten und halb automatisierten Systemen, worin der feste Träger einen Mikropartikel (magnetisch oder nicht magnetisch) einschließt. Solche Systeme schließen diejenigen ein, die in EP-A-0 425 633 und EP-A-0 424 634 beschrieben sind.
Die Reagenzien und Verfahren der vorliegenden Erfindung werden möglich durch die Bereitstellung einer Familie nahe verwandter Nucleotidsequenzen, die im Plasma, Serum oder Leberhomogenisat eines mit HGBV infizierten Individuums, entweder eines Tamarins oder eines Menschen, vorliegen. Diese Familie von Nucleotidsequenzen stammt nicht vom Menschen oder Tamarin, da sie weder mit menschlicher noch mit vom Tamarin stammender genomischer DNS von nicht infizierten Individuen hybridisiert, da Nucleotide dieser Familie von Sequenzen nur in Leber (oder Leberhomogenisaten), Plasma oder Serum von Individuen vorliegen, die mit HGBV infiziert sind, und da die Sequenz nicht in der GenBank^® vorhanden ist. Außerdem wird die Familie von Sequenzen keine signifikante Identität auf Nucleinsäurenebene mit Sequenzen zeigen, die im HAV- HBV-, HCV- HDV- und HEV-Genom enthalten sind, und eine niedrige Identität, die als nicht signifikant betrachtet wird, als Translationsprodukte. Infektiöse Seren, Plasma oder Leberhomogenisate von mit HGBV infizierten Menschen enthalten diese Polynucleotidsequenzen, während Seren, Plasma oder Leberhomogenisate von nicht infizierten Menschen diese Sequenzen nicht enthalten. Die Northern Blot Analyse infizierter Leber mit einigen dieser Polynucleotidsequenzen zeigt, dass sie von einem großen RNS-Transkript abgeleitet sind, das in der Größe einem Virusgenom ähnelt. Seren, Plasma oder Leberhomogenisate von mit HGBV infizierten Menschen enthalten Antikörper, die sich an dieses Polypeptid binden, während Seren, Plasma oder Leberhomogenisate von nicht infizierten Menschen keine Antikörper zu diesem Polypeptid enthalten; diese Antikörper werden in Individuen nach akuter Infektion mit Nicht-A-, Nicht-B-, Nicht-C-, Nicht-D- und Nicht-E-Hepatitis induziert. Aufgrund dieser Kriterien wird angenommen, dass die Sequenz eine Virussequenz ist, worin der Virus Nicht-A-, Nicht-B-, Nicht-C-, Nicht-D- und Nicht-E-Hepatitis verursacht oder damit zusammenhängt.
Bei Verwendung als Diagnostikum kann die zu analysierende Untersuchungsprobe, wie z. B. Blut oder Serum, so behandelt werden, dass die darin enthaltenen Nucleinsäuren extrahiert werden. Die resultierende Nucleinsäure aus der Probe kann einer Gelelektrophorese oder anderen Größentrennungs-Techniken unterzogen werden; oder die Nucleinsäurenprobe kann ohne Größentrennung mit Dot-Blotting untersucht werden. Die Sonden werden dann markiert. Geeignete Labels und Verfahren zum Binden von Labels an Sonden sind im Fachgebiet bekannt und schließen Folgendes ein, ohne darauf beschränkt zu sein: radioaktive Labels, die durch Nick-Translation oder Kinasierung eingebaut werden, Biotin, fluoreszente und chemilumineszente Sonden. Beispiele für zahlreiche dieser Label sind hierin offenbart. Die aus der Probe extrahierten Nucleinsäuren werden dann mit der markierten Sonde unter Hybridisierungsbedingungen von geeigneten Stringenzen behandelt.
Die Sonden können vollständig komplementär zum HGBV-Genom gemacht werden. Daher sind normalerweise hohe Stringenzbedingungen wünschenswert, um falsche positive Ergebnisse zu vermeiden. Bedingungen hoher Stringenz sollten jedoch nur dann angewandt werden, wenn die Sonden komplementär zu Bereichen des HGBV-Genoms sind, denen es an Heterogenität mangelt. Die Stringenz der Hybridisierung wird von einer Reihe von Faktoren während des Waschvorgangs bestimmt, einschließlich der Temperatur, der Ionenstärke, der Länge der Zeit und der Konzentration an Formamid. Siehe z. B. J. Sambrook (supra). Die Hybridisierung kann mit einer Reihe von verschiedenen Techniken vorgenommen werden. Eine Amplifikation kann z. B. durch Ligase-Kettenreaktion (LCR), Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Q-beta-Replicase, NASBA usw. durchgeführt werden.
