DE69804464T2

DE69804464T2 - Nukleinsäuresequenzen als primer und sonden zur amplifizierung und erkennung von allen hiv-1 subtypen

Info

Publication number: DE69804464T2
Application number: DE1998604464
Authority: DE
Inventors: Jaap Goudsmit; Pieter Oudshoorn; Suzanne Jurriaans; Vladimir Vladimirovich Lukashov
Original assignee: Biomerieux BV
Current assignee: Biomerieux BV
Priority date: 1997-08-08
Filing date: 1998-08-05
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2018-08-06
Also published as: DE1002138T1; JP2001512701A; EP1568787B1; US20060228699A1; KR100615407B1; ES2479065T3; JP3689333B2; CA2299275C; ID25877A; US20060223056A1; US20060223057A1; US20150292043A1; ES2438578T3; KR20010022730A; US8697352B2; AU736503B2; GR20010300012T1; US6881537B1; AU9161198A; EP1002138B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen die auf dem Gebiet der Virusdiagnostik, im spezifischen in der Diagnose von Infektionen durch den AIDS-verursachenden Human Immunodeficiency Virus (HIV).
Während sich konventionelle Virusdiagnose vorwiegend auf den Nachweis von viralen Antigenen oder deren spezifische Antikörper gestützt hat, hat sich in letzter Zeit die Aufmerksamkeit mehr zu Methoden zum direkten Nachweis des Genoms von Viren oder davon hergeleiteten Nukleinsäurensequenzen, RNA wie auch DNA, verlagert. Diese Methoden basieren gewöhnlich auf Nukleinsäurehybridisierung. Nukleinsäurehybridisierung basiert auf der Fähigkeit zweier komplementäre Sequenzen enthaltenden Nukleinsäurenstränge unter den geeigneten Bedingungen aneinander zu anelieren, und dadurch eine Dopplestrangstruktur zu bilden. Wenn der Komplementärstrang markiert ist, kann die Markierung nachgewiesen werden und ist kennzeichnend für die Vorliegen der Zielsequenz. Vor allem in Kombination mit Methoden zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen sind diese Methoden ein bedeutendes Hilfsmittel in der viralen Diagnose geworden, insbesondere für den Nachweis des Human Immunodeficiency Virus (HIV).
Nukleinsäurenamplifikationsmethoden sind vor allem nützlich als zusätzliche Methode in Fällen, in denen serologische Methoden zweifelhafte Resultate ergeben oder in Fällen, in denen eine beachtliche Zeitspannne zwischen Infektion und der Entwicklung von Antikörpern gegen das Virus liegt. Im Falle von HIV kann die Serokonversion gewöhnlich 3–6 Monate nach der Virusexposition auf treten. Demnach kann, während mittels konventioneller Immunoassays keine Antikörper nachgewiesen werden können, provirale DNA oder zirkulierende, virale RNA bereits nachweisbar sein. Zudem besitzen Methoden basierend auf Nukleinsäurenamplifikation bei der Überwachung antiviraler Therapie einige Vorteile gegenüber serologischen Methoden. Vor allem quantitative Amplifikationsmethoden stellen ein gewichtiges Hilfsmittel bei der Einschätzung der Änderungen in der Menge des Virus, die vor und nach der Therapie vorhanden ist, dar.
Die Wahl der Oligonukleotide, die zum Gebrauch als Primer oder Proben bei der Amplifikation und Nachweis von Nukleinsäuresequenzen vorgesehen sind, ist kritisch für die Sensitivität und Spezifizität des Assays. Die zu amplifizierende Sequenz ist in einer Probe (zum Beispiel einer Blutprobe, die von einem Patienten, der unter Verdacht steht eine virale Infektion zu haben, erhalten wurde) für gewöhnlich nur in kleinsten Mengen vorhanden. Die Primer sollten in ausreichendem Masse komplementär zur Zielsequenz sein, um effiziente Amplifikation der in der Probe vorhandenen viralen Nukleinsäure zu ermöglichen. Falls die Primer nicht angemessen an die Zielsequenz anelieren (auf Grund von Fehlpaarung der Basen in den Nukleotiden beider Stränge), ist die Amplifikation ernstlich beeinträchtigt. Dies wird sich auf die Sensitivität des Assays auswirken und kann falsche negative Testresultate zur Folge haben. Auf Grund der Heterogeneität viraler Genome können falsche negative Testresultate erhalten werden, falls die Primer und Sonden nur in einem Teil der Varianten des Virus vorhandene Sequenzen erkennen können. Der HIV Virus besitzt eine hohe Heterogeneität. Genetische Variabilität wurde unter Isolaten von verschiedenen Kontinenten, wie auch zwischen Individuen und zwischen unterschiedlichen Krankheitsstadien veranschaulicht. Basierend auf Sequenzanalysen wurden zwei Gruppen innerhalb HIV-1 identifiziert: die Gruppe M (M für „major") und die Gruppe O (O für „outlier"). Innerhalb der Gruppe M wurden Subtypen (A-H) zugeordnet, wovon jeder einen phylogenetischen, separaten Satz von Sequenzen darstellt, und weitere werden identifiziert. Diese Sequenzvariation verteilt sich nicht gleichmässig über das ganze Genom. Das HIV-1 Genom, wie alle retroviralen Genome, besteht annähernd aus den folgenden Regionen: das gag-Gen des HIV-1 Genoms ist die Region, die die Kernproteine des Virus kodiert (zum Beispiel p24). Das env-Gen kodiert ein grosses Precursorprotein, gp160, welches in die envelop-Proteine gp120 und gp41 prozessiert wird. Das pol-Gen kodiert die Polymerase des Virus (Reverse Transkriptase). Die Long Terminal Repeat Regions (LTR's) sind die Regionen des viralen Genoms die an der Integration des Virus in die Wirtszelle und an der Regulierung der Transkription der viralen Gene teilhaben. Manche Regionen sind mehr anfällig für Sequenzvariationen als andere. Vor allem im env-Bereich kann die Sequenzvariation zwischen den Mitgliedern der verschiedenen Subtypen so hoch wie 30% sein. Idealerweise sollte sich die Selektion der Primer auf die Erkenntnis der Variabilität von Primersequenzkandidaten zwischen den Stämmen und den Konsequenzen von Fehlpaarungen an Primerstellen stützen. McCutchan et al, J. AIDS, 4, 1241–1250, 1991 verwendete PCR um einen genetischen Vergleich zwischen verschiedenen HIV-1 Isolaten zu ziehen. Mittels eingebetteter PCR (variierende Sense-Primer wurden mit einem gleichbleibenden Antisense-Primer verwendet, die Primer wurden von verhältnismäßig konservierten Regionen in gag, env und LTR ausgewählt). Der Effekt von Primer-Fehlpaarungen auf die Menge des erhaltenen PCR-Produktes wurde ebenfalls untersucht. Fehlpaarung am 3'-Ende des Primer reduzierte die Produktmenge manchmal um mehr als das 100-fache.
