DE3875667T2

DE3875667T2 - Menschliche papillomavirusnukleinsaeureproben.

Info

Publication number: DE3875667T2
Application number: DE8888401964T
Authority: DE
Inventors: Alex Bollen; Alfredo Cravador; Albert Herzog; Sophie Houard
Original assignee: La Region Wallonne
Current assignee: La Region Wallonne
Priority date: 1987-07-31
Filing date: 1988-07-28
Publication date: 1993-03-18
Anticipated expiration: 2008-07-29
Also published as: EP0301968A1; FR2629458A2; JPH1057099A; FR2629458B2; US4983728A; JPH01128800A; GR3006284T3; CA1340881C; JP2812678B2; DE3875667D1; ES2052758T3; EP0301968B1

Description

Das technische Anwendungsgebiet der vorliegenden Erfindung ist dasjenige der Sonden, die bestehen aus markierten Einzelstrang-DNA- oder RNA-Nucleinsäuresequenzen.
Derartige Sonden sind in dem Stand der Technik bereits bekannt und sie können auf verschiedenen Wegen erhalten werden, insbesondere durch eine genetische Verfahrenstechnik oder durch direkte manuelle oder automatische Synthese.
Diese Nucleinsäuren-Sequenzen haben die Eigenschaft, daß sie sich paarweise zusammenlegen und mit den komplementären Sequenzen der DNA, für den Fall, daß sie vorher denaturiert worden ist, wenn diese anfänglich zweisträngig war, oder der mRNA Hybride bilden. Diese Denaturierung kann nach der Inkubation in einem stark ionischen Medium und bei erhöhter Temperatur oder in einem basischen Medium ablaufen. Diese Hybride sind anschließend nachweisbar.
Der Nachweis der Hybride kann nach verschiedenen Verfahren erfolgen. Die Sonde kann markiert werden nach einem der für die Markierung von Nucleinsäuren-Sonden bekannten Verfahren. Es kann sich dabei um eine radioaktive Markierung, beispielsweise mit Phosphor 32, oder auch im Falle einer kalten Sonde um eine nicht-radioaktive Markierung, beispielsweise um eine enzymatische Markierung, wie sie ebenfalls bereits bekannt ist, handeln. In bestimmten Fällen wird die Sonde bei ihrer genannten Verwendung nicht markiert, sondern chemisch modifiziert, um nach der Hybridisierung markiert werden zu können, beispielsweise mit Biotin.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Nucleinsäuren-Sonden, die den Nachweis von verschiedenen Typen des Human-Papillom-Virus durch Hybridisierung mit der DNA des Virus erlauben. Es handelt sich dabei insbesondere um acht Typen des Human-Papillom-Virus (HPV), deren gesamte DNA-Sequenzen bisher bekannt sind, d. h. um die Typen HPV1a, HPV5, HPV6b, HPV8, HPV11, HPV16, HPV18 und HPV33.
10 % der Frauen sind von dem HPV-Virus infiziert; der Virus ist lokalisiert in den Cervical-Zellen und führt in einer bestimmten Anzahl von Fällen zu dysplastischen und/oder malignen Schädigungen des Gebärmutterhalses. Unter den zahlreichen Typen des HPV-Virus scheinen die Typen HPV16 und HPV18 am häufigsten mit diesen Schädigungen in Verbindung zu stehen.
Die HPV-Viren sind charakterisiert durch ein Genom mit einer kreisförmigen Doppelstrang-DNA einer Länge von etwa 8000 Basenpaaren, das in einer Proteinhülle mit einem Durchmesser von 60 nm eingehüllt ist. Das Virus kommt in den nicht-malignen Schädigungen im nicht-integrierten Episom-Stadium vor. In diesen Fällen beobachtet man eine Störung der Zelldifferenzierung und die Bildung von Virenteilchen in den späteren Stadien der Differenzierung. Wenn das Uterincarcinom sich gebildet hat, stellt man eine variable Integration bestimmter viraler DNA-Sequenzen in die Zell-DNA fest.
Der Nachweis der HPV-Viren in dem Gebärmutterhals erfolgte bisher durch Verwendung von Molekül-Sonden, die aus klonierten und isotop markierten Viren-DNA-Fragmenten bestanden.
Im Rahmen von epidemiologischen und diagnostischen Routine-Untersuchungen von Infektionen durch HPV wäre es vorteilhaft, ein schnelles, einfaches, spezifisches und empfindliches Verfahren auf der Basis der Verwendung von Sonden mit synthetischer DNA zu entwickeln, die auf nichtisotope Weise markiert sind und in situ verwendbar sind. Zu diesem Zweck wurden im Bereich der DNA spezifische Bereiche verschiedener Typen des HPV-Virus identifiziert, um daraus komplementäre homologe synthetische Sonden abzuleiten. Die Nucleotid-Sequenzen von HPV1, HPV5, HPV6, HPV11, HPV16, HPV18 und HPV33 sind bekannt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Sonden vorzuschlagen, die charakteristisch sind für die Gesamtheit der unterschiedlichen Typen des HPV-Virus, insbesondere der obengenannten, die wirksam sind, d. h. Sonden vorzuschlagen, welche die längst möglichen Nucleinsäuren-Sequenzen aufweisen und allen verschiedenen Typen des HPV- Virus gemeinsam sind.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Sonden vorzuschlagen, die spezifisch sind für jeden der verschiedenen Typen des HPV-Virus und die eine stabile Paarung gewährleisten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Nucleinsäuren-Sonde, die verwendbar ist, um in gleicher Weise (reaktionslos) die verschiedenen Typen des Human-Papillom-Virus, insbesondere HPV1a, HPV5, HPV6b, HPV8, HPV11, HPV16, HPV18 und HPV33 nachzuweisen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie umfaßt das Oligomer der Formel
X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X
oder sein Komplement, wobei man austauscht A und X einerseits, C und G andererseits für den Fall, daß die Ziel- DNA des Virus anfänglich zweisträngig war und vor dem Nachweis denaturiert worden ist, mit X = T oder U für den Fall, daß man die mRNA nachweist.
A, T, C, G, U stellen die Nucleotide dar, die den Basen Adenin Thymin, Cytosin, Guanin bzw. Uracil entsprechen.
Die Sequenz T-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-T
ist die einzige, die sich insbesondere in der DNA jedes der acht HPV-Virus-Typen unter den Sequenzen mit einer Länge von mindestens 10 Basen wiederfindet.
Diese Sequenz entspricht den Sequenzen, die in den verschiedenen Virus-Typen auf dem codierenden ersten Strang angeordnet sind in den folgenden Positionen des ersten Nucleotids:
für HPV 1a: Position 1029 bis 1040
für HPV 5 : Position 1190 bis 1201
für HPV 6b: Position 1076 bis 1087
für HPV 8 : Position 1174 bis 1185
für HPV 11: Position 1076 bis 1087
für HPV 16: Position 1121 bis 1132
für HPV 18: Position 1167 bis 1178
für HPV 33: Position 1132 bis 1143
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem eine Nucleinsäuren-Sonde, die den verschiedenen HPV-Virus- Typen gemeinsam ist, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie umfaßt ein Gemisch von 6 Oligomeren, die jeweils die gemeinsame Sequenz von 12 Nucleotiden, wie sie vorstehend angegeben sind, aufweist, die stromaufwärts wie stromabwärts verlängert ist durch die Nucleotide, die den acht HPV-Virus-Typen entsprechen. Diese Verlängerungen bestehen aus Nucleotiden, die sich mit den Nucleotiden paaren, welche die den acht HPV-Virus-Typen gemeinsame Sequenz
T-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-T
unmittelbar umgeben. Unter diesen Oligomeren sind vier jeweils einem anderen Virus-Typ zugeordnet, das fünfte ist den Viren 6b und 11 gemeinsam und ein weiteres ist den Viren 5 und 8 gemeinsam.
So kann man beispielsweise die gemeinsame Sequenz von 12 Nucleotiden für jeden Virus-Typ beiderseits um 1 bis 10 der entsprechenden Nucleotide verlängern.
Durch Verlängerung bis auf 6 oder 7 Nucleotide beiderseits der gemeinsamen Sequenz erhält man die folgenden sechs Oligomeren oder ihre Komplemente: für HPV
Diese Oligomeren entsprechen für jeden HPV-Virus-Typ den DNA-Zielsequenzen der Viren in den folgenden Positionen:
für HPV1a: Position 1023 bis 1047
für HPV5 : Position 1183 bis 1207
