DE69231896T2

DE69231896T2 - Verfahren für die typ-spezifische detektion von herpes simplex virus

Info

Publication number: DE69231896T2
Application number: DE69231896T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Kita; Takashi Kurimura; Toshiya Matsumoto
Original assignee: Iatron Laboratories Inc; Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: LSI Medience Corp
Priority date: 1991-02-25
Filing date: 1992-02-24
Publication date: 2001-10-25
Anticipated expiration: 2012-02-25
Also published as: ES2158846T3; JPH0556800A; EP0526652A1; US5354653A; EP0526652B1; EP0526652A4; DE69231896D1; JP3167138B2; CA2081354A1; CA2081354C; WO1992014846A1

Description

Technischer Hinterrund

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Typ-spezifischen Nachweis des menschlichen Herpes simplex-Virus vom Typ I (nachstehend gegebenenfalls als HSV I bezeichnet) und des menschlichen Herpes simplex-Virus vom Typ II (nachstehend gegebenenfalls als HSV II bezeichnet).

Hintergrund des Fachgebiets

Das menschliche Herpes simplex-Virus (HSV) liegt latent in den menschlichen Spinalganglien. Nach einer Infektion tritt die Erkrankung wiederholt wieder auf. Es gibt zwei Typen bei HSV: Typ I und Typ II. Die Rezidivrate und die Empfindlichkeit gegen Wirkstoffe unterscheiden sich in Abhängigkeit vom Typ. Daher ist die Bestimmung des HSV-Typs wichtig. Das zuverlässigste Diagnoseverfahren der HSV-Infektionskrankheit ist die Isolierung des Virus zur Bestimmung, aber dieses Verfahren macht die Züchtung von Zellen erforderlich und erfordert mehrere Tage für die Bestimmung, so ist es schwierig, die Ergebnisse bei der Behandlung geeignet zu berücksichtigen. Es gibt auch ein Bestimmungsverfahren unter Verwendung eines Fluoreszenz-Antikörpers, aber in diesem Fall sind Zellen des erkrankten Bereichs erforderlich. Ferner ist ein Verfahren bekannt, in dem DNA-Fragmente, die für HSV Typ-spezifisch sind, als Sonde verwendet werden und eine Probe des Patienten durch das Dot-Blot-Verfahren untersucht wird. Nichtsdestoweniger erfordert dieses Verfahren nicht nur viel Probenmaterial (zum Beispiel 200 bis 500 ul), sondern kann auch den HSV-Typ nicht bestimmen, auch wenn das HSV nachgewiesen wurde. Daher bestand der Wunsch nach der Entwicklung eines Verfahrens und von in vitro-Diagnosemitteln, welche die Bestimmung von HSV I und HSV II mit hoher Genauigkeit in einem kurzen Zeitraum ermöglichen.
Andererseits, während in der Vergangenheit angenommen worden war, daß es keine Basensequenz gibt, welche die Typ-spezifische Erkennung von HSV ermöglichen würde, haben die hier genannten Erfinder bereits eine Typ-spezifische DNA-Sonde für HSV entwickelt. Und zwar ist es möglich, eine Typ-spezifische DNA-Sonde zu erhalten, indem DNA-Fragmente, die durch Spaltung von HSV I- oder 115 V II-DNA mit bestimmten Restriktionsenzymen erhalten wurden [oder DNA-Fragmente, die durch Spaltung von DNA, welche durch Insertion der DNA-Fragmente in einen geeigneten Vektor (Plasmid) und Clonierung derselben erhalten wurde, mit bestimmten Restriktionsenzymen gewonnen wurden], markiert werden. Diese markierten DNA-Fragmente schließen mehrere hundert bis mehrere tausend bp (Basenpaare) ein und sind hinsichtlich der Typ-Spezifität überlegen. Einzelheiten davon sind in der ungeprüften Japanischen Patentanmeldung Nr. 2-142499 und in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 2-90198 offenbart. Jedoch weisen die vorstehend erwähnten markierten DNA-Fragmente eine Größe auf, die durch chemische Synthese schwer herzustellen ist.
EP-A2-0 326 395 offenbart ein Primerpaar und eine Sonde für ein Verfahren zum Nachweis von HSV I durch Amplifizieren des IE1-Gens durch PCR und dann Identifizieren desselben durch Hybridisierung.
EP-A1-0 407 291 beschreibt verbesserte Verfahren der DNA-Amplifikation und offenbart ein Primerpaar zur Amplifikation eines unspezifischen Fragments von HSV II. Kimura et al., Med. Microbiol. Immunol. 179 (1990), 177-184 beschreiben ein Verfahren zum Nachweis und zur direkten Typisierung von HSV durch das PCR-Verfahren mit einem gemeinsamen Stromaufwärtsprimer und zwei Typ-spezifischen Stromabwärtsprimern. Die hier genannten Erfinder stellten weitere Studien an, um eine Basensequenz zu entdecken, die ohne Verringerung der Typ-Spezifität leicht gehandhabt werden kann (zum Beispiel mit einer Größe in einem Ausmaß, daß die chemische Synthese gewählt werden kann). Als Ergebnis wurde eine relativ kleine Basensequenz entdeckt, die bei der Typ-spezifischen Bestimmung verwendet werden kann.
Und zwar besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, verschiedene Primer, die zur Amplifikation von DNA-Fragmenten, welche für HS V I oder HS V II spezifisch sind, verwendet werden können, und Sonden, die für HSV I-DNA oder HSV II-DNA spezifisch sind, bereitzustellen.

