DE69432838T2 - Gensonden und Verfahren zum Nachweis vom menschlichen Immunschwäche-Virus Typ 1 - Google Patents

Gensonden und Verfahren zum Nachweis vom menschlichen Immunschwäche-Virus Typ 1 Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft das Design und die Konstruktion von Amplifikations-Oligonukleotiden und Sonden für das Humane Immundefekt-Virus Typ 1 (HIV), welche die Detektion des Organismus in einer Testprobe ermöglichen.
  • Die Labordiagnose des Humanen Immundefekt-Virus Typ 1 beim Menschen wird derzeit anhand des Nachweises des Vorhandenseins von viralem Antigen (p24) oder Anti-HIV-1-Antikörpern in Serum vorgenommen. Der direkte Nachweis viraler DNA stellt jedoch bei einigen Populationen, zum Beispiel von seropositiven Müttern geborenen Säuglingen, ein nützlicheres diagnostisches Hilfsmittel dar. Der Nachweis der viralen DNA ist schneller und weniger gefährlich als die Kultur. Die direkte Hybridisation erbringt bei den meisten Patienten keine angemessene Empfindlichkeit (Shaw et al. Science 226: 1165–1171, 1984). In vielen Literaturstellen werden Oligonukleotide erwähnt, die als für den Nachweis des Humanen Immundefekt-Virus nützlich erklärt werden. In den meisten dieser Literaturstellen wird außerdem die Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erwähnt. Zu diesen Literaturstellen zählen die folgenden: Kwok et al., J. Virol. 61: 1690–1694, 1987; Agius et al., J. Virol. Meth., 30: 141–150, 1990; Albert und Fenyo, J. Clin. Microbiol. 28: 1560-1564, 1990; Bell und Ratner, AIDS Res. and Human Retroviruses 5: 87–95, 1989; Bruisten et al., Vox Sang 61: 24–29, 1991; Clarke et al., AIDS 4: 1133–1136, 1990; Coutlee et al., Anal. Biochem. 181: 96–105, 1989; Dahlen et al., J. Clin. Microbiol. 29: 798–804, 1991; Dudding et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 167: 244–250, 1990; Ferrer-Le-Coeur et al., Thrombosis and Haemostasis 65: 478–482, 1991; Goswami et al., AIDS 5: 797–803, 1991; Grankvist et al., AIDS 5: 575–578, 1991; Guatelli et al., J. Virol. 64: 4093–4098, 1990; Hart et al., Lancet 2 (8611): 596–599, 1988; Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7276–7280, 1991; Keller et al., Anal. Biochem. 177: 27–32, 1989; Kumar et al., AIDS Res. and Human Retroviruses 5: 345–354, 1989; Linz et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 28: 5–13, 1990; Mano and Chermann, Res. Virol. 142: 95–104, 1991; Mariotti et al., AIDS 4: 633–637, 1990; Mariotti et al., Transfusion 30: 704–706, 1990; Meyerhans et al., Cell 58: 901–910, 1989; Mousset et al., AIDS 4: 1225–1230, 1990; Ou et al., Science 239: 295–297, 1988; Pang et al., Nature 343: 85–89, 1990; Paterlini et al., J. Med. Virol. 30: 53–57, 1990; Perrin et al., Blood 76: 641–645, 1990; Preston et al., J. Virol. Meth. 33: 383-390, 1991; Pritchard and Stefano, Ann. Biol. Clin. 48: 492–497, 1990; Rudin et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 10: 146–156, 1991; Shoebridge et al., AIDS 5: 221-224, 1991; Stevenson et al., J. Virol. 64: 3792–3803, 1990; Truckenmiller et al., Res. Immunol. 140: 527–544, 1989; Van de Perre, et al., New Eng. J. Med. 325: 593–598, 1991; Varas et al., BioTechniques 11: 384–391, 1991; Velpandi et al., J. Virol. 