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Hintergrund der Erfindung
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Bereich der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation von
RNA, insbesondere ein Verfahren zur Synthese von RNA mittels einer
Reserve-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (im Folgenden mit RT-PCR
abgekürzt).
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Bei
den in der vorliegenden Beschreibung verwendeten Ausdrücken für Substanzen
umfasst die Singularform sowohl Singular als auch Plural.
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Beschreibung des Stands
der Technik
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In
einem RT-PCR-Verfahren wird eine RNA unter Verwendung einer reversen
Transkriptase in eine komplementäre
DNA (cDNA) überführt und
anschließend
die cDNA durch ein PCR-Verfahren amplifiziert. Da ein RT-PCR-Verfahren
eine quantitative Analyse sogar mit Spuren von RNA ermöglicht,
wird es derzeit als analytisches Verfahren mit der höchsten Sensitivität betrachtet,
welche wesentlich ist zur Detektion eines Virus mit RNA-Gen(en),
zur quantitativen Detektion einer mRNA, zur Analyse eines exprimierten
Gens durch Basensequenzierung und zur Analyse und Herstellung eines
Expressionsprodukts durch cDNA-Klonierung.
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Bei
einem PCR-Verfahren, welches in einem RT-PCR-Verfahren anschließend an
eine RT-Reaktion durchgeführt
wird, handelt es sich um ein Verfahren, mit dem ein bestimmtes,
gewünschtes
DNA-Fragment durch einige hunderttausend Wiederholungen einer DNA-Synthese-Reaktion zwischen
Primern, die einen bestimmten Bereich einer DNA-Kette begrenzen, amplifiziert werden
kann. Ein PCR-Verfahren ist in der Japanischen Patentoffenlegung
Nr. S61-274697, bei der es sich um eine Erfindung von Mullis et
al. handelt, offenbart.
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Ein
weiteres, seit kurzem verwendetes Verfahren zur Amplifikation einer
RNA ist das NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification)-Verfahren. Dieses
Verfahren ermöglicht
die Durchführung
einer Amplifikations-Reaktion direkt von einer RNA und ist somit
in einem Test geeignet, der RNA als Template verwendet.
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Da
das NASBA-Verfahren keinen Denaturierungsschritt wie die PCR beinhaltet,
erfordert es keine thermischen Zyklen und kann somit eine Amplifikation
bei einer konstanten Temperatur bewirken.
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Da
jedoch jedes der RNA-Amplifikations-Verfahren, einschließlich der
oben beschriebenen, auf einer enzymatischen Reaktion basiert, ist
bekannt, dass die Reaktion in hohem Maße durch Pigmente, Proteine, Saccharide
oder unbekannte Verunreinigungen, die in einer biologischen Probe
enthalten sind, inhibiert werden kann.
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Demgemäß ist ein
Verfahren vor der oben beschriebenen RNA-Amplifikation erforderlich, um eine
Zelle, einen Pilz, ein Bakterium oder ein Virus (im Folgenden als
RNA-Einschlusskörper
bezeichnet) von einer Probe zu trennen und anschließend eine
RNA aus einem derartigen RNA-Einschlusskörper vor der oben beschriebenen
Nukleinsäuresynthese
zu extrahieren. Bei einem derartigen Verfahren handelt es sich konventionell
um ein Verfahren, in dem eine biologische Probe beispielsweise mit
einem Enzym, einem grenzflächenaktiven
Stoff oder einem chaotropischen Mittel behandelt und dann die RNA
beispielsweise mit Phenol oder Phenol/Chloroform extrahiert wird.
Seit kurzem werden Ionenaustauscher-Harze, Glasfilter, Glaskügelchen
oder Reagenzien mit Proteinkoagulierender Wirkung in Verfahren zur
Extraktion von RNA angewendet.
