JPH01128800A - ヒトパピローマウイルスの核酸プローブ - Google Patents

ヒトパピローマウイルスの核酸プローブ

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JPH01128800A
JPH01128800A JP63191968A JP19196888A JPH01128800A JP H01128800 A JPH01128800 A JP H01128800A JP 63191968 A JP63191968 A JP 63191968A JP 19196888 A JP19196888 A JP 19196888A JP H01128800 A JPH01128800 A JP H01128800A
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probe
hpv
acid probe
oligomer
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JP63191968A
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Albert Herzog
アルバート　ヘルツ
Alfredo Cravador
アルフレッド　クラバドール
Sophie Houard
ソフィー　ハワード
Alex Bollen
アレックス　ボレン
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Ire Celltarg SA
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の技術分野は、標識化された一本領ＤＮＡ又はＲ
ＮＡ核酸配列からなるプローブの分野である。
そのようなプローブは当業者に周知であり、様々な経路
、特に遺伝子工学又はマニュアルもしくはオートマチッ
ク直接合成によって得ることができる。
これらの核酸配列は相補的ＤＮＡ配列と適合してハイブ
リッドを形成する性質を有しているが、後者は最初に二
重カテナリー（ｂｉｃａｔｅｎａｒｙ）又はｍＲＮＡの
とき場合により予め変性されている。
この変性は高イオン強度の媒体中高温で又は塩基性媒体
中でインキュヘート後に行なうことができる。しかる後
これらのハイブリッドは検出可能となる。
ハイブリッドの検出は種々な方法で実施することができ
る。プローブは核酸プローブの標識化のための公知の方
法のうち１つによって標識化することができる。それは
例えば３２ｐで放射性標識化されでも、又は低温プロー
ブの場合には公知の如く例えば酸素的に非放射性標識化
されてもよい。
ある場合には、プローブはその適宜使用時に標識化され
ていないが、但し例えばビオチンでハイブリッド形成後
に検出可能となるように化学的に修飾される。
更に詳しくは、本発明はウィルスＤＮＡとのハイブリッ
ド形成により様々なタイプのヒトパピローマ（ｐａｐｉ
ｌｌｏｍａ）ウィルスの検出を可能にする核酸プローブ
に関する。特に、現在ＤＮＡ配列がすべて公知となって
いる８つのタイプのヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）
、即ちタイプＨＰＶ　１　ａ。
ＨＰＶ５、ＨＰＶ６ｂ、、ＨＰＶ８、ＨＰＶ１１ＨＰＶ
１６、ＨＰＶ　１８及びＨＰＶ３３に関する。
女性の１０％はＨＰＶウィルスに感染している。
ウィルスは子宮頚°部細胞中に存在しており、ある場合
には頚部の形成障害及び／又は悪性障害を引き起こす。
様々なタイプのＨＰＶウィルスの中では、ＨＰＶＩ６及
びＨＰＶＩ８が最も頻繁にこれらの障害に関与している
ものと思われる。
ＨＰＶは、直径６０ｎｍのタンパク質キャプシドで包ま
れた約８０００塩基対の環状二本鎖ＤＮＡゲノムによっ
て特徴付けられる。ウィルスは非組込みエピソーム状態
で非悪性障害部位に存在する。
これらの場合において、細胞分化障害が観察され、かつ
分化最終段階においてウィルス粒子は産生も観察される
。子宮がんが発生する場合には、あるウィルスＤＮＡ配
列の細胞ＤＮＡ内への変異的組込みが観察される。
頚部におけるＨＰＶウィルスの検出は、アイソトープ的
にクローニングされかつ標識化されたウィルスＤＮＡ断
片からなる分子プローブの使用によって行なわれる。
ＨＰ　Ｖ感染症の疫学的研究及びルーチン的診断の枠内
において、非アイソトープ的に標識化されかつその場で
使用可能な合成りＮＡプローブの使用に基づく迅速簡易
な特異的かつ感受的方法を開発することが有用である。
かかる目的において、異なるタイプのＨＰＶウィルスの
特異的領域が、そこから相補的な相同性合成プローブを
誘導するために、ＤＮＡレベルで確認される。ＨＰＶＩ
、ＨＰＶ５、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶＩ６、ＨＰ
ＶＩ８及びＨＰＶ３３のヌクレオチド配列は公知である
。
本発明の目的は、特に前記の有効なすべての様々なタイ
プのＨＰＶウィルスに特徴的であるプローブ、即ちでき
るだけ最長の核酸配列を有しかつ様々なタイプのＨＰＶ
ウィルスに共通なプローブを提供することである。
本発明のもう１つの目的は、様々なタイプのＨＰＶウィ
ルスの各々にとり特異的であってかつ安定的適合性（ｍ
ａ　ｔｃｈ　ｉｎｇ）を確実にもつプローブを提供する
ことである。
以上のように、様々なタイプのヒトパピローマウィルス
、特にＨＰＶ　１　ａ、ＨＰＶ５、ＨＰＶ６ｂ、、ＨＰ
Ｖ８、ＨＰＶ１１、ＨＰＶＩ６、ＨＰＶＩ８及びＨＰＶ
３３を識別せずに検出するために有用な核酸プローブを
提供することが本発明の目的であって、このプローブは
下記オリゴマー：Ｘ−Ａ−Ａ−＾−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−八
−Ａ−Ｇ−Ｘ（ＸへＴ又はＵ） 又は、ウィルスの標的ＤＮＡが最初に二重カテナリー性
であってプローブ処理前に変性されている場合又はｍＲ
ＮＡがプローブ処理される場合には、一方でＡ及びＸ、
他方でＣ及びＧを交換することによる、その相補鎖（ｃ
ｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）であることを特徴とする。
Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ，Ｕはそれぞれ塩基アデニン、チミン、
シトシン、グアニン及びウラシルに対応するヌクレオチ
ドを表わす。
配列Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−八−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ
は、特に８タイプのＨＰＶウィルスの各々のＤＮＡにお
いて、少なくとも１０塩基鎖長の配列の中から実際に同
一で見出された唯一の配列である。
この配列は、様々なタイプのウィルスにおいて下記位置
の第一ヌクレオチドについてコードする頂上に位置した
配列に対応する： ＨＰＶ１８の場合：１０２９位 ＨＰＶ５　　の場合：１１９０位 ＨＰＶ６ｂの場合：１０７６位 ＨＰＶ８　　（７）場合：１１７４位 ＨＰＶ１１の場合：１０７６位 ）（ＰＶ１６（７）場合：１１２１位 ＨＰＶ１’８（７）場合：１１６７位 ＨＰＶ３３の場合：１１３２位 異なるタイプの）（ＰＶウィルスに共通した核酸プロー
ブを提供することも本発明の目的であって、このプロー
ブは各々が既に標的とされている１２オリゴヌクレオチ
ドの共通配列を含みしかも８タイプのＨＰＶウィルスに
対応するヌクレオチドで上流及び下流が伸長されている
６種のオリゴマーの混合物からなることを特徴とする。
これらの伸長部分は、８タイプのＨＰＶウィルスに共通
した配列Ｔ−＾−＾−＾−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ
−Ｔを直接取囲むヌクレオチドと適合化するヌクレオチ
ドから構成される。これらのオリゴマーのうち、４つは
異なるタイプのウィルスと各々関連しており、５番目の
ものはウィルス６ｂ及び１１に共通であって、もう１つ
はウィルス５及び８に共通している。
例えば、１２ヌクレオチド共通配列を各ウィルスタイプ
に対応する１〜１０個のヌクレオチドで各端部上におい
て伸長させることが可能である。
共通配列の各端部において６又は７個以内のヌクレオチ
ドを伸長することにより、６種の下記オリゴマー又はそ
