CN103597095B - 用于检测hpv核酸的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了能够与HPV16和/或HPV18核酸，特别是编码E2和E6-7基因产物的mRNA杂交的核酸。此类核酸可用于从生物学样品分离RNA的方法、用于检测生物学样品中特定RNA剪接形式变体的存在的方法和手段、用于测定生物学样品中RNA比率的相对比率的方法和手段、用于预测癌前宫颈损伤进展的方法和手段、和用于检测基因或基因表达破坏的方法和手段。

Description

用于检测HPV核酸的材料和方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年2月24日提交的美国临时申请No.61/446,306及还有2011年5月13日提交的美国临时申请No.61/486,118的优先权，其在此都通过提及完整并入。
发明背景
1.领域
本公开内容涉及用于测定样品中核酸存在的方法、组合物和试剂盒，所述核酸包括源自人乳头瘤病毒(HPV)的核酸。
2.相关技术的描述
人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的最重要原因，其中13类引起HPV相关宫颈疾病和癌症。使用分子测试针对致癌性HPV DNA的筛选已经可用于诊断HPV相关疾病。然而，目前的测试方法不能精确预测哪些感染可以形成癌症，因为大多数HPV感染是短暂的，并且自发消退和清除。因此，探索其它生物标志物以在反射测定法(reflex assay)中使用以确认哪些感染会进展并且需要进一步治疗。
疾病进展可以与某些HPV基因的表达相关。因此，HPV mRNA的检测可以是重度感染的别的生物标志物。开发用于诊断学的一些HPV mRNA测定法检测单一类型的转录物种类，诸如E6或E7致癌性序列。这些测定法不能预测重度感染，因为单一种类的丰度可以变动，这是由于在疾病过程期间发生的复杂表达样式，或由于免疫应答对HPV的降解所致。另外，mRNA靶物在收集后可能降解，或者收集标本中的感染细胞数据可能较低，这两者可以影响测定结果。作为一种解决办法，设计用于同时检测一定比率的两种mRNA种类的HPV测定法可以比检测单一mRNA种类的测定法更能预测疾病。
另外，HPV DNA通常以每个细胞50-100个拷贝以环状附加体状态以生产性感染维持。在此状态中，HPV癌基因E6和E7的转录受到E2蛋白紧密控制。E6和E7分别靶向p53和pRb，并且如此干扰正常的细胞周期。消除此转录控制的细胞由于其加速再进入细胞周期中而比其它细胞具有增殖优势。
破坏或删除E2基因(如经常在病毒整合入宿主基因组中期间发生的)消除对E6和E7的负反馈，活化端粒末端转移酶，并脱阻抑hTERT表达，并且如此明显促成细胞永生化的进展及最终癌症进展。
已经利用特定核酸序列和序列变化的检测和表征来检测指示感染的病毒或细菌核酸序列的存在、与疾病和癌症有关的哺乳动物基因的变体或等位基因的存在、和法庭样品中及亲子关系测定中找到的核酸来源的鉴定。牵涉正常生物学过程的RNA种类的表征对于了解各种了解很少的生物学过程可以是重要的。
RNA(例如信使RNA、转运RNA、核糖体RNA、小核RNA、和其它RNA)的检测和表征在许多领域中是一种重要的工具，所述领域包括分子生物学、毒理学和生物化学。信使RNA(mRNA)是一种必需的功能性细胞组分；在基因表达过程期间，mRNA的功能性单链结构被合成，并且充当在蛋白质合成中用于翻译过程的中间模板。mRNA分子的短暂存在以DNA转录成RNA分子开始，并且最终以降解结束。在其寿命期间，mRNA分子在翻译前也可以加工，编辑，并转运。剪接是修饰前mRNA以除去称作内含子的非编码序列的某些区段的过程；保留的区段可以包含蛋白质编码序列，并且称作外显子。有时，可以以几种不同方式剪接前mRNA信息，容许单一转录物编码多种蛋白质。
信使RNA(mRNA)的检测在诊断学中是重要的，因为它可以提供DNA检测不能提供的病毒载量和基因表达信息。这些因素经常给出关于疾病进展和预后的线索。目前用于mRNA检测的技术呈现许多问题，包括复杂性和污染潜力。
最常见的mRNA检测方法包括Northern印迹、核糖核酸酶保护测定法(RPA)和逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。然而，这些中每种技术虽然在灵敏性上提供一些优点，但是需要时间和材料要求。另外，一些技术需要扩增靶mRNA，因为总mRNA仅占总RNA的约1%，并且任何特定的mRNA是小得相当多的百分比。
目前，逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)广泛用于表征RNA转录物。然而，所述方法具有下列限制：1)仅可以共扩增有限数目的特定区；2)突变或可变剪接可以限制特异性引物检测RNA的能力；及3)难以以连续模式方法表征mRNA结构。
因此，具有能够测定给定核酸在样品中存在或缺乏的材料和方法会是有用的。另外，具有能够测定基因(包括HPV E2基因)是否受到破坏、删除、或以其它方式不在宿主细胞中表达的材料和方法会是有用的。
发明概述
本公开内容提供了可用于检测样品中的特定核酸及测定那些核酸是否完整或受到破坏的核酸和方法。
在一个方面，提供了分离的核酸，其具有不超过200个核苷酸的总体长度且包含至少一种与选自下组的核苷酸序列具有至少75%同源性的核苷酸序列、基本上由所述至少一种核苷酸序列组成或由所述至少一种核苷酸序列组成：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:111至SEQ ID NO:308、其RNA等同物及其互补物。
在一个方面，提供了一种检测靶RNA存在的方法，该方法包括：a)提供至少一种DNA捕捉探针，其中所述至少一种DNA捕捉探针与支持物结合；b)使所述靶RNA与所述至少一种DNA捕捉探针杂交，生成靶RNA:DNA捕捉探针复合物；c)分离所述靶RNA:DNA捕捉探针复合物；d)提供至少一种DNA放大探针，并使所述至少一种DNA放大探针与所述靶RNA:DNA捕捉探针复合物杂交，生成靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物；e)提供抗RNA:DNA杂合物抗体，并将所述靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物与所述抗体一起温育，生成靶RNA:DNA:抗体复合物；f)检出所述抗体，其中所述检出指示所述靶RNA的存在。在一个方面，抗体与可检测标志物缀合，并且检测步骤包括检测标志物。在一个方面，可检测标志物选自下组：碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。在一个方面，检测步骤包括提供结合所述抗RNA:DNA杂合物抗体的第二抗体，其中所述第二抗体与可检测标志物缀合，且其中所述检测进一步包括检测标志物。在一个方面，支持物包含磁珠。在一个方面，磁珠与至少一种链霉抗生物素蛋白分子缀合，并且至少一种DNA捕捉探针与生物素分子缀合。在一个方面，至少一种捕捉探针和/或放大探针是核酸探针，如上文所列的。
在一个方面，至少一种DNA捕捉探针和至少一种DNA放大探针的长度是约15至约200个碱基。
在一个方面，靶RNA是剪接变体，并且选择至少一种DNA捕捉探针和至少一种DNA放大探针以检测所述剪接变体的存在。
在一个方面，至少一种DNA捕捉探针和至少一种DNA放大探针与来自HPV高风险型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,26,66,73和82的RNA互补。
在另一个方面，提供了用于检测靶RNA的试剂盒，该试剂盒包含：a)至少一种DNA捕捉探针，其与磁性支持物结合；b)至少一种DNA放大探针；c)抗RNA:DNA杂合物抗体；和d)检测试剂。在一个方面，所述抗RNA:DNA杂合物抗体与可检测标志物缀合，并且所述检测试剂包含所述可检测标志物的底物。在一个方面，试剂盒进一步包含结合所述抗RNA:DNA杂合物抗体的二抗，其中所述二抗与可检测标志物缀合，且其中所述检测试剂包含所述可检测标志物的底物。
本公开内容提供了提供靶RNA进行检测的方法，该方法包括：将含有靶RNA的生物学样品与羧基珠一起温育；将珠分离；裂解附着于分离珠的生物学样品；并从裂解的生物学样品分离珠，其中所得的上清液含有用于检测的靶RNA。
在另一个方面，公开了用于核酸检测的方法，其不依赖于靶物扩增。通过特异性核酸寡核苷酸捕捉感兴趣的核酸。如下提供信号放大，即添加覆盖捕捉的RNA靶物的DNA探针(或者靶物是DNA，反之亦然)，然后使用能够特异性结合DNA:RNA杂合物的实体检测。此杂合物捕捉测定法随转录物的量和长度增加而给出信号的线性升高。因此，它可以用于测量现有技术不能测量的删除。通过测定靶核酸破坏的程度，与来自完整的参照核酸组的总体信号相比，能够测定靶物是否受到破坏及靶物受到破坏的程度。
在一个方面，通过将样品至少分成第一和第二部分测定对靶物的破坏。在足以生成两组DNA:RNA杂合物的条件下处理样品的第一部分：一组包含靶核酸，而一组包含至少一种参照核酸。然后，在足以生成包含参照核酸的DNA:RNA杂合物组，而非包含靶核酸的组的条件下处理样品的第二部分。然后，比较样品的第一部分中DNA:RNA杂合物的总量与样品的第二部分中DNA:RNA杂合物的总量。若靶核酸是缺少的，则在样品的第一和第二部分中应当有相同量的DNA:RNA杂合物。还呈现了用于测定破坏(若有的话)程度的方法变化，其通过应用多个对靶核酸的实质性部分特异性的探针，并逐渐除去探针进行。在检出DNA:RNA杂合物变化前可以除去的探针越多，靶核酸受到破坏的程度越大。
在另一个方面，提供了测定E2基因、cDNA或mRNA是否缺乏或破坏的方法。可以应用此类方法以测定E2基因是否在表达，HPV基因组是否整合入宿主细胞基因组中等等，从而评估HPV感染的进展和/或测定HPV感染进展成癌症的风险。
附图简述
为了进一步理解本公开内容的性质、目的和优点，应当参照以下详细描述，其与以下图结合阅读，其中类似的参照数字表示类似的要素。
图1是通过生物素化的DNA探针(白色柱形)捕获的靶RNA(用交叉排线画出阴影的柱形)的示意图。“B”代表生物素模块；“SA”代表链霉抗生物素蛋白模块；“AP”代表与抗体缀合的碱性磷酸酶，但是AP可以是任何其它合适的可检测模块(例如辣根过氧化物酶等)，并且B和SA可以通过其它连接模块替换。
图2的图描绘了使用DNA捕捉探针(白色柱形)、多种DNA放大探针(黑色柱形)和多种DNA:RNA杂合物抗体来“放大”信号，而不需要扩增靶RNA(用交叉排线画出阴影的柱形)。“B”代表生物素模块；“SA”代表链霉抗生物素蛋白模块，B和SA可以用其它缀合技术替换，其中DNA探针与珠缀合；“AP”代表与抗体缀合的碱性磷酸酶，但是AP可以是任何其它合适的可检测模块(例如辣根过氧化物酶等)。
图3是通过与基片(S)结合的不同DNA捕捉探针捕获的靶RNA(虚线箭)的图。还显示了非缀合的DNA放大探针(黑色柱形)和多种检测并结合DNA:RNA杂合物区的抗体(与碱性磷酸酶或任何其它合适的可检测模块，诸如辣根过氧化物酶等等缀合)。基片(例如珠)可以携带多种DNA捕捉探针，并且DNA捕捉探针可以是相同的(即相同序列和/或长度)或不同的(即不同序列和/或不同长度)。
图4提供了实验结果，其显示了在RNA捕获后添加未生物素化的DNA探针的效果。在此实验中，将可变数目的生物素化探针与链霉抗生物素蛋白珠缀合。靶物是HPV16的E6/7基因转录物。在添加(黑色柱形)和未添加(白色柱形)未标记的信号放大探针(一步对两步测定法)的情况中用每组珠实施测定法。在不添加信号放大步骤(白色柱形)时，信号随由捕捉探针提供的覆盖量而升高。然而，在添加信号放大探针(黑色柱形)时，信号比不添加它们时大，并且它们用较少(3-5)捕捉探针实现较高的信号。
图5显示了内源杂合物经常是临床背景噪音的来源。“RLU”=相对发光单元。
图6显示了在测定溶液中的细胞样品时裂解缓冲液(其中100%缓冲液含有约3M硫氰酸胍和约2%去污剂)浓度对测定法背景的影响，并且证明临床背景随裂解缓冲液浓度降低而降低。
图7显示了细胞团粒的低渗裂解确保背景噪音保持较低且稳定，并且无论使用的标本量如何，背景不显著改变。溶液；“PC(-)”=没有HPV靶物的溶液中固定的标本(宫颈刮落)集合。
图8显示了自HPV阳性细胞(SiHa)的HPV E6/E7检测限。这显示了使用本公开内容的方法，需要少到1x103个细胞检测HPV E6/7RNA。
图9显示了来自对各种裂解缓冲液测试裂解由COOH珠捕获的细胞的能力的结果。图9的数据及下文表1的数据显示优选的裂解缓冲液是约1M硫氰酸胍和约0.7%去污剂。
图10显示了随时间的经羧酸盐修饰的(COOH)磁珠(Sera Dyn产品目录编号6515-2105-050350)的细胞捕获，其证明在温育30分钟后已经捕获约95%的细胞。