65: 4847–4852, 1991; Williams et al., AIDS 4: 393–398, 1990; Zachar et al., J. Virol. Meth. 33: 391–395, 1991; Zack et al. Cell 61: 213–222, 1990; Findlay et al., mit dem Titel "Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid", PCT/US90/00452; Gingeras et al., mit dem Titel "Nucleic acid probe assay methods and compositions", PCT/US87/01966; Brakel und Spadoro, mit dem Titel "Amplification capture assay", EPA-Anmeldungsnummer 90124738.7, Veröffentlichungsnummer 0 435 150 A2; Moncany und Montagnier, mit dem Titel "Sequences nucleotidiques issues du genome des retrovirus du typ hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications notamment pour I'amplification des génomes de ces rétrovirus et pour le diagnostic in-vitro des infections dues à ces virus", EPA-Anmeldungsnummer 90401520.3, Veröffentlichungsnummer 0 403 333 A2; Urdea, mit dem Titel "DNA-dependent RNA polymerase transcripts as reporter molecules for signal amplification in nucleic acid hybridization assays", PCT/US91/00213; Musso et al., mit dem Titel "Lanthanide chelate-tagged nucleic acid probes", PCT/US88/03735; Chang, mit dem Titel "Cloning and expression of HTLV-III DNA", EPA-Anmeldungsnummer 85307260.1, Veröffentlichungsnummer 0 185 444 A2; und Levenson, mit dem Titel "Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids", EPA-Anmeldungsnummer 89311862.0, Veröffentlichungsnummer 0 370 694; und Sninsky et al., US-Patentschrift Nr. 5.008.182.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Mit dieser Erfindung werden neuartige Amplifikations-Oligonukleotide und Detektions-Sonden für den Nachweis des Humanen Immundefekt-Virus Typ 1 beschrieben. Die Sonden sind zur Unterscheidung zwischen dem Humanen Immundefekt-Virus Typ 1 und seinen bekannten engsten phylogenetischen Nachbarn in der Lage. Die Amplifikations-Oliognukleotide und Sonden können in einem Assay für den Nachweis und/oder die Quantifizierung von Nukleinsäure des Humanen Immundefekt-Virus eingesetzt werden.
  • Es ist bekannt, dass eine zum Hybridisieren an eine nachzuweisende Nukleinsäure-Sequenz ("Zielsequenz") fähige Nukleinsäure-Sequenz als eine Sonde für die Zielsequenz dienen kann. Die Sonde kann mit einer nachweisbaren Komponente, z.B. einem Radioisotop, Antigen oder einer chemilumineszenten Komponente, zur Erleichterung des Nachweises der Zielsequenz markiert werden. Eine Hintergrund-Beschreibung der Anwendung der Nukleinsäure-Hybridisation als ein Verfahren zum Nachweisen bestimmter Nukleinsäure-Sequenzen ist wiedergegeben bei Kohne, US-Patentschrift Nr. 4.851.330, und Hogan et al., Patentanmeldung Nr. PCT/US87/ 03009, mit dem Titel "Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organisms."
  • Es ist außerdem bekannt, dass die Hybridisation zwischen komplementären Nukleinsäure-Strängen, umfassend DNA/DNA, DNA/RNA und RNA/RNA, stattfinden kann. Zwei Einzelstränge von Desoxyribo-("DNA) oder Ribo-("RNA")-Nukleinsäure, die aus Nukleotiden gebildet sind (einschließlich der Basen Adenin (A), Cytosin (C), Thymidin (T), Guanin (G), Uracil (U) oder Inosin (I)) können zu einer doppelsträngigen Struktur hybridisieren, in der die beiden Stränge durch Wasserstoffbindungen zwischen Paaren komplementärer Basen zusammengehalten werden. Generell ist A durch Wasserstoffbrücken an T oder U gebunden, G dagegen durch Wasserstoffbrücken an C gebunden. Daher sind an jedem Punkt entlang der hybridisierten Stränge die klassischen Basenpaare AT oder AU, TA oder UA, GC oder CG zu finden. Enthält daher ein erster Einzelstrang von Nukleinsäure ausreichend angrenzende komplementäre Basen zu einem zweiten und werden diese beiden Stränge unter Bedingungen zusammengebracht, die ihre Hybridisation fördern, so resultiert daraus eine doppelsträngige Nukleinsäure. Unter den geeigneten Bedingungen entstehen DNA/DNA-, RNA/DNA- oder RNA/RNA-Hybride. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von Sonden oder Primern, die in der Zuckerkomponente voneinander abweichende oder anderweitig chemisch modifizierte Nukleotide enthalten, die zur Wasserstoffbindung gemäß der oben beschriebenen Art fähig sind.
