JP2015109860A - 標的核酸の存在を判別するための合成プローブを用いた組成物、方法、およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、すべてその全体が参照により組み入れられる米国特許仮出願第61/045,952号(2008年4月17日に出願);同第61/113,841号(2008年11月12日に出願);および同第61/147,862号(2009年1月28日に出願)に対して優先権を主張する。
本発明は、生物試料中の標的核酸の存在を判別するための合成プローブを用いた組成物、方法、およびキットに関する。
特定の核酸配列および配列変更の検出および特徴付けは、感染症を示すウイルス核酸配列または細菌核酸配列の存在、疾患および癌に関連した哺乳動物遺伝子の変種または対立遺伝子の存在、ならびに法医学試料中に存在する核酸の供給源の正体(identification)を検出するため、ならびに父子鑑定において利用されてきた。
1つの局面において、本発明は、試料中の標的核酸の存在を判別するための方法を提供する。この方法は以下の段階を含む:
(a) 標的核酸の変種にはハイブリダイズしない1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが試料中の標的核酸とハイブリダイズして二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブを試料と接触させる段階;および
(b) 二本鎖核酸ハイブリッドを検出する段階であって、二本鎖核酸ハイブリッドを二本鎖核酸ハイブリッドに免疫特異的である第1の抗ハイブリッド抗体と接触させる段階を含み、二本鎖核酸ハイブリッドの検出によって試料中の標的核酸を判別する、段階。
本発明者らは、生物試料中の標的核酸の存在を判別するための合成プローブを用いた新規な方法、組成物、およびキットを発見した。本発明はまた、試料中の標的核酸を検出するために有用な合成プローブも提供する。本発明は、様々な使用の中でも特に、病原生物の検出および同定を非限定的に含む臨床診断目的のための新規な検出方法、組成物、およびキットの使用を含む。
(a) 標的核酸の変種にはハイブリダイズしない1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが試料中の標的核酸とハイブリダイズして二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブを試料と接触させる段階;および
(b) 二本鎖核酸ハイブリッドを検出する段階であって、二本鎖核酸ハイブリッドを二本鎖核酸ハイブリッドに免疫特異的である第1の抗ハイブリッド抗体と接触させる段階を含み、二本鎖核酸ハイブリッドの検出によって試料中の標的核酸を判別する、段階。
本発明によれば、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが試料中の標的核酸とハイブリダイズして二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分な条件下で、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブを試料と接触させる。一定の態様において、標的核酸はDNAであり、プローブはRNAである。一定の態様において、RNAプローブは、完全長の転写されたRNAプローブとは対照的に短いプローブである。これらの短いプローブは、本明細書においてしばしば合成RNAプローブまたは「synRNA」と呼ばれる。
本発明の方法は、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが試料中の標的核酸とハイブリダイズして二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブを試料と接触させる段階を含む。好ましくは、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブは、中和ハイブリダイゼーション緩衝液としても作用し得るプローブ希釈液中で希釈される。この希釈液は、プローブを溶解し希釈するために使用され得、また、試料をほぼ中性のpH、例えば、約pH6〜約pH9に回復させてハイブリダイゼーションにとってより都合の良い環境を提供するのを助け得る。十分な体積、好ましくは2分の1体積量のプローブ希釈液を用いて、1と2分の1体積量の塩基処理した試料を中和することができる。好ましくは、プローブ希釈液は、2-[ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]エタンスルホン酸(BES, Sigma, St. Louis, Mo.)/酢酸ナトリウム緩衝液である。最も好ましくは、プローブ希釈液は、2M BES、1M酢酸ナトリウム、0.05%の抗菌剤NaN3、5mMの金属キレート剤EDTA、0.4%の界面活性剤Tween(商標)-20、およびハイブリダイゼーション促進物質である20%硫酸デキストランの混合物である。プローブ希釈液のpHは、約5〜約5.5でよい。