Es wird in Betracht gezogen, dass die HGBV-Genomsequenzen im Serum infizierter Individuen in relativ geringen Mengen anwesend sein können, z. B. ca. 10²–10³ Sequenzen pro ml. Diese Menge erfordert es möglicherweise, dass Amplifikationstechniken in Hybridisierungstests angewandt werden, wie z. B. die LCR oder die PCR. Solche Techniken sind im Fachgebiet bekannt. Das „Bio- Brücken"-System nutzt z. B. endständige Desoxynucleotidtransferase, um einer Nucleinsäurensonde unmodifizierte 3'-Poly-dT-Schwänze hinzuzufügen (Enzo Biochem. Corp.). Die poly-dt-schwänzige Sonde wird an die Target-Nucleotidsequenz und dann an ein biotin-modifiziertes poly-A hybridisiert. In EP 124221 ist außerdem ein DNS-Hybridisierungstest beschrieben, worin der Analyt an eine einzelsträngige DNS-Sonde angeschmolzen wird, die komplementär zu einem enzymmarkierten Oligonucleotid ist, und der entstehende geschwänzte Doppelstrang an ein enzymmarkiertes Oligonucleotid hybridisiert wird. EP 204510 beschreibt einen DNS-Hybridisierungstest, in dem Analyt-DNS mit einer Sonde in Kontakt gebracht wird, die einen Schwanz hat, z. B. einen poly-dT-Schwanz, einen Amplifikationsstrang mit einer Sequenz, die an den Schwanz der Sonde hybridisiert, z. B. eine Poly-A-Sequenz, und welche die Fähigkeit hat, eine Vielzahl markierter Stränge zu binden. Die Technik beinhaltet möglicherweise zunächst die Amplifikation der Target-HGBV-Sequenzen im Serum auf ungefähr 10⁶ Sequenzen/ml. Dies kann erreicht werden durch Anwendung der Verfahren, die von Saiki et al., Nature 324: 163 (1986) beschrieben sind. Die vervielfältigte(n) Sequenz(en) können dann nachgewiesen werden mit Hilfe eines Hybridisierungstests wie z. B. solcher, die im Fachgebiet bekannt sind. Die Sonden können in Diagnosekits verpackt werden, welche die Sonden-Nucleinsäuresequenz einschließen, die markiert sein kann; alternativ kann die Sonde unmarkiert sein, und die Stoffe zum Markieren können mit dem Kit mitgeliefert werden. Das Kit kann auch andere geeignet verpackte Reagenzien und Materialien enthalten, die für das jeweilige Hybridisierungsprotokoll notwendig oder wünschenswert sind, z. B. Normen sowie Anweisungen zur Durchführung des Tests.
Andere bekannte Amplifikationsverfahren, die hierin verwendet werden können, schließen Folgendes ein, ohne darauf beschränkt zu sein: die so genannte „NASBA"- oder „3SR"-Technik, gelehrt in PNAS USA 87: 1874–1878 (1990) und auch in Nature: 350 (Nr. 6313): 91–92 (1991) und Q-beta-Replikase.
Synthetische Oligonucleotide können hergestellt werden mit Hilfe eines automatisierten Oligonucleotid-Synthezisers wie desjenigen, der beschrieben ist von Warner, DNA 3: 401 (1984). Falls gewünscht, können die synthetischen Stränge markiert werden mit ³²P durch Behandlung mit Polynucleotid-Kinase in Anwesenheit von ³²P-ATP unter Nutzung von Standardbedingungen für die Reaktion. DNS-Sequenzen, einschließlich solcher, die aus genomischen oder cDNS-Mustern isoliert wurden, können modifiziert werden durch bekannte Verfahren, die ortsgerichtete Mutagenese wie von Zoller, Nucleic Acids Res. 10: 6487 (1982) beschrieben, einschließen. Kurz beschrieben wird die zu modifizierende DNS als einzelsträngige Sequenz in Phage verpackt und in eine doppelsträngige DNS mit DNS-Polymerase umgewandelt, wobei als Primer ein synthetisches Oligonucleotid verwendet wird, das komplementär zu dem zu modifizierenden DNS-Abschnitt ist und bei dem die gewünschte Modifikation in seiner eigenen Sequenz eingeschlossen ist. Eine Kultur der umgewandelten Bakterien, die Replikationen jedes Strangs des Phagen enthalten, wird in Agar gegeben, um Plaques zu erhalten. Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques Phagen mit der mutierten Sequenz, und die übrigen 50% haben die ursprüngliche Sequenz. Replikate der Plaques werden zu markierter synthetischer Sonde bei Temperaturen und Bedingungen hybridisiert, die geeignet sind zur Hybridisierung mit dem korrekten Strang, aber nicht mit der unveränderten Sequenz. Die Sequenzen, die durch Hybridisierung bestimmt wurden, werden aufgearbeitet und geklont.
Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) und die Ligasekettenreaktion (ligase chain reaction, LCR) sind Techniken zum Vervielfältigen einer beliebigen Nucleinsäuresequenz (Target), die in einer Nucleinsäure oder einer Mischung davon enthalten ist. Bei der PCR wird ein Paar von Primern im Überschuss eingesetzt, um an die Außenenden von komplementären Strängen der Target-Nucleinsäure zu hybridisieren.