  • So werden bei einem ersten Aspekt der Erfindung Hybridisationsassay-Sonden bereitgestellt, die zur Unterscheidung zwischen Humanem Immundefekt-Virus Typ 1 und anderen in menschlichem Blut oder Geweben anzutreffenden Viren in der Lage sind, ebenso wie Amplifikations-Oligonukleotide, die zur selektiven Amplifikation von Humaner Immundefekt-Virus-Nukleinsäure fähig sind. Spezifisch gesagt sind die Sonden Nukleotid-Polymere, bestehend in der Sequenz (gelesen von 5' nach 3') (SEQ ID NR. 14) ATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGA oder deren RNA-Äquivalent (SEQ ID NR: 80) oder dem dazu komplementären Oligonukleotid (SEQ ID NR. 66) auf dem RNA-Äquivalent zum dazu komplementären Oligonukleotid (SEQ ID NR. 94).
  • Die Oligonukleotide werden mit oder ohne eine Helfer-Sonde verwendet, wie unten beschrieben. Die Verwendung der Helfer-Sonden und komplementären Oligonukleotide zu den Helfer-Sonden und deren RNA-Äquivalenten fördert die Nukleinsäure-Hybridisation.
  • Bei einem verwandten Aspekt wird mit der Erfindung die Bildung von Nukleinsäure-Hybriden bereitgestellt, wie durch die Hybridisation der Sonden dieser Erfindung mit Ziel-Nukleinsäure unter stringenten Hybridisationsbedingungen erhalten. Stringente Hybridisationsbedingungen umfassen die Verwendung von 0,05 M Lithiumsuccinat-Puffer, der 0,6 M LiCl enthält, bei 60°C. Die Hybride sind nützlich, da sie den spezifischen Nachweis viraler Nukleinsäure erlauben.
  • Bei einem anderen verwandten Aspekt werden mit der Erfindung Amplifikations-Oligonukleotide bereitgestellt, die für den spezifischen Nachweis des Humanen Immundefekt-Virus Typ 1 in einem Amplifikations-Assay nützlich sind. Die Amplifikations-Oligonukleotide sind zu konservierten Regionen der HIV-genomischen Nukleinsäure komplementär.
  • Spezifisch bestehen solche Amplifikations-Oligonukleotide der Erfindung in einer Nukleinsäure-Basensequenz, nämlich (X) GTTCGGGCGCCACTGCTAGAGAT (SEQ ID NR. 50), ihrem DNA-Komplement und deren RNA-Äquivalenten; wobei (X) nichts oder eine 5'-Oligonukleotid-Sequenz ist, die durch ein Enzym erkannt wird, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die Promotorsequenz für T7, T3 oder SP6-RNA-Polymerase, welche die Initiation oder Elongation der RNA-Transkription durch eine RNA-Polymerase fördert. Ein Beispiel für X umfasst die Sequenz SEQ ID NR. 52: 5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'.
  • Diese Amplifikations-Oligonukleotide werden bei einem Nukleinsäure-Amplifikationsassay wie der Polyemase-Kettenreaktion oder einer Amplifikationsreaktion unter Verwendung von RNA-Polymerase, DNA-Polymerase und RNase H oder ihrem Äquivalent verwendet, wie beschrieben bei Kacian und Fultz, supra, und von Sninsky et al., US-Patentschrift Nr. 5.079.351.
  • Die Amplifikations-Oligonukleotide und Sonden dieser Erfindung bieten ein schnelles, nicht-subjektives Verfahren zur Identifikation und Quantifikation einer Probe auf spezifische, bei Stämmen des Humanen Immundefekt-Virus Typ 1 einmaligen Sequenzen.
  • Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen ersichtlich werden.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Wir haben besonders nützliche DNA-Sonden entdeckt, die zu bestimmten Nukleinsäure-Sequenzen des Humanen Immundefekt-Virus Typ 1 komplementär sind. Ferner haben wir diese Sonden in einem spezifischen Assay zum Nachweis des Humanen Immundefekt-Virus Typ 1 erfolgreich eingesetzt, wobei dieser von den bekannten und vermutlich am engsten verwandten, in menschlichem Blut oder Geweben vorzufindenden taxonomischen oder phylogenetischen Nachbarn unterschieden wird.
  • Wir haben außerdem besonders nützliche Amplifikations-Oligonukleotide identifiziert, die zur Nukleinsäure des Humanen Immundefekt-Virus Typ 1 komplementär sind, und haben diese Oligonukleotide, z.B. als Primer oder Promotor/Primen-Kombinationen (d.h. einem Primer mit einer daran gebundenen Promotorsequenz) zur Amplifikation der Nukleinsäure des Humanen Immundefekt-Virus verwendet, um seine direkte Detektion in einer Probe zu ermöglichen.