Offenbarung der Erfindung

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Typ-spezifischen Nachweis von Herpes simplex-Virus in einer wäßrigen Probe, umfassend die aufeinanderfolgenden Schritte:
(1) Amplifikation von DNA in einem Gemisch, enthaltend die wäßrige, flüssige Probe, eine DNA-Polymerase und eine Kombination von Primern, wobei die Kombination von Primem umfaßt:
(a) eine erste Kombination eines ersten BamHIB-Oligonucleotidprimers, der mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Nucleotidsequenz (1a):
CACGGGTATA AGGACATCCA (1a)
[nachstehend wahlweise als Primer (1a) bezeichnet]
enthält, mit einem zweiten BamLUIB-Oligonucleotidprimer, der mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Nucleotidsequenz (2a):
GGGTCCTCGT CCAGATCGCT (2a)
[nachstehend wahlweise als Primer (2a) bezeichnet]
enthält, für die Amplifikation eines Fragments des BamII-IIB-DNA-Fragments vom Herpes simplex-Virus Typ I;
(b) eine zweite Kombination eines ersten a-Oligonucleotidprimers, der mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Nucleotidsequenz (1b):
GCCTCTTTTC CCCCGGGGAG (1b)
[nachstehend wahlweise als Primer (1b) bezeichnet]
enthält, mit einem zweiten a'-Oligonucleotidprimer, der mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Nucleotidsequenz (2b):
GGGAAAAAAG CCGCGCCGGGG (2b)
[nachstehend wahlweise als Primer (2a) bezeichnet]
enthält, für die Amplifikation eines Fragments des a'-DNA-Fragments vom Herpes simplex-Virus Typ II; oder
(c) beide Kombinationen, die erste Kombination (a) und die zweite Kombination (b); (II) Nachweis und Analyse der amplifizierten DNA von Schritt (I).
In der Basensequenz der vorliegenden Beschreibung bedeuten A einen Adeninrest, C einen Cytosinrest, G einen Guaninrest und T einen Thyminrest.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse einer Elektrophorese in Verbindung mit DNAs, die durch eine PCR unter Verwendung des erfindungsgemäßen HSV I-Primers amplifiziert wurden.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer Elektrophorese in Verbindung mit DNAs, die durch eine PCR unter Verwendung des erfindungsgemäßen HSV II-Primers amplifiziert wurden.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Bestätigung der Elektrophoreseabbildungen von Fig. 2 durch das Southern-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von mit einem Radioisotop markierten Sonden.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse einer in situ-Hybridisierung unter Verwendung von mit einem Radioisotop markierten erfindungsgemäßen Sonden.