本発明に従って形成された二本鎖核酸ハイブリッドは、二本鎖核酸ハイブリッドに免疫特異的である抗体を用いて検出することができる。抗体は、限定されるわけではないがRNA/DNA;DNA/DNA;RNA/RNA;およびそれらの模倣体などの二本鎖ハイブリッドに免疫特異的であり、この場合、本明細書において定義する「模倣体」とは、RNA/DNAハイブリッド、DNA/DNAハイブリッド、またはRNA/RNAハイブリッドと同様に挙動する分子を意味する。使用される抗二本鎖核酸ハイブリッド抗体(すなわち、「抗ハイブリッド」抗体)は、形成された二本鎖核酸ハイブリッドのタイプに依存する。1つの態様において、抗体は、RNA/DNAハイブリッドに免疫特異的である。
他の局面において、本発明は、本発明の方法を実施するために必要な構成要素および試薬を含むキットを提供する。キットは、次の内の少なくとも1つを含んでよい:剥離細胞試料を採取するためのdacronスワブのような不活性な試料採取器具;解析するために実験室へと輸送する間、試料を安定化させるための試料搬送培地;塩基、または加水分解試薬;判別対象である標的核酸に特異的な1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブ;中和プローブ希釈液;抗ハイブリッド抗体でコーティングした試験管;および任意の必要な対照。
HPV 18 DNAまたはHPV 16 DNAに特異的なRNAプローブを同定するために用いるツールとしてOligoarray 2.0を選択した。この場合、ハイリスク型およびローリスク型のHPV:1、2、3、4、5、6、8、11、13、16、18、26、30、31、33、34、35、39、40、42、43、44、51、52、53、54、56、58、59、61、62、66、67、68、69、70、71、72、73、74、81、82、83、84、および89に対して検査され得る配列データベースが提供された。次いで、関心対象の配列、すなわちHPV 16またはHPV 18をそのデータベースに対してBLAST検索して、同一性のある任意の領域を検索し、類似性を保存した。次に、指定された長さのリボヌクレオチドについてTmおよび%GCを算出し、パラメーターと比較し、その後、二次構造を検査した。BLASTによって決定した類似性を用いて、Mfoldパッケージによってクロスハイブリダイゼーションをチェックした。
本質的には表16に記載するようにして、ハイブリダイゼーションおよび検出のプロトコールを実施した。
ばらつきをできるだけ無くすために、データを(S-N)/Nとして解析し、(S/N)-1として表した。シグナル=ノイズである場合、データ値=0.0。
表17に示すように、HPV 18用に設計された合成RNAプローブ(synRNA)は、109個のコピー/アッセイ法(200ng/ml)になるまで、HPV 6ともHPV 16とも交差反応性を示さなかった。synRNA=HPV18 DNAのカバー率3.7kb;25mer、ハイブリダイゼーション時の最終濃度1.34nM。
HPV45は特異性設計の一部分ではなかったため、HPV 18 synRNAはHPV45に対して特異的になるようには設計しなかった。したがって、表18に示すように、HPV 18用のsynRNAがHPV 45プラスミドに対して交差反応性を示すのは、プラスミドコピーが106個〜107個の間になってからのみであった。synRNA=HPV18 DNAのカバー率3.7kb;25mer、ハイブリダイゼーション時の最終濃度1.34nM。
表19に示すように、HPV16 synRNAは、109個のコピー/アッセイ法(200ng/ml)になるまで、HPV 6もHPV 18もHPV 45も検出することができない。synRNA =HPV16 DNAのカバー率3.175kb;25mer、ハイブリダイゼーション時の最終濃度1.34nM。
約0.5kbのカバー率の特異的な25merプローブを、HPV 16、HPV 18、HPV 31、およびHPV 45のために提供した。図2に示すように、各HPV型は、コピー106個の際に検出された。synRNAプローブは、どのHPV型が望ましいとしても、当然、それらの検出に同様に適用可能である。
synRNAプローブの合計カバー率は、アッセイ法のシグナルに影響を与えた。カバー率を上げるとシグナルは非直線的に強まった。これは、より多くのsynRNAプローブがハイブリダイズされるため、塩基スタッキング効果が生じ、一本鎖DNA標的の二次構造がゆるむことによる可能性が高い。図3に示すように、3.7kbのカバー率で、検出感度は5,000コピー/アッセイ法であった。