れらの相補鎖が得られる：ＨＰＶ１ａの場合 Ａ−Ｘ−Ｇ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−＾−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−ＸＨＰＶ
６ｂ及びＨＰＶ１１の場合 Ａ−Ｇ−Ｇ−＾−Ｃ−Ｃ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ−ＧＨＰＶ
８及び）ｌＰＶ５　（７）場合 Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ
−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−ＡＨ
ＰＶ１６の場合 Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｇ）ＩＰ
Ｖ１８の場合 Ａ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｃ−Ａ−ＧＨＰＶ
３３の場合 Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇこれら
のオリゴマーは、各タイプのＨＰＶウィルスについて下
記位置のウィルスＤＮＡ標的配列に対応する： ＨＰＶ１８の場合：１０２３位 ＨＰＶ５　　（７）場合：１１８３位 ＨＰＶ６Ｍ）場合”１０７０位 ＨＰＶ８　　（７）場合：１１６７位 ＨＰＶ１１（７）場合：１０７０位 ＨＰＶ１６（７）場合：１１１５位 ＨＰＶ１３（７）場合：１１６１位 ＨＰＶ３３の場合：１１２６位 共通配列の各端部における４塩基の伸長の場合は５０〜
５２℃程度の半ハイブリッド形成温度を示す配列を与え
るのみである。他方、上流及び下流双方において６塩基
以上である場合には、ウィルス中に存在する正確な配列
と対応することから、６０〜７０℃程度の半ハイブリッ
ド形成温度が得られる。
したがって、ＨＰＶ１８の標的配列（１０２３位）の場
合には、プローブは６０℃の予想しうる半ハイブリッド
形成温度を有する： ＨＰＶ５　　（７）場合（１１８３位）Ｔ＝６２℃ＨＰ
Ｖ６ｂ（７）場合（１０７０位）Ｔ＝６４℃ＨＰＶ８　
　の場合（１１６７位）Ｔ＝６２℃ＨＰｖ１１の場合（
１０７０位）Ｔ＝６４℃ＨＰＶ１６の場合（１１１５位
）Ｔ＝６４℃ＨＰＶ１８の場合（１１６１位）Ｔ＝６２
℃ＨＰＶ３３の場合（１１２６位）Ｔ＝７０℃公知のヒ
トパピローマウィルスすべてに共通したこれらのオリゴ
ヌクレオチドプローブは、パピローマウィルスに起因し
た疾患の迅速的診断を可能にする。
本発明のもう１つの目的は、各々が他のタイプのものよ
りも１つのタイプのヒトパピローマウィルスに特異的で
ある一組の８種の核酸プローブ、即ち下記オリゴマー又
はそれらの相補鎖を提供することである： ＨＰＶ１８の場合： １　　’　　オリゴ７−　　　Ｃ−Ｃ−Ｘ−Ｃ−Ａ−Ｇ
−Ｇ−Ｃ−Ｇ−，１〜Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ
−Ｇ−Ａ−ＣＨＰＶ５の場合： １　′　オリゴ？−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ
−ＡＨＰＶ６ｂの場合： １　′　オリゴマー　　Ｃ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ｃ−
Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｘ−Ｇ
−Ａ−ＡＨＰＶ８の場合： １　′　オリゴマー　　Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−＾−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ
−ＡＨＰＶ１１の場合： １　　’　　才り：ｆママ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−
Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｘ−Ａ
−ＧＨＰＶ１６の場合： １　　’　　ｔす：ｆママ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−
Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ
−ＸＨＰＶ１８の場合： １　′　オリゴ？−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｃ−
Ｇ−Ｃ−Ｘ−Ａ−Ｃ−Ｘ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｇ
ＨＰＶ３３の場合： １　　’　　才りＪマー　　　Ｃ−Ｇ−Ｘ−Ｃ−Ｃ−Ｘ
−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｃ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ａ−
Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ（Ｘ＝Ｔ又はＵ） プローブ処理されるＤＮＡが最初に二重カテナリー性で
あってハイブリッド形式しうるように変性されている場
合又はｍＲＮＡがプローブ処理される場合には、相補的
オリゴマーの使用を考えることができる。
ＨＰＶ１８の場合の選択的オリゴマーは２１個のモノマ
ーからなり、この配列はウィルスＤＮＡの１０５２位に
対応し、７２℃の半ハイブリッド形成温度を有する。
ＨＰＶ５の場合の選択的オリゴマーは２２個のモノマー
からなり、この配列はウィルスＤＮＡの１８０１位に対
応し、６８℃の半ハイブリッド形成温度を有する。
ＨＰＶ６ｂの場合の選択的オリゴマーは２２個のモノマ
ーからなり、この配列はウィルスＤＮＡの４７６１位に
対応し、７０℃の半ハイブリッド形成温度を有する。
ＨＰＶ８の場合の選択的オリゴマーは２１個のモノマー
からなり、この配列はウィルスＤＮＡの３３４４位に対
応し、７２℃の半ハイブリッド形成温度を存する。
ＨＰＶ１１の場合の選択的オリゴマーは２０個のモノマ
ーからなり、この配列はウィルスＤＮＡの３４１６位に
対応し、７２℃の半ハイブリッド形成温度を有する。
ＨＰＶ　１６の場合の選択的オリゴマーは２０個の七ツ
マ−からなり、この配列はウィルスＤＮＡの６９５位に
対応し、６４℃の半ハイブリッド形成温度を有する。
ＨＰＶ１８の場合の選択的オリゴマーは２１個の七ツマ
−からなり、この配列はウィルスＤＮＡの３４４８位に
対応し、６４℃の半ハイブリッド形成温度を有する。
ＨＰＶ３３の場合の選択的オリゴマーは２２個のモノマ
ーからなり、この配列はウィルスＤＮＡの４４７４位に
対応し、６８℃の半ハイブリッド形成温度を有する。
８種のヒトパピローマウィルスのうちいずれか１つに対
して特異的なこの第二組口のプローブ類の目的は、これ
らのウィルスによる感染症の診断試験用の選択的要素と
して使用されることである。
第二組口の８種の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ核酸プローブ
を提供することも本発明の目的であって、各々が他のタ
イプよりも１つのタイプのヒトパピローマウィルスに対
して特異的である。それらは前記のもの以外の別の選択
的プローブである。
これらのプローブは、下記オリゴマーを含む標識核酸配
列である： ＨＰＶ１８（７）場合：　ＣＸＧＸＣＣＣＸＸＣＸＧＣ
ＧＣＧＡＧＡＣＧＸＨＰＶ５　（７）場合：　ＸＸＧＸ
ＡＸＧＧＧＡＸＣＧＧＧＧＧＣＧＸＸＸＡＨＰＶ６ｂ　
（７）場合：　ＧＧＣＡＡＸＣＡＸＸＡＡＣＧＣＡＧＧ
ＧＧＣＧＩＰＶＢ　（７）場合：　ＧＣＡＧＣＸＣＡＧ
ＸＣＣＧＣＧＧＣＸＣＣＨＰＶ１１（７）場合：　ＧＡ
ＡＧＣＸＣＸＣＣＣＡＡＧＣＣＸＧＣＸＡＸＸＨＰＶ１
６の場合：　ＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＸＧＡＸＣＸＣ
ＸＡＣＸＧ及び　：　ＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡ
ＣＡＧＡＧＣＣＣＡＨＰＶ１８（７）場合：　ＣＣＣＡ
ＸＸＧＸＡＸＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＣＣ）ＨＰＶ３３（