Bestes Verfahren zur Ausführung der Erfindung

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete flüssige Probe ist nicht besonders begrenzt, solange die Probe im Verdacht steht, HSV zu enthalten. Zum Beispiel ist es möglich, Bläschen, Rachenabstriche, Spinalflüssigkeit oder ähnliches von Patienten zu verwenden.
Das erfindungsgemäße HSV-Nachweisverfahren umfaßt hauptsächlich (1) einen DNA-Amplifikationsschritt und (2) einen DNA-Nachweisschritt. Bei dem DNA-Amplifikationsschritt (I) ist es möglich, das PCR (Polymerase-Kettenreaktions)-Verfahren anzuwenden. Durch das PCR-Verfahren ist es möglich, den gewünschten DNA-Bereich aus einer kleinen DNA-Menge automatisch bis etwa millionenfach zu amplifizieren (Science 239 (1988), 487 bis 491). Bei dem PCR-Verfahren werden zwei Typen von DNA-Primern verwendet: ein Primer für den + (Plus)-Strang (nachstehend als der erste Primer bezeichnet) und ein Primer für den - (Minus)-Strang (nachstehend als der zweite Primer bezeichnet), die den zu amplifizierenden DNA-Bereich beidseitig einschließen.
Als Kombinationen der bei dem erfindungsgemäßen DNA-Amplifikationsschritt
(1) verwendeten ersten und zweiten Primer gibt es die folgenden zwei Kombinationen:
(a) der erste Primer (1a) und der zweite Primer (2a); und
(b) der erste Primer (1b) und der zweite Primer (2b).
Die vorstehenden Kombinationen (a) und (b) können allein oder gleichzeitig verwendet werden. Wenn die Kombination (a) der Primer verwendet wird, ist es möglich, einen für HSV I spezifischen Nachweis durchzuführen, und wenn die Kombination (b) der Primer verwendet wird, ist es möglich, einen für HSV II spezifischen Nachweis durchzuführen.
Die Basensequenzen der Formeln (1a) und (2a) liegen in der 0,75-Karteneinheit auf der HSV I-DNA-Genkarte. Die Basensequenz der Formel (1a) schließt die 20 Basen des Komplementärstrangs von der 31. Base bis zur 12. Base stromaufwärts des 5'-Endes des BamHIB-Fragments ein, während die Basensequenz der Formel (2a) die 20 Basen des Komplementärstrangs von der 212. Base bis zur 193. Base stromabwärts des 5'-Endes des BamHIB-Fragments einschließt. Die Basensequenzen der Formeln (1b) und (2b) liegen in der a'-Sequenz der HSV II-DNA (J. Gen. Virol. 55 (1981), 315 bis 331). Die Basensequenz der vorstehend erwähnten Formel (1b)) schließt die 20 Basen des Komplementärstrangs von der 9. Base bis zur 28. Base stromabwärts des 5'-Endes der a'-Sequenz ein, während die Basensequenz der vorstehend erwähnten Formel (2b) die 20 Basen des Komplementärstrangs von der 221. Base bis zur 202. Base stromabwärts des 5'-Endes der a'-Sequenz einschließt. Folglich, wenn HSV I-DNA in der Probe vorliegt, amplifiziert die Kombination der Primer (1a) und (2a) erfindungsgemäß den 243 bp-Teil, der einem Teil des BamHI-Fragment-Gens entspricht, während, wenn HS V II-DNA in der Probe vorliegt, die Kombination der Primer (1b) und (2b) den 213 bp-Teil amplifiziert, der einem Teil des a'-Sequenz-Gens entspricht, in spezifischer Weise, in großen Mengen bzw. in einem kurzen Zeitraum. Demgemäß kann die Anwesenheit von HSV I-DNA und HSV II-DNA in der Probe in einer äußerst spezifischen Weise nachgewiesen werden.
Die ersten und die zweiten Primer können jeweils ein 15mer bis 30mer sein, aber stellen im allgemeinen ein 20mer bis 25mer dar. Wenn die Primer kleiner als ein 15mer werden, ist die Spezifität nach der Anlagerung verringert und unspezifische Bindungen nehmen zu. Außerdem, wenn die Primer länger als ein 30mer werden, muß man mit der Ausbildung von Sekundärstrukturen zwischen den Prirnermolekülen oder in den Molekülen rechnen. Die in dem erfindungsgemäß verwendeten ersten Primer und zweiten Primer beinhalteten Basen können auf jegliche bekannte Weise modifiziert (zum Beispiel biotinyliert oder mit einem fluoreszierenden Stoff markiert) werden.
Die erfindungsgemäßen ersten und zweiten Primer können durch ein bekanntes DNA-Syntheseverfahren (zum Beispiel das Phosphoamiditverfahren) unter Verwendung eines üblichen automatischen DNA-Synthesegeräts (zum Beispiel Applied Biosystems) hergestellt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen DNA-Amplifikationsschritt (I) wird der Amplifikationszyklus unter Verwendung einer DNA-Polymerase, besonders einer hitzebeständigen DNA-Polymerase, zusätzlich zu den ersten und zweiten Primern wiederholt. Als hitzebeständige DNA-Polymerase kann eine DNA-Polymerase verwendet werden, die ihre Aktivität bei einer Temperatur von bis zu 95ºC beibehält, zum Beispiel eine im Handel erhältliche Taq-Polymerase.
Bei dem erfindungsgemäßen DNA-Amplifikationsschritt wird ein flüssiges Gemisch aus einer bestimmten Kombination der vorstehend erwähnten ersten und zweiten Primer, der DNA-Polymerase und der flüssigen Probe verwendet. Die Mengen des ersten Primers, des zweiten Primers und der DNA-Polymerase können in Abhängigkeit der Art der flüssigen Probe variieren, aber sie können in einfacher Weise in einem Bereich bestimmt werden, daß der DNA-Amplifikationsschritt durch das PCR-Verfahren ausgeführt werden kann. Das flüssige Gemisch kann in einigen Fällen eine Pufferlösung (zum Beispiel eine Tris- Hydrochlorid-Pufferlösung), ein Stabilisierungsmittel (zum Beispiel Gelatine) oder ein Salz (zum Beispiel Natriumchlorid) enthalten.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das flüssige Gemisch in dem Amplifikationszyklus des PCR-Verfahrens verwendet. Der Amplifikationszyklus umfaßt die Schritte:
(i) Denaturierung einer doppelsträngigen DNA (für etwa 10 Sekunden bis 2 Minuten bei etwa 90ºC bis 95ºC),
(ii) Anlagerung der einzelsträngigen DNA an die ersten und zweiten Primer (für etwa 30 Sekunden bis etwa 3 Minuten bei etwa 37ºC bis 70ºC), und
(iii) Verlängerung der DNA durch die DNA-Polymerase (für etwa 30 Sekunden bis etwa 5 Minuten bei etwa 65ºC bis 80ºC).
Nach jedem Zyklus ist die DNA zweifach amplifiziert. Daher ist die DNA nach n Amplifikationszyklen 2º-fach amplifiziert. Erfindungsgemäß wird der vorstehend erwähnte Amplifikationszyklus 10- bis 60mal, vorzugsweise 20- bis 40mal, wiederholt. Im letzten Zyklus wird bevorzugt, die Aufheizzeit des Schritts (iii) auf etwa 5 bis 10 Minuten auszudehnen, um die DNA-Synthese zu beenden.
Bei Beendigung des vorstehenden Amplifikationszyklus sind ausreichende DNA- Mengen von etwa 200 bis 300 bp synthetisiert, falls HSV in einer Probe vorliegt. Die so erhaltene DNA wird durch den folgenden DNA-Nachweisschritt nachgewiesen.
Für den DNA-Nachweisschritt kann das Verfahren unter Verwendung einer Gelelektrophorese und einer Ethidiumbromid-Färbung; das Southern-Blot-Hybridisierungsverfahren; oder das Verfahren zur Bestimmung der Basensequenz durch das Didesoxyverfahren; das Verfahren der radioaktiven Markierung; oder ein ähnliches Verfahren angewendet werden. Wenn das Gelelektrophoreseverfahren angewendet wird, ist es möglich, zum Beispiel eine Elektrophorese vom submarinen Typ unter Verwendung eines Agarosegels als Träger oder eine Plattengelelektrophorese unter Verwendung von Acrylamid zu verwenden.