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Da
jedoch jedes der oben beschriebenen Verfahren Probleme hinsichtlich
der vollständigen
Entfernung der Verunreinigungen aufweist, wenn es zur Reinigung
einer RNA in einer Probe verwendet wird, und häufig die Nukleinsäure in einer
Probe nicht mit einer konstanten Ausbeute wiedergewonnen werden
kann, kann eine anschließende
RNA-Amplifikation
nicht erfolgreich stattfinden, insbesondere, wenn der Gehalt der betreffenden
Nukleinsäuren
in einer Probe gering ist. Außerdem
beinhaltet jede dieser Aufreinigungsverfahren eine komplizierte,
zeitaufwendige Durchführung;
zudem besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit einer Kontamination während der
Durchführung
des Verfahrens.
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Da
bei einer RNA stets das Risiko einer Degradation durch ein RNA-abbauendes
Enzym (RNase) besteht, welches im Wesentlichen in allen biologischen
Proben vorliegt, ist es erforderlich, die RNase schnell nach einer
Aufreinigung zu inaktivieren und eine strikte Durchführung und
Kontrolle ebenso während
und nach der Aufreinigung durchzuführen, um eine Kontamination
mit einer RNase auszuschließen.
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EP 0 590 327 A2 beschreibt
ein Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen aus Blutproben
mittels eines enzymatischen Amplifikations-Verfahrens, wobei keine
Vorbehandlung der Blutprobe zum Vorreinigen der zu amplifizierenden
Nukleinsäuresequenzen
durchgeführt
wird.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine neue Reaktionslösung zur
Verfügung
zu stellen, mit der eine RNA in einer biologischen Probe effizient
amplifiziert werden kann, wobei Substanzen mit inhibitorischen Wirkungen
auf die Nukleinsäuresynthese
unterdrückt
werden, wodurch ein Verfahren zur Amplifikation der RNA in der Probe
zur Verfügung
gestellt wird, in dem die Probe oder ein RNA-Einschlusskörper in
der Probe direkt zu der Reaktionslösung gegeben wird.
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Somit
handelt es sich bei der vorliegenden Erfindung um ein Verfahren
zur Amplifikation von RNA, welches die Zugabe einer Probe di rekt
zu einer Reaktionslösung
zur Durchführung
einer RNA-Amplifikations-Reaktion,
bei der die in der Probe vorliegende RNA unmittelbar amplifiziert
wird, umfasst. In diesem Verfahren kann eine Probe zu einer Reaktionslösung oder,
alternativ, die Reaktionslösung
zu der Probe gegeben werden; es besteht also keine bestimmte Reihenfolge
hinsichtlich der Zugabe.
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Obwohl
ein RT-PCR-Verfahren in dem RNA-Amplifikations-Verfahren der vorliegenden Erfindung
enthalten ist, ist das Verfahren nicht darauf beschränkt, und
es können
auch irgendwelche anderen Verfahren, die enzymatische Reaktionen
zur Amplifikation einer RNA verwenden, angewendet werden.
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In
der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "direkte Zugabe" die Zugabe "nachdem eine Zelle,
ein Pilz, ein Bakterium, ein Virus usw. (im Folgenden als RNA-Einschlusskörper bezeichnet)
vor der RNA-Amplifikation
aus einer Probe isoliert wurde, wobei kein Verfahren notwendig ist,
um eine RNA aus einem derartigen RNA-Einschlusskörper zu extrahieren".
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In
der vorliegenden Erfindung bezeichnet eine Probe einen RNA-Einschlusskörper in
einer biologischen Probe oder eine biologische Probe selbst. Eine
biologische Probe bezeichnet ein tierisches oder pflanzliches Gewebe,
eine Körperflüssigkeit,
einen ausgeschiedenen Stoff und Ähnliches;
ein RNA-Einschlusskörper bezeichnet
eine Zelle, einen Pilz, ein Virus und Ähnliches. Eine Körperflüssigkeit
beinhaltet eine vom Blut stammende Probe, wie beispielsweise Blut,
Plasma und Serum, sowie Spinalflüssigkeit,
Speichelflüssigkeit, Milch
und Ähnliches.