Die Primer werden jeweils um eine Polymerase erweitert unter Verwendung der Target-Nucleinsäure als Matrize. Die Erweiterungsprodukte werden nach der Dissoziation vom ursprünglichen Target-Strang selbst zu Targetsequenzen. Neue Primer werden dann hybridisiert und um eine Polymerase erweitert, und der Zyklus wird wiederholt, um die Anzahl der Targetsequenz-Molekülen geometrisch zu erhöhen. PCR ist in den U.S.-Patenten 4,683,195 und 4,683,202 offenbart.
Die LCR ist ein alternativer Mechanismus zur TargetAmplifikation. Bei der LCR werden zwei sense-Sonden (erste und zweite) und zwei Anti-sense-Sonden (dritte und vierte) im Überschuss über das Target eingesetzt. Die erste Sonde hybridisiert an ein erstes Segment des Target-Strangs, und die zweite Sonde hybridisiert an ein zweites Segment des Target-Strangs, wobei die ersten und zweiten Segmente so positioniert sind, dass die primären Sonden zu einem kondensierten Produkt ligiert werden können. Weiterhin kann eine dritte (sekundäre) Sonde an einen Abschnitt der ersten Sonde hybridisieren, und eine vierte (sekundäre) Sonde kann an einen Abschnitt der zweiten Sonde auf ähnliche ligierbare Art hybridisieren. Wenn das Target ursprünglich doppelsträngig ist, werden die sekundären Sonden auch an den komplementären Target-Strang im ersten Beispiel hybridisieren. Sobald der kondensierte Strang von sense- und Anti-sense-Sonden vom Target-Strang getrennt ist, hybridisiert er mit den dritten und vierten Sonden, die ligiert werden können, um ein komplementäres, sekundäres kondensiertes Produkt zu bilden. Die kondensierten Produkte sind entweder zu dem Target oder seinem komplementären Strang funktionell äquivalent. Durch wiederholte Zyklen von Hybridisierung und Ligation wird eine Amplifikation der Targetsequenz erzielt. Diese Technik ist in EP-A-320 308 beschrieben. Weitere Aspekte der LCR-Technik sind in EP-A-439 182 offenbart.
In einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung allgemein die Schritte des In-Kontakt-Bringens einer Untersuchungsprobe, von der angenommen wird, dass sie ein HGBV-C-Targetnucleotid enthält, mit Amplifikationsreaktions-Reagenzien, die ein Paar von Amplifikations-Primern wie oben beschrieben und eine Nachweissonde wie oben beschrieben umfassen, die mit einem inneren Bereich der Amplicon-Sequenzen hybridisieren kann. Sonden und Primer, die nach dem hierin bereitgestellten Verfahren eingesetzt werden, werden mit Einfang- und Nachweislabeln markiert, worin Sonden mit einer Art von Label und Primer mit der anderen Art von Label markiert werden. Zusätzlich sind die Primer und Sonden so ausgewählt, dass die Sondensequenz eine niedrigere Schmelztemperatur hat als die Primersequenzen. Die Amplifikationsreagenzien, Nachweisreagenzien und die Untersuchungsprobe werden Amplifikationsbedingungen ausgesetzt, wodurch in Anwesenheit der Targetsequenz Kopien der Targetsequenz (ein Amplicon) produziert werden. Im Normalfall ist das Amplicon doppelsträngig, da Primer bereitgestellt werden, um eine Targetsequenz und deren komplementären Strang zu vervielfältigen. Das doppelsträngige Amplicon wird dann thermisch denaturiert, um einzelsträngige Ampliconglieder zu liefern. Nach Bildung der einzelsträngigen Ampliconglieder wird die Mischung abgekühlt, um die Bildung von Komplexen zwischen den Sonden und einzelsträngigen Amplicongliedern zu ermöglichen.
Überraschenderweise banden sich die Sondensequenzen, während die einzelsträngigen Ampliconsequenzen und Sondensequenzen abgekühlt wurden, vorzugsweise an die einzelsträngigen Ampliconglieder. Dementsprechend sollte die Schmelztemperatur des Amplicons, das von den Primern produziert wurde, auch eine höhere Schmelztemperatur haben als die Sonden. Daher war beim Abkühlen der Mischung die Neubildung des doppelsträngigen Amplicons zu erwarten. Wie schon gesagt, ist dies jedoch nicht der Fall. Es wurde festgestellt, dass die Sonden sich vorzugsweise an die einzelsträngigen Ampliconglieder banden. Überdies besteht diese Präferenz der Bindung zwischen Sonde und einzelsträngigem Amplicon sogar dann, wenn die Primersequenzen im Überschuss gegenüber den Sonden hinzugefügt werden.