Für die Southern-Blot-Hybridisierung oder die in situ-Hybridisierung ist es möglich, eine radioaktive Sonde oder eine nicht-radioaktive Sonde (zum Beispiel eine mit einem Enzym, Biotin, Digoxigenin, einem chemilumineszierenden Stoff oder einem fluoreszierenden Stoff markierte Sonde) zu verwenden.
Ferner, wenn das Verfahren zur Bestimmung der Basensequenz das Didesoxyverfahren ist, kann ein automatisches DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems) unter Verwendung eines Fluoreszenz-Markers verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch zwei Typen von DNA-Sonden bereit, die für die HSV I-DNA und die HSV II-DNA spezifisch sind, Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Typ-spezifischen Nachweis von Herpes simplex-Virus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Oligonucleotidsonde, die mindestens 10 Basen der Basensequenz der Formel (3):
CCCCGATTCG GGCCCGGTCG CTCGCTACCG GTGCGCCACC (3)
oder der Formel (4)
CCCCGCGGGC GCCGCCCCTC CCCCCGCGCG CCGCGGGCTG (4)
aufweist und dazu eine Markierung trägt, mit einer Probe in Kontakt gebracht wird; und daß ein Signal von der Markierung nachgewiesen wird.
Die Basensequenz der Formel (3) schließt die 40 Basen von der 50. Base bis zur 89. Base stromabwärts des 5-Endes des BamHIB-Fral; ments ein. Die DNA-Sonde, die ein Oligonucleotid enthält, das mindestens 10 Basen der Basensequenz der Formel (3) aufweist (nachstehend wahlweise als Sonde A bezeichnet), ist für das BamHIB-Fragment der HSV I- DNA spezifisch. Die Länge der Sonde variiert mit der Art der auf die Probe angewendeten Vorbehandlung. Wenn die Probe durch den DNA-Amplifikationsschritt des PCR-Verfahrens behandelt wird, kann die Sonde eine Länge von 10 bp bis zur Größe des DNA-Fragments (ausgenommen den Primerteil), die durch das PCR-Verfahren amplifiziert wird, aufweisen. Außerdem, wenn die Probe nicht durch den DNA-Amplifikationsschritt des PCR-Verfahrens behandelt wird und die Sonde A für das in situ-Hybr·idisierungsverfahren verwendet wird, kann die Länge der Sonde A eine Größe von 10 bp bis zu 287 bp aufweisen. Die DNA-Sonde A (40mer), die aus dem Oligonucleotid besteht, das 40 Basen der Basensequenz der Formel (3) aufweist, wird bevorzugt, da eine solche DNA-Sonde für eine Probe nach der Behandlung des DNA-Amplifikationsschritts des PCR-Verfahrens oder des in situ-Hybridisierungsverfahrens verwendet werden kann. Die Sonde A kann durch das Verfahren unter Verwendung eines Succinoimids (zum Beispiel Disuccinymidylsuberat); das Maleimid-Verfahren, das aktive Halogenverfahren, eine Photoreaktion unter Verwendung eines Azids, oder das Carbodümidverfahren hergestellt werden.
Die Basensequenz der Formel (4) schließt die 40 Basen von der 148. Base bis zur 187. Base stromabwärts des 5'-Endes der a'-Sequenz ein. Eine DNA-Sonde, die ein Oligonucleotid enthält, das mindestens 10 Basen der Basensequenz der Formel (4) aufweist (nachstehend wahlweise als Sonde B bezeichnet), ist für die a-Sequenz der HSV II-DNA spezifisch. Die Länge der Sonde B variiert mit der Art der Vorbehandlung der Probe. Wenn die Probe durch den DNA-Amplifikationsschritt des PCR-Verfahrens behandelt wird, kann die Sonde eine Länge von 10 bp bis zur Größe des DNA-Fragments (ausgenommen den Primerteil), die durch das PCR-Verfahren amplifiziert wird, aufweisen. Außerdem, wenn die Probe nicht durch den DNA-Amplifikationsschritt des PCR-Verfahrens behandelt wird und die Sonde B für das in situ-Hybridisierungsverfahren verwendet wird, kann die Länge der Sonde B eine Größe von 10 bp bis zu 185 bp aufweisen. Die DNA-Sonde B (40mer), die aus dem Oligonucleotid besteht, das 40 Basen der Basensequenz der Formel (4) aufweist, wird bevorzugt, da eine solche DNA-Sonde für eine Probe nach der Behandlung des DNA- Amplifikationsschritts des PCR-Verfahrens oder des in situ-Hybridisierungsverfahren verwendet werden kann. Die Sonde B kann durch dieselben Verfahren hergestellt werden, wie die vorstehend zur Herstellung der Probe A erwähnten.
Jegliche bekannte Substanzen können zur Markierung der Sonden A und B verwendet werden. Vorzugsweise wird eine nicht-radioaktive Substanz (ein Enzym, Fluoreszenzfarbstoff, lumineszierender Stoff, Biotin, etc.) verwendet. Für die Synthese der markierten DNA werden hauptsächlich die folgenden zwei Verfahren angewendet:
(1) das Verfahren zur Herstellung einer markierten DNA direkt im Verlauf der Synthese einer DNA, und
(2) das Verfahren unter Synthese einer DNA mit gebundenen Linkem, dann Isolieren der DNA und Anbringen einer Markierung daran.
Das Verfahren (2) wird besonders bevorzugt, da die Art der Markierungen abhängig von der Verwendung in einfacher Weise verändert werden kann, und folglich ist das Verfahren (2) im Hinblick auf die Anwendung überlegen. Als beim Verfahren (2) verwendete Linker können 5'-Dimethoxytolyl-5-[N-(trifluoracetylaminohexyl)-3-acrylimid]-2'-desoxyuridin-3'-[(2- cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl]]phosphoamidid, etc. erwähnt werden. Jedes herkömmliche bekannte Verfahren kann zur Erzeugung eines SignaL ausgehend von der an die Sonde gebundene Markierung und zur Messung des Signals angewendet werden.
Wenn die Kombination der Primer (1a) und (2a) in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, wird der 243 bp große Basenteil, der einem Teil des BamHTB-Fragment-Gens entspricht, in spezifischer Weise, in sehr großen Mengen und in einem kurzen Zeitraum nur amplifiziert und synthetisiert, wenn die HSV I-DNA in der Probe vorliegt. Außerdem, wenn die Kombination der Primer (1b) und (2b) verwendet wird, wird der 213 bp große Basenteil, der einem Teil des a'-Sequenz-Gens entspricht, in spezifischer Weise, in sehr großen Mengen und in einem kurzen Zeitraum nur amplifiziert und synthetisiert, wenn die HSV II-DNA in der Probe vorliegt. Daher ist es möglich, einen Nachweis durchzuführen, der für das in der Probe vorliegende HSV I-Virus und/oder HSV II-Virus äußerst spezifisch ist. Außerdem wird die DNA amplifiziert und synthetisiert, auch wenn die HSV I-DNA oder die HSV II-DNA in einer Probe in einer geringen Menge vorliegt, und so ist die Empfindlichkeit hoch.
Ferner wird erfindungsgemäß eine markierte 'DNA-Sonde, die für die HSV I-DNA oder die HSV II-DNA (die in einigen Fällen amplifiziert wurde) spezifisch ist, verwendet, und daher ist es möglich, die HSV I-DNA oder die HSV VII-DNA äußerst genau nachzuweisen. Außerdem, wenn eine Kombination des Amplifikationsschritts unter Verwendung der ersten und zweiten Primer und des Nachweisschritts unter Verwendung der vorstehend erwähnten Sonden verwendet wird, beträgt der zum Nachweis erforderliche Zeitraum etwa 4 bis 5 Stunden im Fall einer Ethidiumbromid-Färbung und etwa 48 bis 50 Stunden selbst im Fall des Southern-Blot-Hybridisierungsverfahrens, und so können die Ergebnisse schnell erhalten werden.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, aber sie ist nicht darauf begrenzt.