Exkretionen beinhalten Urin, Kot und Ähnliches. Bei einer Zelle kann
es sich beispielsweise um eine Leukozyte, die aus einer Blut- oder
Spinalflüssigkeit
isoliert wurde, sowie um eine Mundschleimhautzelle oder Ähnliches
handeln.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur oben beschriebenen
Amplifikation von RNA, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung zur
Gen-Amplifikation bei 25°C
8,2 oder höher,
bei 55°C
7,4 oder höher und/oder
bei 70°C
7,1 oder höher
ist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur oben beschriebenen
Amplifikation von RNA, wobei ein Polyamin zu dem Reaktionssystem
gegeben wird.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur oben beschriebenen
Amplifikation von RNA, wobei ein sulfatiertes Polysaccharid und/oder
Salze davon (im Folgenden wird beides als sulfatiertes Polysaccharid bezeichnet)
zu dem Reaktionssystem gegeben wird.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur oben beschriebenen
Amplifikation von RNA, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung zur
Gen-Amplifikation bei 25°C
8,2 oder höher,
bei 55°C
7,4 oder höher und/oder
bei 70°C
7,1 oder höher
ist und/oder
wenigstens ein Polyamid, ein sulfatiertes Polysaccharid
und/oder Salze davon und Dithiothreitol zu dem Reaktionssystem gegeben
werden.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
die direkte Zugabe einer biologischen Probe zu einer Reaktionslösung zum
Bewirken einer direkten Amplifikation einer RNA, die in der Probe
vorliegt. Auf diese Weise ermöglicht
die Erfindung eine bequeme, schnelle und hoch sensitive Detektion
eines Fremdorganismus, wie beispielsweise eines RNA-Virus, einschließlich Hepatitis-C-Virus
(HCV), welches latent in einer biologischen Probe vorliegt, eines
Retrovirus, einschließlich
des humanen Immunschwächevirus
(HIV) sowie einer veränderten Zelle,
wie beispielsweise einer Karzinomzelle, die sich als Zelle völlig von
einer Wirtszelle unterscheidet. Die Erfindung ermöglicht außerdem die
Detektion einer mRNA, die einer intrazellulären Transkription unterworfen wird,
eine Analyse eines Expressionsgens durch Basensequenzierung und
eine A nalyse und Herstellung eines Expressionsprodukts durch cDNA-Klonierung, welche
bequem und schnell durchgeführt
werden können.
Des Weiteren kann die Erfindung, in der eine direkte Amplifikation
von RNA aus einer biologischen Probe angewendet wird, den RNA-Abbau
durch eine RNase, die konventionell während der Extraktion und Aufreinigung von
RNA auftritt, verhindert werden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt
die Ergebnisse einer Gel-Elektrophorese, die zur Detektion einer
in Ausführungsbeispiel
1 amplifizierten RNA durchgeführt
wurde.
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2 zeigt
die Ergebnisse einer Gel-Elektrophorese, die zur Detektion einer
in Ausführungsbeispiel
2 amplifizierten RNA durchgeführt
wurde.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Amplifikation von
RNA dar, welches die direkte Zugabe eines RNA-Einschlusskörpers zu
einer biologischen Probe oder einer Probe selbst zu einer Reaktionslösung zum
Bewirken einer RNA-Amplifikations-Reaktion umfasst, wobei die RNA
unmittelbar amplifiziert wird.
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In
dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren
zur Amplifikation einer RNA ist der pH-Wert einer Reaktionslösung, zu
der die Probe gegeben wird, 8,2 oder höher, bevorzugt 8,8 bis 9,2
bei 25°C,
7,4 oder höher,
bevorzugt 8,0 bis 8,4, bei 55°C
und/oder 7,1 oder höher,
bevorzugt 7,7 bis 8,1, bei 70°C.
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Wenn
es sich bei der Probe um eine vom Blut stammende Probe, wie beispielsweise
Blut, Plasma und Serum, handelt, ist der pH-Wert einer Reaktionslösung bevorzugt
ungefähr
8,9 bei 25°C,
ungefähr
8,1 bei 55°C und/oder
ungefähr
7,8 bei 70°C.