图11显示了COOH珠捕获与低渗裂解的比较，并且指示COOH珠捕获比低渗裂解在从细胞获得mRNA方面更有效。“PC-”指示缺乏HPV存在的宫颈刮落标本的集合。
图12的图描绘了捕捉和信号放大探针设计区。可以通过捕获到具有捕捉特定靶物的特异性捕捉寡聚物的磁珠上“表征”HPV转录物的长度，并用延长杂合物区长度使用的多组未标记的寡核苷酸检测。若捕捉RNA携带与使用的捕捉探针互补的序列，则信号会产生。信号输出会在连续添加扩增信号探针的情况下增加，直到达到最大长度，在那里信号会达到稳定水平。显示了HPV16的各种HPV转录物。指明以虚线框表示的区，用于探针设计。
图13显示了随信号放大探针数目增加的信号升高。以此方式，可以通过由增加数目的连续放大探针产生的升高信号测量RNA转录物长度。在图13中，每组的5种寡聚物彼此相邻，并且随着添加连续组，导致RNA:DNA杂合物变得更长，及信号更强。
图14显示了可以针对具有低比率的细胞背景检测具有高度早期:晚期HPV mRNA比率的细胞级分。对于此图14，将SiHa细胞(宫颈癌细胞系)添加至宫颈标本(各诊断为高级HPV相关损伤)集合。SiHa细胞掺入高比率的HPV早期转录物:HPV晚期转录物，其是宫颈癌的一种常见特征。样品模拟在癌症前期损伤细胞间具有癌细胞的标本。结果显示了发明的测定法会检出更多良性损伤细胞集合中的癌细胞。
图15显示了LBC临床标本集合中保存的SiHa细胞的HPV RNA稳定性。RT-PCR图显示了对在67天的过程里温育的SiHa细胞样品相对于PCR循环数目(x轴)绘图的测定信号(y轴)。符号是星号，3天；正方形，13天；三角形，26天；实心菱形，42天；空心菱形，67天。数值是每天的两次反应的平均值。
图16a显示了用于HPV mRNA的杂合物捕捉检测的通用方案。将HPVmRNA靶物(点线)退火以捕捉与磁珠(环形)偶联的寡聚物(短的灰色柱形)。将RNA靶物与信号放大寡聚物(短黑色柱形)退火以参见较长的杂合物。RNA:DNA杂合物与同碱性磷酸酶(Y形状的AP符号)缀合的杂合物捕捉抗体结合。添加化学发光底物(未显示)以在发光计中检测复合物。
图16b显示了具有标示基因(大的灰色箭)的HPV基因组结构的示意图。E6-7探针(1)或E2探针(2)的基因座以下面的黑色柱形显示。基因排列和DNA探针的基因座对于HPV16和HPV18是相似的，但是一级序列是独特的。
图17a对每个用于相同靶物输出(1x105个拷贝，HPV16E6-7体外转录的RNA)的测定法显示了发光信号输出(平均值RLU,n=4)对互补信号放大探针数目的依赖性。在此实验中，杂合物长度在添加5、10和15种探针的情况中在孔中增加。信号对于具有对15种互补探针添加的5种非互补探针的孔(标记为5+15)没有升高。
图17b显示了对于杂合物捕捉测定法，发光信号输出(平均RLU,n=3份样品，误差棒显示标准差)对靶物输入(每次反应的RNA拷贝)的依赖性。在柱形上给出信号:噪音比。
图18a显示了对HPV16E6-7(灰色柱形)和E2(黑色柱形)绘制信号:噪音(平均值,n=3)对每个测定法的SiHa细胞数目的依赖性；对于不同孔中的两个测定法。对于这些测定法，从来自没有添加靶物的对照测定法的信号获得背景噪音，约50RLU。
图18b显示了对癌细胞系SiHa、Caski和HeLa将HPV E6-7和E2mRNA测定法的信号:噪音数值以比率绘制；柱形代表三次重复实验的平均比率。
图19显示了SiHa细胞与来自HPV阳性标本集合的细胞的混合物中HPV16E6-7:E2转录物比率的检测。将培养的SiHa细胞与HPV阳性、基于液体的细胞学标本的集合(2ml)(2ml中约100,000个总细胞)混合。
图20显示了宫颈标本中HPV16E6-7:E2比率。从杂合物捕捉测定法结果绘制E6-7:E2比率。
图21显示了用于测定E2基因表达是否缺乏或破坏的方法。
图22显示了SiHa和W12细胞中E2基因表达完整性的比较。
图23显示了LSIL和HSIL样品中E2基因表达完整性的比较。
发明详述
在进一步描述本公开内容前，应当理解公开内容不限于下文描述的公开内容的具体方面，因为具体方面的变化可以做出，并且仍落入所附权利要求书的范围内。还应当理解，采用的术语是为了描述具体的方面，而并不意图为限制性的。
在本说明书及所附权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。
能够与HPV16和/或HPV18杂交的分离的核酸和探针
本文中提供了由不超过200个核苷酸组成且能够与HPV16或HPV18DNA或RNA杂交的核酸。
在一个方面，核酸包含至少一种与选自下组的核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%同源性的核苷酸序列、基本上由所述至少一种核苷酸序列组成或由所述至少一种核苷酸序列组成：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:111至SEQ ID NO:308、其RNA等同物及其互补物。在又一个方面，核酸包含核苷酸序列，由该核苷酸序列组成，或基本上由该核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1至SEQID NO:105和SEQ ID NO:111至SEQ ID NO:308、RNA等同物及其互补物。
在一个方面，核酸能够在严格条件下与如下的核酸杂交，所述核酸与HPV16或HPV18基因组或自其衍生的核酸至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98%、至少99%、或100%相同的。例示性HPV16基因组的序列披露于GenBankNC_01526(SEQ ID NO:106)。例示性HPV18基因组的序列披露于GenBank X05015(SEQ ID NO:107)。
在另一个方面，核酸能够与如下的核酸杂交或结合，所述核酸与HPV16或HPV18mRNA或其互补物是至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的。在另一个方面，HPV16或HPV18mRNA选自下组：E2和E6/E7mRNA。
出于本目的，“严格条件”涵盖仅会在杂交分子与靶序列之间有25%错配或更小时发生杂交的条件。为了更精确定义，“严格条件”可以分成特定水平的严格性。如此，如本文中使用的，“中等严格性条件”是具有超过25%序列错配的分子不会杂交的条件；“中间严格性”条件是具有超过15%序列错配的分子不会杂交的条件，而“高严格性”条件是具有超过10%序列错配的分子不会杂交的条件。“非常高的严格性”条件是具有超过6%序列错配的分子不会杂交的条件。关于用于获得特定程度的严格性的杂交条件的计算也由Sambrook etal.(编),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989,第9章和第11章讨论，其通过提及完整并入本文。
在一个方面，提供了探针组，所述探针组包含本文中公开的至少一种分离的核酸。作为例子而非作为限制，探针组可以包含分离的核酸，其包含至少一种与选自下组的核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%同源性的核苷酸序列、基本上由所述至少一种核苷酸序列组成或由所述至少一种核苷酸序列组成：SEQ ID NO:1至SEQID NO:105和SEQ ID NO:111至SEQ ID NO:308、其RNA等同物及其互补物。在又一个方面，探针组可以包含分离的核酸，其包含核苷酸序列，由该核苷酸序列组成，或基本上由该核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:111至SEQID NO:308、RNA等同物及其互补物。分离的核酸可以以未修饰的探针提供或者可以是经修饰的。作为例子而非作为限制，修饰可以促进探针和已经与其杂交的核酸的分离和/或检测，例如通过添加配体和/或可检测标记物进行。在一个方面，可以提供与固体支持物诸如板、管、珠、微芯片、或其它固体表面结合的探针。
鉴定HPV mRNA的方法
可以使用本公开内容的方法来检测来自样品的靶核酸的存在。此类核酸可以是RNA，并且此类样品可以包括但不限于标本或培养物(例如细胞、微生物学和病毒培养物)，包括生物学和环境样品。生物学样品可以来自真核生物、原核生物、古菌(archaeon)、病毒、动物(包括人)、植物、真菌、挖掘物，并且可以来自流体、固体(例如粪)或组织、细胞培养物、液体或固体培养基、以及液体和固体食物和饲料产品和成分诸如乳制品项、蔬菜、肉类和肉类副产品和废物。环境样品包括环境材料诸如表面物质、土壤、水、空气和工业样品及从食物和乳制品加工仪、装置、设备、器皿、一次性和非一次性项获得的样品。特别优选的是生物学样品，包括但不限于宫颈上皮细胞(例如从宫颈拭样或活组织检查获得的样品)、腺样细胞、和上皮细胞、血液、唾液、脑脊髓液、胸膜液、乳、淋巴、痰和精液。样品可以包含包括信使RNA(mRNA)的核糖核酸。
本公开内容提供了用于测定样品中靶RNA存在的方法，其中所述方法包括：a)使靶RNA与具有与靶RNA互补的序列的DNA捕捉探针杂交以形成靶RNA:DNA捕捉探针复合物，其中所述DNA捕捉探针与支持物缀合；b)分开靶RNA:DNA捕捉探针复合物与未结合的RNA(例如通过清洗进行)；c)任选地，使至少一种放大探针与靶RNA:DNA捕捉探针复合物杂交，其中所述至少一种放大探针具有与靶RNA互补的序列，由此形成靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物；d)添加识别并结合RNA:DNA杂合物的抗体以结合靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物，由此形成靶RNA:DNA:抗体复合物，其中所述抗体用可检测标志物标记；e)检测所述抗体上的标志物，其中所述检测指示靶核糖核酸的存在；并f)比较检测结果与从放大探针的不同组合产生的结果，其中所述比较指示存在特定的RNA剪接形式。
本公开内容提供了用于测定样品中靶RNA存在的方法，其中所述方法包括：a)使靶RNA与具有与靶RNA互补的序列的DNA捕捉探针杂交以形成靶RNA:DNA捕捉探针复合物，其中所述DNA捕捉探针与支持物缀合；b)分开靶RNA:DNA捕捉探针复合物与未结合的RNA；c)任选地，使至少一种放大探针与靶RNA:DNA捕捉探针复合物杂交，其中所述至少一种放大探针具有与靶RNA互补的序列，由此形成靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物；d)添加识别并结合RNA:DNA杂合物的抗体以结合靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物，由此形成靶RNA:DNA:抗体复合物；e)添加识别并结合一抗的二抗，其中所述二抗用可检测标志物标记；f)检测二抗上的标志物，其中所述检测指示靶核糖核酸的存在；并g)比较检测结果与从放大探针的不同组合产生的结果，其中所述比较指示存在特定的RNA剪接形式。
本公开内容还提供了检测样品中核糖核酸(RNA)剪接形式存在的方法，其中所述方法包括a)在容许探针和靶核糖核酸杂交的条件下使靶RNA与具有与靶RNA互补的序列的DNA捕捉探针杂交，由此形成靶RNA:DNA捕捉探针复合物；b)添加识别并结合RNA:DNA杂合物的一抗以结合靶RNA:DNA捕捉探针复合物，由此形成靶RNA:DNA捕捉探针抗体复合物，其中一抗与支持物缀合；c)分开靶RNA:DNA捕捉探针抗体复合物与未结合的RNA；d)使至少一种放大探针与靶RNA:DNA捕捉探针抗体复合物杂交，其中所述至少一种放大探针具有与靶RNA互补的序列，并且组合添加，其会覆盖特定靶RNA区，由此形成靶RNA:DNA:抗体复合物；e)添加识别并结合RNA:DNA:双链体的二抗以形成靶RNA:DNA:抗体复合物，其中二抗用可检测标志物标记；f)检出所述二抗上的标志物，其中所述检出指示靶RNA的存在；并g)比较检测结果与从放大探针的不同组合产生的结果，其中所述比较指示存在特定的RNA剪接形式。
本公开内容还提供了检测样品中核糖核酸(RNA)剪接形式的存在的方法，其中所述方法包括a)在容许探针和靶核糖核酸杂交的条件下使靶RNA与具有与靶RNA互补的序列的DNA捕捉探针杂交，由此形成靶RNA:DNA捕捉探针复合物；b)添加识别并结合RNA:DNA杂合物的一抗以结合靶RNA:DNA捕捉探针复合物，由此形成靶RNA:DNA捕捉探针:抗体复合物，其中一抗与支持物缀合；c)分开靶RNA:DNA捕捉探针:抗体复合物与未结合的RNA；d)使至少一种放大探针与靶RNA:DNA捕捉探针:抗体复合物杂交，其中至少一种放大探针具有与靶RNA互补的序列，并且组合添加，其会覆盖特定靶RNA区，由此形成靶RNA:DNA:抗体复合物；e)添加识别并结合RNA:DNA:双链体的二抗以结合靶RNA:DNA:抗体复合物，从而形成靶RNA:DNA:抗体复合物；f)分开靶RNA:DNA:抗体复合物与未结合的二抗；g)添加用可检测标志物标记的三抗，其中三抗识别并结合二抗和/或一抗；h)检出三抗上的标志物，其中检出指示靶RNA的存在；并i)比较检测结果与从至少一种放大探针的不同组合产生的结果，其中所述比较指示存在RNA剪接形式。