Nachdem sich die Hybride aus Sonde und einzelsträngigem Ampliconglied gebildet haben, werden sie nachgewiesen. Standard-heterogene Test-Formate sind geeignet, um die Hybride mit Hilfe der Nachweislabel und Einfanglabel nachzuweisen, die auf den Primern und Sonden vorhanden sind. Die Hybride können durch das Einfanglabel an ein Feste-Phase-Reagens gebunden und durch das Detektionslabel nachgewiesen werden. In Fällen, in denen das Detektionslabel direkt nachweisbar ist, kann die Anwesenheit der Hybride auf der festen Phase nachgewiesen werden, indem das Label dazu gebracht wird, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, wenn nötig, und das Signal nachgewiesen wird. In Fällen, in denen das Label nicht direkt nachweisbar ist, können die eingefangenen Hybride mit einem Konjugat in Kontakt gebracht werden, der im Allgemeinen ein Bindungsglied umfasst, das an ein direkt nachweisbares Label gebunden ist. Das Konjugat wird an die Komplexe gebunden, und die Anwesenheit des Konjugats an den Komplexen kann mit dem direkt nachweisbaren Label nachgewiesen werden. Somit kann die Anwesenheit der Hybride auf dem Feste-Phase-Reagens bestimmt werden. Der Fachmann wird erkennen, dass Waschschritte durchgeführt werden können, um nicht hybridisiertes Amplicon oder nicht hybridisierte Sonde sowie ungebundenes Konjugat fortzuwaschen.
Eine Untersuchungsprobe ist typischerweise alles, von dem vermutet wird, dass es eine Targetsequenz enthält. Untersuchungsproben können hergestellt werden mit Methoden, die im Fachgebiet gut bekannt sind, wie z. B. Entnahme einer Probe von einem Individuum und, wenn nötig, Aufspalten darin enthaltener Zellen, um Target-Nucleinsäuren freizusetzen. Obwohl die Targetsequenz als einzelsträngig beschrieben ist, wird auch erwogen, den Fall einzuschließen, in dem die Targetsequenz tatsächlich doppelsträngig ist, aber vor der Hybridisierung mit den Amplifikations-Primersequenzen einfach von ihrem Komplementärstrang getrennt wird. In dem Fall, wo PCR im bevorzugten Verfahren angewandt wird, sind die Enden der Targetsequenzen normalerweise bekannt. In Fällen, in denen LCR oder eine Modifikation davon im bevorzugten Verfahren angewandt wird, ist die gesamte Targetsequenz normalerweise bekannt. Typischerweise ist die Targetsequenz eine Nucleinsäurensequenz wie z. B. RNS oder DNS.
Das hierin bereitgestellte Verfahren kann in bekannten Amplifikationsreaktionen angewandt werden, die Reaktionsmischungen thermisch „zyklisieren" (thermischen Zyklen unterwerfen), vor allem in PCR und GLCR. Amplifikationsreaktionen nutzen typischerweise Primer, um wiederholt Kopien einer Target-Nucleinsäurensequenz zu erzeugen, die normalerweise ein kleiner Bereich einer viel größeren Nucleinsäurensequenz ist. Primer sind selbst Nucleinsäurensequenzen, die zu Bereichen einer Targetsequenz komplementär sind. Unter Amplifikationsbedingungen hybridisieren oder binden sich diese Primer an die komplementären Bereiche der Targetsequenz. Kopien der Targetsequenz werden typischerweise erzeugt durch das Verfahren der Primerausdehnung und/oder Ligation, das, separat oder in Kombination, Enzyme mit Polymerase- oder Ligase-Aktivität verwendet, um den hybridisierten Primern Nucleotide hinzuzufügen und/oder nebeneinander liegende Sondenpaare zu ligieren. Die Nucleotide, die den Primern oder Sonden als Monomere oder vorgeformte Oligomere hinzugefügt werden, sind auch komplementär zu der Targetsequenz. Sobald die Primer oder Sonden genügend ausgedehnt und/oder ligiert wurden, werden sie von der Targetsequenz getrennt, z. B. durch Erwärmen der Reaktionsmischung auf eine „Schmelztemperatur", d. h. eine Temperatur, bei der komplementäre Nucleinsäurestränge dissoziieren. So wird eine Sequenz, die komplementär zu der Targetsequenz ist, gebildet.
Dann kann ein neuer Amplifikationszyklus stattfinden, um die Anzahl der Targetsequenzen weiter zu erhöhen, durch Abtrennen von jeglicher doppelsträngigen Sequenz, wobei es Primern oder Sonden ermöglicht wird, an ihre jeweiligen Targets zu hybridisieren, durch Ausdehnen und/oder Ligieren der hybridisierten Primer oder Sonden und erneutes Trennen. Die komplementären Sequenzen, die durch Amplifikationszyklen erzeugt werden, können als Matrizen zur Primerausdehnung dienen oder die Lücke zwischen zwei Sonden füllen, um die Anzahl der Targetsequenzen weiter zu erhöhen. Typischerweise wird eine Reaktionsmischung zwischen 20- und 100-mal zyklisiert; typischererweise wird eine Reaktionsmischung zwischen 25- und 50-mal zyklisiert. Die Anzahl der Zyklen kann vom Routinier bestimmt werden. Auf diese Art werden mehrere Kopien der Targetsequenz und ihrer komplementären Sequenz erzeugt. So lösen Primer eine Amplifikation der Targetsequenz aus, wenn sie unter Amplifikationsbedingungen vorhanden ist.