für HPV6b: Position 1070 bis 1093
für HPV8 : Position 1167 bis 1191
für HPV11: Position 1070 bis 1093
für HPV16: Position 1115 bis 1138
für HPV18: Position 1161 bis 1184
für HPV33: Position 1126 bis 1149
Eine Verlängerung um 4 Basen auf jeder Seite der gemeinsamen Sequenz ergibt nur Sequenzen, die Semihybridisierungs-Temperaturen in der Größenordnung von 50 bis 52ºC ergeben. Wenn man dagegen von sechs Basen sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts ausgeht, die den genauen Sequenzen entsprechen, die in den Viren vorhanden sind, erhält man Semihybridisierungs-Temperaturen in der Größenordnung von 60 bis 70ºC.
Für die Zielsequenz von HPV1a (in der Position 1023) hat somit die Sonde eine vorhersehbare Semihybridisierungs-Temperatur von 60ºC,
für HPV5 (Position 1183) T = 62ºC
für HPV6b (Position 1070) T = 64ºC
für HPV8 (Position 1167) T = 62ºC
für HPV11 (Position 1070) T = 64ºC
für HPV16 (Position 1115) T = 64ºC
für HPV18 (Position 1161) T = 62ºC
für HPV33 (Position 1126) T = 70ºC
Diese allen bekannten Human-Papillom-Viren gemeinsamen Oligonucleotid-Sonden erlauben die schnelle Diagnose von Erkrankungen, die auf das Papillom-Virus zurückzuführen sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem eine Reihe von acht Nucleinsäuren-Sonden, die jeweils spezifisch sind für einen Typ des Human-Papillom- Virus gegenüber den anderen Typen, d. h. den folgenden Oligomeren oder ihren Komplementen: für HPV das Oligomer
Man kann auch die komplementären Oligomeren verwenden, wenn die nachzuweisende DNA ursprünglich doppelsträngig war und denaturiert wurde, damit sie sich hybridisieren kann, oder für den Fall, daß man die mRNA nachweist.
Das für HPV1a selektive Oligomer umfaßt 21 Monomere, wobei diese Sequenz der Position 1052 bis 1092 der DNA des Virus entspricht und eine Semihybridisierungstemperatur von 72ºC aufweist.
Das für HPV5 selektive Oligomer umfaßt 22 Monomere, wobei diese Sequenz der Position 1801 bis 1822 der DNA des Virus entspricht und eine Semihybridisierungstemperatur von 68ºC aufweist.
Das für HPV6b selektive Oligomer umfaßt 22 Monomere, wobei diese Sequenz der Position 4761 bis 4782 der DNA des Virus entspricht und eine Semihybridisierungstemperatur von 70ºC aufweist.
Das für HPV8 selektive Oligomer umfaßt 21 Monomere, wobei diese Sequenz der Position 3344 bis 3364 der DNA des Virus entspricht und eine Semihybridisierungstemperatur von 72ºC aufweist.
Das für HPV11 selektive Oligomer umfaßt 20 Monomere, wobei diese Sequenz der Position 3416 bis 3435 der DNA des Virus entspricht und eine Semihybridisierungstemperatur von 72ºC aufweist.
Das für HPV16 selektive Oligomer umfaßt 20 Monomere, wobei diese Sequenz der Position 695 bis 714 der DNA des Virus entspricht und eine Semihybridisierungstemperatur von 64ºC aufweist.
Das für HPV18 selektive Oligomer umfaßt 21 Monomere, wobei diese Sequenz der Position 3448 bis 3468 der DNA des Virus entspricht und eine Semihybridisierungstemperatur von 64ºC aufweist.
Das für HPV33 selektive Oligomer umfaßt 22 Monomere, wobei diese Sequenz der Position 4474 bis 4495 der DNA des Virus entspricht und eine Semihybridisierungstemperatur von 68ºC aufweist.
Die Zweckbestimmung dieser zweiten Reihe von Sonden, die für den einen oder den anderen der acht Human-Papillom-Viren spezifisch sind, besteht darin, daß sie als selektive Elemente für Diagnosetests für durch diese Viren hervorgerufene Infektionen verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem eine zweite Reihe von 8 Nucleinsäuren-Sonden der Einzelstrang-DNA oder RNA, die jeweils spezifisch sind für einen Human-Papillom-Virus-Typ gegenüber den anderen Typen. Es handelt sich dabei um alternative selektive Sonden gegenüber den weiter oben beschriebenen Sonden.
Diese Sonden umfassen eine Sequenz von markierten Nucleinsäuren, welche die folgenden Oligomeren umfaßt: für HPV
Die obigen Sequenzen entsprechen den Sequenzen der direkten oder codierenden Faser oder Stranges der DNA des Virus und sie können sich mit der zweisträngigen DNA oder mit der inversen Faser hybridisieren, wenn die DNA denaturiert wurde.
Man kann aber auch umgekehrt-komplementäre Oligomere verwenden durch Austausch von A und X einerseits und von C und G andererseits. Diese umgekehrt-komplementären Oligomeren sind insbesondere verwendbar als Sonden zur Hybridisierung mit der Messenger-RNA des Virus.
Es sei daran erinnert, daß in den obigen Sequenzen A, T, C, G und U die Nucleotide darstellen, die den Basen Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin bzw. Uracil entsprechen und daß X T oder U darstellt.
Das für HPV1a selektive Oligomer umfaßt 22 Monomere. Das erste Nucleotid dieser Sequenz entspricht der Position 3448 des codierenden Stranges der DNA des Virus. Die Sequenz endet in der Position 3469. Diese Sequenz entspricht einer Position, die in dem Gen E3 des Virus HPV1a liegt und sie weist eine Semihybridisierungstemperatur von 72ºC auf.
Das für HPV5 selektive Oligomer umfaßt 23 Monomere. Diese Sequenz entspricht der Position 1800-1822 der DNA des Virus, die in dem Gen E1 liegt und eine Semihybridisierungstemperatur von 70ºC aufweist.
Das für HPV6b selektive Oligomer umfaßt 22 Monomere. Diese Sequenz entspricht der Position 4755-4776 der DNA des Virus, die in dem Gen L2 liegt und eine Semihybridisierungstemperatur von 70 ºC aufweist.
Das für HPV8 selektive Oligomer umfaßt 20 Monomere. Diese Sequenz entspricht der Position 1208-1227 der DNA des Virus, die in dem Gen E1 liegt und eine Semihybridisierungstemperatur von 70ºC aufweist.
Das für HPV11 selektive Oligomer umfaßt 23 Monomere. Diese Sequenz entspricht der Position 4637-4659 der DNA des Virus, die in dem Gen L2 liegt und eine Semihybridisierungstemperatur von 70ºC aufweist.
Das für HPV16 selektive erste Oligomer umfaßt 24 Monomere. Diese Sequenz entspricht der Position 609-632 der DNA des Virus, die in dem Gen E7 liegt und eine Semihybridisierungstemperatur von 70ºC aufweist.
Für das Virus HPV16 wurde eine zweite spezifische Sonde aus 24 Monomeren bestimmt, die in dem Gen E7 liegt, die frei von allen Basen T oder U ist, sie ist lokalisiert in der Position 690-713.
Das für HPV18 selektive Oiigomer umfaßt 22 Monomere. Diese Sequenz entspricht der Position 5486-5507 der DNA des Virus, die in dem Gen L2 liegt und eine Semihybridisierungstemperatur von 72ºC aufweist.
Das für HPV33 selektive Oligomer umfaßt 23 Monomere. Diese Sequenz entspricht der Position 4475-4497 der DNA des Virus, die in dem Gen L2 liegt und eine Semihybridisierungstemperatur von 70ºC aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine andere Reihe von Sonden, die spezifisch sind für jeden der HPV-Virus-Typen gegenüber anderen Typen des Virus. Diese Sonden weisen eine Länge von 35 Monomeren auf. Es handelt sich dabei um die obengenannten spezifischen Sonden, die stromaufwärts und stromabwärts entsprechend den markierten Analogie-Zonen verlängert sind. Diese Oligomeren entsprechen ebenfalls dem codierenden Strang (Faser) der DNA des Virus. Die Erfindung betrifft auch die komplementären Sequenzen, die sich insbesondere mit der Messenger-RNA hybridisieren können.
Diese neuen spezifischen Sonden bestehen aus markierten Nucleinsäure-Sequenzen, welche die folgenden Oligomeren umfassen:
für HPV1a: XGXCCCXXCXGCGCGAGACGXXGGAAGXAXACACA.
Diese Sequenz entspricht der Position 3449 bis 3482 des codierenden Stranges der DNA des Virus und sie liegt in dem Gen E3.
Für HPV5: XGXAXGGGAXCGGGGCCGXXXACCCAXGGACCAXA.