RNA经常自不同启动子转录并剪接，由此生成多种形式，其包括不同基因的编码区。重要的是表征RNA的这些多种剪接形式，用于基础研究及用于如下的应用，其中检测特定mRNA同等型是至关重要的。
本公开内容的一个应用是检测及表征人乳头瘤病毒(HPV)中的mRNA表达。已经显示了宫颈癌与高风险HPV类型的存在有关；目前鉴定出约13至约18种高风险类型。HPV DNA测试可以鉴定高风险HPV类型，但是是癌前临床标本中疾病进展的一种较差的预测项。如此，需要别的方法和标志物来改善HPV测试的预测价值。对mRNA表征E6/7癌基因和其它mRNA的存在(如通过本公开内容提供的)会容许一种精确且可靠的方法，该方法测定这些癌基因对其它病毒基因的表达比率。E6/E7与E2、E4、和/或L1mRNA的比率可以是癌前宫颈损伤进展的一种较好的预测项(参见例如美国专利No.6,355,424，其通过提及并入本文)。杂合物捕捉技术是一种线性信号放大方法。如此，本公开内容提供了在使需要阴道镜检查(colposcopy)的患者数目最小化的情况下引导治疗策略的有价值方法。本公开内容提供了使用能够与RNA(且特别是mRNA)的不同长度/基因杂交的短寡核苷酸的混合物以表征剪接形式的方法。
靶核酸
在一个方面，要检测的靶核糖核酸可以是mRNA、核糖体RNA、核仁RNA、转移RNA、病毒RNA、异质核RNA等，其中一种或多种多核苷酸探针是DNA探针。靶核糖核酸包括但不限于存在于标本或培养物(例如细胞、微生物学和病毒培养物)，包括生物学和环境样品中的核酸。靶核糖核酸可以存在于生物学样品中，所述生物学样品来自动物(包括人)、流体、固体(例如粪)或组织及液体和固体食物和饲料产品和成分诸如乳制品项、蔬菜、肉类和肉类副产品和废物。靶核糖核酸可以存在环境样品中，并且包括环境材料诸如表面物质、土壤、水和工业样品及从食物和乳制品加工仪、装置、设备、器皿、一次性和非一次性项获得的样品。特别优选的是存在于生物学样品中的靶核酸，所述生物学样品包括但不限于宫颈样品(例如从宫颈拭样获得的样品)、腺样细胞、和上皮细胞、血液、唾液、脑脊髓液、胸膜液、乳、淋巴、痰、尿液和精液。
在其它方面，靶核糖核酸来自病毒、细菌、分枝杆菌或疟原虫，例如但不意图限于巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、人免疫缺陷病毒(HIV)、衣原体(Chlamydia spp.)、奈瑟氏球菌(Neisseria spp.)(例如淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhea))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、分枝杆菌(例如结核分枝杆菌)、SARS冠状病毒(SARS-CoV)或正粘液病毒科(Orthomixoviridae)(例如流感病毒)。
在一个方面，靶核糖核酸是人乳头瘤病毒(HPV)，并且包括HPV的遗传变体。变体包括靶核酸的多态性、突变体、衍生物、经修饰的、经改变的形式等。在一个方面，靶核酸是HPV核酸。在另一个方面，HPV核酸是高风险HPV类型的HPV DNA。在另一个方面，靶核酸是高风险HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,26,66,73和82型。
可以将RNA分离并准备好进行杂交，其通过多种方法和试剂，包括(但不限于)硫氰酸胍-酚-氯仿提取(例如用试剂，又称为TRI试剂)、低渗裂解和羧基(COOH)珠捕捉。RNA分离的原则基于细胞/组织裂解，接着进行提取、沉淀和清洗。虽然非常有效，但是这些技术需要高水平的技术精确性，并且不是自动化的候选。其它RNA制备方法没有完全消除DNA和其它潜在的污染物，需要昂贵的酶，而且需要许多(有时是费时的)清洗步骤。挑战是开发一种用于mRNA检测的方法，其降低许多目前的考验，并且可以提供关于特定基因表达的快速信息。已经设计两种主要的样品制备方法用于本公开内容：低渗细胞裂解；和羧基珠捕捉。也可以在此测定法中使用或QIAGEN树脂技术(例如QIAGEN RNeasy Plus微型试剂盒)分离的RNA。
在某些实施方案中，生物学样品由宫颈细胞，尤其是人宫颈细胞构成。可以用本领域中已知的任何方法或装置收集样品，所述方法或装置包括化学惰性收集装置诸如(聚乙烯对苯二甲酸酯poly(ethylene terephthalate))尖端拭子(tippedswab)。可以使用其它可接受的收集装置，包括但不限于棉拭子、宫颈刷、植绒拭子(flockedswab)(形状与拭子一样，但是由尼龙纤维构成的拭子，其实现较多细胞的收集和较容易释放细胞)、宫颈帚(cervical broom)、微型帚(mini broom)、灌洗、或在PAP涂片测试(Papanicolaou测试)中经常使用的任何收集装置。宫颈细胞也可以是活组织检查标本的部分。
样品制备
可以在本公开内容的方法中采用分离RNA的用途及其它已知的RNA分离方法。通过低渗裂解细胞团粒的样品制备降低可以干扰测定法检测步骤的内源RNA:DNA杂合物的释放，并且这是优选的RNA分离方法。在此样品制备方法中，经由离心机将细胞沉淀，除去上清液，并将团粒重悬，并裂解细胞。在裂解后，将细胞碎片沉淀，并收集上清液(含有RNA)。降低裂解严格性(如通过缓冲液中的盐和去污剂浓度测量的)降低自基于甲醇的宫颈标本集合生成的临床背景(图5和6)。信号:噪音比率也是较高的，并且集合间的背景及干扰的变化性是较低的。其它研究已经显示了低渗裂解由于细胞与环境之间的张力差异通过破裂细胞膜，使细胞对大分子可透过来起作用。如此，将细胞中的RNA从细胞释放到溶液中，而测定法的污染物(诸如内源RNA:DNA杂合物)会在不溶性细胞碎片中保留。此方法在如下的情况中可以是有用的，即由于增加标本量不导致背景升高，标本中的RNA量是有限的。
另一种样品制备方法使用羧基(COOH)磁珠，其可以直接添加至生物学样品以浓缩细胞进行DNA分离。经由疏水性相互作用将样品中的细胞吸引到珠。在使用磁性架将珠沉淀后，可以将上清液取出，并裂解细胞。也可以使用非磁性COOH珠或其它吸附性颗粒，代替离心以经由磁性架来沉淀。在裂解(其通常于65℃发生15分钟)后，将珠再次沉淀，并可以在本公开内容的方法中直接使用剩余的上清液。虽然降低裂解严格性再次降低此方法中的背景，但是单独的水不足以从细胞释放。因而，优选的是使用包含约1M硫氰酸胍和约0.7%去污剂的裂解缓冲液进行本公开内容的所有样品制备方法(参见例如图5和6)。
杂交/捕捉：捕捉探针
在制备样品并释放靶RNA后，在对于至少一种多核苷酸探针与样品中的靶RNA杂交足够的条件下使其与至少一种多核苷酸DNA捕捉探针接触，以形成双链核酸杂合物。DNA捕捉探针可以是全长的、截短的或合成的DNA。DNA捕捉探针是对靶RNA特异性的序列。理想地，DNA捕捉探针长约25至35个碱基，并且可以与靶RNA的任何区域互补。DNA捕捉探针的长度范围可以为约15至约200个碱基。在其它方面，捕捉探针的长度可以是不超过100或不超过50个核苷酸。在又一些方面，捕捉探针的长度可以是：20至100、25至100、30至100、35至100、40至100、45至100、或50至100个碱基。
作为例子而非作为限制，捕捉探针可以包含至少一种核苷酸序列，基本上由所述至少一种核苷酸序列组成或由所述至少一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%同源性：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20。在别的方面，捕捉探针包含选自下组的核苷酸序列，由该核苷酸序列组成或基本上由该核苷酸序列组成：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20。在一个方面，提供了对HPV16特异性的捕捉探针组，其包含至少一种选自下组的捕捉探针：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10。在一个方面，提供了对HPV18特异性的捕捉探针组，其包含至少一种选自下组的捕捉探针：SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:20。
DNA捕捉探针可以与支持物结合。“结合的”包括但不限于化学附着、共价结合和共价连接。多个DNA捕捉探针和多个不同DNA捕捉探针可以与同一支持物(例如同一磁珠)结合，如图3中示意性显示的。最佳结果仅需要3-5个不同捕捉探针(见图4)，如此提供大量灵活性以容许这些探针是序列特异性的，并且不落在在一些变体中可以剪接出去的区域中。在一个方面，序列特异性DNA捕捉探针是生物素化的，并且已经通过缀合与链霉抗生物素蛋白磁珠结合。捕捉探针在其包含桥接剪接位点的单一寡聚物时可以分离特定剪接形式。
支持物包括但不限于珠、磁珠、柱、板、滤纸、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、和浸量尺。可以使用任何支持物，只要它容许提取液相，并提供分出结合的和未结合的捕捉探针或抗体的能力。磁珠是特别有用的，因为若应用磁场将珠适当保持，可以将它们在溶液中留下，并且可以提取或弃去液相。较小且具有高表面积的珠是优选的，诸如直径约1μm的珠。在某些方面，支持物包含经修饰的磁珠，其包被或已经对其附着与靶mRNA互补且特异性的DNA捕捉探针。使用磁场来分离双链核酸/磁珠复合物与非结合的核糖核酸。在某些方面，支持物包含经修饰的磁珠，其中磁珠通过用对双链杂合物核酸免疫特异性的一抗包被珠来修饰。使用磁场来分离核酸杂合物/抗体/磁珠复合物与未结合的核糖核酸。也可以使用采用电荷转换(charge switching)或硅土捕捉(与磁场形成比对)的其它珠。在另一个方面，具有检测能力的磁珠(诸如Lumonex磁珠)可以捕捉并检测特定剪接形式。
在如上文中描述的靶RNA或靶RNA:DNA杂合物的捕捉后，可以将捕获的靶RNA或RNA:DNA杂合物与样品的剩余部分分开，其通过应用磁场(在磁珠的情况中)，并洗去非捕获的核酸进行。可以用各个温度使用的含有盐和/或去污剂的缓冲液实现将不想要的干扰性物质洗去。在使用与磁珠不同的支持物时，进行将捕获的杂合物与样品的剩余部分分开的备选方法，包括但不限于清洗。可以使用酶促过程诸如用于双链DNA或RNA:DNA的DNA酶来促进靶RNA的分离。
杂交/捕捉：放大探针
在为了确保仅保留靶物的清洗步骤后，使信号放大DNA探针与靶mRNA杂交，其中信号放大探针是与靶mRNA互补和/或特异性的未标记的DNA探针。放大探针对于靶核酸不需要是特异性的。例如，DNA放大探针可以能够结合与设计的靶物不同的其它核酸。将与mRNA区互补的DNA信号放大探针设计，并在混合物中组合，其会覆盖特定基因。通过延伸并改变覆盖，可以确定哪些基因是存在的及RNA的特定剪接形式。覆盖定义为侧翼有互补信号探针的靶序列的程度或长度。信号放大探针的长度是大致40个碱基，但是因为它们在捕捉探针周围设计，所以一些可以是超过或小于40个碱基。信号放大探针的长度可以是约15至约200个碱基。在又一些方面，信号放大探针可以是：20至100、25至100、30至100、35至100、40至100、45至100或50至100个碱基。升高的覆盖(即，使多种信号探针与靶RNA的互补区杂交)会导致信号升高。因此，优选的是使用多种探针来获得放大的信号。检测限部分取决于靶核酸(即，靶基因)的长度。
作为例子而非作为限制，放大探针可以包含至少一种核苷酸序列，基本上由所述至少一种核苷酸序列组成或由所述至少一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同源性：SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:105。在别的方面，放大探针包含核苷酸序列，由核苷酸序列组成或基本上由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:105。在一个方面，提供了对HPV16特异性的放大探针组，其包含至少一种选自下组的放大探针：SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:62。在一个方面，提供了对HPV18特异性的放大探针组，其包含至少一种选自下组的放大探针：SEQ ID NO:63至SEQID NO:105。