Der Nachweis von derzeit allen bekannten HIV-1 Subtypen ist von grösster Bedeutung, vor allem in Hinblick auf Patientenbehandlung, Gewißheit bezüglich des Blutes und Blutprodukten und in klinischen und epidemiologischen Studien. Gegenwärtige Assays für die Amplifikation und den nachfolgenden Nachweis von HIV-1 hergeleiteten Nukleinsäurensequenzen basieren gewöhnlich auf der Amplifikation der Sequenzen in der gag-Region des viralen Genoms. Diese Assays wurden für den Subtyp B, der den grössten Subtyp in europäischen Ländern und den Vereinigten Staaten darstellt, entwickelt. Jedoch nimmt die Existenz von anderen, zuvor geographisch begrenzten Subtypen auf Grund häufiger Reisen zwischen diesen Ländern und zum Beispiel afrikanischen Ländern zu. Demzufolge sind empfindliche Assays, die so viele Varianten des HIV-1-Virus wie möglich (vorzugsweise alle) nachweisen können, erforderlich.
Während der letzten Jahre wurde gezielte Forschung zur Identifikation von Primersets, die für eine zuverlässige Amplifikation von HIV-1 abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen geeignet betrieben. Engelbrecht et al., J. Virol. Meth., 55, 391–400, 1995, beschreibt eine auf die Entwicklung eines spezifischen und empfindlichen PCR-Protokolls gezielte Studie unter Verwendung von env-, gag- und LTR-Primerpaaren, um Subtypen, die im Western Cape, Südafrika, vorkommen, nachzuweisen. Vierundzwanzig Stämme, von welchen bekannt war, dass sie zu den Subtypen B, C und D gehören, wurden analysiert. Man stellte fest, dass die Leistungsfähigkeit der Primerpaare enorm von der Optimisierung der Reaktionsbedingungen für die verschiedenen Primerpaare abhängig war. Nur wenn weniger harte Bedingungen gebraucht wurden (zum Beispiel waren für das LTR Primerpaar eine erhöhte Zykluszeit und tiefere Anelierungstemperaturen notwendig), konnten diese besonderen HIV-Stämme mit genügender Sensitivität und Reproduzierbarkeit mittels aller Primerpaare ermittelt werden.
Zazzi et al., J. Med. Virol., 38, 172–174, 1992, entwickelte eine Zwei-Schritt PCR-Reaktion (unter Verwendung von verschachtel ten Primer) zur Ermittlung von HIV-1 DNA in klinischen Proben. Die für die Amplifikation verwendeten Primer wurden vom gag-Gen und der LTR-Region hergeleitet. Die in dieser Studie getesteten Patienten waren alle von benachbarten Regionen, wodurch es wahrscheinlich ist, dass sie nur eine limitierte Anzahl von verschiedenen, viralen Stämmen repräsentieren. Andere Beispiele von PCR-Primer zur Ermittlung von HIV sind in EP-A-0 617 132, US 5,629,413 und Ep-A-0 331 939 enthalten.
Eine quantitative PCR Methode, die LTR-hergeleitete, verschachtelte Primer verwendet wurde von Vener et al. in BioTechniques, 21, 248–255, 1996 beschrieben. Diese Methode wurde nur an HIV-1_MN- infizierten, peripheren Blut-mononukleären Zellen (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) getestet. Somit kann keine Aussage über die Eignung der verwendeten Primer zur Ermittlung verschiedener Virus-Subtypen gemacht werden.
In der vorliegenden Erfindung werden Nukeotidsequenzen bereitgestellt, die als Primer und Sonden bei der Amplifikation und Nachweis von HIV-1 Nukleinsäuren gebraucht werden kann. Die in der vorliegenden Erfindung vorgegebenen Nukleinsäuresequenzen sind im LTR Teil des HIV viralen Genoms lokalisiert. Es wurde festgestellt, dass unter Verwendung der erfindungsgemässen Sequenzen in den Methoden zur Amplifikation und Nachweis von Nukleinsäuren ein empfindlicher und spezifischer Nachweis für HIV-1 erhalten werden kann. Der Nutzen der erfindungsgemässen Sequenzen besteht primär in der Tatsache, dass die Nukleinsäuren von allen derzeit bekannten HIV-1-Subtypen mit Hilfe von Primer und Sonden, die die erfindungsgemässen Sequenzen umfassen, mit grosser Präzision und Sensitivität nachgewiesen werden kann. Bis jetzt wurden keine Primerpaare oder Hybridisierungssonden entwickelt, die eine Ermittlung eines so breiten Bereichs von HIV-1 Varianten ermöglichen würde.
Die erfindungsgemässen Oligonukleotidsequenzen sind vor allem nützlich für Methoden zur Amplifikation von Nukleinsäuren.
In Fachkreisen sind verschiedene Methoden zur Amplifikation von Nukleinsäuren bekannt. Ein Beispiel einer Methode zur Amplifikation eines DNA-Zielsegmentes ist die sogenannte „Polymerase Kettenreaktion" (PCR). Mittels der PCR-Methode nimmt die Nummer der Kopien eines bestimmten Zielsegmentes exponentiell mit der Anzahl von Zyklen zu. Ein Primerpaar wird verwendet und in jedem Zyklus wird ein DNA-Primer an die 3'-Seite jedes der zwei Stränge der doppelsträngigen DNA-Zielsequenz aneliert. Die Primer werden mittels einer DNA Polymerase in Gegenwart von verschiedenen Mononukleotiden verlängert, um wiederum doppelsträngige DNA zu erzeugen. Die Stränge der doppelsträngigen DNA werden voneinander mittels thermaler Denaturierung getrennt und jeder Strang dient als Matrize zur Primer-Anelation und anschliessender Verlängerung in einem anschliessenden Zyklus. Die PCR Methode wurde in Saiki et al., Science 230, 135, 1985 und in den Europäischen Patenten Nr. EP 200362 und EP 201184 beschrieben.