Diese Sequenz entspricht der Position 1801-1835 der DNA des Virus, sie liegt in dem Gen E1.
Für HPV6b: GCAAXCAXXAACGCAGGGGCGCCXGAAAXXGXGCC.
Diese Sequenz entspricht der Position 4756-4790 der DNA des Virus und liegt in dem Gen L2.
Für HPV8: GCACCXCAGXCCGCGGCXCCAGXCAAXAXCACXGX.
Diese Sequenz entspricht der Position 1208-1242 des DNA-Virus und liegt in dem Gen E1.
Für HPV11: XAXAXACCCXXCGGAACCXCXCCCAAGCCXGCXAX.
Diese Sequenz entspricht der Position 4624-4658 der DNA des Virus und liegt in dem Gen L2.
Für HPV16: XGXXAGAXXXGCAACCAGAGACAACXGAXCXCXAC.
Diese Sequenz entspricht der Position 596-630 der DNA des Virus und liegt in dem Gen E7.
Für HPV18: CCCAXXCXAXCACCCACGGCCCCXGCCXCXACACA.
Diese Sequenz entspricht der Position 5486-5520 der DNA des Virus und liegt in dem Gen L2.
Für HPV33: XCCXCCGGXXACXGXAGACACXGXXGGACCXXXAG.
Diese Sequenz entspricht der Position 4476 10 der DNA des Virus und liegt in dem Gen L2.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem weitere Nucleinsäuren-Sonden, die spezifisch sind für jeden der Human-Papillom-Virus-Typen, die jedoch immer in dem Bereich E7 des Genoms jedes dieser Viren liegen.
Das Gen E7 des Genoms jedes dieser HPV-Viren ist nämlich am meisten betroffen in der integrierten Form dieser Viren in der DNA der malignen Zellen.
Diese dritte Reihe von spezifischen Sonden umfaßt Oligonucleotide einer solchen Länge, daß sie eine Semihybridisierungstemperatur von 70ºC aufweisen. Es handelt sich dabei um die folgenden Oligomeren oder ihre Komplemente: Virus Oligomer Länge Position Gen HPV
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine neue Reihe von Nucleinsäuren-Sonden, die spezifisch sind für den Bereich E7 jedes der HPV-Virus-Typen in bezug auf die anderen Virus-Typen, wobei diese Sonden Oligonucleotide einer Länge von 35 Monomeren, d. h. die folgenden Oligomeren oder ihre Komplemente umfassen: Virus Oligomer Position HPV
Diese Reihen von Sonden entsprechen wie die obengenannten der codierenden Faser (Strang) der DNA des Virus und ihre Komplemente entsprechen der inversen Faser, die sich insbesondere mit der Messenger-RNA hybridisieren können. Die angegebenen Positionen entsprechen dem direkten Strang wie bei den obengenannten Sonden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Sonden, die es erlauben, zu unterscheiden zwischen den HPV-Viren, die verantwortlich sind für Tumore der Haut, insbesondere der Schleimhäute, die Anogenital-Krebse oder Krebse der Oral-, Nasal- und Paranasal-Wege hervorrufen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Sonden, die spezifisch sind für die Virus-Untergruppe, die besteht aus HPV16, HPV18 und HPV33, die Schleimhaut-Tumore hervorrufen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die folgende Sequenz umfassen:
XXAGGCACAXAXXXX
oder sein Komplement.
Diese Sequenz ist den Viren HPV16, HPV18 und HPV33 gemeinsam und findet sich nicht in den anderen Typen des HPV-Virus.
Sie liegt in den folgenden Positionen (Numerierung in bezug auf die codierende Faser (Strang)): Virus Position Gen HPV stromabwärts
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Sonden, die spezifisch sind für die Untergruppen-Viren HPV16, HPV18, die Schleimhaut-Tumore hervorrufen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die folgende Sequenz aufweisen:
AXAXCAAAXAXXAGXGAAGX
oder ihr Komplement.
Diese Sequenz ist den Viren HPV16 und HPV18 gemeinsam und findet sich nicht in irgendeinem der anderen Typen des HPV-Virus.
Sie liegt in den folgenden Positionen (die Numerierung ist bezogen auf die codierende Faser): Virus Position Gen HPV
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich eine Sonde, die spezifisch ist für die Virus-Untergruppe, die besteht aus HPV5 und HPV8, die Haut-Tumore hervorrufen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein Fragment mit einer Länge von 56 Basen aufweist, dessen Sequenz, definiert in bezug auf den codierenden Strang, die folgende ist:
CAAACAACAGXXGCXGACAAXAXXXXAAAAXAXGGCAGXGCXGGXGXAXXX XXXGG
Sie befindet sich in den folgenden Positionen (die Numerierung ist bezogen auf die codierende Faser) Virus Position Gen HPV
Im Innern dieses Fragments kann man kürzere Sequenzen auswählen, die Semihybridisierungstemperaturen in der Größenordnung von 70ºC aufweisen. Unter diesen verschiedenen Möglichkeiten ist die Sonde zu nennen, welche die folgende Sequenz umfaßt
XAXGGCAGXGCXGGXGXAXXXXXXG
oder ihr Komplement.
Diese Sequenz entspricht den Positionen 4480-4504 von HPV5 und 4413-4437 von HPV8 (numeriert in bezug auf die codierende Faser).
Die ausgewählten Sonden, die jeder der Untergruppen des HPV-Virus gemeinsam sind, erlauben die Identifizierung jeder der Untergruppen und erlauben es aufgrund ihrer Selektivität, sie voneinander zu unterscheiden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem eine Nucleinsäuren-Sonde, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie nach einem der Verfahren markiert ist, die bekannt sind für die Markierung von DNA- oder RNA-Sonden, ausgewählt insbesondere unter den radioaktiven Markierungen, beispielsweise mit ³²P, und den enzymatischen Markierungen, beispielsweise mit Biotin, sowie ein Verfahren zum Nachweisen (Bestimmen) eines HPV-Virus-Typs oder einer Untergruppe des HPV-Virus mittels einer erfindungsgemäßen Sonde, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Sonde mit einer DNA- oder RNA-Sequenz der genannten HPV-Viren hybridisiert, wobei diese gegebenenfalls vorher denaturiert wird, wenn sie anfänglich zweisträngig war.
Weitere Vorteile und Charakteristiken der vorliegenden Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor, in der Bezug genommen wird auf die beiliegenden Zeichnungen. Es zeigen:
Fig. 1 ein Gel, das der selektiven Hybridisierung der erfindungsgemäßen synthetischen HPV-Sonden mit den DNA der HPV-Viren entspricht:
1. radioaktive DNA-Fragmente Lambda EcoRI-HindIII-Größenstandards
2. DNA des Virus HPV6b, digeriert mit BamHI
3. DNA des Virus HPV11, digeriert mit BamHI
4. DNA des Virus HPV16, digeriert mit BamHI
5. DNA des Virus HPV18, digeriert mit EcoRI
A. Sonde Spezifisch für HPV6b
B. Sonde spezifisch für HPV11
C. Sonde spezifisch für HPV16
D. Sonde spezifisch für HPV18;
Fig. 2 ein Gel, das der Hybridisierung der genomischen DNA mit spezifischen erfindungsgemäßen HPV-Sonden entspricht:
1. Lambda EcoRi-HindIII - radioaktive Größenstandards,
2. nichts,
3. genomische Human-DNA (10 ug), digeriert mit EcoRI,
4. nichts
5. DNA des HPV-Virus (6b, 11, 16 oder 18), hybridisiert mit der für HPV (6b, 11, 16 oder 18) spezifischen Sonde;
Fig. 3 ein Gel, das der Hybridisierung der HPV-Klone mit den allen Virus-Typen gemeinsamen Sonden entspricht;
Fig. 4 die selektive Hybridisierung der synthetischen, für HPV Spezifischen Sonden mit der DNA der HPV-Viren.
a: DNA des Virus HPV6b, digeriert mit BamHI
b: DNA des Virus HPV11, digeriert mit BamHI
c: DNA des Virus HPV16, digeriert mit BamHI
d: DNA des Virus HPV18, digeriert mit EcoRI
A: Sonde spezifisch für HPV6b
B: Sonde spezifisch für HPV11
C: Sonde spezifisch für HPV16
D: Sonde spezifisch für HPV18;
Fig. 5 die selektive Hybridisierung der auf den Bereich E7 des Genoms von HPV gerichteten Synthetischem Sonden mit den DNA der HPV-Viren.
a: DNA des Virus HPV6b, digeriert mit BamHI
b: DNA des Virus HPV11, digeriert mit BamHI
c: DNA des Virus HPV16, digeriert mit BamHI
d: DNA des Virus HPV18, digeriert mit EcoRI
A: Sonde spezifisch für HPV6b
B: Sonde spezifisch für HPV11
C: Sonde Spezifisch für HPV16
D: Sonde Spezifisch für HPV18;
I: radioaktive DNA-Fragmente Lambda EcoRI-HindIII-Größenstandards.