  • Nützliche Richtlinien für das Design von Amplifikations-Oligonukleotiden und Sonden mit den gewünschten Eigenschaften sind hierin beschrieben. Die optimalen Stellen für die Amplifikation und Sondierung enthalten zwei, und vorzugsweise drei, konservierte Regionen von mehr als etwa 15 Basen Länge, innerhalb von etwa 350 Basen, und vorzugsweise innerhalb von 150 Basen, von aneinander angrenzender Sequenz. Der mit einem Satz Primern oder Promotor/Primern beobachtete Grad der Amplifikation hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Fähigkeit der Oligonukleotide zum Hybridisieren an ihre komplementären Sequenzen und deren enzymatischer Extendierbarkeit. Da der Umfang und die Spezifität der Hybridisationsreaktionen durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst wird, bestimmt die Manipulation jener Faktoren die exakte Sensibilität und Spezifität eines bestimmten Oligonukleotids, ob nun perfekt komplementär zu seinem Ziel oder nicht. Die Bedeutung und Wirkung verschiedener Assay-Bedingungen sind den Fachleuten des Gebiets bekannt und beschrieben bei Hogan et al., Patentanmeldung Nr. PCT/US87/03009, mit dem Titel "Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organisms"; und Milliman, mit dem Titel "Nucleic Acid Probes to Haemophilus influenzae", US-Anmeldung der laufenden Nr. 07/690,788, eingereicht am 25.04.1991, übertragen an denselben Anmelder der vorliegenden Anmeldung.
  • Die Länge der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz, und demgemäß die Länge der Sondensequenz, kann von Bedeutung sein. In einigen Fällen können verschiedene Sequenzen aus einer bestimmten Region vorliegen, die hinsichtlich Lokalisation und Länge variieren, welche Sonden mit den gewünschten Hybridisations-Eigenschaften ergeben. In anderen Fällen kann eine Sequenz wesentlich besser als eine andere sein, die lediglich um eine einzige Base abweicht. Zwar sind Nukleinsäuren, die nicht perfekt komplementär sind, zur Hybridisation in der Lage, doch wird normalerweise die längste Strecke einer perfekt homologen Basensequenz in erster Linie durch die Hybridstabilität bestimmt. Oligonukleotid-Sonden unterschiedlicher Längen und Basenzusammensetzungen können zwar verwendet werden, doch sind bevorzugte Oligonukleotid-Sonden zwischen etwa 10 und 50 Basen lang und ausreichend homolog zur Ziel-Nukleinsäure, um unter stringenten Hybridisationsbedingungen zu hybridisieren. Wir haben festgestellt, dass optimale Primen Ziel-bindende Regionen von 18 – 38 Basen bei einer vorhergesagten Tm (Schmelztemperatur) an das Ziel von etwa 60°C aufweisen.
  • Die Amplifikations-Oligonukleotide oder Sonden sollten so positioniert werden, dass die Stabilität des Oligomer:Nicht-Ziel-(d.h. Nukleinsäure mit ähnlicher Sequenz zur Ziel-Nukleinsäure)-Nukleinsäure-Hybrids minimiert wird. Es ist bevorzugt, dass die Amplifikations-Oligomere und Nachweis-Sonden zur Unterscheidung zwischen Ziel- und Nicht-Zielsequenzen fähig sind. Beim Design von Sonden sollten die Differenzen bei diesen Tm-Werten so groß wie möglich sein (z.B. mindestens 2°C und vorzugsweise 5°C).
  • Die Regionen der Nukleinsäure, die für die Bildung starker, die Hybridisation hemmender interner Strukturen bekannt sind, sind weniger bevorzugt. Zu Beispielen solcher Strukturen zählen Haarnadel-Schleifen. Entsprechend sollten auch Sonden mit umfangreicher Selbstkomplementarität vermieden werden.
  • Der Grad der nicht-spezifischen Extension (Primer-Dimer oder Nicht-Ziel-Kopierung) kann ebenfalls die Amplifikationsleistung beeinflussen, weshalb Primer mit geringer Selbst- oder Kreuzkomplementarität insbesondere an den 3'-Enden der Sequenz gewählt werden. Lange Homopolymer-Trakte und ein hoher GC-Gehalt werden vermieden, um eine fehlerhafte Primer-Extension zu vermindern. Handelsübliche Computer-Programme zur Hilfestellung bei diesem Aspekt des Designs stehen zur Verfügung. Zu den verfügbaren Computer-Programmen zählen MacDNASISTM 2.0 (Hitachi Software Engineering American Limited) und OLIGO* Version 4.1 (National Bioscience).