７）場合：　ＧＸＣＣＸＣＣＧＧＸＸＡＣＸＧＸＡＧＡ
ＣＡＣＸ上記配列は、ウィルスＤＮＡの直接もしくはコ
ード鎖（ｓｔｒｉｎｇ又はｓ　ｔｒａｎｄ）の配列に対
応し、ＤＮＡが変性されている場合には二重カテナリー
性ＤＮＡ又は反対類とハイブリッド形成することができ
る。
勿論、一方でＡ及びＸ、他方でＣ及びＧを交換すること
により相補的オリゴマーを用いることも可能である。こ
れらの相補的オリゴマーは、ウィルスのメソセンジャー
ＲＮＡとハイブリッド形成せしめられるプローブとして
特に有用である。
上記配列において、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇ及びＵはそれぞれ塩
基アデニン、チミン、シトシン、グアニン及びウラシル
に対応するヌクレオチドを表わし、ＸはＴ又はＵを表わ
すことを再度記載する。
ＨＰＶ１８の場合の選択的オリゴマーは２２個のモノマ
ーからなる。この配列の最初のヌクレオチドは、ウィル
スＤＮＡコード鎖の３４４８位に対応する。配列は３４
６９位で終結する。この配列はＨＰＶ１ａウィルスのＥ
３遺伝子中に存在する部位に対応し、７２℃の半ハイブ
リッド形成温度を有する。
ＨＰＶ５の場合の選択的オリゴマーは２３個のモノマー
からなる。この位置はＥ１遺伝子中に存在するウィルス
ＤＮＡの１８００−１８２２位に対応し、７０°Ｃの半
ハイブリッド形成温度を有する。
ＨＰＶ６ｂの場合の選択的オリゴマーは２２個のモノマ
ーからなる。この位置はＬ２遺伝子中に存在するウィル
スＤＮＡの４７５５−４７７６位に対応し、７０℃の半
ハイブリッド形成温度を有する。
ＨＰＶ８の場合の選択的オリゴマーは２０個のモノマー
からなる。この位置はＥ１遺伝子中に存在するウィルス
ＤＮＡ１２０８−１２２７位に対応し、７０℃の半ハイ
ブリッド形成温度を有する。
ＨＰＶ１１の場合の選択的オリゴマーは２３個のモノマ
ーからなる。この位置はＬ２遺伝子中に存在するウィル
スＤＮＡ４６３７−４６５９位に対応し、７０℃の半ハ
イブリッド形成温度を有する。
ＨＰＶ１６の場合の第一選択オリゴマーは２４個のモノ
マーからなる。この配列はＥ７遺伝子中に存在するウィ
ルスＤＮＡ６０９−６３２位に対応し、７０℃の半ハイ
ブリッド形成温度を有する。
ウィルスＨＰＶ１６の場合、モノマー２４個の第二の特
異的プローブが決定されたが、これはＴ又はＵ塩基を欠
＜Ｅ７遺伝子中に存在し、６９０−７１３位に位置する
。
ＨＰＶ１８の場合の選択的オリゴマーは２２個のモノマ
ーからなる。この配列はＬ２遺伝子中に存在するウィル
スＤＮＡ５４８６−５５０７位に対応し、７２℃の半ハ
イブリッド形成温度を有する。
ＨＰＶ３３の場合の選択的オリゴマーは２３個のモノマ
ーからなる。この配列はＬ２遺伝子中に存在するウィル
スＤＮＡ４４７５−４４９７位に対応し、７０℃の半ハ
イブリッド形成温度を有する。
各々が他のウィルスタイプ以外のＨＰＶウィルスタイプ
に特異的である別の一組のプローブを提供することも、
本発明の目的である。これらのプローブはモノマー３５
個の鎖長を有する。それらはマークされた相似領域に基
づき上流又は下流で伸長された前記の特異的プローブで
ある。これらのオリゴマーはウィルスのＤＮＡコード鎖
にも対応する。したがって、特にメツセンジャーＲＮＡ
とハイブリッド形成しうる相補的配列を提供することも
、本発明の目的である。
これら新規の特異的プローブは標識核酸配列からなり、
下記オリゴマーを有する： ＨＰＶ１ａの場合：　ＸＧＸＣＣＣＸＸＣＸＧＣＧＣＧ
ＡＧＡＣＧＸＸＧＧＡＡＧＸＡＸＡＣＡＣＡ。
この配列はウィルスのＤＮＡコード鎖の３４４９−３４
８２位に対応し、Ｅ３遺伝子中に位置している。
１（ＰＶ５　（７）場合：　ＸＧＸＡＸＧＧＧＡＸＣＧ
ＧＧＧＧＣＧＸＸＸＡＧＣＣＡＸＧＧＡＣＣＡＸＡ。
この配列はウィルスＤＮＡの１８０１〜１８３５位に対
応し、Ｅ１遺伝子中に位置している。
ＨＰＶ６ｂ　１７）場合：　ＧＣＡＡＸＣＡＸＸＡＡＣ
ＧＣＡＧＧＧＧＣＧＣＣＸＧＡＡＡＸＸＧＸＧＣＣ。
この配列はウィルスＤＮＡの４７５６−４７９０位に対
応し、Ｌ２遺伝子中に位置している。
ＨＰＶ８　（７）場合：　ＧＣＡＧＣＸＣＡＧＸＣＣＧ
ＣＧＧＣＸＣＣＡＧＸＣＡＡＸＡＸＣＡＣＸＧＸ。
この配列はウィルスＤＮＡの１２０８−１２４２位に対
応し、Ｅ１遺伝子中に位置している。
ＨＰＶ１１（７）場合：　ＸＡＸＡＸＡＣＣＣＸＸＧＧ
ＧＡＡＧＣＸＣＸＣＣＣＡＡＧＣＣＸＧＣＸＡＸ。
この配列はウィルスＤＮＡの４６２４−４６５８位に対
応し、Ｌ２遺伝子中に位置している。
ＨＰＶ１６ノ場合：　ＸＧＸＸＡＧＡＸＸＸＧＣＡＡＣ
ＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＸＧ−ＡＸＣＸＣＸＡＣｏこの配
列はウィルスＤＮＡの５９６−６３０位に対応し、Ｅ７
遺伝子中に位置している。
ＨＰＶ１８（７）場合：　ＣＣＣＡＸＸＧＸＡＸＣＡＣ
ＣＣＡＣＧＧＣＣＣＣＸＧＣＣＸＣＸＡＣＡＣＡ。
この配列はウィルスＤＮＡの５４８６−５５２０位に対
応し、Ｌ２遺伝子中に位置している。
ＨＰＶ３３（７）場合：　ＸＣＣＸＣＣＧＧＸＸＡＣＸ
ＧＸＡＧＡＣＡＣＸＧＸＸＧＧＡＣＣＸＸＸＡＧ。
この配列はウィルスＤＮ＾の４４７６−４５１０位に対
応し、Ｌ２遺伝子中に位置している。
各々が各タイプのヒトパピローマウィルスニ特異的であ
るが但しこれらウィルスの各々のゲノムのＥ　７　？ｉ
ｉ域中に常に位置するような他の核酸プローブを提供す
ることも、本発明の目的である。
事実、これらＨＰＶウィルスの各々のゲノムのＥ７遺伝
子は、悪性細胞ＤＮＡ中へのこれらウィルスの組込みと
最も関係がある。
この第三組目の特異的プローブ類は、それらが７０℃の
半ハイブリッド形成温度を有するような鎖長のオリゴヌ
クレオチドからなる。それらは下記オリゴマー又はそれ
らの相補鎖である：ウィルス　　　　オリゴマー　　　
　　鎖長　位　置　遺伝子ＨＰＶ１ａ　　ＧＡＣＣＧＸ
ＣＣχＣＧＣＧＧＡＸＣＡＣＡＧ　　　　２１　７１１
〜７３１　　Ｅ７ＨＰＶ５　　ＧＣＣＸＧＡＣＡＡＣＧ
ＡＡＡＧＧＡＸＣＸＣＸＸＡ　　２４　７８８−８１１
　　Ｅ７ＨＰＶ６ｂ　　ＧＡＣＧＡＡＧχＧＧＡＣＧＧ
ＡＣＡＡＧＡＸＸＣ２３６４１〜６６３Ｅ７ＨＰＶ８　
　ＸＧＸＣＡＡＣＧＣＡＡＣＸＧＡＸＸＣＧＧＧＸＡＸ
　　２４　８５６−８７９　　Ｅ７）ＩＰＶ１１　　Ｘ
ＧＡＧＧＸＧＧＡＣＡＡＧＧχＧＧＡＣＡＡＡＣ２３６
３４−６５６Ｅ７ＨＰＶ１６　　ＡＧＸＧＸＧＡＣＸＣ
ＸＡＣＧＣＸＸＣＧＧＸＸＧ　　　２３　７４０−７６
２　　Ｅ７）ＨＰＶ１８　　ＸＸＧＸＡＡＧＸＧＸＧＡ
ＡＧＣＣＡＧＡＡＸＸＧＡＧ　　２５　７８４−８０８
　　Ｅ７ＨＰＶ３３　　ＡＧＣＡＡＧＸＧＡＣＣＸＡＣ
ＧＡＡＣＣＡＸＡＣＡ　　２４　７８８−８１１　　Ｅ
７他のウィルスタイプ以外の各々のＨＰＶウィルスタイ
プのＥ７領域における一組の新規な特異的核酸プローブ
を提供することが、本発明のもう１つの目的であって、
これらのプローブは３５個のモノマー鎖長のオリゴヌク
レオチド、即ち下記オリゴマー又はそれらの相補鎖から
なる：ウイルス　　　　　　　　　オ　　　リ　　　ゴ
　　　マ　　　−（立　　ｔＨＰＶ１８　　　ＧＡＣＣ
ＧＸＣＣＸＣＧＣＧＧＡＸＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＸＸＡ
ＧＡＣＡＧＣ７１１〜７４５ＨＰＶ５　　　ＧＡＧＧＡ
ＧＣＣＸＧＡＣＡＡＣＧＡＡＡＧＧＡＸＣＸＣＸＸＡＣ
ＡＡＡＧＸ　　　７８３−８１７ＨＰＶ６ｂ　　　ＧＡ
ＧＧＸＧＧＡＣＧＡＡＧＸＧＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧＡＸ
ＸＣＡＣＡＡＣＣ６３５−６６９ＨＰＶ８　　　　ＣＸ
ＸＸＸＸＧＸＣＡＡＣＧＣＡＡＣＸＧＡＸＸＣＧＧＧＸ
ＡＸＣＡＧＧＡＣ８５１〜８８５ＨＰＶ１１　　　ＡＧ
ＡＡＧＡＸＧＡＧＧＸＧＧＡＣＡＡＧＧＸＧＧＡＣＡＡ
ＡＣＡＡＧＡＣＧ　　　６２８−６６２ＨＰＶ１６　　
　ＸＸＧＣＡＡＧＸＧＸＧＡＣＸＣＸＡＣＧＣＸＸＣＧ
ＧＸＸＧＸＧＣＧＸＡＣ７３５−７６９）ＨＰＶ１８　
　　ＡＸＧＸＧＸＸＧＸＡＡＧＸＧＸＧＡＡＧＣＣＡＧ
ＡＡＸＸＧＡＧＣＸＡＧＸ　　　７７９−．８１３ＨＰ
Ｖ３３　　　ＡＧＸＡＣＡＧＣＡＡＧＸＧＡＣＣＸＡＣ
ＧＡＡＣＣＡＸＡＣＡＧＣＡＡＣＸ　　　７８３−８１
７これらのプローブ群は、前記プローブと同様に、ウィ
ルスＤＮＡのコード鎖及び特にメツセンジャーＲＮＡと
