CN112111605A - 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR‑Cas12a和G四链体‑血红素的HPV的检测试剂盒，包括如下组分：DNA提取液、阳性对照、阴性对照、RPA反应液、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/gRNA复合物溶液和检测溶液。检测HPV时，其操作简单、快捷，扩增的特异性较高，十分适合RNA的快速、及时的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒。
背景技术
人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒感染引起的一种性传播疾病。主要类型为HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，HPV16和18型长期感染可能与女性宫颈癌有关。为实现HPV的早期检测并使耐药菌传播减至最小，开发低成本、准确、高效、快速地检测HPV相关特异基因的诊断方法非常重要。
重组酶聚合酶扩增技术(recombinase poly-merase amplification，RPA)一种新型的恒温核酸扩增技术，其最显著的优势就是可在37-42℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，可以在10～40min内完成数十亿的DNA拷贝。RPA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应，无需精密仪器。
CRISPR-Cas是细菌抵抗病毒和质粒侵染的获得性免疫防御系统，几乎存在于所有的古菌和约50％的现代细菌。CRISPR-Cas平台是出色的基因组编辑工具，其层出不穷的科研进展及其应用更新给生物学界带来巨大革命。CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR系统要由多个Cas蛋白组成的效应复合物才能发挥功能；第二大类Cas是依靠单个Cas效应蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2等)就能发挥功能。
2015年，张锋等人发现了新的CRISPR相关蛋白内切酶Cas12a(之前称为Cpf1)，它与常用的Cas9蛋白一样是RNA引导的特异性DNA核酸内切酶，但与相比Cas9，Cas12a又有它自身特点，比如仅需要gRNA即可引导特异性切割双链DNA，并产生粘性末端等。Cas12a一旦识别并切割由gRNA序列指定的靶标DNA，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它能将任意非靶标的单链DNA切成碎片。这种作用称之为附属活性。
基于分子的诊断方法可以提高检测抗性基因的速度和准确性，这对医院和社区环境中的感染控制、预防、治疗很有意义。
中国专利CN110396557A公开一种基于CRISPR/Cas12a的特异性HPV核酸检测方法，研究发现了一种HPV核酸检测位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现HPV核酸检测，并构建了基于CRISPR/Cas12a的特异性HPV核酸检测系统和检测试剂盒。该检测可能存在准确度和灵敏度不足等问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，通过采用重组酶聚合酶扩增技术提高检测灵敏度，且是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性和设备简单的检测方法。
为解决上述问题，
一方面，本发明在于提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，包括如下组分：DNA提取液、阳性对照、阴性对照、RPA反应液、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/gRNA复合物溶液和检测溶液。
进一步地，所述DNA提取液来自HPV感染病人阴道、宫颈分泌物。
进一步地，所述阳性对照为HPV重组质粒；所述阴性对照为无关序列的质粒。
进一步地，所述RPA反应液：包含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH2O、冻干酶粉和MgAc。
进一步地，所述PS2.M/Hemin溶液：PS2.M DNA、Tris-HCL溶液和Hemin(血红素)溶液。
进一步地，所述Cas12a/gRNA复合物溶液：FnCas12a、HPV gRNA和Tris-HCl缓冲液。
进一步地，所述检测溶液：ABTS和H2O2。
进一步地，所述扩增引物对用于扩增HPV16型或HPV18型DNA。
进一步地，所述扩增引物对包括：
RPA-1上游引物:5'CACCTTCATCACCGTCGCTGGAGCGCCAGGAGTC3'，
RPA-1下游引物:5'GCGACCGGTGCCTTCTTAGGCAAGACGAGGGAG3'；
RPA-2上游引物:5'CACATTCATCACTGTCGCTGTAGCGCCAGGAGTC3'，
RPA-2下游引物:5'GAGACCGTTGCATTCTTAGCCAAGACGAGGGAG3’。
进一步地，所述HPV16型或HPV18型DNA提取采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒进行提取。