  • Die Hybridisation besteht in der Verbindung zweier Einzelstränge von komplementärer Nukleinsäure zum Erhalt eines durch Wasserstoffbrücken verbundenen Doppelstrangs. Dies impliziert, dass dann, wenn einer der beiden Stränge völlig oder teilweise an einem Hybrid beteiligt ist, dieser in geringerem Umfang an der Bildung eines neuen Hybrids teilnehmen kann. Durch ein derartiges Design einer Sonde, dass ein wesentlicher Abschnitt der Sequenz von Interesse einzelsträngig ist, kann die Rate und der Umfang der Hybridisation stark erhöht werden. Ist das Ziel eine integrierte genomische Sequenz, so wird es natürlicherweise in einer doppelsträngigen Form vorkommen, wie dies mit dem Produkt der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) der Fall ist. Diese doppelsträngigen Ziele sind von Natur aus gegenüber einer Sonden-Hybridisation inhibitorisch und erfordern vor dem Hybridisationsschritt eine Denaturierung. Schließlich können intramolekulare und intermolekulare Hybride innerhalb einer Sonde gebildet werden, wenn eine ausreichende Selbstkomplementarität vorliegt. Solche Strukturen können durch ein behutsames Sonden-Design vermieden werden. Handelsübliche Computer-Programme stehen zur Suche nach dieser Art von Wechselwirkung zur Verfügung. Zu den verfügbaren Computer-Programmen zählen MacDNASISTM 2,0 (Hitachi Software Engineering American Ltd.) und OLIGO* Version 4.1 (National Bioscience).
  • Einmal synthetisiert, können ausgewählte Oligonukleotid-Sonden mittels einer der verschiedenen wohlbekannten Methoden markiert werden. Siehe J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning 11 (2. Aufl. 1989). Zu nützlichen Markern zählen Radioisotope ebenso wie nicht-radioaktive Reportergruppen. Wir bevorzugen derzeit die Verwendung von Acridiniumestern.
  • Die Oligonukleotid/Zielhybrid-Schmelztemperatur kann mittels den Fachleuten des Gebiets wohlbekannten Isotopen Methoden bestimmt werden. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass die Tm für einen gegebenen Hybrid in Abhängigkeit von der verwendeten Hybridisationslösung variiert. Sambrook, et al. supra.
  • Die Hybridisationsrate kann durch Bestimmen der C0t1/2 gemessen werden. Die Rate, bei der eine Sonde an ihr Ziel hybridisiert, stellt ein Maß der Wärmebeständigkeit der sekundären Zielstruktur in der Sondenregion dar. Die Standardmessung der Hybridisationsrate besteht in der C0t1/2, die in Mol der Nukleotide pro Liter mal Sekunden gemessen wird. Folglich handelt es sich um die Konzentration der Sonde mal der Zeit, bei der 50% der maximalen Hybridisation bei jener Konzentration eintritt. Dieser Wert wird durch Hybridisieren verschiedener Mengen der Sonde an eine Konstantmenge des Ziels für einen festgelegten Zeitraum bestimmt. Die C0t1/2 wird mittels standardmäßiger Verfahrensweisen graphisch ermittelt.
  • In den folgenden Beispielen werden Protokolle unter Verwendung von Oligonukleotid-Sonden zum Nachweis von HIV-1-Nukleinsäure in einer Probe veranschaulicht.
  • Beispiele:
  • Für Humanes Immundefekt-Virus Typ 1 spezifische Sonden wurden durch Vergleich der aus der veröffentlichten Datenbank GenBank erhaltenen Sequenzen identifiziert. Die Sequenzen ID Nrn. 1 – 12 wurden charakterisiert und als für Humanes Immundefekt-Virus Typ 1 spezifisch nachgewiesen. Phylogenetisch nahe Nachbarn einschließlich Humanes Immundefekt-Virus Typ 2, Humanes T-Zell-Leukämie-Virus-Typ 1 und Humanes T-Zell-Leukämie-Virus-Typ 2 wurden als Vergleiche mit der Sequenz des Humanen Immundefekt-Virus Typ 1 verwendet.