Beispiel 1

Bestimmung der allen bekannten Human-Papillom-Viren gemeinsamen Oligonucleotidsonden

Zur Herstellung einer Sonde, welche die schnelle Diagnose der durch Papillom-Viren hervorgerufenen Erkrankungen erlaubt, wurden die längsten Sequenzen gesucht, die allen Viren gemeinsam sind, deren Sequenz bis heute bekannt ist, d. h. bis heute der Sequenzen der folgenden Viren:
HPV1a, HPV5, HPV6b, HPV8, HPV11, HPV16, HPV18 und HPV33.
Im Hinblick auf die vorgesehenen Arbeiten wurde spezifisch ein FORTRAN-Programm entwickelt, da die üblichen Algorithmen für den Umgang mit mehreren derart ausgedehnten Sequenzen ungeeignet waren. Das Programm untersucht jede der Sequenzen, die ihm unterbreitet werden, mittels aller möglichen Blöcke, die aus der ersten derselben extrahiert werden, wobei diese Blöcke nacheinander alle Werte einer Basenlänge zwischen 20 und 10 annehmen. Im Verlaufe dieser Untersuchung zeigt das Programm das Vorkommen von integral zuammenhängenden Blöcken innerhalb der Gesamtheit der Sequenzen an, die ihm unterbreitet werden.
Die gefundene längste gemeinsame Sequenz, d. h. das Fragment aus 12 Basen (T-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-T) befindet sich in den verschiedenen Sequenzen in den folgenden Positionen:
HPV1a 1029
HPV5 1190
HPV6b 1076
HPV8 1174
HPV11 1076
HPV16 1121
HPV18 1167
HPV33 1132
Da zwölf Basen ein zu kurzes Fragment darstellen, um unter bestimmten Versuchsbedingungen leicht geeignet zu sein, wurde diese Sequenz stromaufwärts und stromabwärts verlängert.
Eine Verlängerung um vier Basen auf jeder Seite liefert nur Sequenzen, die Semihybridisierungstemperaturen in der Größenordnung von 50 bis 52ºC ergeben. Es wurde daher eine Verlängerung um sechs oder sieben Basen stromaufwärts und stromabwärts vorgenommen, jedesmal um die genauen Sequenzen, die in den Viren vorhanden waren, wobei das Folgende erhalten wurde: Ziel-Sequenz Position Temperatur HPV
Bestimmte dieser Sonden können etwas verkürzt werden und diejenige, die für HPV8 spezifisch ist, kann auch gegebenenfalls verlängert werden zur Erzielung quasi identischer Semidenaturierungstemperaturen.
Es sei darauf hingewiesen, daß die für HPV6b und HPV11 erhaltenen Sequenzen identisch sind, desgleichen für HPV5 und HPV8. Das Gemisch von Oligonucleotiden umfaßt somit nur sechs verschiedene Moleküle.
Das Gemisch aus diesen sechs Oligonucleotiden erlaubt die Erzielung eines sehr charakteristischen Hybridisierungssignals für jedes System, das die DNA eines der Human-Papillom-Viren umfaßt.