Im Allgemeinen werden zwei Primer, die komplementär zu einem Abschnitt eines Targetstrangs und seinem Komplementärstrang sind, in der PCR verwendet. Bei LCR werden im Allgemeinen vier Sonden eingesetzt, von denen zwei komplementär zu einer Targetsequenz und zwei in ähnlicher Weise komplementär zum Komplementärstrang des Targets sind. Zusätzlich zu den zuvor erwähnten Primersätzen und Enzymen kann eine Nucleinsäure-Amplifikations-Reaktionsmischung auch weitere Reagenzien umfassen, die gut bekannt sind und Folgendes einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind: Enzym-Cofaktoren wie z. B. Mangan; Magnesium; Salze; Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) und Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs) wie z. B. Desoxyadenintriphosphat, Desoxyguanintriphosphat, Desoxycytosintriphosphat und Desoxythymintriphosphat.
Während die Amplifikationsprimer die Amplifikation der Targetsequenz auslösen, ist die Detektions- (oder Hybridisierungs)-Sonde an der Amplifikation nicht beteiligt. Detektionssonden sind im Allgemeinen Nucleinsäurensequenzen oder nicht geladene Nucleinsäurenanaloga wie z. B. Peptid-Nucleinsäuren, die in der Internationalen Patentanmeldung WO 92/20702 offenbart sind, Morpholino-Analoga, die in den U.S.-Patenten 5,185,444, 5,034,506 und 5,142,047 beschrieben sind, u. Ä. Je nach Art des Labels, das die Sonde trägt, wird die Sonde eingesetzt, um das durch die Amplifikationsreaktion erzeugte Amplicon einzufangen oder nachzuweisen. Die Sonde ist an der Amplifikation der Targetsequenz nicht beteiligt und muss daher möglicherweise insofern „nicht ausdehnbar" gemacht werden, als zusätzliche dNTPs der Sonde nicht hinzugefügt werden können. An sich sind Analogons normalerweise nicht ausdehnbar, und Nucleinsäuresonden können nicht ausdehnbar gemacht werden, indem das 3'-Ende der Sonde so verändert wird, dass die Hydroxylgruppe nicht an der Elongation teilnehmen kann. Zum Beispiel kann das 3'-Ende der Sonde mit dem Einfang- oder Nachweislabel so beeinflusst werden, dass es damit die Hydroxylgruppe verbraucht oder anderweitig blockiert. Alternativ kann die 3'-Hydroxylgruppe einfach abgespalten, ersetzt oder modifiziert werden. WO 94/24311 beschreibt Modifikationen, die benutzt werden können, um eine Sonde nicht ausdehnbar zu machen.
Dementsprechend ist das Mengenverhältnis von Primern zu Sonden nicht wichtig. So können entweder die Sonden oder die Primer der Reaktionsmischung im Überschuss hinzugefügt werden, wodurch die Konzentration des einen größer wäre als die Konzentration des anderen. Alternativ können Primer und Sonden in äquivalenten Konzentrationen eingesetzt werden. Vorzugsweise werden jedoch die Primer der Reaktionsmischung im Überschuss über die Sonden hinzugefügt. So werden Verhältnisse von Primern zu Sonden von z. B. 5 : 1 und 20 : 1 bevorzugt.
Während die Länge der Primer und Sonden variieren kann, sind die Sondensequenzen so ausgewählt, dass sie eine niedrigere Schmelztemperatur haben als die Primersequenzen. Daher sind die Primersequenzen im Allgemeinen länger als die Sondensequenzen. Typischerweise liegt die Länge der Primersequenzen im Bereich von zwischen 20 und 50 Nucleotiden, typischer im Bereich von zwischen 20 und 30 Nucleotiden. Die Länge der typischen Sonde liegt im Bereich von zwischen 10 und 25 Nucleotiden.