  • Beispiel 1. Sonden für HIV
  • Ein Hybridisations-Schutzassay wurde zum Nachweis der Reaktivität und Spezifität der Sonden für das Humane Immundefekt-Virus Typ 1 verwendet. Die Sonden wurden zunächst mit einem Nicht-Nukleotid-Linker synthetisiert, dann mit einem chemilumineszenten Acridiniumester (AE) markiert, wie beschrieben bei Arnold, et al., PCT/US88/03361, mit dem Titel "Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes". Ein an eine unhybridiserte Sonde gebundener Acridiniumester ist anfällig für eine Hydrolyse und verlor unter mild alkalischen Bedingungen seine Chemilumineszenz. Ein an eine hybridisierte Sonde gebundener Acridiniumester dagegen ist relativ beständig gegenüber Hydrolyse. Daher ist es möglich, auf die Hybridisation der Acridiniumester-markierten Sonde durch Inkubieren mit einem alkalischen Puffer, gefolgt von Nachweisen der Chemilumineszenz in einem Luminometer, hin zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in relativen Lichteinheiten (RLU) angegeben, d.h. der Menge an durch die markierte Sonde emittierten Photonen, wie mittels des Luminometers gemessen.
  • Im folgenden Experiment wurde eine aus Klonen präparierte DNA, die vollständige oder Teilsequenzen der Zielviren enthielten, untersucht. Ein Beispiel eines Verfahrens zur Herstellung der DNA aus Klonen ist wiedergegeben bei Sambrook et al., supra. Die DNA-Quelle für die Klone war wie folgt: Humanes Immundefekt-Virus Typ 1, BH10 (L. Ratner et al., Nature 312: 277–284. 1985); Humanes Immundefekt-Virus Typs 2 NIHZ (J.F. Zagury et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5941–5945. 1988); Humanes T-Zell-Leukämie-Virus Typ 1 pMT-2 (M. Clarke et al. Nature 305: 60–62. 1983); Humanes T-Zell-Leukämie-Virus Typ 2 (K. Shimotohmo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3101–3105, 1985); und Humanes Hepatitis-B-Virus Serotyp ADW, erhalten von ATCC (# 45020). Ziel in 50 μl an 10 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1% Lithiumlaunlsulfat, pH 7,4, wurde bei 95°C für 5 Minuten denaturiert, auf nassem Eis gekühlt, und dem 0,04 pmol Sonde in 50 μl an 0,1 M Lithiumsuccinat-Puffer, pH 4,7, 2% (Gew./Vol.) Lithiumlaunlsulfat, 1,2 M Lithiumchlorid, 10 mM EDTA und 20 mM Ethylenglycol-bis-(beta-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA) zugegeben. Die Hybridisation wurde bei 60°C für 10 Minuten durchgeführt, gefolgt von der Zugabe von 300 μl an 0,6 M Natriumborat, pH 8,5, 1% Triton-X-100, und einer zweiten Inkubation bei 60°C für 6 Minuten zum Hydrolysieren des AE an unhybridisierter Sonde. Die Proben wurde in Eiswasser für 1 Minute gekühlt, für weitere 3 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann in einem LEADER-1-Luminometer, ausgestattet mit automatischer Injektion des Nachweisreagens I (enthaltend 0,1% Wasserstoffperoxid und 1 mM Salpetersäure) und Nachweisreagens II (enthaltend 1 N Natriumhydroxid und eine grenzflächenaktive Komponente), analysiert. Ein Teil der Hybridisationsreaktionen wurde durch Zugabe von 4 pmol unmarkierter "Helfer-Sonde" gefördert, wie beschrieben bei Hogan et al., US-Patentschrift Nr. 5.030.557, mit dem Titel "Means and Methods for Enhancing Nucleic Acid Hybridization".
  • Ein RLU-Wert von größer als 5.000 RLU zeigte ein positives Ergebnis an; weniger als 5.000 RLU bedeuteten ein negatives Ergebnis.
  • Die folgenden Daten (Tabelle 1) zeigen, dass die Sonden mit viraler DNA von im menschlichen Blut oder Geweben vorzufindenden eng verwandten Viren nicht kreuzreagieren. Die Proben ergaben auch ein positives Signal beim Test mit einer für jedes Ziel spezifischen Sonde, was die Probeneignung bestätigte.