Beispiel 2

Bestimmung von Sonden, die spezifisch sind für jeden der bekannten HPV-Typen (erste Reihe von Sonden)

Die Arbeit bestand in der Suche nach Oligonucleotid- Sonden einer Länge in der Nähe von 20 Basen, die so ausgewählt werden, daß sie jeweils spezifisch sind für das eine oder andere der acht Human-Papillom-Viren, deren vollständige Sequenzen heute bekannt sind. Ihre Zweckbestimmung ist ihre Verwendung als selektive Elemente für Diagnosetests für durch diese Viren hervorgerufene Infektionen.
Zu diesem Zweck wurde ein spezifisches Rechenprogramm (Software) entwickelt, das FORTRAN-Programme umfaßt und dazu bestimmt ist, mehrere große Sequenzen miteinander zu vergleichen, um die am wenigsten erhaltenen Bereiche nachzuweisen (zu bestimmen). Dieses Programm funktioniert wie ein progressiver Filter, der in jedem seiner aufeinanderfolgenden Operationen die Bereiche einer Sequenz markiert, die sich genau wiederfinden in jeder der betrachteten anderen Sequenzen. Nach jedem Durchgang wird die Länge der untersuchten Homologie um eine Einheit verkürzt zwischen dem Anfangswert von 25 und einem Endwert von 8.
Jede der Versionen der Bezugssequenz, die bei jedem der aufeinanderfolgenden Durchgänge mit einer der Zielsequenzen markiert worden ist, wird getrennt gespeichert. Ein zweites Programm bestimmt dann unter den verschiedenen markierten Sequenzen die nicht-markierten Bereiche und dies für jede der aufeinanderfolgenden Stufen der Filtrierung. Am Ende erhält man eine Liste der potentiell verwendbaren Bereiche. Die Auswahl unter diesen Bereichen wird getroffen aufgrund einer Überprüfung der Umgebung des Bereiches bei den vorhergehenden Durchgängen durch den Filter in der Weise, daß das ausgewählte Oligomer ein Minimum an Homologien mit den DNA-Sequenzen der anderen Viren aufweist.
Man gelangt so beispielsweise zu der folgenden ersten Reihe von Oligomeren, von denen jedes als Funktion des Virus, für den es selektiv ist, bezeichnet wird: Virus Oligomer Länge (Basen) Position Temperatur HPV
Jede der oben vorgeschlagenen Sonden wird anschließend mit jeder der HPV-Sequenzen verglichen unter Anwendung der Algorithmie von Sellers und Goad, welche die "mismatches"¹ und die "gaps"² zählt bzw. numeriert. Die Ergebnisse dieser Behandlung zeigen, daß die ausgewählten Sonden niemals mehr als 75% Homologien mit den nicht-homologen Sequenzen aufweisen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben.
In jedem Falle sind darin enthalten: - die Anzahl der paarungsfähigen Basen, - die Anzahl der "mismatches" - die Anzahl der "gaps"
¹ "mismatch": Basen-Paarung, die ungeeignet ist für die Bildung von Wasserstoffbindungen; diese Paarung trägt somit nicht zur Stabilisierung des hybridisierten Bereiches bei und hat im Gegenteil häufig eine destabilisierende Wirkung.
² "gap": bei der versuchten Paarung von zwei Nucleinsäure-Bereichen kann es vorkommen, daß zur Maximierung der Gesamtstabilität des hybridisierten Bereiches es erforderlich ist, in einer der Sequenzen eine oder mehrere nicht-gepaarte Basen vorzusehen; diese Art von "Sprung" ergibt allgemein einen negativen Beitrag zur Gesamtstabilität de Hybrids. Tabelle I Zielsequenz HPV Sonde für
* weniger als 8 paarungsfähige Basen
Alle Situationen garantieren sehr spezifische Hybridisierungen ohne die Gefahr von Fehlsignalen oder störendem Hintergrundrauschen.

Beispiel 3

Hybridisierung der HPV-Sonden mit der DNA der verschiedenen Viren

Die Genome von HPV6b, 11, 16 und 18 wurden kloniert in pBR322 erhalten. Wenn man die Klone 6b, 11, 16 mit BamHI digeriert und den Klon 18 mit EcoRI digeriert, trennt man das Genom des Virus (etwa 8 kb) von pBR322 ab.

a) Amplifikation der Klone

Die Anwesenheit der HPV-Genome in den Klonen wurde durch Restriktion bestätigt. Die Klone wurden anschließend amplifiziert und die DNA wurde an einem Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt.

b) Trennung der DNA der HPV-Viren auf Agarose-Gel

2 ug jeder DNA wurden digeriert entweder mit BamHI für die Klone 6b, 11 und 16 oder mit EcoRI für den Klon 18. Die 2 ug jeder DNA wurden auf die Umgebung und parallel auf vier 0,8%ige Agarose-Gele (500 ng DNA/Klon/Gel) in der Nähe eines Größenmarkers, der radioaktiv markiert war (Lambda HindIII-EcoRI), verteilt. Nach 3-stündiger Wanderung bei 80 Volt in 1 XTBE (90 mM Tris, 2,5 mM EDTA, 90 mM Borsäure, pH 8) wurden die Gele denaturiert (0,5 M NaOH, 0,5 M Nacl) für 30 min, mit Wasser gespült und dann neutralisiert (1,5 M Nacl, 0,5 M Tris HCl, pH 8) innerhalb von 30 min bei Umgebungstemperatur. Die Gele wurden anschließend auf Whatman-Papier 3 MM gelegt, mit einem Saranwrap bedeckt und unter Vakuum 1 h lang bei Umgebungstemperatur und 1 h lang bei 60ºC getrocknet.

c) Markierung der Spezifischen HPV-Sonden mit ³²P

Es wurden synthetische Oligomere synthetisiert, die charakteristisch sind für die HPV-Typen 6b, 11, 16 und 18. Größe Temperatur HPV
Diese Sequenzen sind komplementär zu der nicht-codierenden Faser(Strang) der HPV-Viren.
Die vier Oligomeren wurden durch Kinase-Behandlung (Kination) nach dem folgenden Verfahren mit ³²P markiert: 1 ug jedes Oligomers wurde in einem Endvolumen von 30 ul mit 30 uCi Gamma ³²P ATP (3000 Ci/mMol), 5 Einheiten T4- Polynucleotid-Kinase, 67 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM Mgcl&sub2;, 10 mM Dithiothreit gemischt und 45 min lang bei 37ºC inkubiert. Die markierten Oligomeren wurden durch Chromatographie an Sephadex® G50 von den freien Nucleotiden abgetrennt. Die erhaltene Spezifische Aktivität stieg auf 65.10&sup6; cpm/ug des an der Reaktion beteiligten Oligomers.