Beispiel 1: Herstellung der Primer und Sonden

Ein Primer (1α), der 20 Basen der Sequenz der Formel (1a) aufweist, wurde durch Verbinden einer Adenin-CPG-Säule mit einem automatischen DNA-Synthesegerät des Modells 381A (Applied Biosystems) synthetisiert, ein Primer (2a), der 20 Basen der Sequenz der Formel (2a) aufweist, wurde durch Verbinden einer Thymin-CPG-Säule mit demselben Gerät synthetisiert, und ein Primer (113), der 20 Basen der Sequenz der Formel (1b) aufweist, und ein Primer (2ß), der 20 Basen der Sequenz der Formel (2b) aufweist, wurden durch Verbinden einer Guanin-CPG-Säule mit demselben Gerät synthetisiert. Eine Einmalspritze (2,5 ml), enthaltend 2,5 ml Ammoniaklösung (etwa 30%), wurde mit der CPG-Säule verbunden, in der der Syntheseschritt beendet wurde. Die Ammoniaklösung wurde in die Säule injiziert, und die synthetisierten DNA-Fragmente wurden eluiert. Das die gewonnene DNA- Ammoniak-Lösung enthaltende Fläschchen wurde luftdicht verschlossen und bei 65ºC für 6 Stunden erhitzt und dann auf Raumtemperatur gekühlt, und dann wurde die Lösung eingeengt. Das Konzentrat wurde gefriergetrocknet und in 10 mM Triethylammoniumacetat (nachstehend als TEA-A abgekürzt) (pH 7,4) gelöst, und dann wurde der Niederschlag entfernt. Eine Trennsäule (YMC-Pack ODS-AM313: YMC) wurde mit einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographiegerät vom Typ L-6200 (Hitachi) (nachstehend als HPLC bezeichnet) verbunden, dann wurde die Reinigung unter Verwendung eines Konzentrationsgradienten von Acetonitril und 5% Acetonitril enthaltendem 95 mM TEA-A ausgeführt, und die Hauptpeaks wurden gesammelt. Zu dem so erhaltenen Rückstand wurde 80%ige Essigsäure (eingestellt mit Acetonitril) zugegeben, um den Rückstand zu suspendieren, dann ließ man die Suspension bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen und trocknete sie unter vermindertem Druck. Das getrocknete Produkt wurde in 10 mM TEA-A gelöst, mit Diethylether extrahiert und unter vermindertem Druck getrocknet. Die getrocknete DNA-Probe wurde in TEA-A gelöst, und der Niederschlag wurde entfernt. Eine zweite Reinigung wurde durch eine HPLC ausgeführt, und die Hauptpeaks wurden gesammelt. Die so erhaltenen gereinigten DNA-Primer wurden für die Lagerung unter vermindertem Druck getrocknet und für die Beispiele 2 und 3 verwendet.
Durch das gleiche Verfahren, wie vorstehend erwähnt, wurden eine Sonde a, die 40 Basen der Sequenz der Formel (3) aufweist, und eine Sonde b, die 40 Basen der Sequenz der Formel (4) aufweist, synthetisiert. Für die Synthese der Sonde a wurde eine Cytosin-CPG- Säule verwendet, und für die Synthese der Sonde b wurde eine Guanin-CPG-Säule verwendet.

Beispiel 2: Herstellung von markierten Sonden (Oligo-Mlarkierung)

Die in Beispiel 1 hergestellten Sonden a und b wurden mit ³²P (unter Verwendung eines Oligo-Markierungskits von Pharmacia) Oligo-markiert. Zu 4 ul einer wäßrigen Lösung, enthaltend 100 ng der Sonden-DNA, wurden 58 ul Wasser zugegeben. Das Ganze wurde für 10 Minuten bei 100ºC erhitzt und dann sofort mit Eis gekühlt. Zu der eisgekühlten Sondenlösung wurden 20 ul Desoxynucleotidtriphosphatgemisch, 4 ul Rinderserumalbumin, 4 ul Klenow-Enzym und 1 ul α-³²P-dCTP (300 Cl) zugegeben, dann ließ man das Ganze bei Raumtemperatur 2 Stunden stehen. Dann wurden 40 ul der Reaktionsterminatorlösung, 40 ul Träger-RNA (10 mg/ml) und 360 ul Wasser zugegeben. Zu der verdünnten Reaktionslösung wurden 0,1 Volumenteile 4 M Natriumchlorid und 2 Volumenteile Ethylalkohol zugegeben, dann ließ man das Ganze bei -70ºC für 15 Minuten stehen, um die DNA zu fällen, und dann wurde das Ganze bei 15.000 UpM zentrifugiert. Der so erhaltene Niederschlag wurde in 30 ul einer 10 mM Trishydrochlorid-Pufferlösung, enthaltend 1 mM EDTA, gelöst, dann wurden 16 ul 7,5 M Ammoniumacetat und 92 ul Ethylalkohol zugegeben, und man ließ das Ganze bei -70ºC für 15 Minuten stehen, dann wurde das Gemisch zentrifugiert. Zu dem so erhaltenen Niederschlag wurden 200 ul 75%iger Ethylalkohol zugegeben, dann wurde das Ganze wiederum zentrifugiert, und der so erhaltene Niederschlag wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden luftgetrocknet. Die so erhaltene markierte Sonde wurde in 200 ul einer 10 mM Trishydrochlorid-Pufferlösung, enthaltend 1 mM EDTA, gelöst. Die resultierende Lösung mit der markierten Sonde wurde in einer Menge von etwa 10 ul für einen einzelnen Dot-Blot verwendet.

Beispiel 3: Herstellung einer markierten Sonde (Endmarkierung)

Eine mit ³²P endmarkierte Sonde wurde durch das folgende Verfahren hergestellt:
zu 1 ul einer Lösung, enthaltend 500 ng der in Beispiel 1 hergestellten Sonden-DNA, wurden 2,5 ul einer 10x Kinase-Pufferlösung, 1,5 ul (15 Einheiten) T4-Polynucleotidkinase und 20 ul (200 Cl) 'γ-³²P-dATP zugegeben, dann hielt man das Gemisch für 45 Minuten bei 37ºC. Nach Zugabe von 400 ul einer Lösung (1 mM EDTA-1 mM Trishydrochlorid-Pufferlösung, enthaltend 140 ul Triethylamin in 100 ml 0,1 Tris-HCl; pH 7, 7; nachstehend als Lösung A bezeichnet) zu der Reaktionslösung wurde das Ganze über eine Umkehrphasen-Ionenaustauschsäule (NEN SORB 20-Säule: Du Pont) geleitet, die mit 2 ml Methylalkohol und 2 ml der Lösung A gewaschen geworden war. Nach Waschen der Säule mit 3 ml der Lösung A und 3 ml Wasser wurde die markierte Sonde dann mit 1 ml einer wäßrigen 20%igen Ethylalkohollösung eluiert. Die markierte Sonde wurde in der ersten S00 ul-Fraktion eluiert. Für eine einzelne Hybridisierung wurden 50 ul des Eluents verwendet.

Beispiel 4: Extraktion von HSV-DNA

In diesem Beispiel wurden WTS1-3-4 [ein aus einem Patienten mit Herpeskeratitis isolierter Stamm: Acta Virol. 23 (1979), 226-230] als Standardstamm von HSV I, UW268 als Standardstamm von HSV II und jeweils fünf Stämme für Typ I und Typ II von klinisch isolierten Stämmen (isoliert aus Herpes-ähnlichen Stellen von mit HSV infizierten Patienten) als HSV-Wildstämme, für die festgestellt worden war, daß es sich um diese Typen handelt, verwendet.
Jedes Virus wurde angepaßt, so daß es CV-1-Zellen, die aus der Niere von Afrikanischen Grünen Meerkatzen stammen, in einer Konzentration von 1 pfu/Zelle infiziert. Die mit Viren infizierten Zellen wurde in einer Gasphase von 5% Kohlendioxid und 9S% Luft gezüchtet. Die Zellen, die Effekte einer Zellmodifikation zeigten, wurden verwendet, um die Virus-DNAs durch das Saccharoseverfahren (Virology 93 (1979), 260-264) zu extrahieren.