Verschiedene Verfahren zur Synthetisierung von Primern und Sonden sind im Fachgebiet gut bekannt. In ähnlicher Weise sind Verfahren zum Anlagern von Labels an Primer oder Sonden ebenfalls im Fachgebiet gut bekannt. Es ist z. B. Routinearbeit, gewünschte Nucleinsäuren-Primer oder -Sonden unter Verwendung herkömmlicher Nucleotid-Phosphoramidit-Chemie und -Instrumenten zu synthetisieren, die von Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA), Dupont (Wilmington, DE) oder Milligen (Bedford, MA) erhältlich sind. Es sind viele Verfahren zur Markierung von Oligonucleotiden wie z. B. den Primern oder Sonden der vorliegenden Erfindung beschrieben worden. Sowohl Enzo Biochemical (New York, NY) als auch Clontech (Palo Alto, CA) haben Markierungstechniken für Sonden beschrieben und vermarktet. Zum Beispiel kann ein primäres Amin mit Hilfe von 3'-Amine-ON CPG^TM (Clontech, Palo Alto, CA) an einen 3'-Oligo-Terminus angelagert werden. Ähnlich kann mit Hilfe von Aminomodifier II^® (Clontech) ein primäres Amin an einen 5'-Oligo-Terminus angelagert werden. Die Amine können mit Hilfe herkömmlicher chemischer Aktivierungs- und Verbindungstechniken mit verschiedenen Haptenen reagiert werden. Zusätzlich lehren EP-A- 0 562 014 und EP-A- 0 563 287 Verfahren zur Markierung von Sonden an ihren 5'- bzw. 3'-Termini. Veröffentlichungen WO 92/10505, veröffentlicht am 25. Juni 1992, und WO 92/11388, veröffentlicht am 9. Juli 1992, lehren Verfahren zur Markierung von Sonden an ihren 5'- bzw. 3'-Enden. Nach einem bekannten Verfahren zur Markierung eines Oligonucleotids wird ein Label-Phosphoramidit-Reagens hergestellt und benutzt, um das Label an das Oligonucleotid während seiner Synthese anzulagern. Siehe z. B. N. T. Thuong et al., Tet. Letters 29(46): 5905–5908 (1988) oder J. S. Cohen et al., veröffentlichte U.S.-Patentanmeldung 07/246,688 (NTIS ORDER No. PAT-APPL-7-246,688) (1989), die EP-A-0 436 582 entspricht. Sonden werden vorzugsweise an ihren 3'- und 5'-Enden markiert.
Einfanglabel werden von den Primern oder Sonden getragen und können ein spezifisches Bindungsglied sein, das ein Bindungspaar mit dem spezifischen Bindungsglied des Festphasenreagens bildet. Es versteht sich natürlich, dass der Primer oder die Sonde selbst als Einfanglabel dienen kann. Wenn z. B. das Bindungsglied eines Festphasenreagens eine Nucleinsäurensequenz ist, kann es so ausgewählt werden, dass es sich an einen komplementären Abschnitt des Primers oder der Sonde bindet, um so den Primer oder die Sonde auf dem festen Träger zu immobilisieren. In Fällen, in denen die Sonde selbst als das Bindungsglied dient, wird der Fachmann erkennen, dass die Sonde eine Sequenz oder einen „Schwanz" enthält, der nicht zu den einzelsträngigen Amplicongliedern komplementär ist. In dem Fall, in dem der Primer selbst als das Einfanglabel dient, ist mindestens ein Abschnitt des Primers frei, um mit einer Nucleinsäure auf einem festen Träger zu hybridisieren, da die Sonde so ausgewählt wird, dass sie nicht völlig komplementär zu der Primersequenz ist.
Im Allgemeinen können Komplexe aus Sonden und einzelsträngigen Amplicongliedern mit Techniken nachgewiesen werden, die allgemein eingesetzt werden, um heterogene Immunassays durchzuführen. Vorzugsweise wird in dieser Ausführungsform der Nachweis gemäß den Protokollen durchgeführt, die von den im Handel erhältlichen Abbott LCx^®-Instrumenten (Abbott Laboratories; Abbott Park, IL) verwendet werden.
1(a)–1(f) enthalten ein Diagramm eines Testformats der Erfindung. Wie in 1(a) gezeigt, werden eine Untersuchungsprobe mit der Targetsequenz 10, Amplifikationsreagenzien, die Primer 20 umfassen, und Nachweissonden 30 dem Gefäß 40 hinzugefügt, um eine Reaktionsmischung zu bilden. Nach dem Hinzufügen der Reagenzien wird die Reaktionsmischung Amplifikationsbedingungen ausgesetzt, so dass eine Kopie des Targetstrangs 60 produziert wird wie in 1(b) dargestellt. Die Mischung von 1(b) kann dann erhitzt werden, um das doppelsträngige Amplicon thermisch zu dissoziieren, wie in 1(c) gezeigt, die einzelsträngige Ampliconglieder 70 darstellt. Die Mischung von 1(c) wird dann abgekühlt, und Sonden 30 binden die einzelsträngigen Ampliconglieder 70, um Komplexe 80 aus Sonden und einzelsträngigen Amplicongliedern zu bilden, wie in 1(d) gezeigt. 1(e) stellt ein Verfahren zum Nachweis der Komplexe 80 dar. Wie in 1(e) gezeigt, werden die Komplexe 80 auf dem Festphasenreagens 90 immobilisiert, und das Konjugat 100 wird an die Komplexe immobilisiert. Das Vorhandensein der Komplexe auf dem Festphasenreagens kann dann nachgewiesen werden als ein Hinweis auf das Vorhandensein der Targetsequenz in der Untersuchungsprobe. 2 zeigt ein Diagramm des Reaktionskomplexes, worin der große offene Kreis einen festen Träger darstellt, Y_________Y eine Sondensequenz darstellt, an deren beide Enden ein Hapten (Y) angelagert wird, anti-Y einen Anti-Hapten-Y-Antikörper darstellt, X ein anderes Hapten darstellt, anti-X einen Antikörper gegen Hapten X darstellt und (*) eine nachweisbare signalerzeugende Verbindung darstellt. Es ist anzumerken, dass die Sonde und der Primer jeweils an ein anderes Hapten angelagert werden können, wie z. B. Adamantan und Carbazol, und dass die Anlagerung entweder am 5'-Ende, am 3'-Ende oder sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende stattfinden kann, oder mehr als ein Hapten am 5'- oder 3'-Ende oder in deren Nähe angelagert werden kann. In den folgenden Beispielen, SEQUENZ ID-NR. 1, 2, 6, 7, 16, 18, 19, 21, 22, 25, 26 und 27, war Adamantan an Position 1 jedes 5'-Endes angelagert, soweit nicht anders vermerkt; bei den SEQUENZ-ID-NR. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 30 und 31 war Carbazol an der abschließenden Nucleotidposition jedes 3'-Endes angelagert, soweit nicht anders vermerkt; und bei den SEQUENZ-ID-NR. 17, 20, 23, 24, 28 und 29 war Carbazol jeweils an Position 1 des 5'-Endes und der abschließenden Nucleotidposition des 3'-Endes angelagert, soweit nicht anders vermerkt.
