DE07025195T1 - Nukleotidsequenzen des Genoms von Retroviren des Typs HIV-1, HIV-2 und SIV und deren Anwendungen, insbesondere zur Amplifikation von Genomen dieser Retroviren und für die In-Vitro-Diagnostik von durch diese Viren ausgelösten Infektionen - Google Patents
Nukleotidsequenzen des Genoms von Retroviren des Typs HIV-1, HIV-2 und SIV und deren Anwendungen, insbesondere zur Amplifikation von Genomen dieser Retroviren und für die In-Vitro-Diagnostik von durch diese Viren ausgelösten Infektionen Download PDFInfo
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Abstract
Oligonukleotid,
dadurch gekennzeichnet, dass dessen Sequenz besteht aus:
i) einer spezifischen Sequenz des Gens gag und das geeignet ist, bei einer Temperatur von 60°C ± 1°C mit den Genomen der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac zu hybridisieren, oder
ii) einer Komplementärsequenz einer Sequenz, wie sie unter i) definiert ist.
i) einer spezifischen Sequenz des Gens gag und das geeignet ist, bei einer Temperatur von 60°C ± 1°C mit den Genomen der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac zu hybridisieren, oder
ii) einer Komplementärsequenz einer Sequenz, wie sie unter i) definiert ist.
Claims (11)
- Oligonukleotid, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Sequenz besteht aus: i) einer spezifischen Sequenz des Gens gag und das geeignet ist, bei einer Temperatur von 60°C ± 1°C mit den Genomen der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac zu hybridisieren, oder ii) einer Komplementärsequenz einer Sequenz, wie sie unter i) definiert ist.
- Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Größe von ungefähr 15 bis 30 Nukleotiden hat.
- Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Nukleotidsequenz mindestens 60% Identität mit der Sequenz des Gens gag der Viren HIV-Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod oder SIV Mac aufweist, und die Hybridisierungseigenschaften mit den Genomen der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac behält.
- Oligonukleotid, das eine Konservierung von mindestens 5 Basen an jeder Seite des Primers bezüglich der Sequenz eines Oligonukleotidprimers, wie er in Ansprüchen 1 bis 3 beschrieben ist, umfasst, und das in dessen mittleren Teil Modifikationen bezüglich der Sequenz eines Oligonukleotidprimers gemäß Ansprüchen 1 bis 3 aufweist, und das die Hybridisierungseigenschaften mit den Genomen der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac behält.
- Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, das geeignet ist, mit den Genomen der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac in einem Puffer der Zusammensetzung Tris-HCl, pH = 8,9: 50 mM; (NH4)2SO4: 15 mM; MgCl2: 5 mM; β-Mercaptoethanol: 10 mM; Gelatine: 0,25 mg/ml zu hybridisieren.
- Verfahren der Genamplifikation von Nukleinsäuresequenzen des Gens gag von Virus vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV, durchgeführt ausgehend von einer biologischen Probe, wobei dieses Verfahren hauptsächlich die folgenden Schritte umfasst: a) einen Schritt der Extraktion der nachzuweisenden Nukleinsäure, die zum Genom von Virus vom Typ HIV-1, HIV-2 oder SIV gehört, der möglicherweise in der oben erwähnten biologischen Probe vorhanden ist, und gegebenenfalls einen Schritt der Behandlung dieser Nukleinsäure mit Hilfe einer reversen Transkriptase, wenn diese Nukleinsäure in Form von RNA vorliegt, b) einen Zyklus, der folgende Schritte umfasst: – Denaturierung der nachzuweisenden doppelsträngigen Nukleinsäure, was zur Bildung einer einzelsträngigen Nukleinsäure führt, – Hybridisierung von jedem der Nukleinsäurestränge, die bei dem vorhergehenden Denaturierungsschritt erhalten wurden, mit mindestens einem Primer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 durch Inkontaktbringen der oben erwähnten Stränge mit mindestens einem Paar der oben erwähnten Primer, – Bildung, ausgehend von DNA-Primern, die zu den Strängen komplementär sind, auf die sie hybridisiert sind, in Gegenwart einer DNA-Polymerase und vier unterschiedlichen Nukleosidtriphosphaten (dNTP), was zur Bildung einer größeren Anzahl von nachzuweisenden doppelsträngigen Nukleinsäuren als beim vorhergehenden Schritt der Denaturierung führt, wobei dieser Zyklus eine bestimmte Anzahl von Malen wiederholt wird, um die möglicherweise in der biologischen Probe vorhandene, nachzuweisende Nukleinsäuresequenz in einem Ausmaß zu erhalten, das ausreicht, deren Nachweis zu ermöglichen, c) einen Schritt des Nachweises eines möglichen Vorhandenseins von Nukleinsäure, die zum Genom von Virus vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV gehört, in der biologischen Probe.
- Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Denaturierungsschritt in Gegenwart von mindestens einem Primer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 durchgeführt wird.
- Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es unter folgenden Bedingungen durchgeführt wird: a) Hybridisierung: Die Primer (1 μl einer Lösung zu 40 μmolar an jedem der Primer) werden für den ersten Schritt der Denaturierung-Reassoziierung mit DNA-Matrix (100 bis 300 ng) zusammengegeben; es wird 10 Minuten lang auf 100°C erhitzt, und daraufhin werden die Gefäße, die diese Mischung aus DNA-Matrix und Primern enthalten, in Eis-haltiges Wasser getaucht. Die Primer sollen im Amplifikationsschritt in einer Endkonzentration verwendet werden, die jeweils 0,8 μM beträgt. b) Amplifikation: Dem vorher beschriebenen Medium werden die 4 dNTPs, wobei jedes zu 0,5 μmolar in der schließlich erhaltenen Lösung (50 μl) eingesetzt wird, und eine Einheit Taq-Polymerase für ein Reaktionsmedium von 50 μl zugegeben.
- Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 zur in vitro-Diagnose der Infektion eines Individuums mit einem Virus vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2, oder eines Tieres mit mindestens einem der drei Viren (HIV-1, HIV-2, SIV).
- Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, das umfasst: i) mindestens einen Oligonukleotidprimer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, ii) geeignete Reagenzien zur Durchführung des Zyklus der Arbeitsgänge der Amplifikation, insbesondere DNA-Polymerase, vier unterschiedliche Nukleotidtriphosphate und den Puffer „10 × buffer", der in Anspruch 5 beschrieben ist, iii) eine (oder mehrere) Sonde(n), die markiert sein kann (können) und die in der Lage ist (sind), mit der (den) amplifizierten nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz(en) zu hybridisieren.
- Verwendung von mindestens einem Primer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Genamplifikation von Nukleinsäuresequenzen des Gens gag von Virus vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV.
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