组合添加扩增信号探针，其会在已知的RNA剪接形式的遗传序列里延伸。信号放大探针的组合会决定靶mRNA上的覆盖程度，并因此决定信号输出。来自放大探针的不同组合的所得信号输出的比较会指示特定mRNA剪接形式变体的存在。这样，此方法是一种“分子尺”，因为信号输出依赖于存在的剪接形式。例如，预期捕捉探针3与E6/7靶mRNA，而非与E1、E2、E4、E5、L1或L2(见例如表3和图12)杂交。在与捕捉探针3杂交后使用的信号放大探针1和6会产生来自剪接E6/7形式的强信号和来自剪接/整合E6/7形式的弱信号。通过改变捕捉探针和放大探针的组合和数目，信号输出提供关于哪些病毒基因表达(例如其比率)及那些基因的哪些剪接形式表达的信号。预期与临床和实验数据结合的此类信息为癌前宫颈损伤进展提供一种较好的预测项。
经由测量mRNA水平表征细胞中的基因表达是一种在测定细胞是否受到病原体感染，及疾病进展状态中有用的工具。
本公开内容提供了一种测定已知的和未知的剪接形式变体的基因转录物长度的方法。用于测量可变剪接转录物表达的可靠且强力的方法是在调查每种变体的重要性中的一个重要步骤。迄今为止，剪接变体的精确量化，诸如Northern印迹、RT-PCR和实时RT-PCR由于常规方法的固有限制而是费力且困难的。本公开内容提供了测定剪接形式变体的存在的方法。例如，可以如下测定早期HPV转录物(例如HPV E6*I)是否携带晚期基因序列的问题，即用于早期区互补的捕捉探针捕捉转录物，然后用于晚期区互补的放大探针检测；所得的信号可以指示早期基因转录物上晚期区的存在。此外，通过提供会覆盖预测剪接形式序列的简并信号放大探针组合，可以测定剪接变体的存在。此外，可以通过选择的DNA探针捕捉的缺乏指示某个区域的缺乏。
使用识别RNA:DNA杂合物的分子捕捉/检测所得的杂合物。对双链核酸杂合物特异性的分子包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白质(诸如但不限于RNA酶H)、核酸(包括但不限于适体)、或序列特异性核酸。适体是结合特定靶分子的较短寡核苷酸或肽分子。它们经常通过将其自较大的随机序列集合选择来创建，尽管天然存在的适体(例如核糖开关(riboswitch)适体)是已知的。
杂交/捕捉：抗杂合物抗体
在一个方面，对双链核酸杂合物特异性的分子是抗体(抗杂合物抗体)。将杂合物与抗杂合物抗体一起温育足够的时间量，以容许对双链核酸杂合物的结合。抗杂合物抗体可以是单克隆或多克隆的。在一个最优选的方面，抗体是单克隆的。
在另一个方面，一抗与支持物结合。在此方面，在制备样品并释放RNA后，在足以使至少一种多核苷酸探针与样品中的靶RNA杂交的条件下使其与至少一种多核苷酸DNA捕捉探针接触以形成双链核酸杂合物。通过清洗将靶RNA:DNA捕捉探针复合物形式的靶RNA与未结合的RNA分开。在为了确保仅保留的RNA是靶RNA的清洗步骤后，使信号放大DNA探针与靶RNA杂交，其中所述信号放大探针是与靶RNA互补和/或特异性的未标记的DNA探针。捕捉和放大探针与靶RNA的杂交创建双链核酸杂合物。使用识别RNA:DNA杂合物的分子检测所得的杂合物。在一个优选的方面，对双链核酸杂合物特异性的分子是抗体(抗杂合物抗体)。将杂合物与抗杂合物抗体一起温育足够的时间量，以容许对双链核酸杂合物区的结合。抗杂合物抗体与支持物结合，并且对RNA:DNA杂合物的结合形成RNA:DNA杂合物:抗体复合物。将该复合物与未结合的抗体分开。在支持物是磁珠的应用中，使用磁场来分出任何未结合的抗体。
检测
在除去未结合的抗杂合物抗体后，添加二抗，其中二抗用可检测标志物标记，并且识别并结合一抗。检测存在于二抗上的标记物，如此之事靶核糖核酸的存在。用于检测各种标记物的方法是本领域中已知的。例如，例如Coutlee,et al.,J.Clin.Microbiol.27:1002-1007(1989)描述了比色法、放射性、表面等离振子共振或化学发光方法。
例如，可以使用检测仪诸如E/LuminaTM发光计(Source Scientific Systems,Inc.,Garden Grove,CA)、Optocomp ITM发光计(MGM Instruments,Hamden,CT)等通过化学发光用试剂诸如Lumi-PhosTM530试剂(Lumigen,Detroit,MI)或DR2(Applied Biosystems,Foster City,CA)检测与至少一种碱性磷酸酶分子缀合的抗体。如本文中描述的，二抗上标记物的检出指示样品中与一种或多种探针互补的一种或多种靶核糖核酸的存在。在清洗后，将样品在检测缓冲液中悬浮，所述检测缓冲液例如含有二抗上的标记物的底物。
可以将抗杂合物抗体在本测定法中使用和/或与磁珠偶联和/或在支持物上固定化，如下文描述的。在一个优选的方面，用于捕捉和检测靶核酸的抗体是单克隆抗体。一抗和二抗可以是相同的，用于捕捉和检测(即由相同杂交骨髓瘤细胞系生成)，或者可以来自不同杂交骨髓瘤细胞系及由不同杂交骨髓瘤细胞系生成。在一个最优选的方面，用于捕捉和/或检测的单克隆一抗和二抗是相同的，并且对RNA/DNA杂合物是特异性的。还包括对双链杂合物特异性的抗体的免疫片段或衍生物，其中此类片段或衍生物含有抗体的结合区。
例如，可以使用单克隆RNA:DNA杂合物抗体，其源自与用RNA:DNA杂合物免疫的脾细胞融合的骨髓瘤细胞。可以通过针对固体支持物上固定化的RNA:DNA杂合物的亲和纯化来纯化杂合物特异性抗体，例如如记载于Kitawaga et al.,Mol.Immunology,19:413(1982);及美国专利No.4,732,847的，每篇通过提及并入本文。
可以使用生成或分离抗体，包括人或人工抗体的其它合适方法，包括例如如下的方法，其从文库选择重组抗体(例如单链Fv或Fab，或其其它片段)，或者其依赖于免疫能够生成人抗体全集的转基因动物(例如小鼠)(参见例如Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovits et al,Nature,362:255(1993);及美国专利No.5,545,806和5,545,807)。
在又一个方面，本公开内容提供了试剂盒，其容许检测生物学样品或含有核酸的样品中的核糖核酸。在一个优选的方面，试剂盒包含a)与磁珠缀合的DNA捕捉探针；b)DNA放大探针；c)抗杂合物一抗；d)包含二抗的检测试剂，其中二抗结合一抗，并且是可检测标记的；e)基于去污剂的清洗缓冲液和f)第二检测试剂，其包含二抗上标记物的底物。优选的基于去污剂的清洗缓冲液是40mM Tris-HCl、100mM NaCl、0.5%Triton X-100。
在某些方面，本公开内容的检测方法如下检测RNA，即首先将靶物捕获到互补的生物素DNA探针上，所述DNA探针与链霉抗生物素蛋白磁珠缀合。可以将此探针-珠复合物预缀合，并且于4℃持续几个月是稳定的。优选地，将此捕捉步骤于60℃在不断摇动的情况中实施，并且容许进行约30分钟(足以容许捕捉的时间)。然后，将具有捕获靶物的珠清洗，使得除去任何非靶物RNA序列。由于杂合物捕捉抗体结合个别DNA-RNA杂合物，优选的是用DNA放大探针覆盖靶区域以实现最大信号(参见图1和2)。如此，然后使别的探针与靶mRNA杂交。由于在此点时仅捕获靶物，这些探针不需要是序列特异性的，而且可以覆盖基因的全长，其排除已经由生物素化的特定探针覆盖的区域。信号放大探针与mRNA区是互补的，并且进行设计并在混合物中组合，其会覆盖特定基因。通过延伸并改变覆盖，可以测定特定基因和特定剪接变体。优选地，这些信号放大探针以浓度4.2nM使用。优选地，此杂交还于60℃于7.8左右的pH发生30分钟。然后，杂交继之以用上文讨论的杂合物捕捉抗体系统检测(使用抗杂合物抗体和二抗来检测抗杂合物抗体)。
用于测定靶核酸的存在、破坏或缺乏的方法
在另一个方面，提供了用于测定样品中靶核酸的存在或缺乏的方法，所述方法包括：(a)在足以诱导下列各项形成的条件下处理样品的第一部分：(α)包含靶核酸的第一组DNA:RNA杂合物；和(β)包含参照核酸的第二组DNA:RNA杂合物；(b)在足以诱导第二组DNA:RNA杂合物，而非第一组DNA:RNA杂合物形成的条件下处理样品的第二部分；(c)在样品的第一部分和样品的第二部分中产生可检测信号，其中可检测信号具有与DNA:RNA杂合物浓度相关联的强度；并(d)比较样品的第一部分中的可检测信号强度和样品的第二部分中的可检测信号强度，其中：(α)若样品的第一部分中的可检测信号强度大于样品的第二部分中的可检测信号强度，则样品中存在靶核酸；且(β)若样品的第一部分中的可检测信号强度小于或等于样品的第二部分中的可检测信号强度，则样品中缺乏靶核酸。
如本文中使用的，“样品的一部分”应当指以任何方式分开的样品。例如，可以将样品依照体积和/或质量分成相等的部分。或者，可以通过从样品扣除不同组分生成不同部分。作为例子而非作为限制，“样品的一部分”可以指与支持物结合并与样品的剩余部分分开的靶核酸和参照核酸的集合。不管生成多少部分，每个部分应当包含大致相等量的参照核酸。
在一个例示性方面，通过如下的方法形成样品的第一部分和样品的第二部分，所述方法包括使样品与下列各项接触：(a)在严格条件下对靶核酸特异性的第一捕捉探针，其中第一捕捉探针与靶核酸的杂交生成第一捕捉复合物；和(b)在严格条件下对参照核酸特异性的第二捕捉探针，其中第二捕捉探针与参照核酸的杂交生成第二捕捉复合物。然后，可以将捕捉复合物与支持物结合。
第一和/或第二捕捉探针可以以与支持物共价结合方式提供或者备选地可以适合于与支持物结合。作为例子而非作为限制，可以将捕捉探针用配体修饰，并且用能够结合配体的模块包被支持物。在此类构造中，捕捉探针凭借配体与配体结合模块之间的结合与支持物结合。作为例子而非作为限制，配体可以是生物素，而配体结合模块是能够结合生物素的分子，诸如亲合素和链霉抗生物素蛋白。若想要的话，第一和第二捕捉探针可以具有不同配体。在此类情况中，可以提供能够结合第一和第二捕捉探针两者的第一支持物，而提供仅能够结合第二捕捉探针的第二支持物。在此类方式中，可以添加进一步的特异性水平。
在某些其它方面，捕捉探针与靶核酸和/或参照核酸形成DNA:RNA杂合物。在此类构造中，可以如下形成样品的各部分，即使样品与通过能够结合DNA:RNA杂合物的实体，诸如对双链杂合核酸免疫特异性的抗体(或其片段)修饰的支持物接触。然后，可以将由捕捉探针和靶序列和/或参照核酸形成的DNA:RNA杂合物结合到支持物，并且经由抗体结合与样品的剩余部分分开。抗体可以与支持物共价结合，凭借配体/配体结合模块结合，或者通过包被到支持物的能够结合抗体的实体，诸如Ig特异性抗体结合。
在另一个方面，支持物用本文中称为锚探针的核酸包被。在此类构造中，捕捉探针可以设计为具有能够与锚核酸的至少一部分杂交，由此将捕捉复合物结合到支持物的序列。在此类构造中，捕捉探针可以包含：(α)能够在严格条件下与靶序列和/或参照核酸杂交的区域；和(β)能够与锚探针序列杂交的区域。每种捕捉探针的锚探针可以是相同的，或者它可以是不同的。另外，每种捕捉探针可以包含能够与相同锚探针的不同序列杂交的序列。可以在相同或不同锚探针中布置不同序列。
在另一个例示性方面：(a)通过包括将第一捕捉复合物和第二捕捉复合物捕获到第一支持物上的方法形成样品的第一部分；和(b)通过包括将第二捕捉复合物，而非第一捕捉复合物捕获到第二支持物上的方法形成样品的第二部分。在此类方面，第一支持物可以包含与其共价结合的第一和第二捕捉探针(或能够捕捉其的实体)，而第二支持物可以包含与其结合的第二捕捉探针，而非第一捕捉探针(或能够捕捉其的实体)。或者，第一和第二支持物可以是基本上相同的。在此类情况中，首先应当将样品分开，然后与合适的捕捉探针接触，之后与相应的支持物接触。
在另一个方面，通过如下的方法形成样品的第一和第二部分，所述方法包括：(a)将第一捕捉复合物和第二捕捉复合物捕获到第一支持物以形成样品的第一部分；并(b)将第一捕捉复合物和第二捕捉复合物捕获到第二支持物以形成样品的第二部分。
在通过捕获到支持物形成样品的各部分的情况中，任选地，可以清洗捕捉复合物以除去非捕获的核酸。可以使用以各个温度使用的含有盐和去污剂的缓冲液实现洗去不想要的干扰性物质。
一旦已经将样品分成第一和第二部分并任选地清洗，通过形成包含靶核酸的第一组DNA:RNA杂合物和包含参照核酸的第二组DNA:RNA杂合物检测靶核酸和/或参照核酸。
在一个方面，通过使样品的各部分与能够与靶序列和/或参照核酸形成DNA:RNA杂合物的信号探针接触形成DNA:RNA杂合物。如本文中使用的，术语“信号探针”指能够在严格条件下与靶核酸或参照核酸杂交以形成DNA:RNA杂合物的任何寡或多核苷酸。信号探针可以是但不需要是对靶序列或参照序列特异性的。例如，信号探针可以能够结合与设计的靶物不同的其它核酸。优选地，信号探针的长度是约15至约200个碱基。在一些方面，信号探针设计为长度35至40个核苷酸。在其它方面，提供了信号探针组，其包含多个能够与靶序列和/或参照序列的独特区域杂交的信号探针。
在一个方面：(a)通过包括使样品与能够与靶核酸杂交的第一信号探针接触的方法形成第一组DNA:RNA杂合物；并(b)通过包括使样品与能够与参照核酸杂交的第二信号探针接触的方法形成第二组DNA:RNA杂合物。在每种情况中，应当使样品的第一部分与第一和第二信号探针两者接触。在样品的第二部分包含靶序列和参照核酸两者的情况中，不应使其与第一信号探针接触。