Eine andere Methode zur Amplifikation von Nukleinsäuren ist das sogenannte Transkriptions-basierende Amplifikationssystem (TAS). Die TAS Methode wird in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 88/10315 beschrieben. Transkriptions-basierende Amplifikationsmethoden umfassen gewöhnlich die Behandlung von Zielnukleinsäuren mit zwei Oligonukleotiden, von denen eines eine Promotorsequenz enthält, um eine einen funktionellen Promotor enthaltende Matrize zu erzeugen. Mehrfache RNA-Kopien werden von besagter Matrize transkribiert und können als Basis für weitere Amplifikationen dienen.
Eine isothermale, kontinuierliche Transkriptions-basierende Amplifikationsmethode ist der sogenannte NASBA-Prozess („NASBA") wie im Europäischen Patent Nr. EP 329822 beschrieben. NASBA beinhaltet den Gebrauch von T7 RNA Polymerase um mehrfache RNA Kopien von einer einen funktionellen Promotor enthaltenden Matrize zu transkribieren. Andere Transkriptions-basierende Amplifikationsmethoden werden in EP 408295 beschrieben. EP 408295 befasst sich vor allem mit einer Zwei-Enzym Transkriptions-basierenden Amplifikationsmethode. Transkriptions-basierende Amplifikationsmethoden, wie zum Beispiel die in EP 329822 beschriebene NASBA-Methode, werden für gewöhnlich mit einem Satz Oligonukleotiden verwendet, von denen eines mit einer DNA-Promotorsequenz versehen ist, die von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase, wie zum Beispiel T7 Polymerase, erkannt wird. Mehrere Modifikationen der Transkriptions-basierenden Methoden sind in Fachkreisen bekannt. Diese Modifikationen umfassen, zum Beispiel, den Gebrauch von blockierten Oligonukleotiden (die mit einer Promotorsequenz versehen sein können). Diese Oligo's sind blockiert um eine von ihnen ausgehende Verlängerungsreaktion zu verhindern ( US 5,554,516 ). Ein oder mehrere „Promotor-Primer" (Oligonukleotide versehen mit einer Promotorsequenz) können in Transkriptions-basierenden Amplifikationsmethoden verwendet werden, gegebenenfalls in Kombination mit der Verwendung von einem oder mehreren Oligonukleotiden, die nicht mit einer Promotorsequenz versehen sind. Im Falle von RNA-Amplifikation ist eine Transkriptions-basierende Amplifikationsmethode eine bevorzugte Technologie. Amplifikation mit Hilfe von PCR kann auch auf einer RNA-Matrize basieren. Der eigentlichen PCR muss ein Reverser-Transkriptions-Schritt vorangehen, um die RNA in DNA zu kopieren (RT-PCR). Jedoch ist, falls RT-PCR für den Nachweis von viralen Transkripten gebraucht wird, eine Differenzierung von mRNA- und DNA-hergeleiteten PCR-Produkten notwendig. Eine DNAse Behandlung vor RT-PCR kann verwendet werden (Bitsch, A. et al., J. Infect. Dis. 167, 740–743, 1993; Meyer, T. et al., Mol. Cell Probes. 8, 261– 271, 1994), diese scheitert jedoch manchmal verunreinigte DNA hinreichend zu entfernen.
Im Gegensatz zu RT-PCR benötigt NASBA, die auf RNA-Transkription mittels T7 RNA Polymerase basiert (Kievits et al., 1991; Compton, 1991) keine Differenzierung zwischen RNA- und DNA-abgeleiteten Amplifikationsprodukten, da sie RNA als ihr erstes Ziel verwendet. NASBA ermöglicht spezifische Amplifikation von RNA-Zielen sogar vor einem DNA-Hintergrund.
Der Gebrauch der erfindungsgemässen Oligonukleotide ist nicht auf eine bestimmte Amplifikationsmethode oder eine bestimmte Modifikation davon beschränkt. Es ist offenbar, dass die erfindungsgemässen Oligonukleotide in vielen verschiedenen Nukleinsäurensequenz-Amplifikationsmethoden und in verschiedenen Methoden zum Nachweis der Anwesenheit von (amplifizierten) HIV-Nukleinsäuren zur Anwendung kommen. Die erfindungsgemässen Oligonukleotide können gleichermassen in quantitativen Amplifikationsmethoden gebraucht werden. Ein Beispiel solch einer quantitativen Amplifikationsmethode wird in EP 525882 beschrieben.
Der Begriff „Oligonukleotid", wie er hierin gebraucht wird, bezieht sich auf ein Molekül, das zwei oder mehr Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide umfasst. Solche Oligonukleotide können als Primer oder Sonden gebraucht werden.
Natürlich können auch Oligonukleotidanaloge, basierend auf den Sequenzen der erfindungsgemässen Oligonukleotide, hergestellt werden. Solche Analoge können alternative Strukturen, wie zum Beispiel „PNA" (Moleküle mit einem Peptid-ähnlichen Rückgrat anstatt eines Zuckerphosphatrückgrates einer normalen Nukleinsäure) oder ähnliche Strukturen darstellen. Es ist offenbar, dass diese alternativen Strukturen, die die erfindungsgemässen Se quenzen repräsentieren, gleichermassen Teil dieser Erfindung sind.