図4に示すように、synRNAの濃度を上昇させると、検出感度が上昇した。25mer synRNAオリゴのTmは約45〜約60℃であった。プローブ濃度を上昇させるとTmが上昇し、その結果、ハイブリダイゼーションがより効率的になった。synRNA=3.7kbのカバー率;25mer、濃度は図4に示す濃度。
図5に示すように、カバー率が等しいことを前提とすると、長いsynRNAの方が、高い感度を与えた。
図6に示すように、synRNAプローブが隣接した領域を標的とするほど、感度が上昇した。特定の理論に固執するわけではないが、1つのプローブが結合して標的鎖の二次構造がゆるみ、隣接したsynRNAがハイブリダイゼーションするのにさらに接近しやすい鋳型を提供するために、ハイブリダイゼーション効率が改善したと考えられている。
図7に示すように、約3.175kbのカバー率のHPV16 synRNAおよび約3.7kbのカバー率のHPV18は、ほぼ同じ結果をもたらした。どちらのsynRNAも、5,000コピーの濃度で各自の標的を検出することができた。
TOMアミダイト化学反応(Operon Biotechnologies, Inc., Huntsville, AL)またはtBDMS化学反応(Integrated DNA Technologies (IDT))によってsynRNAを調製した。図8に示すように、様々な化学合成方法を用いて、品質が類似した25merを提供することができる。
synRNAから生じるRNA依存性のバックグラウンドが無いため、所望の場合はハイブリダイゼーション温度を低下させて、抗体/抗原相互作用のための許容性がより高い条件を提供することができる(図9)。
synRNAは、大部分は二次構造を持たない。これにより、長いRNA二次構造を認識する抗RNA:DNAハイブリッド抗体から生じる、非特異的なRNAに基づくバックグラウンドが排除される。DNAに結合されていないRNAはバックグラウンドシグナルにもはや寄与しないため、このアッセイ法においてRNase Aを使用することは不要となる(図10)。
この方法により、特異性およびバックグラウンドの低減が提供された。この方法は、RNaseを必要とせず、SurePath、PC、STM、およびDCMを含む様々な培地に適合性がある。
標的増幅構成要素を含めることにより、感度が増強された。この方法では、HPV核酸標的を含むわずか10コピーのHPVプラスミドまたはわずか10個のSiHa細胞を検出した。この方法はまた、強い特異性、すなわち、他のすべてのハイリスクHPV型およびローリスクHPV型からHPV 16プラスミドまたはHPV 18プラスミドを区別する能力を提供した。
別の態様において、合成の型特異的ビオチン標識DNAプローブを用いて、標的mRNAとの二本鎖ハイブリッドを形成させる(図15)。ハイブリッドは、磁性ストレプトアビジンビーズ上に捕捉される。シグナルの増幅および検出は、抗ハイブリッド抗体/アルカリホスファターゼを用いて実施し、結果として生じる化学発光シグナルを検出する。
前もって変性させた試料をマルチウェルプレートに移す。変性させた試料に、中和溶液に溶かしたプローブを添加し、振盪しながら室温で約1分間インキュベートして、試料を中和する。標的DNAが合成RNAプローブにハイブリダイズでき、また、固定された抗体によって捕捉され得るように、中和した試料を、固定された抗RNA:DNAハイブリッド抗体を含むプレートに移す。インキュベーションは、約55℃で約120分間である。アルカリホスファターゼと結合させた抗RNA:DNAハイブリッド抗体を室温で添加し、約30分間インキュベートする。結合された抗体の段階の後に、プレートを約12分間洗浄する。ジオキセタン基質を添加し、15分間インキュベートする。次いで、ルミノメーターを用いてプレートを読み取る。
[本発明1001]
以下の段階を含む、試料中の標的核酸の存在を判別するための方法:
(a) 該標的核酸の変種にはハイブリダイズしない1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが該試料中の該標的核酸とハイブリダイズして二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、該1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブを試料と接触させる段階;および
(b) 二本鎖核酸ハイブリッドに免疫特異的である第1の抗ハイブリッド抗体と該二本鎖核酸ハイブリッドを接触させることを含む、該二本鎖核酸ハイブリッドを検出する段階であって、該二本鎖核酸ハイブリッドの検出によって該試料中の該標的核酸を判別する、段階。
[本発明1002]
前記検出する段階が、二本鎖核酸ハイブリッドに免疫特異的である第2の抗ハイブリッド抗体を提供することをさらに含み、該第2の抗ハイブリッド抗体が、検出可能となるように標識されている、本発明1001の方法。
[本発明1003]