一旦形成DNA:RNA杂合物，产生可检测信号，其强度与样品部分中的DNA:RNA杂合物总浓度相关联。在与样品的第一部分相比，可检测信号的强度在样品的第二部分中相同或更大的情况中，靶核酸是缺乏的。另一方面，在与样品的第一部分相比，可检测信号的强度在样品的第二部分中更小的情况中，靶核酸是存在的。
在一些方面，多个信号探针设计为使得覆盖靶核酸和/或参照核酸的实质性部分。通过延伸并改变覆盖，可以确定存在的大概的靶核酸部分。提高覆盖(即，使多个信号探针与靶核酸的互补区杂交)会导致信号升高。因此，优选的是使用多种探针来获得放大的信号。检测限部分取决于靶核酸(即，靶基因)的长度。在一个方面，探针组包含足以覆盖至少70%的靶序列和/或参照核酸的探针。在其它方面，探针组包含足以覆盖至少75%、至少80%、至少85%、至少90%和至少95%的靶序列和/或参照核酸的探针。在其它方面，探针组的信号探针设计为具有长度20至50个核苷酸的平均长度。
在一个方面，组合添加信号探针，其会在怀疑截短或可变剪接的靶mRNA的遗传序列里延伸。信号探针的组合会决定靶mRNA上的覆盖程度，并且因此决定信号输出。比较来自不同信号探针组合的所得信号输出会指示特定mRNA剪接形式变体的存在。这样，此方法是一种“分子尺”，因为信号输出依赖于存在的剪接形式。
本公开内容还提供了用于测定高风险HPV E2基因在宿主细胞中是否表达或受到破坏的测定法，其中靶核酸是E2mRNA，且参照核酸选自下组：HPV E1、HPV E6/E7、HPV L1和HPV L2mRNA。此类方法也可以应用于检测HPV对宿主细胞基因组中的整合和/或预测HPV相关细胞转化和/或癌症例如宫颈癌的开始。高风险HPV类型包括但不必限于HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68和82。
在某些方面，本公开内容的检测方法通过使样品与生物素化的与靶核酸互补的DNA捕捉探针和生物素化的与参照核酸互补的DNA捕捉探针接触来检测mRNA，其中捕捉探针与链霉抗生物素蛋白磁珠偶联。可以将此探针-珠复合物预缀合，并且于4℃持续几个月是稳定的。优选地，将此捕捉步骤于60℃在不断摇动的情况中实施，并且容许进行约30分钟(足以容许捕捉的时间)。然后，将具有捕获靶物的珠清洗，使得除去任何非靶物/参照RNA序列。然后，将珠捕获的靶物/参照核酸复合物分成多个相等部分。然后，使样品的每个部分与DNA信号探针接触，所述DNA信号探针足以覆盖参照mRNA的相当大的部分。还将各部分与DNA信号探针接触，所述DNA信号探针足以覆盖靶mRNA的不断增加的部分。不应使至少一个部分与能够与靶mRNA杂交的信号探针接触。由于在此点时仅捕获靶物和/或参照mRNA，这些探针不需要是序列特异性的，而且可以覆盖mRNA的全长，其排除已经由生物素化的特定探针覆盖的区域。优选地，这些信号探针以4.2nM左右的浓度使用。优选地，此杂交还于60℃于7.8左右的pH发生30分钟。然后，杂交继之以用上文讨论的杂合物捕捉抗体系统检测(使用抗杂合物抗体和二抗来检测抗杂合物抗体)。
本领域技术人员会理解，本发明可以在许多平台上实施，所述平台包括但不限于管、浸量尺、微阵列、微板、384孔板、其它微量滴定板和微流控系统。本领域技术人员会理解，如与发展中国家相关的，目前可以利用低技术方法诸如滴瓶、橡胶泡(rubber bulb)、巴斯德(Pasteur)移液管、或喷射瓶(squirt bottle)，用于牵涉液体流动的步骤。这些装置在测定法需要的合适范围内投递相对精确的体积。在一个方面，公开内容的方法不包括自动化移液器或其它电池供电或能量供电的移液装置。
实施例
实施例1
经由细胞团粒的低渗裂解的样品制备
内源杂合物对检测测定法提出一项独特的考验，因为它们会被杂合物捕捉抗体检出。如此，优选地，样品制备使内源杂合物的背景失活，这通过隔绝(sequestration)、结合或降解阻止它们增加信号来进行。低渗水解依赖于前一种策略。在此方法中，经由离心机将细胞沉淀，将上清液除去，并裂解团粒。如图6中显示的，通过改变缓冲液中的盐和去污剂浓度降低裂解严格性降低由基于甲醇的宫颈标本集合产生的临床背景。信号:噪音比也是较高的，并且集合间背景和干扰的变化性是较低的(表2)。其它研究已经显示了低渗裂解如下起作用，即由于与环境相比细胞张力的差异使细胞膜破裂，使细胞对较为可溶的mRNA(但对于杂合物和核DNA而言不太可溶)可透过。如此，将细胞中的RNA从细胞释放到溶液中，而测定法的污染物(诸如杂合物)会在不溶性细胞碎片中保留。此方法在如下的情况中可以是有用的，即由于增加标本量不导致背景升高，标本中的RNA量是有限的(图7)。使用将HPV阳性细胞掺入阴性宫颈标本集合中的模型，相继的低渗裂解和本公开内容的检测方法可以检出仅来自1000个细胞的HPV E6/7RNA(图8)。
实施例2
经由羧基磁珠的样品制备
已经在本公开内容的方法中使用方面表征的另一种样品制备方法使用经羧基修饰的(COOH)磁珠，其可以直接添加至生物学样品(例如经羧酸盐修饰的磁性颗粒;Thermo Fisher Scientific,Inc.)。经由疏水性相互作用将样品中的细胞吸引到珠。在使用磁性架使珠沉淀后，可以将上清液除去，并裂解细胞。裂解后，将珠再次沉淀，并转移剩余的上清液，用于本公开内容的方法。虽然降低裂解严格性再次降低此方法中的背景(参见表1)，单独的水不足以从细胞释放。表1中的数字代表2%溶液(不是最终溶液)的百分比。此外，优选的裂解缓冲液是约1M硫氰酸胍和约0.7%去污剂(见图9)，因为它支持裂解和水解两者。若在杂交捕捉步骤前将其稀释，则可以使用较强的裂解缓冲液浓度。如图10中显示的，将细胞捕获到珠上是二相反应。将羧基珠直接掺入基于的宫颈细胞样品中。将占样品中所有细胞的约50-60%在暴露的第一分钟内吸引到珠。此过程达到稳定水平，持续至少15分钟，但是添加珠后约30分钟，已经捕获至少95%的细胞(如通过对上清液中剩余的细胞计数测量的；见图10)。图11显示了使用本公开内容的方法，可以仅使用约1000个HPV阳性细胞获得结果；相继的羧基珠细胞捕捉和本公开内容的检测方法比相继的低渗细胞裂解和本公开内容的检测方法在从细胞获得mRNA方面更有效(见图11)。
表1
％裂解缓冲液 S/N
100 1.6
50 3.2
32.5 7.0
25 1.7
0 0.9
实施例3
内源杂合物对测定法背景的影响
内源杂合物经常是临床背景噪音的来源(参见图5)。在将HPV16E6/7RNA掺入临床集合(没有HPV;KPSTM(-))中时，背景是较高的，而信号是掩盖的。然而，在添加RNA前使所述集合变性(1.75M NaOH)并中和后，背景是较低的，并且信号得到挽救。这揭示了在利用采用识别核酸杂合物的抗体的检测方法前需要消除或阻止内源核酸杂合物的释放。
实施例4
裂解缓冲液浓度对背景的影响
降低裂解严格性降低临床背景噪音(见图6)。将1mL基于甲醇的宫颈标本向下旋转，并将团粒在多个浓度的缓冲液中重悬(100%缓冲液=约3M硫氰酸胍+约2%去污剂)，如沿着x轴显示的。将沉淀的细胞于65℃加热15分钟。然后，将裂解缓冲液的终浓度调节至32.5%，用于依照本公开内容的方法捕捉RNA。如图6中显示的，背景随裂解缓冲液的浓度降低而降低。此实验提供了如下的证据，即对细胞的低渗裂解成功用于阻止内源核酸杂合物的释放。
从细胞释放细胞质中的RNA，而测定法的污染物诸如杂合物会在核中保留。
另外，水裂解比更严格的裂解给出更低的背景和变化性和更高的信号:噪音(见下文表2)。表2中的数值在来自宫颈标本的4个不同临床集合的结果间取平均值。通常，这些集合在背景中极大变化。
表2
实施例5
细胞团粒的低渗裂解
图7显示了细胞团粒的低渗裂解确保背景噪音保持稳定。将不同量的宫颈标本(250ul-10ml)向下旋转，用水裂解，并进行本公开内容的RNA检测测定法。如图7中的图中显示的，不管使用的标本量如何，背景没有显著改变。实施例6
检测限
测试针对来自HPV阳性细胞(SiHa细胞)的HPV16E6/7RNA的检测限(见图8)。将细胞掺入1mL阴性宫颈标本集合中以为临床样品建模。在向下旋转并用水裂解和加热后，将缓冲液添加至细胞(至浓度32.5%缓冲液，或约1M硫氰酸胍和约0.7%去污剂)，并将它们在板中放置以开始本公开内容的RNA检测测定法。结果显示了使用本公开内容的方法，HPV E6/7RNA检测需要少到1x103个细胞。
实施例7
裂解由COOH珠捕获的细胞
对多种裂解缓冲液比较裂解由COOH珠捕获的细胞的能力(见图9)。结果显示了单独的水不足以裂解由COOH珠捕获的细胞。将HPV阴性或HPV阳性细胞掺入1mL阴性宫颈集合中。在通过珠捕获细胞并除去上清液后，将不同浓度的缓冲液(含有硫氰酸胍和去污剂)添加至样品，然后，将该样品于65℃加热15分钟。将缓冲液浓度调节至总共32.5%，用于使用本公开内容的方法进行RNA检测。如用向下旋转方法看到的，背景确实随降低盐和去污剂量而降低。然而，需要至少32.5%缓冲液(总计约1M盐和0.7%去污剂)来裂解足以释放RNA的细胞。
实施例8
通过COOH珠的细胞捕捉的时间过程显示了将细胞捕获到珠上是二相反应。
进行通过COOH珠的细胞捕捉的时间过程(参见图10)。将细胞掺入1mL阴性宫颈集合中。对细胞的基线数目计数，并且在添加COOH珠后的每个时间点，将珠沉淀1.5分钟，然后除去上清液并稀释以进行计数。在一分钟内捕获约50%的细胞。捕获然后达到稳定水平，但是在30分钟时，已经捕获至少95%的细胞。较多的珠提供略微有效的捕获。
实施例9
羧基(COOH)珠捕捉比低渗裂解更有效。
用COOH珠捕捉或用沉淀和低渗裂解制备1mL阴性宫颈标本集合中的HPV18阳性(HeLa)细胞。羧基珠捕捉方法的检测限也是约1000个HPV阳性细胞，并且逆杂合物捕捉测定法的结果显示了此方法在从细胞获得mRNA方面更有效(见图11)。虽然背景在使用COOH珠捕捉时略高(271个RLU对163个RLU(对于低渗裂解))，但是信号:噪音和信号---噪音(检出的总RNA的测量)比在使用低渗裂解时高得多。
实施例10
与靶RNA检测组合的预处理规程(低渗裂解)
以下方案组合样品预处理规程(使用低渗细胞裂解)与本公开内容的RNA检测方法。将管中的细胞以1500相对离心力(RCF)向下旋转3分钟。除去上清液，并添加33.75μL水，并温和移液以重悬团粒。然后，在温和摇动的情况下于65℃加热15分钟。接着，添加16.25μL缓冲液(约3M硫氰酸胍和约2%去污剂)，并将50μL样品转移至板上的孔。然后，添加10μL与生物素化捕捉探针预先缀合的链霉抗生物素蛋白珠，并于60℃在摇动的情况中以1150每分钟旋转(RPM)将板温育30分钟。将板置于磁性架上，并让珠沉淀1.5分钟，然后弃去，并将板吸干。用剧烈清洗缓冲液(SharpWash buffer)(1M Tris-HCl,0.6M NaCl,0.25%Tween-20)清洗两次；第一次清洗应当是2分钟，而第二次清洗应当是5分钟。在清洗后，弃去，并通过吸干干燥板孔。对每个孔添加65μL在RNA杂交缓冲液中稀释至4.2nM的信号放大探针。然后，于60℃在摇动的情况中以1150RPM将板温育30分钟。将板在磁性架上放置3分钟，弃去，并干燥孔。将35μL Digene杂合物捕捉2试剂盒检测试剂1(具有0.05%(w/v)叠氮化钠而没有RNA酶的缓冲溶液中针对RNA:DNA杂合物的缀合有碱性磷酸酶的抗体)添加到每孔中，并于45℃将板温育30分钟。将板置于磁性架上，弃去，并吸干。用包含40mM Tris-HCl,100mM NaCl,0.5%Triton X-100的缓冲液将板清洗5次，每次清洗容许板放立1分钟。然后，弃去，并干燥孔。接着，对每孔添加45μL Digene杂合物捕捉2试剂盒检测试剂2(试剂，其具有Emerald IITM，即一种化学发光底物)。避光保护，并于室温在以300RPM摇动的情况中将板温育15分钟。在发光计上读板。
实施例11
与靶RNA检测组合的预处理规程(COOH珠捕捉)
以下方案组合羧基珠捕捉样品制备与本公开内容的RNA检测方法。对每个样品添加8μL羧基(COOH)珠(2mL孔板)，并于室温以800RPM摇动30分钟。将在磁性架上放置2分钟以使珠沉淀。用真空除去上清液，并在50μL32.5%缓冲液(约1M硫氰酸胍和约0.7%去污剂)中重悬。然后，于65℃以1000RPM摇动15分钟。将板置于磁性架上，使珠沉淀，并将上清液转移至新孔。然后，添加10μL与生物素化的捕捉探针预缀合的链霉抗生物素蛋白珠，并于60℃在以1150RPM摇动的情况中将板温育30分钟。将板置于磁性架上，并让珠沉淀1.5分钟，然后弃去，并将板吸干。用剧烈清洗缓冲液(1M Tris-HCl,0.6MNaCl,0.25%Tween-20)清洗两次；第一次清洗应当是2分钟，而第二次清洗应当是5分钟。在清洗后，弃去，并通过吸干将板孔干燥。对每个孔添加65μL在RNA杂交缓冲液中稀释至4.2nM的信号放大探针。于60℃在以1150RPM摇动的情况中将板温育30分钟。将板在磁性架上放置3分钟，弃去，并干燥孔。将35μL检测试剂1(具有0.05%(w/v)叠氮化钠而没有RNA酶的缓冲溶液中针对RNA:DNA杂合物的缀合有碱性磷酸酶的抗体)添加到每孔中，并于45℃将板温育30分钟。将板置于磁性架上，弃去，并吸干。用包含40mM Tris-HCl,100mM NaCl,0.5%Triton X-100的缓冲液将板清洗5次，每次清洗容许板放立1分钟。然后，弃去，并干燥孔。接着，对每孔添加45μL检测试剂2(试剂，其具有Emerald IITM，即一种化学发光底物)。避光保护，并于室温在以300RPM摇动的情况中将板温育15分钟。在发光计上读板。