Beispiel 5: Amplifikation von HSV-DNA durch das PCR-Verfahren

Mengen von zehn (10) ng einer jeden der in Beispiel 4 extrahierten DNAs der HSV I- und II-Standardstämme und der HSV-Wildstämme, für die festgestellt worden war, daß es sich um diese Typen handelt, wurden zu 100 ul einer PCR-Reaktionslösung, enthaltend 125 uM dATP, 125 uM dCTP, 125 uM dTTP, 31,25 uM dGTP, 93,75 uM Desaza-C&sup7;-GTP (nachstehend als dC&sup7;dGTP abgekürzt), 0,01% Gelatine, 20 mM Trishydrochlorid-Pufferlösung (pH 8,8), 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 10% Dimethylsulfoxid, 2 uM Primer und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (AmpliTaq-DNA-Polymerase: Cetus), zugegeben. Für die Probe unter Verwendung des HSV I-Primers wurde das PCR-Verfahren ausgeführt, um die DNA durch 30maliges Wiederholen des Zyklus, bestehend aus (i) 92ºC für 1 Minute, (ii) 60ºC für 1 Minute und (iii) 72ºC für 2 Minuten und schließlich einer Behandlung bei 72ºC für 5 Minuten, zu amplifizieren. Für die Probe unter Verwendung des HSV II-Primers wurde das PCR-Verfahren ausgeführt, um die DNA durch 30maliges Wiederholen des Zyklus, bestehend aus (i) 93ºC für 1 Minute, (ii) 65ºC für 1 Minute und (iii) 73ºC für 1 Minute und schließlich einer Behandlung bei 73ºC für 5 Minuten, zu amplifizieren.

Beispiel 6: Untersuchung und Diagnose des PCR-Produkts durch Elektrophorese

Das Elektrophoresegel wurde durch Lösen von 4% Agarosegel in 1 Liter einer Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend S. 4 g Trishydrochlorid, 2,75 g Borsäure und 2 ml 0,5 M EDTA (nachstehend als 0,5x TBE bezeichnet), und Gießen in eine Gelplatte von Mupid (Advance) hergestellt. Dann wurden 2 ul einer 15%igen wäßrigen Lösung von Ficoll Typ 400 (Pharmacia) mit 10 ul der Lösung nach der PCR-Reaktion gemischt, und das Gemisch wurde in Probenvertiefungen eingebracht. Nach Einbringen von 1 x TBE in einen Elektrodenbehälter wurde die Elektrophorese bei Raumtemperatur und 100 V für 2 Stunden ausgeführt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Agarosegel mit Ethidiumbromid gefärbt, und die Ergebnisse der Elektrophorese wurden unter Beleuchtung mit einer UV-Lichtquelle betrachtet. Die Ergebnisse für den Fall, wo der HS VI-Primer verwendet wurde, sind in Fig. 1 gezeigt, und die Ergebnisse für den Fall, wo der HSV II-Primer verwendet wurde, sind in Fig. 2 gezeigt. In den Fig. 1 und 2 haben die Kennziffern die folgenden Bedeutungen:
M: DNA-Marker
1: HSV I-Standardstamm (WT51-3-4)
2-6: HSV I-Wildstämme
7: HSV II-Standardstamm (UW268)
8-12: HSV II-Wildstämme
Als DNA-Marker (φ · 174-HaeIII-Spaltprodukt) wurden diejenigen verwendet, die bei 72 bp, 118 bp, 194 bp, 234 bp, 271 bp, 281 bp, 310 bp, 603 bp, 872 bp, 1078 bp und 1357 bp von unten aus gesehen erschienen. Aus den Fig. 1 und 2 wird offensichtlich, daß das PCR-Verfahren, bei dem die erfindungsgemäßen Primer verwendet werden, es möglich macht, die einzelnen DNA-Teile zu amplifizieren, welche für die gewünschten HSV'en spezifisch sind.
Wie mit der Ethidiumbromid-Färbung von Fig. 2 gezeigt wurde, werden mehrere Banden bei HSV I und HSV II beim PCR-Verfahren, bei dem die HSV II-Primer verwendet werden, beobachtet. Da sich die amplifizierten Teile bei HSV I und HSV II voneinander unterscheiden, ist es möglich, HSV I und HSV II durch einen Vergleich mit den Standardstämmen davon zu bestimmen. Außerdem wurde zur Bestätigung des Vorstehenden eine Southern-Hybridisierung unter Verwendung der in Beispiel 3 hergestellten, endmarkierten Sonden a und b ausgeführt. Und zwar wurde eine Autoradiographie nach Hybridisierung mit jeder Sonde und den Southern-Blot-Verfahren auf der DNA-Hybridisierungsmembran (Gene Screen Plus: Du Pont) von dem Agarosegel nach der Elektrophorese erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Die Bahnen 1 und 3 von Fig. 3 stellen den HSV I-Standardstamm (WT51-3-4) dar, und die Bahnen 2 und 4 stellen den HSV II-Standardstamm (UW268) dar. Außerdem wurde die endmarkierte Sonde a für die Bahnen 1 und 2 von Fig. 3 verwendet, während die endmarkierte Sonde b für die Bahnen 3 und 4 verwendet wurde. Aus Fig. 3 wird offensichtlich, daß nur die Banden, die mit den HSV II-Primern als Matrize amplifiziert wurden, mit der Sonde b zur Bestimmung von HSV II hybridisierten, während die Banden, die mit den HSV I-Primern als Matrize amplifiziert wurden, mit der Sonde b zur Bestimmung von HSV II nicht hybridisierten. Wie aus den vorstehenden Ergebnissen ersichtlich ist, ist es möglich, zu bestimmen und zu diagnostizieren, ob das die HSV-Infektion hervorrufende Virus das HSV I oder HSV II ist, indem die DNA in den Patientenproben durch die erfindungsgemäßen Primer amplifiziert und die amplifizierte DNA mit den erfindungsgemäßen Sonden untersucht wird.