d) Hybridisierung auf einem Gel mit den markierten Sonden

Die Agarose-Gele wurden von dem Whatman®-Papier abgelöst, indem man sie einige Minuten lang in Wasser eintauchte. Jedes Gel wurde mit einem der vier radioaktiv markierten Oligomeren hybridisiert in einem Volumen von 5 ml Hybridisierungsmischung, die enthielt 2.10&sup6; cpm/ml radioaktive Oligomere, 0,1% SDS, 100 ug/ml DNA von 10 min lang bei 100ºC denaturiertem Lachssamen , 5 · SSPE (0,9 M NaCl, 5 mM NaH&sub2;PO&sub4;, EDTA pH 8). Die Inkubation wurde in versiegelten Kunststoffbeuteln und in einem bei 60ºC gerührten Bad 14 h lang durchgeführt.

e) Waschen und Exponieren (Belichten)

Die Gele wurden zweimal 15 min und dann 1 h bei Umgebungstemperatur, 10 min bei 60ºC und schließlich 1 h bei Umgebungstemperatur gewaschen in 6·SSC (0,9 M NaCl, 90 mM Trinatriumcitrat, pH 7). Nach dem Abscheiden auf einem Blatt Whatman®-Papier und nach dem Abdecken mit Saranwrap wurden die Gele zwischen zwei Verstärkungsschirmen bei -70ºC 14 h lang exponiert (belichtet) (Film Kodak® X- OmatS).

f) Ergebnisse

Vier gleiche Proben eines Gels, enthaltend die DNA der Klone HPV6b, 11, 16 und 18, wurden jeweils mit einem der vier Oligomeren hybridisiert. Man sieht, daß auf dem Gel A nur HPV6b von der Sonde 6b erkannt wird; auf dem Gel B nur HPV11 von der Sonde 11 erkannt wird; auf dem Gel C nur HPV16 von der Sonde 16 erkannt wird und auf dem Gel D nur HPV18 von der Sonde 18 erkannt wird.
Daraus resultiert, daß jede Sonde ausschließlich den entsprechenden HPV-Typ erkennt unter Ausschluß der anderen HPV-Typen (Fig. 1).

Hybridisierung der HPV-Sonden auf genomischer Human-DNA

Darüber hinaus wurden auf vier Gele aufgebracht 4 · 10 ug genomische DNA, isoliert aus Lymphozyten, digeriert mit EcoRI, und 200 ng der DNA eines der vier HPV-Klone. Jedes Gel wurde hybridisiert mit der Sonde, die dem auf dem Gel vorhandenen HPV-Typ entsprach (positiver Vergleich) und wie weiter oben beschrieben gewaschen. Nach 70-stündiger Exposition wurde absolut keine Spur von unspezifischer Hybridisierung der vier getesteten Sonden-Typen auf der genomischen Human-DNA festgestellt (Fig. 2).

Beispiel 4

Hybridisierung der HPV-Klone mit den allen bekannten HPV- Typen gemeinsamen Sonden

a) Herstellung der Gele

Die Klone der HPV-Typen 6b, 11, 16 und 18 wurden mit BamHI oder EcoRI digeriert. 600 ng jedes Klons wurden parallel auf vier Gele und angrenzend an andere Klone und in der Nähe des radioaktiven Größenmarkers Lambda HindIII- EcoRI verteilt (150 ng DNA/Klon/Gel). Nach 3-stündiger Wanderung bei 80 Volt wurden die Gele denaturiert, neutralisiert und unter Vakuum getrocknet.
b) Kinase-Behandlung (Kination) der gemeinsamen Sonden (Markierung mit 32 P 1
Durch Informatik wurde die längste Sequenz bestimmt, die allen Virus-Typen gemeinsam ist, deren Sequenz bekannt ist. Diese gemeinsame Sequenz ist ein Fragment aus 12 Basen. Da dieses Fragment zu kurz war, wurden die Sonden um sechs Basen (sieben Basen für die Sonde 8) stromaufwärts und um sechs Basen stromabwärts dieses Fragments verlängert. Dabei handelt es sich um die folgenden Sequenzen: Sonde Größe Temperatur HPV
Diese Sonden sind komplementär zur codierenden Faser (Strang). Da die Sonden 6b und 11l vollkommen identisch sind, wurde nur eine der beiden synthetisiert (die Sonde 6b/11). Diese Sonden wurden durch Behandlung mit Kinase (Kination) wie vorstehend beschrieben mit ³²P markiert.

c) Hybridisierung der Gele

Jedes Gel wurde hybridisiert mit einem Sonden-Abschnitt in einem Volumen von 5 ml Hybridisierungsgemisch, enthaltend 0,1% SDS, 100 ug/ml DNA eines denaturierten Lachssamens, 5·SSPE in einem versiegelten Kunststoffbeutel bei 60ºC für einen Zeitraum von 15 h.
Das Hybridisierungsgemisch A enthielt 10&sup6; cpm/ml jeder der Sonden (1a, 6b/11, 8/5, 16, 18 und 33).
Das Gemisch B enthielt 10&sup6; cpm/ml jeder der Sonden mit Ausnahme der Sonde 6b/11.
Das Gemisch C enthielt 10&sup6; cpm/ml jeder der Sonden mit Ausnahme der Sonde 16.
Das Gemisch D enthielt 10&sup6; cpm/ml jeder der Sonden mit Ausnahme der Sonde 18.

d) Waschen und Exponieren

Die vier Gele wurden in 6XSSC 1 h lang bei Umgebungstemperatur, 10 min lang bei 60ºC und dann erneut 1 h lang bei Umgebungstemperatur gewaschen. Die Gele wurden zwischen zwei Verstärkungsschirmen 2 h lang bei -80ºC exponiert.

e) Ergebnisse (Fig. 3)

Hybridisierung der HPV-Klone mit den allen Virus-Typen gemeinsamen Sonden
1. lambda HindIII-EcoRI,
2. HPV6b BamHI,
3. HPV11 BamHI,
4. HPV16 BamHI,
5. HPV18 EcoRI
A. Hybridisierung mit der Gesamtheit der Sonden (1a, 6b, 11, 16, 18, 33),
B: Hybridisierung mit der Gesamtheit der Sonden mit Ausnahme der Sonde 6b/11,
C: Hybridisierung mit der Gesamtheit der Sonden mit Ausnahme der Sonde 16,
D: Hybridisierung mit der Gesamtheit der Sonden mit Ausnahme der Sonde 18.
Die Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die gemeinsamen Sonden sich mit der Gesamtheit der untersuchten Klone hybridisieren und daß die Versuchsbedingungen es sogar erlauben, zwischen den Klonen zu differenzieren aufgrund der Spezifität der Verlängerungsenden der gemeinsamen Sequenz.