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Des
Weiteren wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation
einer RNA ein Polyamin zu der Reaktionslösung in einem Nukleinsäure-Syntheseverfahren
zur Amplifikation einer bestimmten RNA in einer Probe gegeben. Ein
derartiges Polyamin kann zuerst zu einer Probe gegeben werden, die
anschließend zu
einer Reaktionslösung
gegeben wird, oder das Polyamid kann alternativ direkt zu einer
Reaktionslösung gegeben
werden. Auch wenn ein Polyamin nicht gleichmäßig in einer Reaktionslösung enthalten
ist (beispielsweise dann, wenn ein Polyamin zu einer Probe gegeben
wird und die Probe zu einer Reaktionslösung gegeben wird, ohne dass
gerührt
wird), hat es die gleiche Wirkung. Es können entweder lediglich ein
einziges Polyamin oder eine Kombination mehrerer verschiedener Polyamine
verwendet werden.
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Polyamin
ist der allgemeine Name für
einen Kohlenwasserstoff mit zwei oder mehr primären oder sekundären Aminogruppen.
Während
einige Polyamine in vivo vorkommen und in hohen Mengen in Geweben enthalten
sind, die intensiver Proteinsynthese und Nukleinsäuresynthese
unterliegen, wodurch sie verschiedene physiologische Wirkungen ausüben, besitzen
die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polyamine nicht notwendigerweise
solche Wirkungen; es können
jegliche Polyamine, bei denen es sich um Kohlenwasserstoffe mit
zwei oder mehr primären
oder sekundären
Aminogruppen in ihrem Molekül
handelt, ohne irgendwelche Einschränkungen verwendet werden.
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Dabei
handelt es sich z. B. typischerweise um ein gerades Polyamin mit
zwei Aminogruppen in seinem Molekül (Ethylendiamin, Trimethylendiamin,
Putrescin), ein gerades Polyamin mit drei Aminogruppen (Spermidin,
Diethylentriamin), ein gerades Polyamin mit vier Aminogruppen (Spermin,
Triethylentetramin), ein gerades Polyamin mit fünf Aminogruppen (Tetraethylenpentamin),
ein gerades Polyamin mit sechs Aminogruppen (Pentaethylenhexamin),
ein zyklisches Polyamin (1,4-bis(3-aminopropyl)-piperazin, 1-(2-Aminoethyl)piperazin,
1-(2- Aminoethyl)piperidin,
1,4,10,13-Tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecan und Tris(2-aminoethyl)amin
und Ähnliches.
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Die
Menge (Konzentration) eines zugegebenen Polyamins kann in Abhängigkeit
des Polyamintyps, des Probentyps oder der Probenkonzentration und Ähnlichem
variieren; die Wirkung kann bei einer höheren Konzentration erreicht
werden, wenn die Anzahl der Aminogruppen in dem Molekül geringer
ist, und bei einer niedrigeren Konzentration, wenn die Anzahl der
Aminogruppen höher
ist. Beispielsweise wird Ethylendiamin, welches zwei Aminogruppen
aufweist, bevorzugt mit einer Konzentration von ungefähr 8 mM
zugegeben, während
Tetraethylenpentamin und Pentaethylenhexamin, welche fünf oder
mehr Aminogruppen aufweisen, inhibitorische Wirkungen auf die Amplifikations-Reaktion
haben, wenn sie mit 4 mM oder darüber zugegeben werden; somit
werden sie bevorzugt mit Konzentrationen nicht über 2 mM zugegeben.