进一步地，所述Tris-HCL溶液的浓度为20mm/L，PH7.5，含100mm/L KCl、40mm/LMgCl2、0.008％Triton X-100。
进一步地，所述Hemin溶液由Hemin用DMSO配制成。
进一步地，所述FnCas12a的制备过程如下：使用化学合成法进行FnCas12基因合成，并将FnCas12克隆入PET-32a原核表达载体中；经Sanger法测序鉴定插入序列正确后，将重组质粒转化大肠杆菌E.coli.BL21；用IPTG诱导表达6His-TRX-TCRP1融合蛋白，进行亲和层析纯化融和蛋白；用EK酶切去除融合蛋白6His标签，并纯化鉴定FnCas12蛋白。
进一步地，所述HPV gRNA的制备过程如下：合成如序列SEQ ID NO.8所示的正义链序列、如序列SEQ ID NO.9所示的反义链序列；将二者经退火形成双链DNA；经T7polymerase体外转录成gRNA，并使用亲和层析纯化得到如序列SEQ ID NO.10所示的HPV gRNA；
所述正义链序列为
5’GCACCAAAAGAGAACTGCAATGT3’；
所述反义链序列为
5’CATATACCTCACGTCGCAGTAACT3’；
所述HPV gRNA序列为
5’UCUAAAAUUUACUGUGUAUGGAUCCCACCUAAGACACUCCA3’。
进一步地，所述Tris-HCl缓冲液包括20mM/L Tris-HCl，pH 7.5，100mM/L KCl，5mM/L MgCl2，1mM/L DTT，5％甘油。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，通过采用重组酶聚合酶扩增技术检测HPV，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，检测灵敏度高，最低可以检测到1×101拷贝/ul HPV重组质粒DNA。
检测过程中不需将RNA转化为DNA再进行扩增，只需要将Cas12a与RNA结合形成复合物，再与RPA扩增的靶标DNA形成三元复合体；激活的Cas12a不但可以切割靶标HPV DNA，而且可将体系中PS2.M DNA单链切成碎片，使PS2.M不能形成G-四链体，G-四链体/Hemin复合体不能形成，抑制了ABTS2-H2O2体系的氧化还原反应，响应体系吸光度即可实现检测，且该检测可以通过普通分光光度计、酶标仪检测，甚至肉眼可见。
本发明的检测过程采用重组酶聚合酶扩增技术，可在20min内完成反应，无需精密仪器。
本发明设计了多条检测引物对，可使引物尽量与HPV序列吻合，可保证全面的与世界各地不同基因型和不同感染HPV病毒的检测。
本发明的检测方法简单、高效、快速、低成本、高准确度、高敏感性、通用性好、特异性强，设备简单。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
1)RPA引物及试剂：
以HPV18分离株基因组保守区域片段为靶标，根据RPA引物的设计原则，设计1对RPA引物。引物序列如下：
RPA-1上游引物:5'CACCTTCATCACCGTCGCTGGAGCGCCAGGAGTC3'，
RPA-1下游引物:5'GCGACCGGTGCCTTCTTAGGCAAGACGAGGGAG3'；
以HPV16分离株基因组为靶标，根据RPA引物的设计原则，设计1对RPA引物。引物序列如下：
RPA-2上游引物:5'CACATTCATCACTGTCGCTGTAGCGCCAGGAGTC3'，
RPA-2下游引物:5'GAGACCGTTGCATTCTTAGCCAAGACGAGGGAG；
2)HPV gRNA：
制备HPV gRNA：设计针对RPA扩增靶标区的单链gDNA，正义链序列为
5’GCACCAAAAGAGAACTGCAATGT3’；
反义链序列为5’CATATACCTCACGTCGCAGTAACT3’。正义链和反义链经退火形成双链DNA。经T7 polymerase体外转录成gRNA，并使用亲和层析纯化gRNA，gRNA序列如为
5’UCUAAAAUUUACUGUGUAUGGAUCCCACCUAAGACACUCCA3’。
3)G4/Hemin显色体系：
HPV阳性对照品的准备:以含HPV片段的重组质粒为阳性对照。制备方法：用化学合成法进行HPV基因片段合成，并克隆至PUC57载体获得重组质粒。通过Sanger法测序确定插入序列正确，命名为PUC57/HPV。将重组质粒菌37度培养过夜，抽提质粒，测浓度。根据下列公式，计算PUC57/HPV重组质粒拷贝数。
实施例：
实施例1
RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法灵敏度检测
(1)将重组质粒PUC57/HPV重组质粒进行稀释，使其浓度为0、101、102、103、104、105、106、107、108拷贝/ul(copies/μl)。
(2)RPA扩增：以上述不同浓度的PUC57/HPV重组质粒为模板，以HPV RPA引物进行RPA扩增。RPA的反应体系是50ul，50ul RPA反应体系包括：10um上、下游引物各2.4ul，重泡胀缓冲液29.5ul，不同浓度的PUC57/HPV重组质粒模板1ul，ddH2O13.2ul，混匀，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的反应管中，加入2.5μl 280mm MgAc，混匀。37℃水浴锅中孵育20min，RPA产物备用；