ハイブリッド形成しうる反対類たるそれらの相補鎖に対
応する。示された位置は前記の場合の直接鎖に対応して
いる。
本発明は、粘膜に属する皮層の腫瘍の原因をなし、肛門
性器（ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ）がん又は口腔、鼻及び副
鼻管のがんを引き起こすＨＰＶウィルスを識別しうるプ
ローブにも関する。
粘膜腫瘍を起こすＨＰＶｌ　６、ＨＰＶｌ８及びＨＰＶ
３３で構成されるウィルスサブグループの特異的プロー
ブを提供することも本発明の目的であって、それらは下
記配列： ＸＸＡＧＧＣＡＣＡＸＡＸＸＸＸ 又はその相補鎖を有することを特徴とする。
この配列はＨＰＶｌ６、ＨＰＶｌ８及びＨＰＶ３３に共
通であって、他のタイプのＨＰＶウィルスには存在して
いない。
それは下記位置（コード鎖に関してナンバーリングした
場合）に存在している。
ウィルス　　位　置　　　　遺伝子 ＨＰＶ１６　　７６９８−７７１２　　　Ｌｌの下流Ｈ
ＰＶ１８　　７６８６−７７００　　　Ｌｌの下流ＨＰ
Ｖ３３　　７７４１〜７７５５　　　Ｌｌの下流粘膜腫
瘍を起こすサブグループＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８の特異
的プローブを提供することも本発明の目的であって、そ
れらは下記配列：ＡＸＡＸＣＡＡＡＸＡＸＸＡＧＸＧＡ
ＡＧＸ又はその相補鎖を有することを特徴とする。
この配列はＨＰＶ　１６及びＨＰＶｌ８に共通であって
、他のいずれのタイプのＨＰＶウィルスにも存在してい
ない。
それは下記位置（コード鎖に関してナンバーリングした
場合）に存在している。
ウィルス　　位　置　　　　遺伝子 １（ＰＶ１６　　１８４０−１８５９　　　　　ＥＩＨ
ＰＶ１８　　１９１０−１９２９　　　　　Ｅｌ最後に
、皮膚腫瘍を起こすＨＰＶ５及びＨＰＶ８からなるウィ
ルスサブグループの特異的プロー　　　ブを提供するこ
とも本発明の目的であって、それは鎖長５６塩基の断片
を有することを特徴とし、コード鎖に関して既定される
その配列は下記のとおりである： ＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＸＸＧＣＸＧＡＣＡＡＸＡＸＸＸ
ＸＡＡＡＡＸＡＸＧＧＣＡＧＸＧＣＸＧＧＸＧＸＡＸＸ
ＸＸＸＧＧ それは下記位置くコード鎖に関してナンバーリングした
場合）に存在している。
）ＩＰＶ　５　　　　４４５０−４５０５　　　　Ｌ２
ＩＰＶ　Ｂ　　　　　４３８３−４４３８　　　　Ｌ２
この断片内において、７０℃程度の半ハイブリッド形成
温度を有する更に短い配列を選択することもできる。こ
れら様々な可能性の中では、下記配列： ＸＡＸＧＧＣＡＧＸＧＣＸＧＧＸＧＸＡＸＸＸＸＸＸＧ
又はその相補鎖を有するプローブが特記される。
この配列はくコード鎖に関してナンバーリングした場合
） ＨＰＶ５（７）４４８０−４５０４位及びＨＰＶ８（７
）４４１３−４４３７位に対応する。
選択されたプローブは、ＨＰＶウィルスサブグループの
各々に共通であって、サブグループの各々の固定を可能
化し、しかもそれらの選択能を介してそれらを他から区
別することができる。
特に３１ｐのような放射性標識及びビオチンのような醋
素標識の中から選択される公知のＤＮＡ又はＲＮＡプロ
ーブ標識化方法の１つによって標識化されていることを
特徴とする核酸プローブ、並びにこのプローブが最初に
二重カテナリー性であるならば場合により予め変性され
た前記ＨＰＶウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡ配列とハイブ
リッド形成することを特徴とする本発明プローブによる
ＨＰＶウィルスタイプ又はＨＰＶウィルスサブグループ
の検出方法を提供することも、本発明の目的である。
本発明の他の利点及び特徴は下記説明から明らかになる
であろう。
添付図面中において、第１図は本発明のＨＰＶ合成プロ
ーブとＨＰＶウィルスＤＮＡとの選択的ハイブリッド形
成に対応したゲルを表わしている＝１、放射性ＤＮＡ断
片ラムダＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍ−サイズ標準 ２、　８　ａｍ　Ｈｌで切断されたＨＰＶ６ｂウィルス
ＮＡ ３．８ａａ＋ＨＩで切断されたＨＰＶ１１ウィルスＮＡ ４、　８ａｉＨＩで切断されたＨＰＶ１６ウイルスＮＡ ５、　　ＥｃｏＲＩで切断されたＨＰＶ１８ウィルスＮ
Ａ Ａ、ＨＰＶ６ｂの特異的プローブ Ｂ、ＨＰＶｌｌの特異的プローブ Ｃ，ＨＰＶ１６の特異的プローブ Ｄ、ＨＰＶ１８の特異的プローブ； −第２図は、ゲノムＤＮＡと本発明の特異的ＨＰＶプロ
ーブとのハイブリッド形成に対応したゲルを表わしてい
る： １、　ラムダＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍ−放射性サイ
ズ標準 ２、なし ３、　　ＥｃｏＲＩで切断されたヒトゲノムＤＮＡ（１
０ｐｇ） ４、なし ５、ＨＰＶ特異性プローブ（６ｂ、１１．１６又は１８
）とハイブリッド形成するＨＰＶウィルス（６ｂＳ１１
．１６又は１８）のＤＮＡ。
−第３図は、ＨＰＶクローンとすべてのウィルスタイプ
に共通するプローブとのハイブリッド形成に対応したゲ
ルを表わしているニ ー第４図は、ＨＰＶ合成特異性プローブとＨＰＶウィル
スＤＮＡとの選択的ハイブリッド形成について示してい
る： ａ、Ｂａ＋ａＨＩで切断されたＨＰＶ６ｂウィルスＮＡ ｂ、ＢａｍＨＩで切断されたＨＰＶ１１ウィルスＮＡ ｃ、Ｂａｎ＋ＨＩで切断されたＨＰＶ１６ウイルスＮＡ ｄ、ＥｃｏＲＩで切断されたＨＰＶ１８ウィルスＮＡ Ａ、ＨＰｖ６ｂの特異的プローブ Ｂ、ＨＰＶ１１の特異的プローブ Ｃ０ＨＰＶ１６の特異的プローブ Ｄ、ＨＰＶ１８の特異的プローブ； −第５図は、ＨＰＶゲノムＥ　７６５域に対する合成プ
ローブとＨＰＶウィルスのＤＮＡとの選択的ハイブリッ
ド形成について示している：ａ、ＢａｍＨＩで切断され
たＨＰＶ６ｂウィルスＮＡ ｂ、Ｂａｎ＋ＨＩで切断されたＨＰＶ１１ウィルスＮＡ ｃ、Ｂａ＋ｓＨＩで切断されたＨＰＶ１６ウイルスＮＡ ｄ、ＥｃｏＲＩで切断されたＨＰＶ１８ウィルスＮＡ Ａ、ＨＰＶ５ｂの特異的プローブ Ｂ、ＨＰＶｌｌの特異的プローブ Ｃ，ＨＰＶ１６の特異的プローブ Ｄ、ＨＰＶ１８の特異的プローブ １：放射性ＤＮＡ断片ラムダＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　
ｍ−サイズ標準 実新■壓１ 公知のヒトパピローマウィルスすへてに共通したオリゴ
ヌクレオチドツブローフ゛のン バビローマウイルスに起因する疾患の迅速的診断が可能
なプローブの製造のために、現在公知の配列、即ち現時
点では下記ウィルス：　ＨＰＶ　１　ａ、ＨＰ　Ｖ　５
、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ８、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、Ｈ
ＰＶ１８及びＨＰＶ３３の配列を有するすべてのウィル
スに共通した最長の配列に関する研究が続けられてきた
。
フォートラン（ＦＯＲＴＲＡＮ）プログラムが問題の研
究に関して開発されたが、通常の問題解決手段はこのよ
うに伸長されたいくつかの配列の処理にとって適さない
。そのプログラムは、それに供される配列の各々につい
て、それらの中で第一のものから抽出されるすべての可
能なブロックを用い探索するものであるが、これらのブ
ロックは鎖長ｌＯ〜２０塩基の間で連続的な値をもつ。
この探索中に、プログラムではそれに供されるすべての
配ν１１の中から集積されたブロックの出現について知
らせている。
見出された最長の共通配列、即ち１２塩基の断片（Ｔ−
Ａ−Ａ−＾−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ）は、様
々な配列中において下記位置に存在している： ＨＰＶ１ａ　　　　１０２９ ）！ＰＶ５　　　　１１９０ ｏｐｖ６ｂ　　　　１０７６ ＨＰＶ８　　　　１１７４ １１ＰＶ１１　　　　１０７６ １１ＰＶ１６　　　１１２１ ＨＰＶ１８　　　１１６７ ＋１ＰＶ３３　　　１１３２ １２塩基ではある実験条件下で容易に機能する断片とし
て短かすぎることから、この配列を上流及び下流で伸長
させた。
各端部における４塩基の伸長のみで、５０〜５２℃程度
の半ハイブリッド形成温度を有する配列を得た。したが
って、それを上流及び下流双方で６又は７個の塩基によ