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Des
Weiteren wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation
einer RNA ein sulfatiertes Polysaccharid zu einer Reaktionslösung in
einem Nukleinsäure-Syntheseverfahren
zur Amplifikation einer bestimmten RNA in einer Probe gegeben. Ein
derartiges sulfatiertes Polysaccharid kann zunächst zu einer Probe und anschließend zu
einer Reaktionslösung
gegeben werden, oder das sulfatierte Polysaccharid kann alternativ
direkt zu einer Reaktionslösung
gegeben werden. Auch wenn ein sulfatiertes Polysaccharid nicht gleichmäßig in einer
Reaktionslösung
enthalten ist (beispielsweise, wenn ein sulfatiertes Polysaccharid
zu einer Probe gegeben wird und die Probe zu einer Reaktionslösung ohne
Rühren
gegeben wird), weist es die gleiche Wirkung auf. Es kann lediglich
ein einziges sulfatiertes Polysaccharid oder eine Kombination mehrerer
verschiedener sulfatierter Polysaccharide verwendet werden.
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Obwohl
Heparin und dessen Salze und Dextransulfat und dessen Salze die
sulfatierten Polysaccharide darstellen, die bevorzugt in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, sind auch andere Substanzen, wie beispielsweise
Heparansulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Funoran, sulfatiertes
Agarose, Carrageenan, Porphyran, Fucoidan oder sulfatiertes Curdlan,
geeignet.
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Die
Menge (Konzentration) eines zugegebenen sulfatierten Polysaccharids
kann in Abhängigkeit
des Typs des sulfatierten Polysaccharids, des Probentyps oder der
Probenkonzentration und Ähnlichem
variieren; sie beträgt
bevorzugt 0,4 bis 25 μg/ml
in einer Reaktionslösung,
wenn eine von Blut stammende Probe verwendet wird, und Heparin als
sulfatiertes Polysaccharid verwendet wird. Bei Verwendung einer
von Blut stammenden Probe und von Dextransulfat als sulfatiertes
Polysaccharid beträgt
die Konzentration bevorzugt 0,05 bis 8 μg/ml in einer Reaktionslösung.
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Eine
RT-Reaktionslösung
enthält
im Allgemeinen eine pH-Puffer-Lösung, Salze,
wie beispielsweise MgCl2 und KCl, Dithiotreitol
(DTT), einen oder mehrere Primer, Desoxyribonukleotide, einen RNase-Inhibitor und eine
reverse Transkriptase. Die oben beispielhaft genannten Salze können durch
andere geeignete Salze ersetzt werden. Gegebenenfalls werden Proteine,
wie beispielsweise Gelatine und Albumin, sowie grenzflächenaktive
Stoffe und Ähnliches
zugegeben.
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Eine
Reaktionslösung
für eine
PCR, die anschließend
an eine RT-Reaktion
in einer RT-PCR durchgeführt
wird, enthält
im Allgemeinen eine pH-Puffer-Lösung,
Salze, wie beispielsweise MgCl2 und KCl,
Primer, Desoxyribonukleotide und eine hitzeresistente Polymerase.
Die oben beispielhaft genannten Salze können durch andere geeignete
Salze ersetzt werden. Außerdem
können
gegebenenfalls Proteine, wie beispielsweise Gelatine und Albumin,
sowie Dimethylsulfoxid, grenzflächenaktive
Stoffe und Ähnliches
zugegeben werden.
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Eine
RT-PCR kann durchgeführt
werden, indem ein Teil eines RT-Reaktionsprodukts
zu einer PCR-Reaktionslösung
gegeben wird (zwei Reaktionsgefäße – zwei Schritte)
oder indem ein PCR-Reaktionsreagenz zu einem RT-Reaktionsprodukt
gegeben wird (ein Reaktionsgefäß – zwei Schritte);
sie kann auch als kontinuierliches Verfahren einer RT-Reaktion mit anschließender PCR,
wobei alle für
eine RT-PCR-Reaktion erforderlichen Reagenzien vorher bereitgestellt
werden, durchgeführt
werden (ein Reaktionsgefäß – ein Schritt).