Der Begriff „Primer", wie er hierin gebraucht wird, bezieht sich entweder auf ein natürlich vorkommendes (zum Beispiel in Form eines Restriktionsfragmentes) oder ein synthetisch hergestelltes Oligonukleotid, das fähig ist als Synthese-Ausgangspunkt eines Primer-Verlängerungsproduktes, das komplementär zu einem Nukleinsäurestrang (einer Matrize oder Zielsequenz) ist, zu wirken, im Falle von geeigneten Bedingungen (wie zum Beispiel Puffer, Salz, Temperatur und pH) und in Gegenwart von Nukleotiden und eines Hilfsmittels zur Nukleinsäurepolymerisation, wie zum Beispiel einer DNA-abhängigen oder RNA-abhängigen Polymerase. Ein Primer muss genügend lang sein, um die Synthese der Verlängerungsprodukte in Gegenwart eines Hilfsmittels zur Polymerisation vorzubereiten. Ein typischer Primer besteht in der Länge aus mindestens 10 Nukleotiden einer Sequenz, die im wesentlichen komplementär oder homolog zur Zielsequenz ist, jedoch werden etwas längerer Primer bevorzugt. Für gewöhnlich bestehen Primer aus etwa 15–26 Nukleotiden, jedoch werden auch längere Primer verwendet, vor allem wenn die Primer zusätzliche Sequenzen, wie zum Beispiel eine Promotorsequenz für eine bestimmte Polymerase enthalten.
Üblicherweise besteht ein Satz von Primer aus mindestens zwei Primer, ein „upstream" und ein „downstream" Primer, welche zusammen das Amplifikat (die mittels der Primer zu amplifizierende Sequenz) definieren.
Vor allem für den Gebrauch in Transkriptions-basierenden Amplifikationsmethoden können die erfindungsgemässen Oligonukleotiden auch an eine Promotorsequenz geknüpft werden. Der Begriff „Promotorsequenz" definiert eine Region einer Nukleinsäuresequenz, die spezifisch von einer RNA Polymerase erkannt wird, die an eine erkannte Sequenz bindet und den Transkriptionsprozess, bei welchem ein RNA Transkript erzeugt wird, initiiert. Prinzipiell kann jegliche Promotorsequenz verwendet werden, für welche eine bekannte und erhältliche Polymerase existiert, die fähig ist, eine Initiationssequenz zu erkennen. Bekannte und nützliche Promotoren sind diejenigen die von gewissen Bakteriophagen RNA-Polymerasen, wie zum Beispiel Bakteriophage T3, T7 oder SP6, erkannt werden. Oligonukleotide, die an eine Promotorsequenz verknüpft sind, werden im allgemeinen als „Promotor-Primer" bezeichnet. Deren Funktion als Primer, i. e. der Ausgangspunkt für eine Verlängerungsreaktion, kann jedoch in gewissen Variationen der Transkriptions-basierenden Amplifikationsreaktionen entweder, wie zuvor schon erwähnt, blockiert sein oder fehlen.
Ein Oligonukleotid gemäss der vorliegenden Erfindung ist im wesentlichen komplementär zu einer Sequenz der LTR Region einer Nukleinsäuresequenz eines HIV-Genoms, wobei besagtes Oligonukleotid 10–50 Nukleotide in der Länge aufweist und wenigstens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
oder deren komplementären Sequenz.
Es versteht sich, dass aus erfindungsgemässen Sequenzen bestehende Oligonukleotide geringfügige Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Nukleinsäurebasen enthalten können, soweit dass sich solche Änderungen nicht in bedeutendem Grad negativ auf die erhaltene Ausbeute oder das Produkt auswirken. Wenn erfindungsgemässen Oligonukleotide als Sonden gebraucht werden, sollten die Änderungen nicht eine Verminderung der Hybridisierungseffizienz der Sonde zur Folge haben. Zum Beispiel kann im Falle von Transkriptions-basierenden Amplifikationsreaktionen, wobei einer oder mehrere der Primer mit einer Promotorsequenz versehen sein kann, die Einführung einer Purin-reichen (= G oder A) hybridisierenden Sequenz gleich nach der Promotorsequenz positive Auswirkungen auf die Transkription haben (falls C's und T's vorhanden sind, kann eine missglückte Transkription vorkommen). Falls keine solche Sequenz in der Zielnukleinsäure erhältlich ist, kann eine Purin-reiche Sequenz gleich anschliessend an die drei letzten G-Reste der Promotorsequenz in das Oligonukleotid eingefügt werden.
Die erfindungsgemässen Sequenzen werden als DNA Sequenzen wiedergegeben. Die RNA-Äquivalente dieser Sequenzen sind gleichermassen Teil der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugte Oligonukleotide der Erfindung sind Oligonukleotide die im wesentlichen aus einer Sequenz bestehen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
SEQ ID 9–11 umfassen eigentlich die in SEQ ID 1–3 wiedergegebenen Sequenzen. In SEQ ID 9–11 sind die Sequenzen von SEQ ID 1–3 funktionell mit einer Promotorsequenz (der T7 Promotorsequenz) verbunden. Dadurch werden die Sequenzen besonders geeignet für den Gebrauch als Upstream-Primer in einer Transkriptions-basierenden Amplifikationsmethode, wie zum Beispiel NASBA.
Eine bevorzugte Variante der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination zweier erfindungsgemässen Oligonukleotiden zum Gebrauch als ein Satz bei der Nukleinsäure-Amplifikation.
Solch ein Oligonukleotidpaar vorgesehen zum Gebrauch als ein Satz bei der Amplifikation einer, innerhalb des LTR-Bereichs des Genoms von HIV-1 lokalisierten Zielsequenz, besteht aus einem ersten Oligonukleotid, das 10–50 Nukleotide in der Länge aufweist und wenigstens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
und einem zweiten Oligonukleotid, das 10–50 Nukleotide in der Länge aufweist und wenigstens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Eines der Oligonukleotide kann bei der Amplifikation als „Upstream-Oligonukleotid", d. h. als Upstream-Primer, dienen, während das zweite Oligonukleotid als Downstream-Oligonukleotid, d. h. als Downstream-Primer, dienen. Die Stelle im HIV Genom (oder die dazu komplementäre Sequenz) an welche beide erfindungsgemässen, in diesem Paar enthaltenden Oligonukleotide anelieren können, definiert zusammen die Nukleinsäuresequenz, die amplifiziert wir. Die amplifizierte Sequenz ist zwischen den „Primer-bindenden Stellen" innerhalb des LTR-Bereichs des Genoms von HIV-1 lokalisiert. Es wurde festgestellt, dass durch den Gebrauch eines erfindungsgemässen Oliginukleotidpaares bei einer Amplifikationsreaktion eine exakte und zuverlässige Amplifikation von Nukleinsäuren, die von allen derzeit bekannten HIV-Subtypen abgeleitet wurden, erzielt werden kann.