り、即ち各々ウィルス中に存在する正確な配列によって
伸長し、下記配列を得た： 標的配列　　　　　　　　　　　　位−１１〜渡ＨＰＶ
１ａ　　：　　ＡＴＧＣＴＴＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴ
ＴＡＣＴＴＴ　　　　　　１０２３　　　　６０°ＣＨ
ＰＶ５　　：　ＣＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧ
ＴＡＴＣＴＴＡ　　　１１８３　　６２℃ＨＰＶ６ｂ　
　：　　ＡＧＧＡＣＣＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴＡＴＴ
ＴＡＧ　　　　　　１０７０　　　　６４°ＣＨＰＶ８
　　　：　　ＣＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴ
ＡＴＣＴＴＡ　　　　　１１６７　　　　６２℃ＨＰＶ
１１　　：　　ＡＧＧＡＣＣＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴ
ＡＴＴＴＡＧ　　　　　　１０７０　　　　６４℃）Ｈ
ＰＶ１６　：　ＡＧＧＴＴＣＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴ
ＡＴＴＴＧＧ　　　１１１５　　６４℃ＨＰＶ１８　　
：　　ＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴＴＴＧＣ
ＡＧ　　　　　　１１６１　　　　６２°Ｃ１１ＰＶ３
３　　：　　ＧＴＧＣＡＣＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴＴ
ＴＧＣＣＧ　　　　　　１１２６　　　　７０℃これら
のプローブのうちあるものは若干短縮化されていてもよ
く、ＨＰ　Ｖ　８に対して特異的なものはほぼ同一の生
変性温度を得るために必要であれば伸長させることもで
きる。
ＨＰ　Ｖ　６　ｂ及びＨＰＶ１１の場合に得られる配列
は同一で、Ｉ（ＰＶ５及びＨＰＶ８の場合も同様である
ことにン主目される。したがって、オリゴヌクレオチド
混合物は６種の異なる分子のみを含んでいる。
これら６種のオリゴヌクレオチドの混合により、ヒトパ
ピローマウィルスのうち１種のＤＮＡを含むあらゆる系
にとって、非常に特徴的なハイブリッド形成シグナルを
もつ混合物が得られる。
１膳±１ 公知タイプのＨＰＶの各々に特異的なプローブのｌ　　
（第一組のプローブ） 操作は鎖長約２０塩基のオリゴヌクレオチドプローブの
探索からなり、それらは現在公知の完全配列をもつ８種
のヒトパピローマウィルスのうち１つ又は他に対して各
々特異的であるように選択された。それらの目的は、そ
れらウィルスによる感染症の診断試験のための選択的要
素として使用されることである。
この目的のために、フォートランプログラムからなる特
別のソフトウェアが開発されたが、これは最小保存領域
検出用にいくつかの大きな配列を比較するためである。
このプログラムは段階的フィルターのように機能し、そ
の連続的実行の各々の時点で、他の関連配列の各々にお
いて全く同一で存在する配列の領域をマークするもので
ある。
各逐行後、探索される相同部分の鎖長は初期値２５と最
終値８の間で１単位ずつ短縮される。
連続的逐行の各々の時点で各標的配列によりマークされ
た参照配列の各修正体は別々に保存される。次いで第ニ
ブログラムではマークされた様々な配列間で非マーク領
域を決定するが、これはフィルターリングの各連続的段
階においてである。
アウトプット時点で、有用領域のリストが得られる。こ
れらの領域からの選択は前記フィルター逐行中における
領域環境試験によって行なわれ、その結果選択されるオ
リゴマーは他のウィルスのＤＮＡ配列と最小の相同性し
か示さない。
例えば最初の一組の下記オリゴマーが得られたが、各々
は選択されるウィルスの関数として命名されている： ウィルス　　オリゴマー　　　　　　亘長　俊１１度Ｈ
ＰＶ１ａ　　　　ＣＣＴＣＡＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣ
ＧＧＡＣ２１１０５２７２℃ＨＰＶ５　　　ＴＧＴＡＴ
ＧＧＧＡＴＣＧＧＧＧＧＣＧＴＴＴＡ　　２２　１８０
１　６８℃ＨＰＶ６ｂ　　　　ＣＡＴＴＡＡＣＧＣＡＧ
ＧＧＧＣＧＣＣＴＧＡＡ　　　　２２　　　４７６１　
　７０℃＋１ＰＶ８　　　　　ＡＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣ
ＡＡＧＡＣＣＣＣＣＡ　　　　　２１　　　３３４４　
　７２℃＋１ＰＶ１１　　　　ＧＧＣＧＴＧＴＣＧＧＣ
ＧＣＣＧＣＣＴＡＧ　　　　　　２０　　　３４１６　
　７２℃ＨＰＶ１６　　　　ＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＣＡ
ＧＡＧＣＣＣＡＴ　　　　　　２０　　　　６９５　　
６４℃！ＩＰＶ１８　　ＣＧＧＴＡＴＣＣＧＣＴＡＣＴ
ＣＡＧＣＴＴＧ　　　２１　３４４Ｂ　　６４℃＋１Ｐ
Ｖ３３　　ＣＧＴＣＣＴＣＣＧＧＴＴＡＣＴＧＴＡＧＡ
ＣＡ　　２２　４４７４　６８℃次いで、上記各々のプ
ローブは、′ミスマツチ”（ｍｉＳｍａ　Ｌｃｈ）　’
及び“ギャップ”（ｇａｐ）　”を用いるセラーズ（ｓ
ｅｌｌｅｒｓ）及びボード（Ｇｏａｄ）の問題解決手段
によって各々のＨＰＶ配列と比較された。この処理結果
では、選択されたプローブが非相同配列に対して７５％
以上の相同性を有していないことを示している。得られ
た結果は下記第１表に示されている。
各場合において、対形成可能塩基、“ミスマツチ”及び
“ギヤツブの数が示されている。
１“ミスマツチ”：水素結合形成に不適な塩基の対形成
；したがってこの対形成ハイブリッド形成領域の安定化
に役立たず、他方たびたび脱安定化作用を有する。
２“ギャップ”：２つの核酸領域で対形成させようとす
る場合、ハイブリッド形成領域の全体的安定性を最大化
するためには配列の一方において１個又は数個の非対形
成塩基を存在させることが必要になることもある；この
タイプの１ジヤンプ”（ｊ　ｕｍｐ）は通常ハイブリッ
ドの全体的安定性にとって否定的役割を果たす。
すべての場合がエラーシグナル又は障害背景ノイズの危
険性なしに高度に特異的なハイブリッド形成を保証して
いる。
夫藷開ユ ＨＰＶプローブと異なるウィルスＤＮＡとのハイブリッ
ドノ ＨＰＶ６ｂ、１１１６及び１８のゲノムをｐＢＲ３２２
でクローニングすることにより得た。
クローン６ｂ、１１．１６をＢａｍＨＩで切断し、クロ
ーン１８をＥｃｏＲＩで切断して、ｐＢＲ３２２からウ
ィルスのゲノム（約８　ｋｂ）を分離した。
ａ）又旦二ノ夏堰旧 クローン中におけるＨ’ＰＶゲノムの存在を制限により
確認した。次いでクローンを増幅させ、ＤＮＡを塩化セ
シウム勾配により精製した。
ｂ）アガロースゲル上でのＨＰＶウィルスＤＮＡ公立版 各ＤＮＡ２μｇを、クローン６ｂ、１１及び１６の場合
ＢａｍＨＩで又はクローン１８の場合ＥｃｏＲＩで切断
した。各ＤＮＡ２μｇを４つの０．８％アガロースゲル
（５００ｎｇＤＮＡ／クローン／ゲル）上において放射
性標識サイズラベル（ラムダＨｉｎｄ　ｍ−ＥｃｏＲＩ
）近くで隣接させかつ並行に再分配した。ＴＢＥＩＸ　
（）リス９０ｍＭ、ＥＤＴＡ２．５ｍＭ、ホウ酸９０ｍ
Ｍ、ｐｔ１８）中８０ボルトで３時間の移動後、ゲルを
３０分間（ＮａＯＨ０，５Ｍ、　ＮａＣ１Ｏ，５Ｍ）変
性し、水洗し、しかる後室温で３０分間（ＮａＣｆｆ　
１．５　Ｍ、　）リス）１ｃｊ！　０．５Ｍ、　ｐＨ８
）中和した。次いでゲルをワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ
）　３　Ｍ　Ｍ紙上に加え、サランラップでカバーし、
室温で１時間及び６０℃で１時間減圧乾燥させた。
Ｃ）３２ｐによる。　　・ＨＰＶプローブのＴ１．：　
　ヒＨＰＶ６ｂ、１１．１６及び１８に特徴的な合成オ
リゴマーを合成した。
サイズ　　温度 ＨＰＶ６ｂ　：　ＣＡＴＴＡＡＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＣ
ＣＴＧＡ＾　２２モノマ一７０℃１１ＰＶ１１　：　Ｇ
ＧＣＧＴＧＴＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＡＧ　　　２０−