实施例12
链霉抗生物素蛋白珠-生物素化的探针缀合物
以下方案提供了形成与磁珠结合的DNA捕捉探针的方法。涡旋振荡并超声处理Seradyn dsMag链霉抗生物素蛋白珠(Seradyn部分#3015210301050,Thermo FisherScientific,Inc.)。将5μL珠添加至250μL珠缀合缓冲液(1x PBS;0.15M NaCl)。在磁性架上拉下珠，并用珠缀合清洗缓冲液(高于0.5%的Tween-20)两次。在珠缀合缓冲液中重悬具有45nM每种DNA捕捉探针的珠。于37℃在以1150RPM摇动的情况中温育30分钟。将珠拉下，并用珠缀合清洗缓冲液清洗三次。在来自Digene杂合物捕捉2的250μL阻断剂缓冲液(基于酪蛋白的)中重悬以产生50x珠。
实施例13
逆杂合物捕捉测定法
逆杂合物捕捉如下检测mRNA，即首先将靶RNA捕获到互补的生物素化的DNA探针上，所述DNA探针与链霉抗生物素蛋白磁珠缀合。可以将此探针-珠复合物预缀合，并且于4℃持续几个月是稳定的。此捕捉步骤需要30分钟，并且应当于60℃在不断摇动的情况中发生。然后，将具有捕获靶物的珠清洗，使得除去任何非靶RNA序列。由于杂合物捕捉抗体结合个别DNA-RNA杂合物，优选的是用DNA探针(例如DNA捕捉探针和放大探针)覆盖靶RNA以实现最大信号(见例如图1和2)。如此，然后将别的探针与靶mRNA杂交。由于靶物仅在此点时存在(因为已经将非靶RNA洗去)，这些探针不需要是序列特异性的，而是可以覆盖基因的全长，其排除已经由生物素化的DNA探针覆盖的区域。将这些信号放大探针稀释至工作浓度4.2nM。也于60℃在7.8左右的pH发生此杂交30分钟，优选地在摇动的情况中。然后，杂交继之以用杂合物捕捉抗体系统的检测：于45℃暴露于检测试剂1(具有0.05%(w/v)叠氮化钠而没有RNA酶的缓冲溶液中针对RNA:DNA杂合物的缀合有碱性磷酸酶的抗体)达30分钟，接着广泛清洗，随后于室温添加检测试剂2(试剂，其具有Emerald IITM，即一种化学发光底物)达15分钟。在发光计上阅读信号。测定法的此分析后部分花费约2小时15分钟。
实施例14
添加未标记的信号放大探针的效果
信号对于用仅3或5种生物素化的DNA捕捉探针和无未标记的信号探针捕获的RNA靶物是相对较低的。信号在未标记的探针在用杂合物捕捉抗体和发光技术检测前与靶物杂交时基本上是较高的。使用逆杂合物捕捉测定法来检测RNA。在此实验中，将可变数目的生物素化的DNA捕捉探针与链霉抗生物素蛋白珠缀合(见图4)。靶物是HPV16的E6/7基因。在添加和不添加信号放大探针的情况中用每组珠实施测定法(分别是一步对两步测定法)。在不添加未标记的DNA探针进行信号放大时(一步测定法；灰色柱形)，信号随着由生物素化的捕捉探针提供的覆盖量而升高。然而，在添加未标记的DNA探针进行信号放大时(两步测定法；黑色柱形)，信号在仅使用1、3或5种捕捉探针时比在一步测定法中高得多。在两步测定法中，用少到3至5种捕捉探针实现最佳信号。
实施例15
通过分子尺方法测定的mRNA转录物长度
可以通过捕获到磁珠上，并用为了延伸杂合物区长度使用的未标记的寡核苷酸检测测量HPV转录物的长度。信号输出会随放大信号探针的连续添加而升高，直到达到最大长度，在那里信号会达到稳定水平。图12中示意性显示了HPV16的各种HPV转录物。指明编号区1到7(图12)，用于探针设计。例如，可以使用DNA捕捉探针3从样品捕捉E6/7基因转录物，并且信号放大探针的组合会决定信号输出。若存在的变体形式是全长，并且放大探针的组合覆盖转录物的整个长度，则信号会是较强的。若存在的E6/7变体形式是剪接的，并且使用信号探针的子集(例如探针1和6)，则来自全长/未剪接的E6/7的信号相比，信号输出会略弱(见表3)。若E6/7变体形式是剪接并整合的，则它会提供弱得多的信号(见表3)。较强的信号指示较大数目的靶物和某种疾病状态。E6/7剪接的整合变体提供较弱的信号，并且指示较少的捕获靶物，以及如此此基因的较小表达。它还指示不同疾病状态。表3显示了源自来自HPV16的各个区的所列探针(图12中显示)的组合使用的预期信号。
表3
再次参照图12和表3，可以从使用其它捕捉探针产生的信号扣除通过与捕捉探针#2(例如)杂交的非剪接转录物贡献的信号以测定源自单独的剪接转录物的信号程度。信号放大探针的组合会决定靶mRNA上的覆盖程度，并因此决定信号输出。比较源自放大探针的不同组合的信号输出会指示特定mRNA剪接形式变体的存在。这样，此方法是一种分子尺，因为信号输出依赖于存在的剪接形式，并且可以指示疾病状态的进展。
实施例16
升高的早期:晚期mRNA比的检测
本公开内容的方法实现早期和晚期HPV mRNA转录物比率的检测，其可以指示进行性HPV相关宫颈疾病。相对于HPV阳性标本背景，描述的测定法检测SiHa细胞(癌细胞系)的较高早期:晚期mRNA比率(图14)。捕捉和检测DNA探针设计为检测HPV的早期转录物和晚期转录物。对相同样品同时实施这两种测定法，并且所得信号的比率指示早期和晚期HPV转录物的比率。为了模拟包含与癌前损伤细胞混合的少数癌细胞的标本，将HSIL标本(高度鳞状上皮内损伤，按照宫颈细胞学的Bethesda系统)的集合与已知数目的SiHa细胞(如沿着x轴指示的)掺入，然后经由本公开内容的方法测定(见例如实施例12)。如图14指示的，可以针对具有低比率的细胞背景检测具有高E6/7mRNA比率的细胞分数。
本说明书中引用的所有参考文献通过提及并入本文，就像明确且单独指出通过提及并入每篇参考文献一样。任何参考文献的引用是为了其在提交日前的公开内容，并且不应解释为承认凭借在先发明，本公开内容没有资格早于此类参考文献。
应当理解，上文描述的每项要素或两项或更多项一起也可以在与上文描述的类型不同的其它类型的方法中找到有用的应用。不进一步分析，上文会完整揭示本公开内容的要旨，使得其它人可以通过应用目前的知识在不省略从现有技术观点看完全构成所附权利要求书中列出本公开内容的一般或具体方面的本质特征的特性的情况下容易地使其适合于各种应用。前述方面仅作为例子提出；本公开内容的范围应当仅以所附权利要求书限制。
实施例17
依照本申请的核酸的用途
样品和标本
SiHa(HTB-35)、CaSki(CRL-1550)、HeLa(CCL-2)和HCC1806(CRL-2335)细胞系获自ATCC(Manassas,Va.)，并通过标准技术培养。在来自Cytology Services of Maryland的常规测试后获得基于液体的细胞学(LBC)培养基(,Hologics,Ma;20ml初始体积)中残留的宫颈标本。标本集合由这些中的几个标本构成。这些标本是5-8个月龄，并且在使用前于室温贮存。依照Nazarenko et al(2008)完成一些临床标本的HPV基因型分型以确认单一HPV16感染或确认HPV DNA的缺乏。
RNA靶物分离
使用HPV16(SEQ ID NO:106)或HPV18(SEQ ID NO:107)作为模板用标准的克隆技术制备E6(1-790nt)和E2(2755-3852nt)区的体外转录的HPV16或HPV18RNA。使用Plus微型试剂盒或QIAzol裂解试剂(QIAGEN,Valencia,Ca)从样品、细胞系和标本制备RNA。对于QIAzol RNA分离，通过离心将LBC中保存的细胞分离，将细胞提取，然后将沉淀的RNA在Tris缓冲液pH7中重悬)。
细胞浓缩
通过吸附到经羧基修饰的磁珠上(8μl5%固体；产品目录编号#65162105050350,Seradyn)在微量离心管中浓缩来自标本的在LBC培养基(1ml)中保存的一些细胞。将标本-珠悬浮液在旋转微量离心块(1100rpm,Eppendorf)中于22℃温育30分钟。通过磁性管固定器(Promega,Madison,WI)使吸附到珠上的细胞沉淀。使用血球计通过对剩余上清液中的细胞计数测定自已知细胞数目的混合物沉淀的细胞百分比。将细胞用盐水清洗，并在裂解缓冲液中重悬，然后转移至96孔测定板。
寡脱氧核糖核苷酸
通过使用任一种Blast(NCBI)比较将寡脱氧核糖核苷酸(寡聚物)探针设计为对HPV16(或18)mRNA靶物特异性的。调节捕捉探针的设计以避免与其它HPV类型的交叉杂交。信号放大寡聚物与其靶物互补，但是不设计为避免与其它HPV类型的交叉反应性。下文表4中显示了捕捉和放大探针序列。捕捉寡聚物用5’生物素修饰。
表4
通过PrimerQuest(IDT,Coralville,IA)和Beacon Designer(Palo Alto,Ca)设计逆转录、PCR引物和TaqMan探针。所有寡核苷酸由IDT(Coralville,IA)合成。
实时、逆转录和PCR(RT-PCR)
使用5x病毒混合物(无rox;QIAGEN,Valencia,Ca)依照供应商方案实施一步RT-PCR。使用软件针对E6-7区和E2区设计引物和探针组。
使用Stratagene MX3000P(Stratagene,LaJolla,Ca)或Bio-Rad iQTM5(Bio-Rad,Hercules,Ca)实时PCR仪实施实时RT-PCR。RT-PCR体积是25μ1。使用共有PCR(Nazarenko etal.,2008)来指示宫颈标本集合是否含有HPV DNA类型。
杂合物捕捉测定法
通过添加10μ1磁珠(经链霉抗生物素蛋白修饰的,0.01%固体,1μ1,Seradyn)在60μ1裂解缓冲液(RLT Plus,QIAGEN Inc)中发生RNA分离。
使用标准规程将生物素化的捕捉寡聚物与磁珠偶联。每种靶物有5种序列特异性捕捉探针。在1100rpm旋转的情况下于60℃温育30分钟期间将靶RNA捕获到这些经寡聚物修饰的珠上。将此样品用纯水以1:3稀释，并分入96孔微量滴定板的2个孔中。使放大DNA探针(各4.2mM,33-45nt)与缓冲液中的靶RNA杂交，所述缓冲液由变性试剂:探针稀释剂(QIAGENInc)的5:8混合物组成。存在有15种针对E6-7靶物的放大探针和27种针对E2靶物的放大探针。使用磁性板固定器(Ambion)将附于珠的所得杂合物沉淀。用基于去污剂的盐水缓冲液(pH7.5)在磁性板上清洗杂合物-珠复合物。将复合物与同碱性磷酸酶(DR1;QIAGEN Inc)缀合的单克隆杂合物捕捉抗体一起温育(45℃,30分钟)。然后，将此复合物用HC2清洗缓冲液(QIAGEN Inc)清洗。然后，将复合物与化学发光的碱性磷酸酶底物(DR2,QIAGEN Inc)一起温育(22℃,15分钟,旋转300rpm)。使用DML2000发光计(QIAGEN Inc)以相对荧光单位(RLU)测量信号。
结果
HPV mRNA的稳定性
使用实时RT-PCR测定法测定LBC培养基中固定的细胞中HPV mRNA的稳定性。SiHa细胞含有2个拷贝的整合HPV16基因组(无附加体的)，并且表达HPV E6-7mRNA。在合并的LBC宫颈标本中保存新鲜的SiHa细胞，所述合并的LBC宫颈标本先前不含HPV，如通过PCR指示的。将这些样品于室温温育多达67天。定期(3,13,26,42和67天)取出2个等分试样(1ml)，并通过QIAzol试剂分离RNA。使用实时RT-PCR(5'-3';正向引物GCACCAAAAGAGAACTGCAATGT(SEQ ID NO:108),反向引物CATATACCTCACGTCGCAGTAACT(SEQ ID NO:109),TaqMan探针FAM-CAGGACCCACAGGAGCGACCCAGA-BHQ1(SEQ ID NO:110))测定HPV mRNA水平。每个反应含有来自约125,000个SiHa细胞的mRNA。RT-PCR的循环阈值(即mRNA丰度的测量)是相对稳定多至42天，然后对于42和67天等分试样转变约1-2个循环(图15)。基于理论PCR动力学，此转化可以造成约3倍的靶mRNA降低。
杂合物捕捉mRNA检测测定法的分析性能