Die hierin offenbarten Primer und Sonden sind nützlich in typischen PCR-Tests, worin die Untersuchungsprobe mit einem Paar von Primern in Kontakt gebracht wird, Amplifikation durchgeführt wird, die Hybridisierungssonde hinzugefügt und der Nachweis durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen beschrieben werden, die dazu dienen, die Erfindung zu verdeutlichen, aber nicht einzuschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1. Amplifikation mit HGBV-NTR-Primersatz
Targetspezifische Primer-Nachweissonden wurden hergestellt, um die obige Targetsequenz durch Oligonucleotid-Hybridisierungs-PCR nachzuweisen. Diese Primer waren SEQUENZ-ID NR. 1 und SEQUENZ-ID NR. 2.
A. NTR-Primersatz. Targetsequenzen wurden mit Hilfe des NTR-Primersatzes (SEQUENZ-ID NR. 1 und SEQUENZ-ID NR. 2) erweitert und unter Verwendung von Standard-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Kopplungstechnik an ihrem 5'-Ende mit Adamantan haptenisiert.
Das vervielfältigte Produkt wurde dann mit Hilfe verschiedener Hybridisierungssonden wie in TABELLE 1 gezeigt nachgewiesen. Die Spezifizität wurde unter Verwendung menschlicher Plazenta-DNS (hp DNS; Sigma, St. Louis, MO) bewertet. Die Reaktivität wurde mit Hilfe von Plasmid-DNS bewertet, die NTR-Sequenz enthielt.
TABELLE 1
B. Beschreibung des Plasmids. Eine PCR-Erweiterung wurde für die Reaktionen 1–12 (s. Tabelle 1) wie unten beschrieben mit Hilfe des 10 × PCR-Puffers (Perkin Elmer, Foster City, CA) durchgeführt, der aus 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, bestand. Die endgültige MgCl2-Konzentration betrug 2 mM, und die endgültige Konzentration der Nucleotide betrug 200 μM. Die Reaktionsbedingungen für Tabelle 1 sind in Tabelle 2 dargestellt.
TABELLE 2
Nach der Amplifikation wurden die Reaktionsprodukte mit dem Abbott LCx^®-System (erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) nachgewiesen. Die Daten aus diesen Experimenten sind in TABELLE 3 dargestellt. Die Daten in TABELLE 3 verdeutlichten eine spezifische Amplifikation und Nachweis der HGBV-Targetsequenz.
TABELLE 3
Beispiel 2. GB-Serumprobe PCR/LCx^®-Parameter
„IVDU 300" war eine Probe, von der bekannt war, dass sie den GB-Erreger enthielt. Sie wurde getestet wie im Folgenden beschrieben. Die negative Kontrollprobe war normales Serum.
A. HGBV 5'NTR-Nachweis
Die Targetsequenzen (TABELLE 4) wurden unter Verwendung der Primer (SEQ-ID Nr. 1 und 2) und Nachweissonden (SEQ-ID Nr. 3 und 4) amplifiziert wie in Beispiel 1 beschrieben. Für diese Untersuchung hatten die Primer eine Konzentration von 0,25 mM (3,0 × 10¹³ Molekülen), und die Nachweissonden hatten eine Konzentration von 0,01 mM (1,2 × 10¹² Molekülen). Zusätzlich gab es 0,025 Einheiten/ml (insgesamt 5 Einheiten) von rTth DNS-Polymerase und insgesamt 20 ng rRNS.