Beispiel 5

Hybridisierung von spezifischen HPV-Sonden mit der DNA verschiedener Viren (zweite und dritte Reihe von Sonden)

Die Genome von HPV6b, 11, 16 und 128 wurden erhalten kloniert in pBR322. Wenn man die Klone 6b, 11, 16 mit BamHI und den Klon 18 mit EcoRI digeriert, trennt man das Genom des Virus (etwa 8 kb) von pBR322.

a) Amplifikation der Klone

Die Anwesenheit der HPV-Genome in den Klonen wurde durch Restriktion bestätigt. Die Klone wurden anschließend amplifiziert und die DNA wurde auf einem Cäsiumchlorid- Gradienten gereinigt.

b) Trennung der DNA der HPV-Viren auf Agarose-Gel

1,6 ug jeder DNA wurden entweder mit BamHI für die Klone 6b, 11 und 16 oder mit EcoRI für den Klon 18 digeriert. Die 1,6 g jeder DNA wurden angrenzend an und parallel auf acht 0,8%ige Agarose-Gele verteilt (200 ng DNA/Klon/Gel) in der Nähe eines radioaktiv markierten Größenmarkers (Lambda HindIII-EcoRI). Nach 3-stündiger Wanderung bei 80 Volt in IXTBE (90 mM Tris, 2,5 mM EDTA, 90 mM Borsäure, pH 8) wurden die Gele 30 min lang denaturiert (0,5 M NaOH, 1,5 M Nacl), mit Wasser gespült, dann neutralisiert (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris HCl pH 8) für 30 min bei Umgebungstemperatur. Die Gele wurden anschließend auf Whatman® 3MM-Papier abgeschieden, mit Saranwrap bedeckt und 1 h lang bei Umgebungstemperatur und 1 h lang bei 60ºC unter Vakuum getrocknet.

c) Markierung der spezifischen HPV-Sonden mit ³²P

Die synthetischen Oligomeren, die charakteristisch für die HPV-Typen 6b, 11, 16 und 18 sind, wurden synthetisiert.
Es handelt sich dabei um die zweite Reihe von spezifischen Sonden. Virus Oligomer Länge Position Gen Temp. HPV
Darüber hinaus wurde parallel dazu eine dritte Reihe von Sonden synthetisiert, die jeweils spezifisch sind für einen Typ des Human-Papillom-Virus, die jedoch in dem Bereich E7 des Genoms jedes dieser Vieren liegt. Reihe von E7-Sonden: Virus Oligomer Länge Position Gen Temp. HPV
In diesen beiden Reihen entsprechen die Sonden der inversen Fasern (Strang) der HPV-Typen, wobei die angegebenen Positionen auf der direkten Faser (Strang) lokalisiert (markiert) sind.
Die acht Oligomeren wurden durch Kinase-Behandlung (Kination) nach dem folgenden Verfahren mit ³²P markiert; 0,1 g jedes Oligomers wurde in einem Endvolumen von 30 ul gemischt mit 30 uCi Gamma ³²P ATP (3000 Ci/mMol), 5 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase, 67 mM Tris HCl pH 8, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit und 45 min lang bei 37ºC inkubiert. Die markierten Oligomeren wurden durch Chromatographie an Sephadex® G50 von den freien Nucleotiden getrennt. Die erhaltene spezifische Aktivität erhöht sich auf 5·10&sup8; cpm/ug des an der Reaktion beteiligten Oligomers.

d) Hybridisierung mit den markierten Sonden auf einem Gel

Die Agarose-Gele wurden von dem Whatman®-Papier abgelöst, indem man sie einige Minuten lang in Wasser eintauchte. Jedes Gel wurde hybridisiert mit einem der vier radioaktiv markierten Oligomeren in einem Volumen von 5 ml Hybridisierungsgemisch, enthaltend 2·10&sup6; cpm/ml radioaktive Oligomere, 0,1% SDS, 100 ug/m DNA eines 10 min lang bei 100ºC denaturierten Lachssames, 5 · SSPE (0,9 M NaCl, 50 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 5 mM EDTA pH 8). Die Inkubation wurde in versiegelten Plastikbeuteln und in einem gerührten Bad von 65ºC etwa 14 h lang durchgeführt.

e) Waschen und Exponieren

Die Gele wurden 2 · 15 min, dann 1 h bei Umgebungstemperatur, 10 min bei 65ºC und schließlich 1 h bei Umgebungstemperatur in 6XSSC (0,9 M Nacl, 90 mM Trinatriumcitrat, pH 7,0) gewaschen. Nach der Abscheidung auf einem Blatt Whatma -Papier und nach dem Bedecken mit Saranwrap wurden die Gele zwischen zwei Verstärkungsschirmen bei -70ºC 2 bis 14 h lang exponiert (Film Kodak®-Omats).

f) Ergebnisse

Zwei Reihen von vier identischen Gelen, enthaltend die DNA der HPV-Klone 6b, 11, 16 und 18, wurden jeweils mit einem der vier Oligomeren der beiden Spezifischen Sonden-Reihen hybridisiert man sieht, daß HPV6b nur erkannt wird von den Sonden 6b (Fig. 4A und 5A), daß HPV11 nur erkannt wird von den Sonden 11 (Fig. 4b und 5b), daß HPV16 nur erkannt wird von den Sonden 16 (Fig. 4C und 5C) und daß schließlich HPV18 nur erkannt wird von den Sonden 18 (Fig. 4D und 5D). Jede Sonde erkennt ausschließlich den entsprechenden HPV-Typ unter Ausschluß der anderen HPV-Typen.

Beispiel 6

Zur Erhöhung der Empfindlichkeit des Nachweises der durch HPV-Viren hervorgerufenen Infektionen wird die Methode der enzymatischen Amplifikation der DNA, in der wissenschaftlichen Literatur auf diesem Gebiet häufig als PCR (Polykettenreaktion) bezeichnet, auf die Amplifikation der DNA der HPV-Viren angewendet.
Diese Arbeitsweise dient der Erhöhung der Empfindlichkeit unter gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Spezifität des weiter oben in diesem Patent erläuterten Nachweises. Der Bereich der Viren-Genome, der für die Amplifikation ausgewählt wird, umfaßt infolgedessen die Basen-Sequenzen, die komplementär zu den Sonden sind, die bestimmt sind für den Nachweis des Gens E7 der verschiedenen Viren. Die Spezifität der Amplifikation wird durch die Definition der Sequenzen gewährleistet, welche die Polymerisation starten durch eine wärmebeständige Polymerase beiderseits der Zielsequenz der Sonden. Die Sequenzen jedes der Starter-Paare werden so ausgewählt, daß das Fragment des Gens des Virus, an das es sich richtet, spezifisch amplifiziert wird unter Ausschluß aller anderen. Außerdem wird die relative Position jedes der Starter in bezug auf sein Paar so ausgewählt, daß 'die Fragmente unterschiedlicher Größe für jede Viren-DNA amplifiziert werden und die schnelle und direkte Identifikation des Typs oder der Typen der Human-Papillom-Viren erlauben durch Abtrennung der amplifizierten Fragmente als Funktion ihrer Länge auf Elektrophorese-Gel. Ein ergänzendes Kriterium der Auswahl der Sequenzen der Starter trägt ihrer Zusammensetzung und ihrer Länge Rechnung, die eine spezifische Hybridisierung mit der komplementären Sequenz der zu amplifizierenden DAN bei optimalen Arbeitstemperaturen der wärmebeständigen Polymerasen erlauben müssen.
Die folgenden Sequenzen, die dazu bestimmt sind, als oligomere Starter für die enzymatischen Amplifikations-Reaktionen zu dienen, wurden definiert unter Berücksichtigung der obengenannten Kriterien. für HPV Position Länge des amplifizierten Fragments für HPV
Sequenz des Virus HPV1A: O. Danos, M. Katinka, M. Yaniv, (1982) EMBO J. 1, S. 231- 236
Unterlagen der Angaben EMBL: VO1116
Sequenz des Virus HPV5:
K. Zachow, R.S. Ostrow, A.J. Faras, (1987), Virology, 158, S. 251-254
Unterlagen der Angaben EMBL: M22961
Sequenz des Virus HPV6B:
E. Schwartz, M. Dürst, c. Demankowski, O. Latterman, R. Zech, E. Wolfsperger, S. Suhai, H. zur Hausen (1983) Nature 314, S. 2341-2348
Unterlagen der Angaben EMBL: X00203
Sequenz des Virus HPV8:
P.G. Fuchs, T. Iftner, J. Weninger, H. Pfister (1986) J. Virol. 58, S. 626-634
Unterlagen der Angaben EMBL: M12737
Sequenz des Virus HPV11: K. Dartman, E. Schwartz, L. Gissman, H. zur Hausen (1986) Virology 151, S. 124-130
Unterlagen der Angaben EMBL: M14119
Sequenz des Virus HPV16:
K. Seedorf, G. Krämmer, M. Dürst, S. Suhai, W.G. Röwekamp (1985) Virology, 145, S. 181-185
Unterlagen der Angaben EMBL: KO2718
Sequenz des Virus HPV18:
S.T. Cole, O. Danos (1987) J.Mol. Biol. 193, S. 599-608 Unterlagen der Angaben EMBL: X05015
Sequenz des Virus HPV33:
S.T. Cole, R.E. Streeck (1l986) J. Virol. 58, S. 991-995 Unterlagen der Angaben EMBL: M12732