Ein besonders bevorzugtes erfindungsgemässes Oligonukleotidpaar besteht aus einem ersten Primer umfassend die Sequenz SEQ ID NO 1 und einem zweiten Primer umfassend die Sequenz SEQ ID NO 5. Für den Gebrauch in einer Transkriptions-basierenden Amplifikationsmethode werden Oligonukleotide der SEQ ID NO 9 bevorzugt, in Kombination mit einem Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID NO 5.
Ein Teil der erfindungsgemässen Oligonukleotide sind vor allem geeignet für deren Verwendung als Sonde bei der Ermittlung von Nukleinsäuren, die mittels eines erfindungsgemässen Oligonukleo tidpaares amplifiziert wurden. Falls sie als Sonde gebraucht werden, können besagte Oligonukleotide mit einer nachweisbaren Markierung versehen werden. Erfindungsgemässe Oligonukleotide die als Probe vor allem geeignet sind bestehen im wesentlichen aus der Sequenz
versehen mit einer nachweisbaren Markierung. Insofern ist ein besonders bevorzugtes Oligonukleotid ein Oligonukleotid mit einer Sequenz wie in SEQ ID NO 6 beschrieben.
In Fachkreisen sind verschiedene Markierungsgruppen bekannt. Besagte Gruppen können zum Beispiel entweder eine radioaktive Verbindung, ein nachweisbares Enzym (z. Bsp. Meerrettich-Peroxidase (horse radish peroxidase, HRP)), ein Hapten wie zum Beispiel Biotin oder jede andere Gruppe, die fähig ist ein nachweisbares Signal, wie zum Beispiel ein colorimetrisches, fluoreszierendes, chemielumineszierendes oder electrochemielumineszierendes Signal zu erzeugen, sein.
Hybride von erfindungsgemässen Oligonukleotiden und (amplifizierten) Zielnukleinsäuren können ebenso mittels in Fachkreisen wohlbekannten Methoden nachgewiesen werden.
Selbstverständlich sind Methoden zur Amplifikation von Nukleinsäuren, wie die hierin zuvor beschriebenen, unter Verwendung der erfindungsgemässen Oligonukleotiden ebenfalls Teil der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner Testkits zur Amplifikation und Ermittlung von HIV Nukleinsäuren vor. Der Gebrauch besagter Testkits ermöglicht ein exaktes und empfindliches Screening von Proben, von denen vermutet wird, dass sie HIV-abgeleitete Nukleinsäuren enthalten. Solche Testkits können ein erfindungsgemässes Oligonukleotidpaar beinhalten und gegebenenfalls auch ein erfindungsgemässes Oligonukleotid, das als Sonde zur Ermittlung von amplifiziertem Material gebraucht werden kann.
Zudem kann das Testkit geeignete Amplifikationsreagenzien umfassen. Ein für den Gebrauch mit NASBA geeignetes Kit kann zum Beispiele angemessene Mengen an Reverser Transkriptase, RNase H und T7 RNA Polymerase enthalten. Besagte Enzyme können im Kit in einer gepufferten Lösung vorhanden sein, sie können jedoch gleichermassen auch als lyophilisiertes Gemisch vorliegen, zum Beispiel als lyophilisiertes, sphärisches Partikel. Solche lyophilisierten Partikel wurden in PCT Anmeldung Nr. EP 95/01268 offenbart. Das Kit kann ferner mit Puffermischungen versehen werden, die zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion geeignet sind. Besagte Puffer können für eine bestimmte Amplifikationsmethode, für welche das Kit vorgesehen ist, wie auch für den Gebrauch bestimmter Oligonukleotide, die mit dem Kit zur Verfügung gestellt werden, optimisiert werden. Im Falle von Transkriptions-basierenden Amplifikationsmethoden, wie zum Beispiel NASBA, können diese Puffer beispielsweise DMSO, das die Amplifikationsreaktion verstärkt, enthalten (wie in PCT Anmeldung Nr. US 90/04733 beschrieben).
Zudem kann das Kit mit einer internen Kontrolle zur Überprüfung der Amplifikationsmethode oder um ein Vorkommen von falschen negativen Testresultaten aufgrund von Fehlschlägen in der Amplifikationsmethode zu verhindern, versehen werden. Der Gebrauch von internen Kontrollen im Falle von Transkriptions-basierenden Amplifikationsmethoden ist in PCT Anmeldung Nr. EP 93/02248 beschrieben. Eine optimale Kontrollsequenz wird so ausgewählt, dass sie nicht mit der Zielnukleinsäure in der Amplifikations reaktion konkurriert. Kits können auch Reagenzien zur Isolierung von Nukleinsäuren biologischer Proben vor der Amplifiziering beinhalten. Eine geeignete Methode zur Isolierung von Nukleinsäuren ist in EP 389063 offenbart.
Kurze Beschreibung der Figuren
1
Amplifikationsprodukte nach Blotting und Nachweis mittels enhanced Chemiluminescence, die nach Amplifikation in Gegenwart (Tafel A) oder in Abwesenheit (Tafel B) von HIV-1 RNA unter Verwendung folgender Primerpaare erhalten wurden: Bahn 1: SEQ ID 9–SEQ ID 10, Bahn 2: SEQ ID 9–SEQ ID 5, Bahn 3: SEQ ID 10–SEQ ID 4, Bahn 4: SEQ ID 10–SEQ ID 5, Bahn 5: SEQ ID 3–SEQ ID 12.
Beispiele
Beispiel 1: Amplifikation und Nachweis von genomischer RNA von HIV-1
Die folgenden Vorgehensweisen wurden angewendet um genomische RNA von HIV-1 von Proben zu amplifizieren und nachzuweisen, wie in den folgenden Beispielen beschrieben.