  • Tabelle 1. Hybridisations-Assay mit HIV-1-Sonden
    Figure 00110001
  • Beispiel 2. Amplifikation von HIV mittels PCR
  • Null, 20 oder 100 Kopien der Plasmid-DNA, die Humane Immundefekt-Virus-DNA enthielt, wurden mit einer Restriktionsendonuklease linearisiert und Amplifikationsreaktionen zugesetzt, die 50 pmol jedes Primers, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM KCl, 1,25 mM MgCl2, 0,25 mM jeweils von dATP, dTTP, dCTP, dGTP und 2,5 E Taq-DNA-Polymerase in 50 μl enthielten. Die Reaktionen wurden bei 95°C für 1 bis 2 Minuten inkubiert und dann 35-mal bei 55°C für 15 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden und 95°C für 20 Sekunden in einem Perkin-Elmer-9600-Wärmezyklierer, oder bei 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 60 Sekunden und 95°C für 60 Sekunden in einem Perkin-Elmer-48-Well-Wärmezyklierer zykliert. Nach der Zyklierung wurden die Reaktionen bei 72°C für 6 bis 7 Minuten inkubiert und bei 4°C gelagert. Zehn μl des Produkts wurden mittels Hybridisations-Schutzassay mit 0,04 pmol der markierten Sonde analysiert. Die Daten sind in Tabelle 2 gezeigt. Ein RLU-Wert von größer 7.000 wird als ein positives Ergebnis betrachtet.
  • Tabelle 2. Amplifikation des Humanen Immundefekt-Virus Typ 1 mittels PCR
    Figure 00120001
  • Figure 00130001
  • Beispiel 3. Patientenproben
  • In diesem Beispiel wurden Patientenproben, die ein Lysat enthielten, das aus 200.000 Ficoll-Hypaque-gereinigten weißen Blutzellen von Individuen präpariert war, die als mit HIV-Typ 1 infiziert bekannt waren, oder einem Individuum, das nicht mit HIV-Typ 1 infiziert war (negativ), wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert. Diese Zellen wurden präpariert, wie beschrieben bei Ryder und Kacian, mit dem Titel "Preparation of nucleic acid from blood", US-Patent der laufenden Nummer 07/898.785, eingereicht am 12.06.92. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3. PCR-Assay
    Figure 00130002
  • Figure 00140001
  • Beispiel 4. Auf Transkription basierende Nicht-PCR-Amplifikation
  • 0, 2.000 oder 20.000 Kopien der Plasmid-DNA, die HIV-Typ 1 enthielt, wurden unter Verwendung einer Restriktionsendonuklease linearisiert und auf 95°C für 2 Minuten erhitzt und auf 37°C für eine Minute abgekühlt. Nach Zugabe von 800 E MMLV-Reverse Transkriptase wurden die Reaktionen für 12 Minuten bei 37°C inkubiert, auf 95°C für zwei Minuten erhitzt und auf 37°C für eine Minute abgekühlt. 800 E MMLV-Reverse Transkriptase und 400 E T7-RNA-Polymerase wurden zugegeben und die Reaktionen für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die abschließenden Amplifikations-Bedingungen waren 70 mM Tris-HCl, pH 8, 35 mM KCl, 15 mM KOH, neutralisiert mit N-Acetylcystein, 6 mM rGTP, 4 mM rCTP, 4 mM rATP, 4 mM rUTP, 1 mM jeweils von dTTP, dATP, dCTP und dGTP, und 22 mM MgCl2 in 100 μl. Zehn μl jeder Reaktion wurden mit 40 μl Wasser gemischt und wie in Tabelle 1 beschrieben untersucht, mit der Ausnahme, dass der Hybridisationspuffer 20 mM Aldrithiol enthielt. Die Ergebnisse in RLU sind in Tabelle 4 gezeigt.
  • Tabelle 4. Auf Transkription basierender Amplifikations-Assay
    Figure 00150001
  • Mit steigender Kopienzahl nahmen auch die RLU zu. Folglich wurde festgestellt, dass die Primer die HIV-Typ 1-Zielsequenzen unter Verwendung eines auf Transkription basierenden Amplifikations-Assays amplifizierten.