少なくとも1つの前記プローブおよび前記抗ハイブリッド抗体が同じ段階で添加される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記標的核酸がHPV核酸である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記HPV核酸がハイリスクHPV型のHPV DNAである、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記HPV型がHPV 16であり、前記変種が、HPV 1、HPV 2、HPV 3、HPV 4、HPV 5、HPV 6、HPV 8、HPV 11、HPV 13、HPV 18、HPV 26、HPV 30、HPV 31、HPV 33、HPV 34、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 62、HPV 66、HPV 67、HPV 68、HPV 69、HPV 70、HPV 71、HPV 72、HPV 73、HPV 74、HPV 81、HPV 82、HPV 83、HPV 84、およびHPV 89からなる群より選択される型の核酸である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記HPV型がHPV 18であり、前記変種が、HPV 1、HPV 2、HPV 3、HPV 4、HPV 5、HPV 6、HPV 8、HPV 11、HPV 13、HPV 16、HPV 26、HPV 30、HPV 31、HPV 33、HPV 34、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 62、HPV 66、HPV 67、HPV 68、HPV 69、HPV 70、HPV 71、HPV 72、HPV 73、HPV 74、HPV 81、HPV 82、HPV 83、HPV 84、およびHPV 89からなる群より選択される型の核酸である、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記HPV型がHPV 45であり、前記変種が、HPV 1、HPV 2、HPV 3、HPV 4、HPV 5、HPV 6、HPV 8、HPV 11、HPV 13、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 30、HPV 31、HPV 33、HPV 34、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 62、HPV 66、HPV 67、HPV 68、HPV 69、HPV 70、HPV 71、HPV 72、HPV 73、HPV 74、HPV 81、HPV 82、HPV 83、HPV 84、およびHPV 89からなる群より選択される型の核酸である、本発明1005の方法。
[本発明1009]
前記HPV型がhrHPV型であり、前記変種がローリスクHPV型の核酸である、本発明1005の方法。
[本発明1010]
前記1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:1〜2026からなる群より選択される配列またはその相補体から本質的になる、本発明1005の方法。
[本発明1011]
以下の段階を含む、試料中のHPV 18 DNAの存在を判別するための方法:
(a) 1つまたは複数のポリヌクレオチドを該試料中の対応する相補的核酸配列にアニールさせて二本鎖核酸ハイブリッドを形成させるのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブまたはその相補体を該試料と接触させる段階であって、該1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:163〜309からなる群より選択される少なくとも1つの核酸配列を含む核酸プローブのセットである、段階;および
(b) 二本鎖核酸ハイブリッドを検出する段階であって、該二本鎖核酸ハイブリッドの検出によって該試料中のHPV 18 DNAの存在が示される、段階。
[本発明1012]
以下の段階を含む、試料中のHPV 16 DNAの存在を判別するための方法:
(a) 1つまたはポリヌクレオチドを該試料中の対応する相補的核酸配列にアニールさせて二本鎖核酸ハイブリッドを形成させるのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブまたはその相補体を該試料と接触させる段階であって、該1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:1〜162からなる群より選択される少なくとも1つの核酸配列を含む核酸プローブのセットである、段階;および
(b) 二本鎖核酸ハイブリッドを検出する段階であって、該二本鎖核酸ハイブリッドの検出によって該試料中のHPV 16 DNAの存在が示される、段階。