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Eine
pH-Puffer-Lösung
ist eine Kombination von Tris(hydroxymethyl)aminomethan und einer
Mineralsäure,
wie beispielsweise Salzsäure,
Salpetersäure
und Schwefelsäure,
wobei Salzsäure
die bevorzugte Mineralsäure
darstellt. Ebenso können
verschiedene andere pH-Puffer-Lösungen,
wie beispielsweise Kombinationen von Tricin, CAPSO (3-N-Cyclohexylamino-2-hydroxypropansulfonsäure) oder
CHES (2-(Cyclohexylamino)ethansulfonsäure), mit Natriumhydroxid oder
Kaliumhydroxid verwendet werden. Eine Pufferlösung, deren pH-Wert eingestellt
ist, wird häufig
mit einer Konzentration von 10 mM bis 100 mM in einer Genamplifikations-Reaktionslösung verwendet.
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Ein "Primer" bezeichnet ein Oligonukleotid,
welches als Synthese-Anfangspunkt
für eine
cDNA-Synthese oder eine Nukleinsäure-Amplifikation dient.
Obwohl ein einzelsträngiger
Primer bevorzugt ist, können ebenso
doppelstängige
Primer verwendet werden. Bei Verwendung eines doppelstängigen Primers
wird der Primer bevorzugt vor der Reaktion in einen einzelsträngigen Primer überführt. Ein
Primer kann durch ein bekanntes Verfahren synthetisiert oder aus
einem natürlich
vorkommenden Wildtyp isoliert werden.
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Eine
in einer RT-Reaktion verwendete reverse Transkriptase bezeichnet
ein Enzym, welches eine RNA revers in cDNA umschreiben (transkribieren)
kann. Beispiele für
eine derartige reverse Transkriptase sind eine von einem Vogel-Retrovirus,
wie beispielsweise dem Rous-Associated-Virus
(RAV) und dem Vogel-Myeloblastose-Virus (AMV), stammende reverse
Transkriptase, eine von einem murinen Retrovirus (MMLV), wie beispielsweise
dem murinen Moloney-Leukämie-Virus
(MMLV), stammende reverse Transkriptase, oder die oben beschriebene
Tth-DNA-Polymerase.
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Bei
der RT-Reaktion der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt eine reverse
Transkriptase verwendet, die von einem Vogel-Retrovirus, insbesondere
von AMV, stammt.
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Eine
hitzeresistente Polymerase, die in einer PCR verwendet wird, bezeichnet
eine Polymerase mit ausgezeichneter Hitzebeständigkeit, welche eine Nukleinsäure als
Antwort auf eine Primer-Zugabe synthetisiert. Beispiele für eine geeignete
hitzeresistente Polymerase sind die von Thermus Aquaticus stammende Taq-DNA-Polymerase,
die von Thermus Thermophilus stammende Tth-DNA-Polymerase, die von
Pyrococcus stammende KOD, Pfu- oder Pwo-DNA-Polymerase oder einer
Mischung dieser hitzeresistenten Polymerasen. Tth-DNA-Polymerase
kann bequem als einzelnes Enzym verwendet werden, um eine RT-PCR
in dem Ein-Gefäß-Ein-Schritt-Verfahren
durchzuführen,
da Tth-DNA-Polymerase
ebenso RT-Aktivität
aufweist.
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Das
Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung
entspricht einem gewöhnlichen
Verfahren, mit dem Unterschied, dass eine Reaktionslösung verwendet
wird, deren pH-Wert höher
ist als der einer gewöhnlich
verwendeten Lösung,
und/oder dass ein Polyamin und/oder ein sulfatiertes Polysaccharid
zugegeben werden. Auf diese Weise findet bei einer RT-Reaktion die
Reaktion über
etwa 30 Minuten bis 1 Stunde bei einer Temperatur, die für einen
Primer und eine ausgewählte
reverse Transkriptase geeignet ist, statt. Bei einer PCR wird eine
DNA zunächst
mittels Hitzedenaturierung in eine einzelsträngige DNA überführt (Denaturierungsschritt).
Als zweites werden die Primer, die einen zu amplifizierenden Bereich
eingrenzen, hybridisiert (Annealing-Schritt). Anschließend werden
die Primer durch eine DNA-Polymerase in Gegenwart der vier Desoxyribonukleotide
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) verlängert
(Polymerisationsschritt).