Probezubereitung und Nukleinsäurenisolierung
Die Isolierung von Nukleinsäuren wurde gemäss Boom et al., 1990, Journal of Clinical Microbiology 28, 495–503 und gemäss Europäischem Patent Nr. EP 0389063 durchgeführt. In Kürze: ein Volumen von 200 μl gesammelten Plasmas von gesunden Spendern (negativ für HbsAg, anti-HIV und anti-HCV) wurde zu 900 μl Lyse-Puffer (47 mM Tris-HCl pH 7.2, 20 mM EDTA, 1.2% Triton X-100, 4.7 M Guanidin-Thiocyanat (GuSCN, Fluka, Buchs, Schweiz)) gegeben. Nach Vortexieren und Zentrifugation (30 Sekunden, 13'000 rpm) wurde eine Verdünnungsserie des HIV-1 RNA Subtyp B Standards (charakterisiert und beschrieben von Layne et al., 1992, Virolo gy 189, 695–714) oder von HIV-1 positiven Proben zugegeben. Nach Zugabe von 50 μl aktiviertem Silikon (0.4 g/ml Suspension in 0.1 N HCl) wurde die Suspension für 10 Minuten bei Raumtemperatur und regelmässigem Vortexieren inkubiert. Nach Zentrifugation (30–60 Sekunden, 13'000 rpm) wurde das Silikon-Pellet zweimal mit 1 ml Waschpuffer (5.25 M GuSCN, 50 mM Tris-HCl pH 6.4) gewaschen, gefolgt von zwei Waschgängen mit 70% Ethanol und einem Waschschritt mit Aceton. Danach wurden die Silikon-pellets während 10 Minuten in einem 56°C warmen Heizblock getrocknet. Die Nukleinsäuren wurden vom Silikon durch Zugabe von 50 μl Elutionspuffer (1.0 mM Tris-HCl, pH 8.5) und Inkubation bei 56°C für 10 Minuten ausgewaschen. Danach wurden 5 μl Eluat vom Pellet genommen zum weiteren Gebrauch in der Amplifikationsreaktion. Das restliche Eluat wurde bei –70°C aufbewahrt.
NASBA Amplifikation
Die Amplifikationen wurden in einem Reaktionsvolumen von 20 μl, das sich aus 10 μl eines Primergemischs, 5 μl (isolierten) Nukleinsäuren und 5 μl eines Enzymgemischs zusammensetzte, durchgeführt. Das Primergemisch wurde durch Rekonstitution einer lyophilisierten Accusphäre in 50 μl Accusphären-Verdünnungsmittel, 51.6 μl Wasser, 8.4 μl 2 M KCl und 5 μl jedes Primers (10 μM) hergestellt. Das Gemisch wurde vor Gebrauch gründlich gevortext. Von diesem Primergemisch wurden 10 μl zu 5 μl der (isolierten) HIV-1 RNA (Standard) gegeben. Dieses Gemisch wurde für 5 Minuten bei 65°C inkubiert und anschliessend bei 41°C für weitere 5 Minuten inkubiert. Nach diesen Inkubationen wurde 5 μl Enzym hinzugegeben und das Gemisch wurde für 5 Minuten bei 41°C inkubiert. Die Röhrchen wurden zum Detektionsbereich transferiert und für 90 Minuten bei 41°C inkubiert. Nach der Amplifikationsreaktion wurden die Röhrchen bis zu weiterem Gebrauch bei –20°C aufbewahrt.
Jede Amplifikationsreaktion enthält die folgenden Reagenzien:
40 mM Tris-HCl, pH 8.5
12 mM MgCl2
70 mM KCl
15% v/v Dimethylsulfoxid
5 mM Dithiotreitol
1 mM jedes Deoxynukleosidtriphosphates
2 mM der Nukleoside rATP, rCTP, rUTP
1.5 mM rGTP
0.5 mM ITP
0.105 μg/μl BSA
0.08 Einheiten RNaseH
32 Einheiten T7 RNA Polymerase
6.4 Einheiten Rreverse Ttranskriptase des Avian Myeloblastosis Virus (Seikagaku, USA)
0.2 μM jedes Primer
375 mM Sorbitol
45.6 mM Sukrose
28.5 mM Mannitol
0.13 mM Dextran T40
Nachweis der amplifizierten Produkte
A. Gelelektrophorese
Das Vorliegen von amplifizierten Produkten wurde mittels eines Agarose Gels (100 ml 2% Pronarose und 0.5 μg/ml Ethidiumbromid) analysiert, unter Verwendung von 1 × TAE (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA pH 8.0) als Laufpuffer. Elektrophorese wurde bei 100 Volt während ungefähr 30 Minuten durchgeführt. Die Ethidiumbromidgefärbten Banden der amplifizierten Produkte wurden mittels UV-Bestrahlung veranschaulicht. Der Blot wurde mit einer Biotin-Sonde (3 μM) im Hybridisierungsmix (750 mM NaCl, 75 mM Natrium citrat, 20 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (pH 6.7), 10 × Denhardts) hybridisiert indem der Blot für 4 Stunden bei 50°C inkubiert wurde. Nach der Hybridisierung wurde der Blot zweimal für 5 Minuten bei 50°C mit 450 mM NaCl, 45 mM Natriumcitrat pH 6.4 (2 × SSPE) und 1 Natriumdodecylsulfat (SDS) und einmal für 10 Minuten mit 20 mM Na₂HPO₄ pH 7.4, 360 mM NaCl, 2 mM EDTA und 0.1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen. Danach wurde der Blot für 30 Minuten mit 2 μl einer Streptavidin/Meerrettich-Peroxidase-Lösung (500 U/ml des enhanced Chemiluminescence Nachweiskits von Amersham Life Science) in 10 ml 50 mM Na₂HPO₄, 900 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 7.4 und 0.5 SDS inkubiert. Nach anschliessenden Waschgängen mit je zweimal für 5 Minuten in 2 × SSPE, 0.1% SDS respektive einmal für 10 Minuten in 2 × SSPE bei Raumtemperatur, wurde der Blot zwischen Filterpapier getrocknet, entwickelt und auf einen Film gemäss des Amershamkit-Protokolls belichtet.
B. Elektrochemielumineszenz (ECL)-Sondenhybridisierung
Die Amplifikationsprodukte wurden zweimal in Detektionsverdünnungsmittel (1.0 mM Tris/HCl, pH 8.5 und 0.2 g/l 2-Methylisothiazolon HCl) verdünnt. Danach wurden 5 μl des verdünnten Amplifikationsproduktes für 30 Minuten bei 41°C mit 0.084 μM der HIV-1 spezifischen Biotin-Sonde, gebunden an 5 μg Streptavidin-beschichtete, magnetische Beads (Durchschnittsgrösse 2.8 μm ± 0.2 μm, Dynal, Great Neck, NY, USA) und 2 × 10¹¹ Molekülen einer ECL (Tris[2,2-bipyridin]ruthenium[II]Komplex)markierten Sonde in einem Gesamtvolumen von 25 μl 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat, pH 6.4 (5 × SSC) inkubiert. Als negative Kontrollen wurde ebenfalls Nachweis-Verdünnungsmittel mit den Bead-Sonden und ECL-Sonden Gemischen inkubiert. Während der Inkubation wurden die Röhrchen alle 10 Minuten geschüttelt, um die Beads in Suspension zu halten. Danach wurde 300 μl der Assaypufferlösung (100 mM Tripropylamin, pH 7.5) hinzugegeben und die Röhrchen wurden in ein ECL-Detektions-Instrument (NASBA QR- System von Organon Teknika BV) gestellt, um die emittierten ECL-Signale zu messen.