Beispiel 7: Bestimmung von HSV-Typen einer Blasenlösung durch das Dot-Blot-Verfahren

Ein Bläschen (5 ul), das von Patienten entnommen wurde, die im Verdacht stehen, eine Herpesinfektion zu haben, wurde in 2 ml einer physiologischen Salzlösung zur Verdünnung suspendiert. Zu 200 ul der verdünnten Probe wurde die gleiche Menge an 0,5 N NaOH zugegeben, und man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur für 10 Minuten stehen. Die so erhaltene, behandelte Probe (50 ul), enthaltend die modifizierte DNA, wurde in eine Blot- Vorrichtung mit einem Gene Screen Plus NEF976-Film (Du Pont) eingebracht und bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehengelassen, dann wurde die Flüssigkeit durch Absaugen entfernt. Der Gene Screen Plus NEF976-Film mit der geblotteten DNA wurde in einen Plastikbeutel gelegt, dann wurden 5 ml einer Hybridisierungslösung, enthaltend eine Zusammensetzung aus 0,2% Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht 40.000), 0,2% Ficoll (Molekulargewicht 40.000), 0,2% Rinderserumalbumin, 0,05 M Trishydrochlorid-Pufferlösung (PH 7,5), 1 M Natriumchlorid, 0,1% Natriumphosphat, 1% Natriumlaurylsulfat, 10% Dextrannatriumsulfat (Molekulargewicht 500.000) und modifizierte Lachssperma-DNA (100 ug/ml) zugegeben, und der Beutel wurde luftdicht versiegelt. Das Ganze ließ man bei 65ºC für 6 Stunden stehen, dann wurden die in Beispiel 2 (Oligo-Markierung) hergestellten 32Pmarkierten und HSV bestimmenden Sonden zugegeben, anschließend ließ man das Ganze bei 65ºC weitere 6 Stunden stehen. Der behandelte Gene Screen Plus NEF976-Film wurde zweimal bei Raumtemperatur unter Bewegen für 5 Minuten in 2x SSC (pH 7,0), enthaltend eine große Menge von 0,3 M Natriumchlorid und 0,034 lvi Trinatriumcitrat, dann zweimal bei 65ºC für 15 Minuten in 2x SSC und 1% SDS und außerdem zweimal bei Raumtemperatur unter Bewegen für 5 Minuten in 0,1 x SSC gewaschen. Der gewaschene Film wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde luftgetrocknet.
Der Gene Screen Plus NEF976-Film, welcher der Hybridisierungsbehandlung mit den HSV-Typ-Bestimmungssonden unterzogen worden war, wurde in eine Belichtungskassette gelegt und darin fixiert. Dann wurde der Film (Kodak-X-OMAT-AR XARS) bei -70ºC belichtet und entwickelt. Die Ergebnisse sind in higur 4 gezeigt. In Fig. 4 stellen die Nrn. 1 bis 5 Patientenproben dar, Nr. 6 ist ein HSV I-Standardstamm und Nr. 7 ist ein HSV II-Standardstamm. Die Bemerkungen auf der rechten Seite der Figur entsprechen den Ergebnissen der Bestimmung. Wie aus Fig. 4 ersichtLich ist, hybridisiert die Sonde a mit dem HSV I-Virus und hybridisiert die Sonde b mit dem 115 V II-Virus.

Beispiel 8: Typ-Bestimmung von HSV in einem Bläschen

(I) Das in Beispiel 7 verwendete Bläschen (5 ul) wurde in 2 ml einer physiologischen Salzlösung suspendiert. Zu 50 ul der verdünnten Probe wurden 50 ul 6 M Guanidinisocyanat und 10 ul Glasmehl zugegeben, und man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur stehen. Nach 10 Minuten wurde das Gemisch bei 15.000 UpM 2 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Zu dem Niederschlag wurden I ml einer 10 mM Tris- Hydrochlorid-Pufferlösung (pH 7,4), enthaltend 50% Ethylalkohol, 1 mM EDTA und 50 mM Natriumchlorid, zugesetzt, um eine Suspension herzustellen. Die Suspension wurde geschüttelt, dann weiterhin bei 15.000 UpM 2 Minuten zentrifugiert. Das Waschen des Glasmehls durch Zentrifugation wurde dreimal wiederholt. Zu dem gewaschenen Glasmehl wurden 50 ul destilliertes Wasser zugegeben, um eine Suspension herzustellen, dann ließ man die Suspension bei 55ºC für 15 Minuten stehen. Anschließend wurde die Suspension bei 15.000 UpM 2 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde als DNA-Extraktlösung für den DNA-Amplifikationsprozeß durch das PCR-Verfahren verwendet. Der DNA-Amplifikationsprozeß wurde durch das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren ausgeführt, und die Typ- Bestimmung des PCR-Reaktionsprodukts wurde durch das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren ausgeführt.

(2) Als Kontrolltest wurde das herkömmliche Fluoreszenz-Antikörper-Verfahren

ausgeführt. Und zwar wurden erkrankte Bereiche mit einem kleinen Baumwolltupfer abgerieben, und die so erhaltene Substanz wurde in zwei Punkten auf einen nicht-fluoreszierenden Objektträger aufgetragen. Man ließ den Objektträger auf natürliche Weise trocknen und immobilisierte die Proben mit Aceton bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann wurden die immobilisierten Proben bei Raumtemperatur für etwa 30 Minuten mit einem fluoreszenzmarkierten anti-HSV I-Antikörper (Syva) oder anti-HSV II-Antikörper (Syva) umgesetzt. Der Objektträger wurde gespült, dann in Glycerin eingebettet und unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
(3) Ferner wurde als Kontrolltest das herkömmliche klinische Diagnoseverfahren (bei dem ein Arzt die Diagnose durch Betrachten der erkrankten Bereiche und Läsionen stellt) ausgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1
Die vorstehende Tabelle 1 zeigt, daß, was die 18 Bläschenlösungen betrifft, gemäß dem klinischen Untersuchungsverfahren drei Proben als HSV I und drei Proben als HSV II identifiziert wurden, und 12 Proben konnten nicht bestimmt werden (es war nicht möglich, sie endgültig als Typ I oder Typ II zu diagnostizieren). Durch das Fluoreszenz-Antikörper- Verfahren wurden sieben Proben als HSV I identifiziert, eine Probe wurde als HSV II identifiziert, acht Proben konnten nicht untersucht werden (die erkrankten Zellen waren nicht zur Aufnahme in der Lage) und zwei Proben konnten nicht bestimmt werden. Andererseits wurden durch die erfindungsgemäße Dot-Blot-Hybridisierungs-DNA-Untersuchung 12 Proben als HSV I identifiziert und sechs Proben wurden als HSV II identifiziert. Es gab keine Proben, die nicht untersucht oder nicht hinsichtlich der Typen bestimmt werden konnten.