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen, welche
die Erfindung in keiner Weise einschränken, beschrieben.
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[Ausführungsbeispiel 1]
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In
diesem Experiment wurde humanes Blut direkt zu einer erfindungsgemäß zusammengesetzten
Reaktionslösung
gegeben, um eine RT-PCR unter Verwendung eines Primers, der spezifisch
für eine
humane Beta-Actin-mRNA ist, durchzuführen. In der RT-PCR wurde 1 μl des humanen
Bluts zu 50 μl
der Reaktionslösung
gegeben.
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Der
Primer für
die RT-Reaktion war ein Oligonukleotid (BAR) mit der zur humanen
Beta-Actin-mRNA komplementären
Sequenz; in der anschließenden
PCR wurde ein Oligonukleotid (BAF) mit der zu der in der RT-Reaktion
synthetisierten cDNA komplementären
Basensequenz zusätzlich
verwendet. Um das von der RNA stammende Produkt von dem von der
DNA stammenden Produkt in der RT-PCR zu unterscheiden, wurde der
BAF-Primer auf das Exon 3 des humanes Beta-Actin-Gens und der BAR-Primer auf das Exon
4 gesetzt, wodurch ein Intron von 107 bp, welches durch die beiden
Primer begrenzt wurde, erzeugt wurde. Entsprechend bestand bei der
RT-PCR in diesem Experiment das von der RNA stammende Produkt aus
264 bp und das von der DNA stammende Produkt aus 370 bp. Die Sequenzen
der verwendeten Primer sind die folgenden:
BAF: 5' CAAGAGATGGCCACGGCTGCT
3' (Seq. ID No.
1)
BAR: 5' TCGTTCTGCATCCTGTCGGCA
3' (Seq. ID. No.
2)
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Die
verwendete RT-Reaktionslösung
(pH 8,9) enthielt 10 mM Tris-HCl,
35 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, jeweils 200 μM dATP, dCTP,
dGTP und dTTP, 2 mM DTT, 0,4 μM
des BAR-Primers, 50 Einheiten/50 μl
Ribo nuklease-Inhibitor (Takara shuzo, Kyoto, Japan) und 5 Einheiten/50 μl AMV XL
reverse Transkriptase (Takara shuzo) zusammen mit einem Polyamin
und einem sulfatierten Polysaccharid. In diesem Experiment wurde
Triethylentetramin als Polyamin mit einer Konzentration von 2 mM
zugegeben. Als sulfatiertes Polysaccharid wurde Heparin Na mit einer
Konzentration von 0,8 μg/ml
zugegeben.
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In
der auf die RT-Reaktion folgenden PCR wurden 20 pmol des BAF-Primers
und 1,25 Einheiten der Taq-DNA-Polymerase (TaKaRa Taq: Takara shuzo)
zu der oben beschriebenen RT-Reaktionslösung gegeben.
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Die
RT-Reaktion wurde 30 Minuten bei 55°C durchgeführt; anschließend wurde
bei 95°C
5 Minuten behandelt, wodurch die reverse Transkriptase inaktiviert
wurde.
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Nach
dieser Prozedur wurden der BAF-Primer und die Taq-DNA- Polymerase zugegeben,
um eine PCR durchzuführen.
Die PCR umfasste 50 Zyklen, wobei jeder Zyklus aus 30 Sekunden bei
94°C, gefolgt
von 30 Sekunden bei 68°C,
gefolgt von 60 Sekunden bei 72°C
bestand; dann wurde eine finale Polymerisation bei 72°C über 7 Minuten
durchgeführt.
Nach Beendigung der PCR wurden 5 μl
der Reaktionslösung
einer Elektrophorese auf einem 2,5%-igen Agarosegel in TAE (40 mM
Tris-acetat, 1 mM EDTA), enthaltend 0,5 μg/ml Ethidiumbromid, unterzogen,
um das Amplifikationsprodukt zu detektieren.