Beispiel 2: Amplifikation und Nachweis von genomischer RNA von HIV-1
Die folgenden Primerpaare wurden an 10⁴ Kopien (wie mittels Spektrophotometrie bei 260 nm bestimmt) des HIV-1 RNA Standards getestet. Die RNA wurde direkt zu der Amplifikation hinzugegeben. Die Analyse der Amplifikationsprodukte wurde mittels Gelelektrophorese wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Resultate sind In 1 wiedergegeben.
Alle Primerpaare und Sonden der vorliegenden Erfindung konnten HIV-1 RNA vom Subtyp B in ähnlichem Ausmass nachweisen. Die analytische Sensitivität ist für zwei Primerpaare (SEQ ID 9/SEQ ID 5 und SEQ ID 11/SEQ ID 5) unter Verwendung einer Verdünnungsserie des HIV-1 RNA Standards, der eine anfängliche Konzentration von 5.5 × 10⁹ Kopien/ml hat, aufgezeigt. Der Nachweis wurde mit Sonden, die die in SEQ ID 7 und SEQ ID 6 illustrierten Sequenzen besitzen, durchgeführt. Die Amplifikation und der Nachweis wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Tabelle 1 führt die mit beiden Primerpaaren erhaltenen Resultate auf.
Tabelle 1
Beide Primerpaare haben ungefähr die gleiche Sensitivität gegenüber des HIV-1 RNA Standards, beziehungsweise eine Nachweisrate von 70% für das Primerpaar SEQ ID 9/SEQ ID 5 und eine Nachweisrate von 63% für das Primerpaar SEQ ID 3/SEQ ID 5.
Beispiel 3: Amplifikation und Nachweis von HIV-1 RNA in Gegenwart einer internen Kontrolle
IN diesem Beispiel wurde das Primerpaar SEQ ID 9/SEQ ID 5 und die Sonde mit der Sequenz von SED ID 7 in einer Verdünnungsserie des HIV-1 RNA Standards in Gegenwart einer internen Kontrolle (ic-) RNA getestet. Die ic-RNA ist ein in vitro Transkript, welches einen Teil der LTR-Sequenz von HIV-1 HXB-2 enthält, und 10⁴ Kopien (wie mittels Spektrophotometrie bei 260 nm bestimmt) wurden vor der Nukleinsäureisolierung hinzugegeben. Die Isolierung, Amplifikation und ECL-Nachweis wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Als Vergleich wurde eine separate Amplifikation und Nachweis mit einem Primerpaar durchgeführt, das in der HIV-1 gag-Region lokalisiert (P1/P2) ist, wie zuvor von Van Gemen et al, 1993, Journal of Virological Methods, 43, 177–188 beschrieben. Die Sonden, die zum Nachweis der Amplifikationsprodukte, die durch das auf gag-basierende Primerpaar erzeugt wurden, waren:
Biotin Sonde: 5'-TGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGA
ECL Sonde: 5'-GAATGGGATAGAGTGCATCCAGTG
Die Resultate sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Sowohl das LTR-Primerpaar dieses Beispiels wie auch das gag-Primerpaar konnten einen vergleichbare Menge an HIV-1 RNA in einem Assay, der durch eine in vitro erzeugte RNA, die vor der Nukleinsäureisolierung hinzugegeben wurde, kontrolliert wurde, nachweisen.
Beispiel 4: Nachweis von HIV.1 RNA in HIV-1 positiven Proben
In diesem Beispiel wurden 40 HIV-1 positive Proben von verschiedenen geographischen Orten auf das Vorliegen von HIV-1 RNA analysiert. Alle Proben wurden mittels der Nukleinsäureisolierungsmethode beschrieben in Beispiel 1 isoliert. Amplifikation und Nachweis wurden wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung des Primerpaars SEQ ID 9/SED ID 5 und der Sonde mit der Sequenz SEQ ID 7 oder der Sonde mit der Sequenz SEQ ID 8 durchgeführt.
Als Vergleich wurden separate Amplifikation und Nachweis unter Verwendung des gag-Primerpaars und Proben wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Das Vorliegen von amplifizierten Produkten wurde mittels ECL-Sondenhybridisierung gemäss der Methode von Beispiel 1 nachgewiesen. Die Resultate sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3
Beide Primersondenkombinationen, die von der LTR Region von HIV-1 wie in diesem Beispiel beschrieben hergeleitet wurden, konnten HIV-1 in allen getesteten Proben nachweisen. Im Gegensatz dazu misslang es der Primersondenkombination des gag-Assays genomische RNA von HIV-1 in einer beträchtlichen Anzahl von Proben nachzuweisen.
Beispiel 5: Amplifikation und Nachweis von HIV-1 RNA mit definierten Subtypen
In diesem Beispiel wurden 33 Proben enthaltend HIV-1 RNA von bekannten envelope-basierenden Subtypen getestet. Die Proben stammten von in Zellkultur fortgepflanzten Subtyp-Viren. Proben der Zellkultur-Überstände von beiden Varianten der Gruppe M Subtypen A bis H und Varianten der Gruppe O wurden zu HIV-1 negativem menschlichem Plasma gegeben und gemäss der Methode von Beispiel 1 behandelt. Amplifikation und Nachweis wurden im wesent lichen wie in Beispiel 4 durchgeführt.
Die Resultate sind in Tabelle 4 als die Anzahl von Proben jedes Typs, in welchem HIV-1 RNA nachgewiesen wurde, bezogen auf die Gesamtzahl jedes getesteten Typs, wiedergegeben.