Claims

1. Nucleinsäuren-Sonde für den reaktionslosen Nachweis verschiedener Typen des Human-Papillom-Virus, insbesondere von HPV1a, HPV5, HPV6b, HPV8, HPV11, HPV16, HPV18 und HPV33, die aus einer markierten Nucleinsäure-Sequenz besteht, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt ein Oligomer von zwölf Nucleotiden der Formel,

X-A-A-A-A-C-G-A-A-A-G-X,

worin X = T oder U, oder sein Komplement.

2. Gemisch von sechs Nucleinsäuren-Sonden, die unterschiedlichen Typen des HPV-Virus gemeinsam sind, das besteht aus einem Gemisch von sechs Oligomeren, die alle die gemeinsame Sequenz von zwölf Nucleotiden gemäß Anspruch 1 aufweisen, verlängert durch die entsprechenden Nucleotide für jeden Virus-Typ.

3. Gemisch von sechs Nucleinsäuren-Sonden nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die gemeinsame Sequenz von zwölf Nucleotiden für jeden der acht Virus-Typen beiderseits durch 1 bis 10 entsprechende Nucleotide verlängert ist.

4. Gemisch von Sonden nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt ein Gemisch der folgenden sechs Oligomeren oder ihrer Komplemente: für HPV

worin X = T oder U.

5. Nucleinsäuren-Sonde, die spezifisch ist für den Nachweis des Human-Papillom-Virus-Typs HPV1a, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt ein Oligomer, ausgewählt aus:

worin X = T oder U, und ihren Komplementen.

6. Nucleinsäuren-Sonde, die spezifisch ist für den Nachweis des Human-Papillom-Virus-Typs HPV5, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt ein Oligomer, ausgewählt aus:

worin X = T oder U, und ihren Komplementen.

7. Nucleinsäuren-Sonde, die spezifisch ist für den Nachweis des Human-Papillom-Virus-Typs HPV6b, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt ein Oligomer, ausgewählt aus:

worin X = T oder U, und ihren Komplementen.

8. Nucleinsäuren-Sonde, die spezifisch u ist für den Nachweis des Human-Papillom-Virus-Typs HPV8, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt ein Oligomer, ausgewählt aus:

worin X = T, oder U und ihren Komplementen.

9. Nucleinsäuren-Sonde, die spezifisch ist für den Nachweis des Human-Papillom-Virus-Typs HPV11, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt ein Oligomer, ausgewählt aus:

worin X = T oder U, und ihren Komplementen.

10. Nucleinsäuren-Sonde, die spezifisch ist für den Nachweis des Human-Papillom-Virus-Typs HPV16, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt ein Oligomer, ausgewählt aus:

worin X = T oder U, und ihren Komplementen.

11. Nucleinsäuren-Sonde, die spezifisch ist für den Nachweis des Human-Papillom-Virus-Typs HPV18, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt ein Oligomer, ausgewählt aus:

worin X = T oder U, und ihren Komplementen.

12. Nucleinsäuren-Sonde, die spezifisch ist für den Nachweis des Human-Papillom-Virus-Typs HPV33, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt ein Oligomer, ausgewählt aus:

worin X = T oder U, und ihren Komplementen.

13. Nucleinsäuren-Sonde, die spezifisch ist für die Untergruppe des HPV-Virus, bestehend aus HPV16, HPV18 und HPV33, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt das Oligomer

XXAGGCACAXAXXXX

worin X = T oder U, oder sein Komplement.

14. Nucleinsäuren-Sonde, die spezifisch ist für die Untergruppe des Virus, bestehend aus HPV16 und HPV18, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt das Oligomer

AXAXCAAAXAXXAGXGAAGX

worin X = T oder U, oder sein Komplement.

15. Nucleinsäuren-Sonde, die spezifisch ist für die Untergruppe des Virus, bestehend aus HPV5 und HPV8, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt das Oligomer

CAAACAACAGXXGCXGACAAXAXXXXAAAAXAXGGCAGXGCXGGXGXAXXX XXXGG worin X = T oder U, oder sein Komplement oder ein Fragment davon, das umfaßt zwischen 18 und 35 Oligomere, wie

XAXGGCAGXGCXGGXGXXXXXXXXG

worin X = T oder U, oder sein Komplement.

16. Nucleinsäuren-Sonde nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie markiert ist nach einem der für die Markierung der DNA- oder RNA-Sonden bekannten Verfahren, ausgewählt insbesondere aus den radioaktiven Markierungen wie ³²P und den enzymatischen Markierungen, wie Biotin.

17. Verfahren zum Nachweis eines Typs des HPV-Virus oder einer Untergruppe des HPV-Virus mit Hilfe einer Sonde nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die genannte Sonde mit einer DNA- oder RNA-Sequenz des genannten HPV-Virus hybridisiert, die gegebenenfalls vorher denaturiert worden ist, wenn sie anfänglich zweisträngig war.

18. Nachweisverfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Sonden, die zum Nachweis der E7- Gene verschiedener Viren bestimmt sind, die PCR-Amplifikations-Methode anwendet, bei der die durch die Sonden identifizierten Ziele vorher amplifiziert worden sind mittels der folgenden, sie inserierenden Oligonucleotid-Aktivatoren: für HPV Position Länge des amplifizierten Fragments für HPV