图16a中显示了mRNA的杂合物捕捉测定法的示意图。测定法松散地基于DigeneHC2HPV DNA(QIAGEN Inc)，只是mRNA是靶物，且探针由合成的DNA(不是RNA)组成，不包括靶物的碱变性，且在磁珠(代替ELISA板)上捕捉形成的RNA:DNA杂合物。通过使用特异性捕捉探针将4种针对HPV mRNA的杂合物捕捉测定法设计为对HPV16E6-7或E2，或HPV18E6-7或E2特异性的(表4)。通过Blast程序确认捕捉探针的特异性。将细胞团粒或RNA裂解以释放并解开RNA。将裂解物相等地分到不同孔中，用于检测E6-7或E2mRNA。每个孔接受附于磁珠的独特组的序列特异性捕捉探针(5种，35nt)。在清洗未结合的材料后，添加一些放大探针(33-45nt)以互补每个捕获的mRNA靶物的E6-7或E2编码区的整个长度。这些放大探针不设计为避免与其它HPV类型的交叉反应性。其功能是经由杂合物捕捉抗体与碱性磷酸酶的结合升高来提供信号放大。形成的杂合物靶物的长度是约740bp(对于E6-7)和1500bp(对于E2)。图16b中指示杂合物捕捉探针的探针位置。
首先对HPV16E6-7、HPV16E2、HPV18E6-7或HPV18E2的纯的、体外转录的HPV RNA靶物实施杂合物捕捉测定法。图17b中显示了HPV16E6-7测定法的结果。该测定法每个反应检出约1000个拷贝的RNA。存在有信号对靶物输入的线性依赖性，具有3-4个对数的动力学范围。对其它三种RNA靶物，包括HPV16E2、HPV18E6-7和HPV18E2转录物检出类似的信号对靶物输入的依赖性。在用HPV16特异性探针探查HPV18RNA靶物时没有产生高于背景的信号，或反之亦然。
在靶物量外，测定法信号依赖于容许测定法用作分子尺的形成的杂合物的长度。为了证明这点，通过信号对用于加长杂合物的相邻放大探针数目的依赖性测量HPV16E6-7体外转录的RNA的相对长度。通过几个孔中的磁珠(5种捕捉寡聚物)捕捉相等量的HPV16E6-7RNA。将增加数目的相邻放大探针类型添加至每个不同孔。如此，每个孔具有连续更长长度的RNA:DNA杂合物，直到一些孔含有完全杂合的RNA靶物(图17a)。孔信号升高，直到在完全杂交靶物的孔(添加15种放大探针)达到稳定水平。进一步添加5种非互补的探针没有提高测定信号。
杂合物捕捉测定法检出先前不含HPV的LBC临床标本集合中保存的SiHa细胞的HPV16mRNA。应用使用经羧基包被的磁珠的细胞浓缩规程以沉淀SiHa和其它细胞，如方法中描述的。使用此规程在30分钟中使95%的细胞沉淀；如通过用血球计的细胞计数测定的。将所得的细胞团粒裂解，并将裂解物相等(按体积计)分到两孔中。在一个孔中测定HPV16E6-7转录物，而在第二个孔中测定HPV16E2。SiHa混合物表达丰富的E6-7转录物，而非E2(图18a)。在使用HeLa细胞(1x106个细胞)的HPV18mRNA作为靶物(S:N<2;未显示)时，这些针对HPV16的测定法仅检出可忽略的信号。没有测试与其它HPV类型的交叉反应性。可以从此数据计算SiHa细胞中HPV16E6-7和E2的比率。E2杂合物的最大信号由于其延长的长度而按比例大于E6-7杂合物的。出于此原因，在对细胞和标本计算E6-7:E2比率时用E2信号除以0.51因子。根据测定法中细胞数目，HPV16E6-7:E2比率对于SiHa细胞是8.2或更高。使用此方法来对表达HPV转录物的其它癌细胞系计算HPV E6-7:E2比率。这些包括Caski和HeLa，它们分别表达HPV16和HPV18(图18b)。对于SiHa和HeLa细胞系的比率相对高于Caski细胞的。
实施实验以测定以不相等比率表达HPV E6-7和E2转录物两者的癌细胞和非癌细胞的异质混合物中的HPV E6-7:E2比率。将SiHa细胞(其具有相对较高的E6-7:E2转录物比率)添加，并在仅对HPV16呈阳性的临床标本集合(LBC培养基)中保存。合并标本的HPV16E6:E2比率是约1，没有添加的SiHa细胞。将连续稀释的SiHa细胞添加至此标本集合的2ml等分试样。通过QIAzol提取分离样品RNA。HPV E6-7和E2测定法的结果以比率表示(图19)。将SiHa细胞添加至HPV阳性集合产生增加的E6-7:E2比率，在添加100,000个SiHa细胞后实质性增加约4,2倍。比较而言，单独的SiHa细胞(33,000个细胞)的比率是约9(图18b)。
还使用针对HPV16E6-7和E2的杂合物捕捉测定法在有限数目(n=13)的宫颈标本中测定HPV16E6-7:E2比率。标本的组织学诊断是已知的，并且所有标本通过PCR确认为仅包含HPV16。通过QIAzol提取来分离标本RNA。对于所有组织学等级有较宽的比率分布，但是一些标本具有相对较高的比率(图20)。
此杂合物捕捉测定法以良好的线性和约3-4个对数的动力学范围检出体外转录的RNA。此分析性能与DNA的杂合物捕捉检测的分析性能类似。由于捕捉寡聚物的特异性，HPV16和HPV18mRNA之间没有交叉反应性。没有测试所有各种HPV类型的交叉反应性。通过在不同孔中的测定法证明来自HPV16或HPV18的E6-7或E2mRNA的检出。可以从这些不同测定法计算HPV E6-7:E2比率。使用短的DNA探针进行靶物捕捉和检测容许用各种靶物设计的灵活性。测定法可以设计为在单一孔中检测单一HPV类型(分型)或者同时检测各种类型的多种特定HPV序列(筛选)。
实施例18
用于测定靶核酸的存在或缺乏的方法
实施例18-21利用两杂交步骤测定法，如图2中例示的。在第一个杂交步骤中，通过生物素化的DNA探针捕捉RNA，所述生物素化的DNA探针已经与链霉抗生物素蛋白磁珠缀合。在洗去外来的RNA后，添加第二轮DNA探针，其涵盖RNA靶物的全长。虽然为了确保仅捕获期望的RNA靶物，第一组DNA探针必须是特异性的，但是第二轮探针不需要是特异性的，因为对于此步骤，仅靶RNA存在于孔中。然后，通过两步杂合物捕捉抗体系统(QiagenGaithersburg,Inc.,Gaithersburg,M(D)检测杂合物，并在发光计上阅读信号。基于数量和长度两者，此方法容许RNA的线性检测。可以对此测定法应用分子尺概念，其中可以添加增加量的信号探针以测定例如转录物的长度。
虽然以下实施例使用RNA，但是可以对任何核酸形式应用通用概念。
实施例18：材料和方法
体外转录的RNA
在以下一些实施例中使用E6/E7的来自HPV16RNA的体外转录RNA(790个核苷酸)。使用HPV16质粒作为模板(GenBankNC_01526,X05015)用标准克隆技术制备RNA。
临床样品
在2009年期间获得经由杂合物捕捉II测试在PRESERVCYTTM培养基测试中对高风险HPV呈阳性的宫颈标本。使用gp+共有引物对所有样品确定基因型。在此研究中使用对HPV16呈阳性的代表性样品测试。这些之中，14份诊断为LSIL，而35份诊断为高度宫颈上皮间新生物(HSIL)。对每份样品分析E2基因表达的完整性。
RNA提取
使用QIAZOLTM试剂(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)从样品提取RNA。将样品的全部内容物(范围为2-16ml)离心15分钟。将细胞团粒在3mlQIAZOLTM中重悬，并于RT温育5分钟以实现完全裂解。然后，添加0.6ml氯仿，并且有力摇动样品，然后，于RT再次温育2-3分钟，并以12,000x g离心15分钟。将无色水层转移至含有1.5ml异丙醇的新管，并于RT温育10分钟。然后，实施以12,000x g于4℃再离心10分钟，期间在管侧形成沉淀物。将上清液清除，并将团粒用3ml75%乙醇清洗一次。在容许团粒风干10分钟后，将其在50μl分子生物学级水中重悬。
DNA探针
使用BLAST(NCBI)将各35个核苷酸的针对HPV16的DNA捕捉探针设计为针对其它HPV类型是特异性的。这些探针沿着HPV基因间隔，使得每种可能的RNA转录物会被探针捕获。这些捕捉探针合成为在5’端具有生物素。然后，信号探针设计为覆盖HPV16基因的剩余部分。这些探针的长度从28变化至42个核苷酸，并且使用寡聚物分析仪程序(IntegratedDNA Technologies,Inc.,Coralville,Iowa)来实现最佳的热力学稳定性和一致性。然后，将这些探针在探针混合物中合并。还生成不同的探针混合物，其缺乏E2区中的所有探针。
表5
DNA探针可用于逆杂合物捕捉HPV16E2破坏测定法。在测定法中使用两个探针组，组1包括沿着HPV16基因组展开的探针，且组2是子集，针对E2基因区不包括探针。表6和7中列出探针，表7中列出生物素化的捕捉探针。
表6
表7
珠/探针缀合
将链霉抗生物素蛋白磁珠(5%固体,Seradyn,Inc.,Indianapolis,IN)涡旋振荡，并且在基于Tween的清洗缓冲液中清洗两次。然后，将它们与包含180nM/探针的生物素化捕捉探针的混合物一起温育，并于37℃在以1150RPM摇动的情况中温育30分钟。将珠沉淀，再清洗三次，并在酪蛋白阻断溶液中重悬，于4℃贮存。
E2完整性测定法
于60℃在摇动的情况中将30μl离液盐溶液中20μl Qiazol提取的RNA捕获到10μl珠缀合的捕捉探针上达30分钟。在此步骤后，通过将30μl反应移液到同一96孔板上两个不同干净的孔中分开样品。然后，使用磁性架将珠-探针-RNA复合物拉下，并将所得的团粒用缓冲的盐水-去污剂溶液清洗两次，一次持续2分钟，且一次持续5分钟。然后，将信号探针混合物(一种具有所有探针，而一种没有E2区探针)以4.2nM在65μl核酸杂交缓冲液中添加，并于60℃在摇动的情况中实施杂交反应30分钟。在此反应后，将珠复合物再次沉淀，并在吸收纸巾上干燥板。以45μl/孔添加与碱性磷酸酶缀合的抗DNA:RNA核酸杂合物抗体溶液，并于45℃将板温育30分钟。将珠再次沉淀，并清洗五次，1分钟/清洗，这次用基于Tris的清洗缓冲液进行。然后，添加35μl化学发光碱性磷酸酶底物，并于室温在箔密封下以350RPM将板摇动15分钟以使样品避光。然后，在DML3000TM微板发光计(QiagenGaithersburg,Inc.,Gaithersburg,MD)上阅读来自孔的发光。
测定两个孔(具有和没有E2探针)中样品值的信号:噪音(“S/N”)。从统计学分析排除所有探针孔中具有低于2的信号:噪音值的样品。用以下等式百分比差异测定E2破坏程度：[(S/N(所有)-S/N(无E2))/S/N(所有)]x100。
实施例19
提供了体外转录的HPV E6/E7，如上文描述的。将三种各40个核苷酸的生物素化捕捉探针(沿着转录物均匀隔开)与链霉抗生物素蛋白磁珠偶联，如上文描述的。然后，将1x105个拷贝的HPV16E6/E7转录物捕获到链霉抗生物素蛋白珠，如上文描述的。生成探针混合物，其包含0、5、10、15和19种针对HPV E6/E7的信号探针。排除捕捉探针，19种信号探针足以与E6/E7转录物的全长杂交。
另外，生成探针混合物，其包含19种针对HPV E6/E7的信号探针及5种针对HPV16L1的信号探针。对每个探针混合物计算S/N比。在图13显示结果。如可以看出的，信号强度随探针数目增加而以稍呈线性的方式升高。
实施例20
使用实施例18描述的方法比较SiHa和W12细胞中E2完整性。SiHa细胞包含整合的HPV16基因组，导致对细胞中维持的E2基因的大部分的破坏。相反，HPV16基因组在W12细胞中以附加体形式维持；如此，E2基因是完整的。在图22显示数据。在从信号放大混合物除去E2探针时，SiHa细胞信号没有下降，因为用所有探针得到的信号无一来自E2区。然而，来自W12的信号显著降低，指示检出的约50%的RNA转录物来自E2。
实施例21
在实施例18描述的E2完整性测定法中测试LSIL和HSIL样品。数据显示于图23，并在下文表8中汇总。
水平 最小值 25％ 中值 75％ 最大值
HSIL 2 11 22.9 38.1 50.2
LSIL 16.5 34 42.9 47.7 57.2
如可以看出的，LSIL和HSIL样品之间具有显著差异(p=0.0012)。然而，更值得注意的是每个损伤种类中的样品分布。虽然损伤种类的最大百分比差异是相似的，最小值的差异大得多(对于HSIL为2，而对于LSIL为16.5)。鉴于仅小百分比的HSIL样品最终进展成宫颈癌，此样式有意义。

Claims (45)

1.一种分离的脱氧核糖核酸，其具有不超过50个核苷酸的总体长度且由选自下组的核苷酸序列组成：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10，其中所述核酸能够在高严格条件下与源自HPV16基因组的mRNA转录物杂交，且其中所述核酸不能在严格条件下与超过一类HPV基因组杂交。
2.权利要求1的分离的脱氧核糖核酸，其中所述核酸能够在严格条件下与下列各项杂交：
(a)人乳头瘤病毒(HPV)基因组中选自HPV16的部分，
(b)源自所述HPV基因组的mRNA转录物，或
(c)所述mRNA的互补物。
3.权利要求1或2的分离的脱氧核糖核酸，其中所述核酸：
(1)能够在高严格性条件下与下列各项杂交：
(a)人乳头瘤病毒(HPV)基因组中选自HPV16的部分，
(b)源自所述HPV基因组的mRNA转录物，或
(c)所述mRNA的互补物；
和/或
(2)能够在严格条件下与选自下组的HPV 16基因和/或mRNA杂交：E2和E6/E7。
4.权利要求1或2的分离的脱氧核糖核酸，该分离的核酸在其整个长度间与HPV 16基因中选自下组的部分具有至少75％同源性：E2和E6/E7。