Tabelle 4
HIV-1 RNA wurde in allen 33 HIV-1 Proben nachgewiesen, unter Verwendung des LTR Primerpaars SEQ ID 9/SEQ ID 5 und der Sonde mit der Sequenz SEQ ID 7. Im Gegensatz dazu misslang es im Assay, der die wie in Beispiel 3 beschriebene gag-Primersondenkombination verwendete, sowie Subtyp A wie auch Subtyp E von je einem der Proben und allen Proben, die HIV-1 RNA von Mitgliedern der Gruppe O enthielten, nachzuweisen.
Beispiel 6: Amplifikation und Nachweis von klinischen Proben von HIV-1
In diesem Beispiel wurden 7 Proben, die von seropositiven, von Afrika, Südamerika und Asien stammenden Patienten erhalten wurden, auf das Vorliegen von genomischer RNA von HIV-1 geprüft. Trotz der Tatsache, dass die Blutproben dieser Patienten sowie anti-p24 Antikörper (Abbott Laboratories, Abbott Park IL) wie auch Western Blot (Genelabs) positiv sind, wurden alle Proben im NASBA HIV-1 RNA QL Assay (Organon Teknika BV), der das gag-Primerpaar und die Sondenkombination von Beispiel 3 verwendet, als negativ bewertet und nur eine einzige Probe (R9612222) wurde mittels des Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 (Chiron) Assay unter Ver wendung eines Probenvolumens von 50 μl nachgewiesen und quantifiziert (29'500 RNA Kopien/ml). Im Gegensatz dazu wies das Primerpaar SEQ ID 9/SEQ ID 5 und die Sonde mit der Sequenz SEQ ID 7, unter Verwendung eines gleichen Probevolumens, vier von sieben Proben nach (Tabelle 5).
Tabelle 5
Die der LTR-Primerpaar-Kombination entgangenen Proben wurden aufgrund einer tiefen, unter der Ermittlungsgrenze liegenden viralen Beladung nicht nachgewiesen, da der Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 (Chiron) Assay beim Gebrauch einer Probe von einem ml HIV-1 RNA-Niveaus von 30 oder unter 30 HIV-1 RNA Kopien pro 50 μl dieser Proben quantifizierte.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Oligonukleotidpaar zur Verwendung als ein Primer-Satz bei der Amplifikation einer Zielsequenz, die innerhalb des LTR-Bereichs des Genoms von HIV-1 lokalisiert ist, wobei das Paar aus einem ersten Oligonukleotid, das 10–50 Nukleotide in der Länge aufweist und wenigstens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
und einem zweiten Oligonukleotid, das 10–50 Nukleotide in der Länge aufweist und wenigstens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
mit der Ausnahme der Oligonukleotidpaare:
besteht.
Oligonukleotidpaar zur Verwendung als ein Primer-Satz bei der Amplifikation einer Zielsequenz, die innerhalb des LTR-Bereichs des Genoms von HIV-1 lokalisiert ist, wobei das Paar aus einem ersten Oligonukleotid, das in die Zielsequenz oder seiner komplementären Sequenz hybridisiert und 10–26 Nukleotide in der Länge aufweist und wenigstens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
und einem zweiten Oligonukleotid, das in die Zielsequenz oder seiner komplementären Sequenz hybridisiert und 10–26 Nukleotide in der Länge aufweist und wenigstens ein Fragment von 10 Nukleotiden einer Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Oligonukleotidpaar gemäss Anspruch 1 oder Anspruch 2, bestehend aus einem ersten Oligonukleotid, das wenigstens ein Fragment von 10 Nukleotiden der Sequenz SEQ ID 1: G GGC GCC ACT GCT AGA GA umfasst, und einem zweiten Oligonukleotid, das wenigstens ein Fragment von 10 Nukleotiden der Sequenz SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA umfasst.
Oligonukleotidpaar gemäss Anspruch 1, 2 oder 3, worin das erste Oligonukleotid zusätzlich mit einer Promotorsequenz zur Verfügung gestellt wird, welche von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase erkannt wird.
Oligonukleotidpaar gemäss Anspruch 4, bestehend aus einem ersten Oligonukleotid, welches im wesentlichen aus der Sequenz SEQ ID 9: aat tct aat acg act cac tat agg gAG AGG GGC GCC ACT GCT AGA GA besteht, und einem zweiten Oligonukleotid, welches im wesentlichen aus der Sequenz SEQ ID 5: CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA besteht.
Verfahren für den Nachweis von HIV-1-Nukleinsäure in einer Probe, worin die Probe einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion unterzogen wird, in welcher ein Oligonukleotidpaar gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 und geeignete Amplifikationsreagenzien verwendet werden, und das Vorliegen jeglicher amplifizierten Nukleinsäure nachgewiesen wird.
Verfahren gemäss Anspruch 6, worin der Nachweis jeglicher amplifizierten Nukleinsäure durch ein Umsetzen der Probe unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit einem oder mehreren Oligonukleotiden, die (eine) Sequenz(en) besitzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
von denen eine oder mehrere mit einer nachweisbaren Markierung versehen ist, und durch ein Nachweisen des Vorliegens der Markierung in jeglichen Hybriden, die zwischen der amplifizierten Sequenz und der Sonde gebildet wurden, durchgeführt wird.
Verfahren gemäss Anspruch 6, worin die verwendete Amplifikationstechnik eine auf einer Transkription basierende Amplifikationstechnik ist.
Testkit für den Nachweis von HIV-1 in einer Probe, umfassend: – ein Oligonukleotidpaar gemäss Anspruch 1 oder 2; – eines oder mehrere Oligonukleotide, welche eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die zu wenigstens einem Teil der amplifizierten Nukleinsäuresequenz im wesentlichen komplementär sind, welche mit einer nachweisbaren Markierung ausgestattet sind; – geeignete Amplifikationsreagenzien.
Testkit für den Nachweis von HIV-1 in einer Probe, umfassend ein Oligonukleotidpaar gemäss Anspruch 5 zusammen mit geeigneten Amplifikationsreagenzien und Mitteln zum Nachweisen der amplifizierten Nukleinsäure.
Verwendung eines Oligonukleotidpaares gemäss Anspruch 1 oder 2 als ein Primer-Satz bei der Amplifikation einer Zielsequenz, die innerhalb des LTR-Bereichs des Genoms von HIV-1 lokalisiert ist.