Ｅツマ−７２℃ＨＰＶ１６　：　ＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡ
ＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴ　　　２０−Ｅツマ−６４℃ＨＰ
シ１８　：　ＣＧＧＴＡＴＣＣＧＣＴＡＣＴＣＡＧＣＴ
Ｔ　　　２０モノマー　６０℃これらの配列はＨＰＶの
非コード鎖と相補的である。
４種のオリゴマーを下記操作に従いキネ−ジョン（Ｋｉ
ｎａｔｉｏｎ）によって３２ｐで標識化した：各オリゴ
マー１μｇを最終容量３０μ！中ガンマ：１２ｐＡＴＰ
３０＃Ｃｉ　　（３０００Ｃｉ　／ｍｍｏｌ）　、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ５単位、ｐＨ８の６７ｍＭト
リスＨＣｌ１１０ｍＭ　　ＭｇＣｊ、　、１０ｍＭジチ
オスレイトールと混合し、３７℃で４５分間インキュベ
ートした。標識オリゴマーをセファデックスＧ　５０　
　（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　５０）クロマトグラフィー
により遊離ヌクレオチドから分離した。得られた特異的
活性は、反応に供されたオリゴマーｌμｇにつき６５Ｘ
１０’ｃｐｍであった。
ｄ）ゲル上における標識プローブとのハイブリ。
ドヅ アガロースゲルを、それらを水中に数分間浸漬すること
によってワットマン紙から分離した。各ゲルを、放射性
オリゴマー２　Ｘ　１０　”　ｃｐｍ／ｍ６．０、１％
ＳＤＳ、１００℃で１０分間変性されたすケ精子ＤＮＡ
　１００　ｐｇ／　ｍ（！、５ｘＳＳＰＥ（ＮａＣＡ　
０．９　Ｍ、、Ｎａ１ｌｚＰＯａ　、ＥＤＴＡ　５ｍＭ
、ｐＨ８）含有のハイブリッド形成用混合物５　ｍｌ中
で、４種の放射性標識オリゴマーのうち１種とハイブリ
ッド形成させた。インキュベートをシールされたプラス
チック製バンク中で行ない、浴中６０℃で１４時間攪拌
した。
ｅ）洗浄及び露朋 ゲルを環境温度で１５分間しかる後１時間の２回、６０
℃で１０分間、最後に環境温度で１時間にわたり６　ｘ
ｓｓｃ　（０，９Ｍ　ＮａＣ１，９０ｍＭクエン酸三ナ
トリウム、ｐＨ７）で洗浄した。１枚のワットマン紙上
におき、サランランプでカバー後、ゲルを２枚の強化ス
クリーン間で一７０℃にて１４時間露出下においた〔フ
ィルムコダックＸ−オーマットＳ　　（Ｘ　−ＯｍａＬ
Ｓ　）　）。
ｆ）痘果 クローンＨＰＶ６ｂ、１１．１６及び１８のＤＮＡ含有
の４つの同一ゲルは４種のオリゴマーのうち１種と各々
ハイブリッド形成した。ゲルＡではＨＰＶ６ｂのみがプ
ローブ６ｂで認識され；ゲルＢではＨＰＶ１１のみがプ
ローブ１１で認識され；ゲルＣではＨＰＶ１６のみがプ
ローブ１６で認識され；最後にゲルＤではＨＰＶ１８の
みがプローブ１８で認識されることが観察された。
各プローブは他のＨＰＶタイプを排除して対応ＨＰＶの
みを認識することが観察される（第１図）。
ヒトゲノムＤＮＡにおけるＨＰＶプローブのハイブリッ
ド式 更に、リンパ球から単離されたＥｃｏＲＩで切断された
ゲノムＤＮＡ４Ｘ１０μｇ及びＨＰＶクローン４種中１
種のＤＮＡ２００ｎｇを４つのゲル上に加えた。各ゲル
をゲル上に存在するＨＰＶタイプに対応したプローブと
ハイブリッド形成させ（陽性コントール）、前記のよう
に洗浄した。
７０時間の露出後、ヒトゲノムＤＮＡに関して試験され
た４タイプのプローブの特異的ハイブリッド形成は全く
痕跡はどにも検出されなかった（第２図）。
実籐桝土 すべての公知ＨＰ　Ｖタイプに共通したプローブとＨＰ
Ｖクローンとのハイブリラドン ａ）欠四勿ｍ裂 ＨＰ　Ｖ　６　ｂ、１１．１６及び１８のクローンをＢ
ａｍＨＩ又はＥｃｏＲＩで切断した。各クローン６００
ｎｇを４つのゲル上に平行にかつ他のクローンと隣接さ
せ、しかも放射性サイズトラヘルラムダＨｉｎｄ　１１
Ｉ　−ＥｃｏＲＩ　　（１５０ｎｇＤＮＡ／クローン／
ゲル）の近くに分配した。８０ボルトで３時間移動後、
ゲルを変性し、中和し、減圧乾燥させた。
ｂ）共通プローブ（３２Ｐで標識化されている。）のキ
ネ−ジョン 配列が公知であるすべてのウィルスタイプに共通した最
長配列をコンピューターで決定した。この共通配列は１
２塩基の断片であった。この断片は短かすぎるため、プ
ローブをこの断片から１流で６塩基（プローブ８の場合
は７塩基）及び下流で６塩基伸長させた。配列は下記の
とおりであったニ プローブ　　　　　　　サイズ　　社 １１ＰＶ１ａ　　ＡＴＧＣＴＴＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧ
ＴＴＡＣＴＴＴ　　　２４　　　６０℃ＨＰＶ６ｂ　　
　　ＡＧＧＡＣＣＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＡ
Ｇ　　　　　２４　　　　　　６４℃ＰＶＩ１ １１ＰＶ８　　　　　ＣＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＡＣＧＡ
ＡＡＧＴＡＴＣＴＴＡ　　　　２５　　　　　　６２℃
ＰＶ５ ＨＰν１６　　ＡＧＧＴＴＣＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴ
ＡＴＴＴＧＧ　　　２４　　　６４℃＋１ＰＶ１８　　
ＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧ　
　　２４　　　６２℃＋１ＰＶ３３　　ＧＴＧＣＡＣＴ
ＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴＴＴＧＣＣＧ　　　２４　　　
７０℃これらのプローブはコード鎖と相補的であった。
７’　＋’：Ｉ−プロｂ及び１１は完全同一であったた
め、２つのうち１つのみを合成した（プローブ６ｂ／１
１）。これらのプローブを前記キネ−ジョンにより３２
ｐで標識化した。
Ｃ）ゲルのハイブリッド杉」 各ゲルをシールされたプラスチック製バンク内の０．１
％ＳＤＳ、変性サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌｌ、５
ＸＳＳＰＥ含有のハイブリッド形成用混合物５　ｍｌ中
６０℃で１５時間にわたりプローブとハイブリッド形成
させた。
ハイブリッド形成用混合物Ａは各プローブ（１８、６ｂ
／１１．８１５′、１６．１８及び３３）　１０’　ｃ
ｐｍ　／　ｍｌを含有していた。
混合物Ｂはプローブ６ｂ／１１を除く各プローブ１０ｂ
ｃｐｍ　／　ｍｌを含有していた。
混合物Ｃはプローブ１６を除く各プローブ１１０６ｃｐ
　／　ｍｌを含有していた。
混合物りはプローブ１８を除く各プローブ１１０６Ｃｐ
　／　＠βを含有していた。
ｄ）１企及び五■ ４つのゲルを室温で１時間、６０℃で１０分間、しかる
後再度室温で１時間にねたり６ｘＳＳＣで洗浄した。ゲ
ルを２枚の強化スクリーン間において一８０℃で２時間
露出した。
ｅ）語法」ｊＬＨの− すべてのウィルスタイプに共通したプローブとＨＰＶク
ローンとのハイブリッド形成 １、　ラムダ　　ＨｉｎｄＩ［Ｉ−旦ｃｏＲＩ。
２、　　ＨＰＶ６ｂ　　　旦ａｍＨＩ。
３、　　１１ＰＶ１１　　　　ＢａｍＨＩ　。
４、　　ＨＰＶ１６　　　ＢａｍＨＩ　。
５、　　ＨＰＶ１８　　　　ＥｃｏＲＩＡ、すべてのプ
ローブ（１８、６ｂ／１１，１６．１８．３３）とハイ
ブリッド形成 り、プローブ６ｂ／１１を除くすべてのプローブとハイ
ブリッド形成 Ｃ，プローブ１６を除くすべてのプローブとハイブリッ
ド形成 り、プローブ１８を除くすべてのプローブとハイブリッ
ド形成 これらの結果は、共通プローブが実験においてすべての
プローブとハイブリッド形成し、しかも同一実験条件下
であっても共通配列の伸長端の特異性によりクローン間
の差異を識別しうろことを明確に示している。
夫嵐桝１ ＨＰＶ特異性プローブと様々なウィルスＤＮＡとのバイ
ブリソトノ （第二及び第三組のプローブ） ＨＰＶ６ｂ、１１．１６及び１８のゲノムをｐＢＲ３２
２でクローニングすることにより得た。
クローン６ｂ、１１．１６をＢａｍＨＩでかつクローン
１８をＥｃｏＲＩで切断し、ウィルスのゲノム（約８　
ｋｂ）をｐＢＲ３２２から分離した。
ａ）Ｌ旦二Ｚ叫壇太 クローン中におけるＨＰＶゲノムの存在は、リストリク
ジョンにより確認された。クローンは次いで、増大化さ
れ、ＤＮＡは、セシウムクロライド勾配により精製され
た。
ｂ）アガロースゲル上でのＨＰＶウィルスＤＮＡ■分剤 各ＤＮＡ１．６μｇをクローン６ｂ、１１及び１６の場