Die Reverse Transkriptase-Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 60°C durchgeführt. Das Produkt wurde unter den folgenden Zyklisierungsbedingungen PCR-amplifiziert: 94°C für 1 min./55°C für 1 min./72°C für 1 min. für 40 Zyklen. Als Nächstes war der Oligomer-Hybridisierungsschritt eine 95°C-, für 5 min. 15°C-, Eintauchung.
Nach der Amplifikation wurden im Abbott LCx^®-System (erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) die Reaktionsprodukte nachgewiesen. Die Daten aus diesen Experimenten sind in TABELLE 4 dargestellt. Die Daten in TABELLE 4 zeigten eine spezifische Amplifikation und Nachweis der HGBV-Targetsequenz.
TABELLE 4
Beispiel 3. Leistungsstudie
Das Primerpaar von SEQUENZ-ID Nr. 1 und SEQUENZ-ID Nr. 2 wurde wie in Beispiel 2 oben mit dem Sondensatz von SEQUENZ-ID Nr. 3, SEQUENZ-ID Nr. 6 und SEQUENZ-ID Nr. 7 getestet, um die Sensitivität und Spezifizität zu beurteilen. Beachten Sie, dass für Sonden der SEQUENZ-ID NR. 3 die Sonde sowohl an das 5'-Ende an Position 1 als auch an das 3'-Ende an Position 15 angelagert wird.
TABELLE 5 Reaktivität der Kombination
Beispiel 4. Sensitivität und Spezifizität von Primer- und Sonden-Kombination
Der Primersatz von SEQUENZ-ID Nr. 1 und SEQUENZ-ID Nr. 2 wurde wie in Beispiel 3 oben beschrieben mit dem Sondensatz von SEQUENZ-ID Nr. 3 (wobei Carbazol am 5'-Ende an Position 1 und am 3'-Ende an Position 15 angelagert war) und SEQUENZ-ID Nr. 6 getestet, um die Sensitivität und Spezifizität zu beurteilen. Ergebnisse sind unten in TABELLE 6 dargestellt.
TABELLE 6
Die Sonden der vorliegenden Erfindung, die hierin beschrieben sind, sind somit nützlich zum Nachweis von HGBV in Individuen. Andere Verwendungen oder Variationen der vorliegenden Erfindung werden für Personen mit normalen Fachkenntnissen beim Betrachten dieser Offenbarung offensichtlich sein. Daher soll die vorliegende Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche eingeschränkt sein.
SEQUENZLISTE

Claims

Eine Sonde, die spezifisch für Hepatitis-GB-Virus C (HGBV-C) 5' NTR ist, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 3, SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 4 und SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 5.
Eine Zusammensetzung, die ein Primer-Paar umfasst, das spezifisch für HGBV-C 5' NTR ist und aus SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 1 und SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 2 besteht.
Ein Assay zur Bestimmung des Vorhandenseins von HGBV-C-Ziel-Nukleotiden in einer Testprobe, der Folgendes umfasst: a. In-Kontakt-Bringen einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie eine Ziel-HGBV-C-Nukleotidsequenz enthält, mit dem HGBV-C-Primer-Paar von SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 1 und SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 2, um eine Mischung zu bilden; b. In-Kontakt-Bringen des Reaktionsgemischs mit mindestens einer HGBV-C-Sonde, gewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 3, SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 4 und SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 5; c. Detektieren des Vorhandenseins des HGBV-C-Zielnukleotids in der Testprobe.
Der Assay von Anspruch 3, worin die HGBV-C-Sonde mit einer detektierbaren signalerzeugenden Verbindung konjugiert wird.
Der Assay von Anspruch 4, worin die signalerzeugende Verbindung gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer chemilumineszierenden Verbindung, Fluorescein und einem Enzym.
Der Assay von Anspruch 3, worin die HGBV-C-Sonde mit einem Hapten konjugiert wird.
Der Assay von Anspruch 6, worin das Hapten gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adamantan, Carbazol, Fluorescein und Biotin.
Ein Testkit zur Bestimmung von Ziel-HGBV-C-Nukleotid in einer Testprobe, das Folgendes umfasst: a. einen Behälter, der ein Primer-Paar enthält, das für ein HGBV-C-Zielnukleotid spezifisch ist, worin das Primer-Paar SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 1 und SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 2 ist; b. einen Behälter, der mindestens eine Sonde enthält, die spezifisch für HGBV-C ist, worin die HGBV-C-Sonde gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 3, SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 4 und SEQUENZ-IDENTIFIKATIONSNR. 5.
Das Testkit von Anspruch 8, worin die HGBV-C-Sonde mit einer detektierbaren signalerzeugenden Verbindung konjugiert wird.
Das Testkit von Anspruch 9, worin die signalgenerierende Verbindung gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer chemilumineszierenden Verbindung, Fluorescein und einem Enzym.
Das Testkit von Anspruch 8, worin die HGBV-C-Sonde mit einem Hapten konjugiert ist.
Das Testkit von Anspruch 11, worin das Hapten gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adamantan, Carbazol, Fluorescein und Biotin.