[本発明1013]
以下の段階を含む、試料中のHPV 45 DNAの存在を判別するための方法:
(a) 1つまたは複数のポリヌクレオチドを該試料中の対応する相補的核酸配列にアニールさせて二本鎖核酸ハイブリッドを形成させるのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブまたはその相補体を該試料と接触させる段階であって、該1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:842〜974からなる群より選択される少なくとも1つの核酸配列を含む核酸プローブのセットである、段階;および
(b) 二本鎖核酸ハイブリッドを検出する段階であって、該二本鎖核酸ハイブリッドの検出によって前記試料中のHPV 45 DNAの存在が示される、段階。
[本発明1014]
SEQ ID NO:1〜162 (HPV 16); 163〜309(HPV 18); 842〜974(HPV 45); 310〜454(HPV 31); 455〜579(HPV 33); 580〜722(HPV 35); 723〜841(HPV 39); 975〜1120(HPV 51); 1121〜1252(HPV 52); 1253〜1367(HPV 56); 1368〜1497(HPV 58); 1498〜1646(HPV 59); 1647〜1767(HPV 66); 1768〜1875(HPV 68);および1876〜2026(HPV 82)からなる群より選択される、プローブセット。
[本発明1015]
前記1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:1〜2026に示すプローブを含むプローブセットの混合物である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記ハイブリダイゼーションが約45〜約55℃で実施される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
本発明1014のプローブセットを含む、キット。
Claims (17)
- 以下の段階を含む、試料中の標的核酸の存在を判別するための方法:
(a) 該標的核酸の変種にはハイブリダイズしない1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが該試料中の該標的核酸とハイブリダイズして二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、該1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブを試料と接触させる段階;および
(b) 二本鎖核酸ハイブリッドに免疫特異的である第1の抗ハイブリッド抗体と該二本鎖核酸ハイブリッドを接触させることを含む、該二本鎖核酸ハイブリッドを検出する段階であって、該二本鎖核酸ハイブリッドの検出によって該試料中の該標的核酸を判別する、段階。 - 前記検出する段階が、二本鎖核酸ハイブリッドに免疫特異的である第2の抗ハイブリッド抗体を提供することをさらに含み、該第2の抗ハイブリッド抗体が、検出可能となるように標識されている、請求項1記載の方法。
- 少なくとも1つの前記プローブおよび前記抗ハイブリッド抗体が同じ段階で添加される、請求項1記載の方法。
- 前記標的核酸がHPV核酸である、請求項1記載の方法。
- 前記HPV核酸がハイリスクHPV型のHPV DNAである、請求項4記載の方法。
- 前記HPV型がHPV 16であり、前記変種が、HPV 1、HPV 2、HPV 3、HPV 4、HPV 5、HPV 6、HPV 8、HPV 11、HPV 13、HPV 18、HPV 26、HPV 30、HPV 31、HPV 33、HPV 34、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 62、HPV 66、HPV 67、HPV 68、HPV 69、HPV 70、HPV 71、HPV 72、HPV 73、HPV 74、HPV 81、HPV 82、HPV 83、HPV 84、およびHPV 89からなる群より選択される型の核酸である、請求項5記載の方法。
- 前記HPV型がHPV 18であり、前記変種が、HPV 1、HPV 2、HPV 3、HPV 4、HPV 5、HPV 6、HPV 8、HPV 11、HPV 13、HPV 16、HPV 26、HPV 30、HPV 31、HPV 33、HPV 34、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 62、HPV 66、HPV 67、HPV 68、HPV 69、HPV 70、HPV 71、HPV 72、HPV 73、HPV 74、HPV 81、HPV 82、HPV 83、HPV 84、およびHPV 89からなる群より選択される型の核酸である、請求項5記載の方法。