5.权利要求3的分离的脱氧核糖核酸，该分离的核酸在其整个长度间与HPV 16基因中选自下组的部分具有至少75％同源性：E2和E6/E7。
6.一种核酸探针，其由依照权利要求1-5中任一项的分离的脱氧核糖核酸组成，且缀合有或不缀合有可检测标记物和/或配体。
7.权利要求6的核酸探针，其中所述核酸探针与固体支持物结合。
8.一种探针组，其包含依照权利要求6或权利要求7的至少一种核酸探针。
9.依照权利要求1-5中任一项的分离的脱氧核糖核酸在制备一种用于检测靶RNA存在的方法的试剂盒中的用途，该方法包括：
a)提供至少一种DNA捕捉探针，其中所述至少一种DNA捕捉探针与支持物结合；
b)使所述靶RNA与所述至少一种DNA捕捉探针杂交，生成靶RNA:DNA捕捉探针复合物；
c)分离所述靶RNA:DNA捕捉探针复合物；
d)提供至少一种DNA放大探针，并使所述至少一种DNA放大探针与所述靶RNA:DNA捕捉探针复合物杂交，生成靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物；
e)提供抗RNA:DNA杂合物抗体，并将所述靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物与所述抗体一起温育，生成靶RNA:DNA:抗体复合物；
f)检出所述抗体，其中所述检出指示所述靶RNA的存在，
其中所述捕捉探针和/或放大探针包含依照权利要求1-5中任一项的分离的脱氧核糖核酸。
10.权利要求9的用途，其中所述靶RNA是剪接变体，且其中选择所述至少一种DNA捕捉探针和所述至少一种DNA放大探针以检测所述剪接变体的存在。
11.依照权利要求1-5中任一项的分离的脱氧核糖核酸在制备一种检测靶RNA的存在的方法的试剂盒中的用途，该方法包括：
a)提供至少一种DNA捕捉探针；
b)提供第一抗RNA:DNA杂合物抗体，其中所述第一抗RNA:DNA杂合物抗体与支持物结合；
c)使所述靶RNA与所述至少一种DNA捕捉探针杂交，生成靶RNA:DNA捕捉探针复合物；
d)使所述靶RNA:DNA捕捉探针复合物与所述抗RNA:DNA杂合物抗体一起温育，生成结合的靶RNA:DNA捕捉探针复合物；
e)提供至少一种DNA放大探针，并使所述至少一种DNA放大探针与所述结合的靶RNA:DNA捕捉探针复合物杂交，生成结合的靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物；
f)提供第二抗RNA:DNA杂合物抗体，并将所述结合的靶RNA:DNA捕捉/放大探针复合物与所述第二抗RNA:DNA杂合物抗体一起温育，生成结合的靶RNA:DNA:抗体复合物；
g)检出所述第二抗RNA:DNA杂合物抗体，其中所述检出指示所述靶RNA的存在，
其中至少一种所述捕捉探针和/或放大探针包含依照权利要求1-5中任一项的分离的脱氧核糖核酸。
12.权利要求11的用途，其中所述靶RNA是剪接变体，且其中选择所述至少一种DNA捕捉探针和所述至少一种DNA放大探针以检测所述剪接变体的存在。
13.依照权利要求1-5中任一项的分离的脱氧核糖核酸在制备一种用于测定靶核酸在样品中是否缺乏或受破坏的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括：
a)在足以诱导下列各项形成的条件下处理所述样品的第一部分，包括使样品与包含依照权利要求1-5中任一项的分离的脱氧核糖核酸的DNA捕捉探针接触，从而形成：
i)包含所述靶核酸的第一组DNA:RNA杂合物；和
ii)包含参照核酸的第二组DNA:RNA杂合物；
b)在足以诱导所述第二组DNA:RNA杂合物，而非所述第一组DNA:RNA杂合物形成的条件下处理所述样品的第二部分；
c)在所述样品的所述第一部分和所述样品的所述第二部分中产生可检测信号，其中所述可检测信号具有与DNA:RNA杂合物浓度相关联的强度；及
d)比较所述样品的所述第一部分中的所述可检测信号的强度和所述样品的所述第二部分中的所述可检测信号的强度，其中：
i)若所述样品的所述第一部分中的所述可检测信号的强度大于所述样品的所述第二部分中的所述可检测信号的强度，则所述靶核酸是完整的且存在于所述样品中；及
ii)若所述样品的所述第一部分中的所述可检测信号的强度小于或等于所述样品的所述第二部分中的所述可检测信号的强度，则所述靶核酸是样品缺乏的。
14.权利要求13的用途，其中通过包括使所述样品与下列各项接触的方法形成所述样品的所述第一部分和所述样品的所述第二部分：
a)在严格条件下对所述靶核酸特异性的第一捕捉探针，其中所述第一捕捉探针与所述靶核酸的杂交生成第一捕捉复合物；和
b)在严格条件下对所述参照核酸特异性的第二捕捉探针，其中所述第二捕捉探针与所述参照核酸的杂交生成第二捕捉复合物。
15.权利要求14的用途，其进一步包括将所述第一捕捉复合物和所述第二捕捉复合物捕捉到支持物。
16.权利要求15的用途，其中所述第一和第二捕捉探针与所述支持物结合或适合于与所述支持物结合。
17.权利要求16的用途，其中所述捕捉探针包含配体，且所述支持物包含配体结合模块。
18.权利要求17的用途，其中所述第一捕捉探针和所述第二捕捉探针包含相同配体。
19.权利要求17的用途，其中所述第一捕捉探针和所述第二捕捉探针包含不同配体，其中：
a)使所述样品的所述第一部分与第一组固体支持物接触，所述第一组固体支持物包含能够结合所述第一捕捉探针的所述配体的配体结合模块和能够结合所述第二捕捉探针的所述配体的配体结合模块；和
b)使所述样品的所述第二部分与第二组固体支持物接触，所述第二组固体支持物包含能够结合所述第二捕捉探针，而非所述第一捕捉探针的所述配体的配体结合模块。
20.权利要求19的用途，其中使所述样品的所述第一部分和所述样品的所述第二部分与下列各项接触：
i)第一探针组，其包含多个能够与所述靶核酸杂交的信号探针；和
ii)第二探针组，其包含多个能够在严格条件下与所述参照核酸杂交的信号探针。
21.权利要求17的用途，其中所述第一捕捉探针和所述第二捕捉探针是生物素化的，且其中所述第一支持物和所述第二支持物包含生物素结合模块。
22.权利要求17的用途，其中所述捕捉探针与所述支持物共价结合。
23.权利要求15的用途，其中：
a)所述第一和第二捕捉复合物包含DNA:RNA杂合物；并
b)将所述第一和第二捕捉复合物捕捉到所述第一和第二支持物，其通过包括使所述第一和第二捕捉复合物与能够特异性结合DNA:RNA杂合物的实体接触的方法进行，其中所述能够特异性结合DNA:RNA杂合物的实体与所述支持物结合或适合于与所述支持物结合。
24.权利要求23的用途，其中所述能够特异性结合DNA:RNA杂合物的实体包括配体，且所述第一和第二支持物包含配体结合模块。
25.权利要求24的用途，其中所述能够特异性结合DNA:RNA杂合物的实体是生物素化的，且其中所述支持物包含生物素结合模块。
26.权利要求23的用途，其中所述能够特异性结合DNA:RNA杂合物的实体与所述支持物共价结合。
27.权利要求23的用途，其中所述能够特异性结合DNA:RNA杂合物的实体是DNA:RNA杂合物特异性抗体或其片段。
28.权利要求15的用途，其中：
a)所述第一捕捉探针包含：
i)能够在严格条件下与所述靶核酸杂交的区域；和
ii)能够与锚探针的第一核酸序列杂交的区域；
b)所述第二捕捉探针包含：
i)能够在严格条件下与所述靶核酸杂交的区域；和
ii)能够与锚探针的第二核酸序列杂交的区域，
其中所述锚探针与所述第一支持物和/或第二支持物结合或适合于与所述第一支持物和/或第二支持物结合。
29.权利要求28的用途，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列是相同的。
30.权利要求28的用途，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列是不同的。
31.权利要求30的用途，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列在同一锚探针中布置。
32.权利要求30的用途，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列在不同锚探针中布置。
33.权利要求28的用途，其中：
a)所述第一支持物含有包含所述第一核酸序列的锚探针和包含第二核酸序列的锚探针；和
b)所述第二支持物含有包含所述第二核酸序列的锚探针，但是不含包含所述第一核酸序列的锚探针。
34.权利要求13的用途，其中：
a)通过包括使所述样品与能够与所述靶核酸杂交的第一信号探针接触的方法形成所述第一组DNA:RNA杂合物；并
b)通过包括使所述样品与能够与所述参照核酸杂交的第二信号探针接触的方法形成所述第二组DNA:RNA杂合物。
35.权利要求34的用途，其中：
a)使所述样品的所述第一部分与所述第一信号探针和所述第二信号探针接触；并
b)使所述样品的所述第二部分与所述第二信号探针，而非所述第一信号探针接触，
其中所述第一信号探针在严格条件下对所述靶核酸是特异性的，且所述第二信号探针在严格条件下对所述参照核酸是特异性的。
36.权利要求24的用途，其中：
a)所述第一信号探针在第一探针组中布置，所述第一探针组包含多个能够与所述靶核酸杂交的信号探针；并且
b)所述第二信号探针在第二探针组中布置，所述第二探针组包含多个能够与所述参照核酸杂交的信号探针。
37.权利要求36的用途，其中：
a)所述第一探针组的所述多个信号探针能够与所述靶核酸的至少70％杂交；
b)所述第二探针组的所述多个信号探针能够与所述参照核酸的至少70％杂交。
38.权利要求13的用途，其中通过包括使所述样品的所述第一部分和所述样品的所述第二部分与能够特异性结合DNA:RNA杂合物的实体接触的方法产生所述可检测信号。
39.权利要求38的用途，其中所述能够特异性结合DNA:RNA杂合物的实体是DNA:RNA杂合物特异性抗体或其片段。
40.权利要求13的用途，其包括：
a)通过如下的方法生成所述样品的所述第一部分和所述样品的所述第二部分，所述方法包括：
i)使所述样品至少与在严格条件下对所述靶核酸特异性的第一生物素化的捕捉探针接触；
ii)使所述样品至少与在严格条件下对所述参照核酸特异性的第二生物素化的捕捉探针接触；
iii)在如下条件下使所述样品与经链霉抗生物素蛋白包被的磁珠接触，所述条件足以容许所述生物素化的捕捉探针与所述经链霉抗生物素蛋白包被的珠结合；并
iv)将所述经链霉抗生物素蛋白包被的珠分入不同容器中以形成所述样品的所述第一部分和所述样品的所述第二部分；
b)通过包括使所述样品的所述第一部分与探针混合物接触的方法在所述样品的所述第一部分中形成所述第一组DNA:RNA杂合物和所述第二组DNA:RNA杂合物，所述探针混合物包含：
i)多个可检测标记的核酸探针，其能够在严格条件下与所述靶核酸杂交，其中所述多个足以覆盖所述靶核酸；和
ii)多个可检测标记的核酸探针，其能够在严格条件下与所述参照核酸杂交，其中所述多个足以覆盖所述靶核酸；并
c)通过包括使所述样品的所述第二部分与探针混合物接触的方法在所述样品的所述第二部分中形成所述第二组DNA:RNA杂合物，所述探针混合物包含多个可检测标记的信号探针，其能够在严格条件下与所述参照核酸杂交，其中所述多个足以覆盖所述靶核酸，
其中通过所述可检测标记的信号探针产生所述可检测信号。
41.权利要求13的用途，其中：
a)所述靶核酸是HPV E2核酸；且
b)所述参照核酸选自下组：
i)HPV E1核酸，
ii)HPV E6/E7核酸，
iii)HPV L1核酸，
iv)HPV L2核酸。
42.权利要求41的用途，其中检测参照核酸组，该组包含至少两种选自下组的参照核酸：
i)HPV E1mRNA或cDNA，
ii)HPV E6/E7mRNA或cDNA，
iii)HPV L1mRNA或cDNA；和
iv)HPV L2mRNA或cDNA。
43.权利要求41或42的用途，其中所述参照核酸组包含：
i)HPV E1mRNA；
ii)HPV E6/E7mRNA；
iii)HPV L1mRNA；和
iv)HPV L2mRNA。
44.权利要求1-5中任一项的分离的脱氧核糖核酸在制备一种用于预测患者中HPV诱导的细胞转化开始的试剂盒的用途，所述预测中使用的方法包括通过权利要求41-43中任一项的用途中所描述的方法检测受HPV感染的源自患者的组织中HPV E2mRNA的存在或缺乏，其中HPV E2mRNA的缺乏指示所述HPV诱导的细胞转化的开始。
45.权利要求1-5中任一项的分离的脱氧核糖核酸在制备一种用于检测HPV基因组整合入宿主细胞基因组中的试剂盒的用途，所述检测中使用的方法包括通过权利要求41-43中任一项的用途中所描述的方法检测受HPV感染的源自患者的组织中HPV E2mRNA的存在或缺乏，其中HPV E2mRNA的缺乏指示所述HPV基因组整合入宿主细胞基因组中。
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