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1 zeigt
die Ergebnisse der Elektrophorese eines Amplifikationsprodukts,
welches durch eine RT-PCR, in der 1 μl humanes Blut direkt zu 50 μl der Reaktionslösung gegeben
worden waren, erhalten wurde.
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In
dieser Figur bezeichnet "M" einen Größenmarker
(250 ng
X174-RF-DNA,
erhalten durch Spaltung mit HincII), "1" zeigt
die Ergebnisse der RT-PCR in Gegenwart der reversen Transkriptase,
und "2" zeigt die Ergebnisse
in Abwesenheit der reversen Transkriptase zum Vergleich.
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Auf
der Grundlage der oben beschriebenen Ergebnisse wurde ein Amplifikationsprodukt
spezifisch für die
humane Beta-Actin-mRNA (Pfeil) in der RT-PCR erhalten, die in Gegenwart
von reverser Transkriptase unter Zugabe von humanem Blut direkt
zu der Reaktionslösung
durchgeführt
worden war (Spur 1). Die oberhalb des Pfeils auftretenden Amplifikations-Produkte
sind DNA-Amplifikations-Produkte, die während der PCR amplifiziert
wurden.
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[Ausführungsbeispiel 2]
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In
diesem Experiment wurde humanes Blut mit einer hypotonischen Lösung behandelt,
um eine Hämolyse
zu bewirken, und dann zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen und ein
Leukozyten-Pellet zu erhalten, zu dem die Reaktionslösung wie
bei Ausführungsbeispiel
1 gegeben wurde, um eine RT-PCR zu bewirken. Die RT-PCR und der
Nachweis der RNA-Amplifikationsprodukte durch Gelelektrophorese
wurde unter Bedingungen durchgeführt,
die denen in Ausführungsbeispiel
1 entsprachen.
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Zu
verschiedenen Mengen des Leukozyten-Pellets wurden 50 μl der Reaktionslösung gegeben,
um die RT-PCR durchzuführen;
die Ergebnisse der Elektrophorese der Amplifikationsprodukte sind
in 2 dargestellt.
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In
dieser Figur bezeichnet "M" einen Größenmarker
(250 ng von
X174-RF-DNA,
erhalten durch eine Spaltung mit HincII), "2", "3", "4" und "5" zeigen die Ergebnisse der RT-PCR, in
der das Leukozyten-Pellet, welches durch Behandlung von 10 μl, 20 μl, 40 ml
bzw. 80 μl
humanen Bluts hergestellt worden war, mit 50 μl der Reaktionslösung kombiniert
wurde. "1" zeigt die Ergebnisse
einer Kontroll-RT-PCR in Abwesenheit von Leukozyten.
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Auf
der Grundlage der oben beschriebenen Ergebnisse wurde ein Amplifikationsprodukt
spezifisch für die
humane Beta-Actin-mRNA (Pfeil) bei jeglicher zugegebener Leukozytenmenge
in der RT-PCR, in der eine Reaktionslösung der vorliegenden Erfindung
zu dem humanen Leukozyten-Pellet gegeben wurde, erhalten. Die Amplifikationsprodukte
oberhalb des Pfeils sind DNA-Amplifikationsprodukte, welche während der
PCR amplifiziert wurden.
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2 zeigt
außerdem,
dass ein Amplifikationsprodukt spezifisch für die humane Beta-Actin-mRNA
erhalten wurde, sogar wenn Leukozyten, die durch Behandlung des
Bluts erhalten wurden, in einer so hohen Menge wie 80 μl der RT-PCR
unterzogen wurden (Spur 5).
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Die
oben beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass eine RT-PCR, welche eine
Reaktionslösung
der vorliegenden Erfindung verwendet, eine RNA-Analyse einer großen Leukozytenmenge
ermöglicht.
Demgemäß kann eine
RNA, die in einem Teil der Zellen exprimiert wird, oder eine RNA,
die in einer kleine Menge in einer Zelle exprimiert wird, direkt
aus einer Probe oder einem RNA-Einschlusskörper in einer Probe durch Anwendung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
analysiert werden.
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