- 前記HPV型がHPV 45であり、前記変種が、HPV 1、HPV 2、HPV 3、HPV 4、HPV 5、HPV 6、HPV 8、HPV 11、HPV 13、HPV 16、HPV 18、HPV 26、HPV 30、HPV 31、HPV 33、HPV 34、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 62、HPV 66、HPV 67、HPV 68、HPV 69、HPV 70、HPV 71、HPV 72、HPV 73、HPV 74、HPV 81、HPV 82、HPV 83、HPV 84、およびHPV 89からなる群より選択される型の核酸である、請求項5記載の方法。
- 前記HPV型がhrHPV型であり、前記変種がローリスクHPV型の核酸である、請求項5記載の方法。
- 前記1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:1〜2026からなる群より選択される配列またはその相補体から本質的になる、請求項5記載の方法。
- 以下の段階を含む、試料中のHPV 18 DNAの存在を判別するための方法:
(a) 1つまたは複数のポリヌクレオチドを該試料中の対応する相補的核酸配列にアニールさせて二本鎖核酸ハイブリッドを形成させるのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブまたはその相補体を該試料と接触させる段階であって、該1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:163〜309からなる群より選択される少なくとも1つの核酸配列を含む核酸プローブのセットである、段階;および
(b) 二本鎖核酸ハイブリッドを検出する段階であって、該二本鎖核酸ハイブリッドの検出によって該試料中のHPV 18 DNAの存在が示される、段階。 - 以下の段階を含む、試料中のHPV 16 DNAの存在を判別するための方法:
(a) 1つまたはポリヌクレオチドを該試料中の対応する相補的核酸配列にアニールさせて二本鎖核酸ハイブリッドを形成させるのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブまたはその相補体を該試料と接触させる段階であって、該1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:1〜162からなる群より選択される少なくとも1つの核酸配列を含む核酸プローブのセットである、段階;および
(b) 二本鎖核酸ハイブリッドを検出する段階であって、該二本鎖核酸ハイブリッドの検出によって該試料中のHPV 16 DNAの存在が示される、段階。 - 以下の段階を含む、試料中のHPV 45 DNAの存在を判別するための方法:
(a) 1つまたは複数のポリヌクレオチドを該試料中の対応する相補的核酸配列にアニールさせて二本鎖核酸ハイブリッドを形成させるのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブまたはその相補体を該試料と接触させる段階であって、該1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:842〜974からなる群より選択される少なくとも1つの核酸配列を含む核酸プローブのセットである、段階;および
(b) 二本鎖核酸ハイブリッドを検出する段階であって、該二本鎖核酸ハイブリッドの検出によって前記試料中のHPV 45 DNAの存在が示される、段階。 - SEQ ID NO:1〜162 (HPV 16); 163〜309(HPV 18); 842〜974(HPV 45); 310〜454(HPV 31); 455〜579(HPV 33); 580〜722(HPV 35); 723〜841(HPV 39); 975〜1120(HPV 51); 1121〜1252(HPV 52); 1253〜1367(HPV 56); 1368〜1497(HPV 58); 1498〜1646(HPV 59); 1647〜1767(HPV 66); 1768〜1875(HPV 68);および1876〜2026(HPV 82)からなる群より選択される、プローブセット。
- 前記1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NO:1〜2026に示すプローブを含むプローブセットの混合物である、請求項1記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーションが約45〜約55℃で実施される、請求項1記載の方法。
- 請求項14記載のプローブセットを含む、キット。
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