合ＢａｍＨＩで又はクローン１８の場合ＥｃｏＲＩで切
断した。各ＤＮＡ１．６．ｃｒｇを８つの０．８％アガ
ロースゲル（２００ｎｇＤＮＡ／クローン／ゲル）上に
おいて放射性標識サイズラベル（ラベルＨｉｎｄ　ｌ１
ｌ−ＥｃｏＲＩ）近くで隣接させかつ並行に分配した。
ＴＢＥＩＸ（）リス９０ｍＭ。
ＥＤＴＡ２．５ｍＭ、ホウ酸９０　ｍＭ、　ｐ）１８）
中８０ボルトで３時間の移動後、ゲルを３０分間（Ｎａ
ＯＨ０，５Ｍ、、ＮａＣｆ　１．５　Ｍ）変性し、水洗
し、しかる後室温で３０分間（ＮａＣ１１，５Ｍ、トリ
スＨＣβ０．５Ｍ、ｐＨ８）中和した。次いでゲルをワ
ットマン３ＭＭｍ上に加え、サランラップでカバーし、
室温で１時間及び６０℃で１時間減圧乾燥させた。
ｃ）”Ｐによる　０・ＨＰＶプローブの費福ウィルス　
　主ユ互ヱニ　　　　　長吏　血互　　遺伝ｌ」」叉Ｈ
ＰＶ６ｂ　　ＣＧＣＣＣＣＴＧＣＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴ
ＧＣＣ２２４７７６−４７５５Ｌ２　７０°ＣＨＰＶ１
１　　　ＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＧＧＡＧＡＧＣＴ
ＴＣ２３４６５９−４６３７Ｌ２　　　７０℃１（ＰＶ
１６　　ＣＡＧＴＡＧＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＴＣＴ（’
、ＴＧＧＴ　２４　６３２−６０９　　　Ｅ７　７０°
Ｃ１１ＰＶ１８　　　ＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡ
（：ＡＡＴＧＧＧ　　　　２２　５５０７−５４８６　
　　１．２　　７２°Ｃ更に、各々がヒトパピローマウ
ィルスのうち１タイプと特異的であるが但しこれらウィ
ルスの各々のゲノムのＥ　Ｔ　Ｓｉ域中に位置する第三
粗目のプローブを同様に合成した。
Ｅプローブ群： ウィルス　　オリゴマー　　　　　　１史　位１　遺旦
］Ｘ仄度）ＩＰＶ６ｂ　　　ＧＡＡＴＣＴＴＧＴＣＣＧ
ＴＣＣＡＣＴＴＣＧＴＣ２３６６３−６４１Ｅ７　　　
７０℃ＨＰＶ１１　　ＧＴＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴ
ＣＣＡＣＣＴＣＡ　　２３　６５６−６３４　　Ｅ７　
７０℃ＨＰＶ１６　　　ＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧ
ＡＧＴＣＡＣＡＣＴ　　　　２３　　７６２−７４０　
　　　Ｅ７　　　７０℃ＨＰＶ１８　　　ＣＴＣＡＡＴ
ＴＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＴＴＡＣＡＡ　　２５　　
８０８−７８４　　　　Ｅ７　　　７２℃これらの２組
において、プローブはＨＰ　”／の反対類に対応し、示
された位置は直接積上でマークされている。
８つのオリゴマーを下記操作に従いキネ−ジョンによっ
て１２ｐで（票識化した：各オリゴマー０．１μｇを最
終容計３０μ！中ガンマ”Ｐ　　ＡＴＰ３０μＣｉ　　
（３０００Ｃｉ　／ｍｍｏｌ）　、Ｔ４ポリヌタレオチ
ドキナーゼ５単位、ｐＨ８の６７　ｍ　Ｍ　トリス１Ｉ
ｃｆ　、　　１０ｍＭ　ＭｇＣ６ｚ　、ｌ　ＯｍＭジチ
オスレイトールと混合し、３７℃で４５分間インキュベ
ートした。標識オリゴマーをセファデックスＧ５０クロ
マトグラフイーにより遊離ヌクレオチドから分離した。
得られた特異的活性は、反応に供されたオリゴマー５Ｘ
１０８ｃｐｍ／μｇであった。
ｄ）ゲル上における標識プローブとのハイブリッド形 アガロースゲルを、それらを水中に数分間浸漬すること
によってワットマン紙から分離した。各ゲルを放射性オ
リゴマー２Ｘ　１０６ｃｐｍ　／　ｍ（１，０、１％Ｓ
ＤＳ、１００℃で１０分間変性されたサケ精子ＤＮＡＩ
　００１〜１ｇ／　ｍｌ、５ＸＳＳＰＥ（Ｎａ（ｌ　０
．９　Ｍ、　ＮａＨ，ＰＯ４５０ｍＭ、　Ｅ　ＤＴＡ５
ｍＭ、ｐＨ８）含有のハイブリッド形成用混合物Ｓ　ｍ
ｅ中で、４種の放射性標識オリゴマーのうち１種とハイ
ブリッド形成させた。インキュベートをシールされたプ
ラスチック製ハソグ中で行ない、浴中６５℃で約１４時
間撹拌した。
ｅ）先企及グＪ−ｊ＆ ゲルを室温で１５分間しかる後１時間の２回、６５℃で
１０分間、最後Ｇこ室温で１時間にねたり６ＸＳＳＣ（
０，９Ｍ　Ｎａ（１！、９０ｍＭクエン酸三ナトリウム
、ｐＨ７）で洗浄した。１枚のワットマン紙上におき、
サランラップでカバー後、ゲルを２枚の強化スクリーン
間で一７０℃にて２〜１４時間露出下においた（フィル
ムコダックＸ−オーマノドＳ）。
ｆ）猪果 クローンＨＰＶ６ｂ、１１．１６及び１８のＤＮＡを含
有した２組の４つの同一ゲルは、２組の特異的プローブ
のオリゴマー４種のうち１種と各々ハイブリッド形成し
た。ＨＰＶ６ｂのみがプローブ６ｂで認識され（第４Ａ
及び５Ａ図）、ＨＰＶｌｌのみがプローブ１１で認識さ
れ（第４Ｂ及び５Ｂ図）、ＨＰＶ１６のみがプローブ１
６で認識され（第４Ｃ及び５Ｃ図）、最後にＨＰ　Ｖ１
８のみがプローブ１８で認識される（第４Ｄ及び５Ｄ図
）ことが判明する。各プローブは他のＨＰ　Ｖタイプを
排除して対応ＨＰＶのみを認識した。
犬屓Ｉ鉗１ ＨＰＶ惑染感染検出感度を高めるために、専門科学誌で
現在ＰＣＲ（ポリチエイン反応（ｐｏｌｙｃｈａｉｎｒ
ｅａｃｔｉｏｎ）　）と呼ばれているＤＮＡ酵素的増幅
技術をＨＰＶのＤＮＡ増大用に適用した。
このステップは、本明細書中で前記された検出特異性を
残存させつつ感度を増加させることがねらいであった。
したがって、増幅用に選択されたウィルスゲノム領域は
Ｅ７遺伝子のプローブの標的セグメントであった。増幅
特異性は、プローブ標的配列の各端部において熱安定性
ポリメラーゼで重合化せしめられる出発配列を限定する
ことによって確保される。したがって、数対のプライマ
ーの各々の配列は、それらが関与するウィルスの遺伝子
断片を他のすべてを排除して特異的に増幅するように選
択された。しかも、その対形成に係わる各プライマーの
相対的位置は、各ウィルスＤＮＡに関する異なるサイズ
の断片を増幅させ、及び電気泳動ゲル上におけるそれら
の長さに基つ＜増幅断片の分離によってヒトパピローマ
ウィルスのタイプの迅速かつ直接的同定を可能ならしめ
るように選択された。プライマーの配列１γ択のための
他の基準は、熱安定性ポリメラーゼの至適機能温度にお
いて、増幅されるＤＮＡの相補的配列と特異的ハイブリ
ッド形成しうるにちがいないそれらの組成及び鎖長を考
慮することである。
酵素的増幅反応に際しオリゴマー性プライマーとして機
能する下記配列は、前記基準を考慮して規定された。
ｔ（ＰＶ１８の場合 ＧＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＡＴＴＧＣＧ　　　
　　６７３−６９４ＣＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＣＣ
ＡＧＣＴＧ　　　　　　７６２−７４２＋１ＰＶ５の場
合 １１　Ｐ　Ｖ　６　Ｉ（の場合 ＨＩ’　Ｖ　８の場合 １１ＰＶ１１の場合 １１ＰＶ１６の場合 ＨＰＶ１８の場合 ＋１ＰＶ３３の場合 同一実験でも、本発明の他のプローブの特異的、特に本
発明のウィルスサブグループの特異的プローブの特異性
を立証している。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のＨＰＶ合成プローブとｌ＋ＰＶウィ
ルスＤＮＡとの選択的ハイブリッド形成に対応したゲル
を表わす図面である。 第２図は、ゲノムＤＮＡと本発明の特異的＋１ＰＶプロ
ーブとのハイブリッド形成に対応したゲルを表わす図面
である。 第３図は、ＨＰＶクローンとすべてのウィルスタイプに
共通するプローブとのハイブリッド形成に対応したゲル
を表わす図面である。 第４図は、）（ＰＶ合成特異性プローブとＨＰＶウィル
スＤＮＡとの選択的ハイブリ・ノド形成について示す図
面である。 第５図は、ＨＰ　ＶゲノムＥ　７　’ｐＨ域に対する合
成プローブとＨＰＶウィルスのＤＮＡとの選択的）＼イ
ブリッド形成について示す図面である。 Ａ　　　　　　　　　　　Ｂ 嶋 ＩＧｊ ＩＧ−２ ！２１、 Ａ　　　　　　　　Ｂ づ〒　　　　　　　　　　　　　　　　キＣ（） ＦｉＣ，３ 、ａ　　　　　　　　　　　　　　ａ ｓ　　　番　　・　　Φ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、様々なタイプのヒトパピローマウイルス、特にＨＰ