Beispiel 9: Typ-Bestimmung von HSV eines Rachenabstrichs

Durch Ausführung des in Beispiel 8 (I) beschriebenen Verfahrens wurde DNA aus dem Rachenabstrich von Patienten, die im Verdacht stehen, an einer Herpesinfektion zu leiden, extrahiert. Die extrahierte DNA wurde zur Typ-Bestimmung von HSV durch das Dot- Blot-Verfahren, wie in Beispiel 7 beschrieben, und das PCR-Verfahren, wie in Beispiel 8 (I) beschrieben, verwendet. Für die 36 untersuchten Rachenabstriche zeigte das Dot-Blot-Verfahren, daß 10 Proben HSV I waren, von 10 Proben konnte der Typ nicht bestimmt werden und 16 Proben waren negativ. Das erfindungsgemäße PCR-Verfahren zeigte jedoch ein großes Typ-Bestimmungsvermögen, wobei 32 Proben als HSV I und die restlichen vier als negativ identifiziert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Die vorliegende Erfindung wurde vorstehend unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen erläutert, aber für den Fachmann ersichtliche Modifikationen und Verbesserungen sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.

Anwendbarkeit in der Industrie

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt Primer, die zur Amplifikation von DNA- Fragmenten, die für HS VI-DNA oder HS V II-DNA spezifisch sind, verwendet werden können, und auch Sonden, die für HSV I-DNA oder HSV II-DNA spezifisch sind, sowie Oligonucleotide, die Basensequenzen mit einer Größe in einem Ausmaß aufweisen, die chemisch synthetisiert werden kann, und die ferner hinsichtlich der Typ-Spezifität nicht abgeschwächt sind, bereit. Daher ist es möglich, eine HSV VI- oder HSV II-Infektion in einer Typ-spezifischen Weise mit hoher Genauigkeit zu bestimmen, und es ist auch möglich, von diesen Ergebnissen bei der Diagnose und Behandlung Gebrauch zu machen.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Herpes simplex-Virus in einer wäßrigen, flüssigen Probe, umfassend die aufeinanderfolgenden Schritte:

(I) Amplifikation von DNA in einem Gemisch, enthaltend die wäßrige, flüssige Probe, eine DNA-Polymerase und eine Kombination von Primern, wobei die Kombination von Primern umfaßt:

(a) eine erste Kombination eines ersten BamHIB-Oligonucleotidprimers, welcher mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Nucleotidsequenz (1a):

CACGGGTATA AGGACATCCA (1a)

enthält, mit einem zweiten BamIIIB-Oligonucleotideprimer, welcher mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Nucleotidsequenz (2a):

GGGTCCTCGT CCAGATCGCT (2a)

enthält, für die Amplifikation eines Fragments des BamHIB-DNA- Fragments vom Herpes simplex-Virus Typ I;

(b) eine zweite Kombination eines ersten a'-Oligonucleotidprimers, der mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Nucleotidsequenz (1b):

GCCTCTTTTC CCCCGGGGAG (1b)

enthält, mit einem zweiten a'-Oligonucleotidprimer, der mindestens 15 aufeinanderfolgende Basen der Nucleotidsequenz (2b):

GGGAAAAAAG CCGCGCCGGGCi (2b)

enthält, für die Amplifikation eines Fragments des a'-DNA-Fragments vom Herpes simplex-Virus Typ II; oder

(c) beide Kombinationen, die erste Kombination (a) und die zweite Kombination (b);

(II) Nachweis und Analyse der amplifizierten DNA von Schritt (I).

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oligonucleotidprimer 15mer bis 30mer sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Kombination der Primer verwendet wird und der erste BamHIB-Primer ein 20mer bis 25mer ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das BamHIB-DNA-Fragment vom Herpes simplex-Virus Typ I amplifiziert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei in der ersten Kombination von Primern der erste BamHIB-Primer die Nucleotidsequenz (1a) hat.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die erste Kombination von Primern verwendet wird und wobei der zweite BamHIB-Primer ein 20mer bis 25mer ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der zweite BamHIB-Primer die Nucleotidsequenz (2a) hat.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die zweite Kombination von Primern verwendet wird und wobei der erste a'-Primer ein 20mer bis 25mer ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 7 oder 8, wobei die a'-DNA-Sequenz vom Herpes simplex-Virus Typ II amplifiziert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei in der zweiten Kombination von Primern der erste a'-Primer die Nucleotidsequenz (1b) hat.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei in der zweiten Kombination von Primern der zweite a'-Primer ein 20mer bis 25mer ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei in der zweiten Kombination von Primern der zweite a'-Primer die Nucleotidsequenz (2b) hat.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, ferner umfassend die Schritte:

(i) Denaturierung doppelsträngiger DNA, um einzelsträngige DNA zu erhalten,

(ii) Anlagerung der einzelsträngigen DNA von Schritt (i) mit einem ersten und zweiten Primer, und

(iii) Verlängerung der angelagerten DNA von Schritt (ii) unter Verwendung einer DNA-Polymerase.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die in Schritt (II) amplifizierte DNA mittels Gelelektrophorese, Ethidiumbronild-Färbung, Southern-Hybridisierung, Didesoxysequenzierung oder radioaktiver Markierung analysiert wird.

15. Verfahren für den Typus-spezifischen Nachweis von Herpes simplex Virus, umfassend:

(i) Inkontaktbringen einer Probe mit einer Oligonucleotidsonde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einer BamHIB-Oligonucleotidsonde, die für einen Bereich des BamHIB-DNA-Fragments vom Herpes simplex-Virus Typ I spezifisch ist, wobei die Sonde eine Nucleotidsequenz aufweist, die mindestens 10 aufeinanderfolgende Basen der Sequenz (3):

CCCCGATTCG GGCCCGGTCG CTCGCTACCG GTGCGCCACC (3)

beinhaltet, und die dazu eine Markierung trägt,

(b) eine a'-Oligonucleotidsonde, die für einen Bereich der a'-DNA-Sequenz vom Herpes simplex-Virus Typ II spezifisch ist, wobei die a'-Sonde eine Nucleotidsequenz aufweist, die mindestens 10 aufeinanderfolgende Basen der Sequenz (4):

CCCCGCGGGC GCCGCCCCTC CCCCCGCGCG CCGCGGGCTG (4)

beinhaltet, und dazu eine Markierung; trägt, und

(c) Kombinationen davon; und

(ii) Nachweis eines Signals von der Markierung.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Schritt (II) ferner das Typusspezifische Nachweisverfahren von Anspruch 15 umfaßt.