  • Beispiel 5
  • In diesem Beispiel wird die Fähigkeit der Sonden für humanes Immundefekt-Virus Typ 1 gezeigt, geringe Mengen des in einem auf Transkription basierenden Amplifikations-Assays erzeugten Ziel-Oligomers zu detektieren. Null oder 10 Kopien der Plasmid-DNA, die die HIV-Typ I-Sequenz enthielt, wurden unter Verwendung einer Restriktionsendonuklease linearisiert, in Gegenwart von 1 μg humaner DNA auf 95°C für acht Minuten erhitzt und dann auf 42°C für sechs Minuten abgekühlt. Die Amplifikation wurde bei 42°C für 2 Stunden unter Verwendung von 800 E MMLV-Reverse Transkriptase und 400 E T7-RNA-Polymerase im folgenden Reaktionsgemisch durchgeführt: 50 mM Tris-HCl, pH 8, 17,5 mM MgCl2, 0,05 mM Zinkacetat, 10% Glycerol, 6,25 mM rGTP, 2,5 mM rCTP, 6,25 mM rATP, 2,5 mM rUTP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dCTP und 0,2 mM dGTP. Primen SEQ ID NRn. 26, 28 und 41 wurden bei einer Konzentration von 30 pmol verwendet, Primen SEQ ID NR. 39 wurde bei einer Konzentration von 15 pmol verwendet. Die gesamte Reaktion wurde unter Anwendung des Hybridisations-Schutzassay mit 0,04 pmol Sonde in 100 μl des Hybridisationspuffers (ergänzt mit 20 mM Aldrithiol) analysiert, wie beschrieben in Beispiel 1. Sonde SEQ ID NR. 10 wurde in Gegenwart von 2 pmol unmarkierter Helfer-Sonde SEQ ID NR. 17 hybridisiert.
  • Tabelle 5. Auf Transkription basierender Amplifikations-Assay geringer Mengen
    Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001
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  • Figure 00520001

Claims (14)

  1. Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleinsäure-Basensequenz, die gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ. ID. NR. 14: 5'-ATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGA-3', ihrer komplementären DNA und deren RNA-Äquivalenten.
  2. Oligonukleotid, bestehend aus einer Nukleinsäure-Basensequenz, die gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ. ID. NR. 50: 5'-GTTCGGGCGCCACTGCTAGAGAT-3', ihrer komplementären DNA und deren RNA-Äquivalenten.
  3. Oligonukleotid nach Anspruch 1, markiert mit einer nachweisbaren Komponente.
  4. Oligonukleotid nach Anspruch 2, das außerdem eine zusätzliche und an das 5'-Ende des Oligonukleotids geknüpfte Nukleotidsequenz umfasst, wobei die zusätzliche Nukleotidsequenz durch ein Enzym erkannt wird.
  5. Oligonukleotid nach Anspruch 4, wobei die zusätzliche Nukleotidsequenz eine Promotorsequenz umfasst, welche die Initiation der Transkription oder die Elongation durch eine RNA-Polymerase fördert.
  6. Oligonukleotid nach Anspruch 4, wobei die zusätzliche Nukleotidsequenz eine Promotorsequenz für T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase umfasst.
  7. Oligonukleotid nach Anspruch 4, wobei die zusätzliche Nukleotidsequenz SEQ. ID. NR. 52 oder deren komplementäre Sequenz umfasst.
  8. Anwendung eines Oligonukleotids nach einem der vorangehenden Ansprüche bei einem Assay-Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von HIV-1-Nukleinsäure in einer Probe.
  9. Anwendung einer Zusammensetzung, welche ein markiertes Oligonukleotid nach Anspruch 3 und ein Helfer-Oligonukleotid umfasst, bei einem Assay-Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von HIV-1 in einer Probe.
  10. Sonden-Gemisch, welches ein Oligonukleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 3 und ein Helfer-Oligonukleotid umfasst, zur Anwendung bei einem Assay-Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von HIV-1 in einer Probe.
  11. Anwendung eines Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 2 und 4 bis 7 als einem Amplifikations-Primer bei einem Amplifikations-Assay zum Nachweis von HIV-1-Nukleinsäure in einer Probe.
  12. Anwendung eines Zusammensetzung, welche einen ersten Amplifikations-Primer, bestehend in einem Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 2 und 4 bis 7, und einen zweiten Amplifikations-Primer umfasst, bei einem Amplifikations-Assay zum Nachweis von HIV-1-Nukleinsäure in einer Probe.
  13. Paar von Amplifikations-Primern, welches in einem Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 2 und 4 bis 7 und einem zweiten Amplifikations-Primer besteht, zur Anwendung nach Anspruch 12.
  14. Verfahren zum Nachweisen von HIV-1-Nukleinsäure in einer Probe, welches den Schritt des Hybridisierens von direkt erhaltener oder aus der Probe mit einem Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 amplifizierter Nukleinsäure umfasst.
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