    Ｖ１ａ、ＨＰＶ５、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ８、ＨＰＶ１１
    、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ３３を識別せずに
    検出するために有用な標識核酸配列からなる核酸プロー
    ブであって、１２個のヌクレオチドＸ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ
    −Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ（式中、ＸはＴ又はＵで
    ある）のオリゴマー又はその相補鎖を有することを特徴
    とする核酸プローブ。 ２、請求項１記載の異なるタイプのＨＰＶウィルスに共
    通した核酸プローブであって、 請求項１記載の１２個のヌクレオチドの共通配列をすべ
    て含み、各ウィルスタイプに対応するヌクレオチドで伸
    長された６種のオリゴマーの混合物であることを特徴と
    する核酸プローブ。 ３、１２個のヌクレオチドの共通配列が、８種のウィル
    スタイプの各々に対応する１〜１０個のヌクレオチドに
    より各端部において伸長されている請求項２記載の核酸
    プローブ。 ４、下記６種のオリゴマー： ＨＰＶ１ａの場合 Ａ−Ｘ−Ｇ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
    −Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−ＸＨＰＶ
    ６ｂ及びＨＰＶ１１の場合 Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
    −Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ−ＧＨＰＶ
    ８及びＨＰＶ５の場合 Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ
    −Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−ＡＨ
    ＰＶ１６の場合 Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
    −Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−ＧＨＰＶ
    １８の場合 Ａ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
    −Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｃ−Ａ−ＧＨＰＶ
    ３３の場合 Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｃ−ＡーＣ−Ｘ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ
    −Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ（Ｘ＝
    Ｔ又はＵ） 又はそれらの相補鎖の混合物である請求項３記載のプロ
    ーブ。 ５、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１ａタイプ検出用の
    特異的核酸プローブであって、 【遺伝子配列があります】 （Ｘ＝Ｔ又はＵ） 及びそれらの相補鎖の中から選択されるオリゴマーであ
    ることを特徴とするプローブ。 ６、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ５タイプ検出用の特
    異的核酸プローブであって、 【遺伝子配列があります】 （ＸはＴ又はＵ） 及びそれらの相補鎖の中から選択されるオリゴマーであ
    ることを特徴とするプローブ。 ７、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ６ｂタイプ検出用の
    特異的核酸プローブであって、 【遺伝子配列があります】 （Ｘ＝Ｔ又はＵ） 及びそれらの相補鎖の中から選択されるオリゴマーであ
    ることを特徴とするプローブ。 ８、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ８タイプ検出用の特
    異的核酸プローブであって、 【遺伝子配列があります】 （Ｘ＝Ｔ又はＵ） 及びそれらの相補鎖の中から選択されるオリゴマーであ
    ることを特徴とするプローブ。 ９、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１１タイプ検出用の
    特異的核酸プローブであって、 【遺伝子配列があります】 （Ｘ＝Ｔ又はＵ） 及びそれらの相補鎖の中から選択されるオリゴマーであ
    ることを特徴とするプローブ。 １０、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６タイプ検出用
    の特異的核酸プローブであって、 【遺伝子配列があります】 （Ｘ＝Ｔ又はＵ） 及びそれらの相補鎖の中から選択されるオリゴマーであ
    ることを特徴とするプローブ。 １１、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１８タイプ検出用
    の特異的核酸プローブであって、 【遺伝子配列があります】 （Ｘ＝Ｔ又はＵ） 及びそれらの相補鎖の中から選択されるオリゴマーであ
    ることを特徴とするプローブ。 １２、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ３３タイプ検出用
    の特異的核酸プローブであって、 【遺伝子配列があります】 （Ｘ＝Ｔ又はＵ） 及びそれらの相補鎖の中から選択されるオリゴマーであ
    ることを特徴とするプローブ。 １３、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ３３からなる
    ＨＰＶウィルスサブグループの特異的核酸プローブであ
    って、 下記オリゴマー： ＸＸＡＧＧＣＡＣＡＸＡＸＸＸＸ （Ｘ＝Ｔ又はＵ） 又はその相補鎖であることを特徴とするプローブ。 １４、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８からなるＨＰＶウィル
    スサブグループの特異的核酸プローブであって、 下記オリゴマー： ＡＸＡＸＣＡＡＡＸＡＸＸＡＧＸＧＡＡＧＸ（Ｘ＝Ｔ又
    はＵ） 又はその相補鎖であることを特徴とするプローブ。 １５、ＨＰＶ５及びＨＰＶ８からなるＨＰＶウィルスサ
    ブグループの特異的核酸プローブであって、 下記オリゴマー： 【遺伝子配列があります】 （Ｘ＝Ｔ又はＵ） もしくはその相補鎖又は ＸＡＸＧＧＣＡＧＸＧＣＸＧＧＸＧＸＡＸＸＸＸＸＸＧ
    （Ｘ＝Ｔ又はＵ） のような１８〜３５個のオリゴマーからなる後半の断片
    もしくはその相補鎖であることを特徴とするプローブ。 １６、プローブが、＾３＾２ｐのような放射性標識及び
    ビオチンのような酵素標識の中から特に選択されるＤＮ
    Ａ又はＲＮＡプローブの標識化のための公知の方法のう
    ち１つによって標識化されている、請求項１〜１５のい
    ずれか一項に記載の核酸プローブ。 １７、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプローブ
    によるＨＰＶウィルスタイプ又はＨＰＶウィルスサブグ
    ループの検出方法であって、最初に二重カテナリー性で
    あるならば場合により予め変性された上記ＨＰＶウィル
    スのＰＮＡ又はＲＮＡ配列で上記プローブをハイブリッ
    ド形成させることを特徴とする方法。 １８、下記オリゴマー性プライマー： ▲数式、化学式、表等があります▼ によるＰＣＲ増幅方法を用いる、請求項１７記載の検出
    方法。
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