(3)Cas12a-gRNA复合物的准备：将纯化的FnCas12a及HPV gRNA加入到用Tris-HCl缓冲液(20mM/L Tris-HCl,pH 7.5,100mM/L KCl,5mM/L MgCl2,1mM/L DTT,5％甘油)中，使FnCas12a及HPV gRNA终浓度分别为400nM/L、500nM/L。37度孵育30min。使Cas12a与gRNA结合形成复合物。
(4)吸光度检测：PS2.M DNA溶解在20mM/L Tris-HCL溶液(PH7.5，含100mM/L KCl、40mM/L MgCl2、0.008％Triton X-100)，浓度为1umol/L，向溶液中加入终浓度为2uM/LHemin(Hemin用DMSO配制成2.38mM/L的母液)。-20度冻存备用。取10ul PS2.M/Hemin溶液、上述Cas12a/gRNA复合物溶液2ul、上述RPA产物8ul加入384微孔板中，共20ul，37度孵育1h。加入ABTS和H2O2(终浓度分别为2mM/L、4mM/L)，反应5分钟后上Biotek多功能酶标仪在波长400nm处测定吸光度。
(5)结果：随着HPV重组质粒浓度的增加，420nm处测得的吸光度逐渐降低，当重组质粒浓度达到106以上时，吸光度进入平台期。本方法最低可以检测到1×101拷贝/ul HPV重组质粒DNA，表明本方法具有较高的灵敏度。
实施例2 RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法检测效果评价
采集样本：HPV感染病人及健康人阴道、宫颈分泌物样本各6例。棉拭子经分泌物用1ml生理盐水充分洗涤后挤干，弃棉球，浸出液经离心后弃上清液，在沉淀中加入DNA提取液，吹打均匀后100℃煮沸15min,离心10min。
提取：将样品处理上清液经柱提法提取DNA后，用灭菌水溶解DNA提取液。
检测方法：以DNA提取液为样品，以103-106拷贝/ul HPV重组质粒为阳性对照，以无关序列的质粒为阴性对照。所有样品及对照进行RPA扩增(方法同实施例1)。取RPA产物8ul、PS2.M/Hemin溶液10ul、Cas12a/gRNA复合物溶液2ul、加入384微孔板中，体系共20ul，37度孵育1h。加入ABTS和H2O2(同实施例1)，反应5分钟后上Biotek多功能酶标仪在波长400nm处测定吸光度。
结果：所有6个HPV病人样品均为阳性，6个健康人血清样品均为阴性。与qPCR方法吻合率达100％。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学附属第一医院
<120> 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒
<130> 2020
<140> 202010992418.0
<141> 2020-11-03
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caccttcatc accgtcgctg gagcgccagg agtc 34
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcgaccggtg ccttcttagg caagacgagg gag 33
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cacattcatc actgtcgctg tagcgccagg agtc 34
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gagaccgttg cattcttagc caagacgagg gag 33
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcaccaaaag agaactgcaa tgt 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
catatacctc acgtcgcagt aact 24
<210> 7
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ucuaaaauuu acuguguaug gaucccaccu aagacacucc a 41
Claims (10)
1.一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：DNA提取液、阳性对照、阴性对照、RPA反应液、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/gRNA复合物溶液和检测溶液。
2.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液来自HPV感染病人阴道、宫颈分泌物。
3.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为HPV重组质粒；所述阴性对照为无关序列的质粒；
所述RPA反应液：包含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH2O、冻干酶粉和MgAc。
4.根据权利要求3所述基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物对用于扩增HPV16型或HPV18型DNA；
所述扩增引物对包括：
RPA-1上游引物:5'CACCTTCATCACCGTCGCTGGAGCGCCAGGAGTC3'，
RPA-1下游引物:5'GCGACCGGTGCCTTCTTAGGCAAGACGAGGGAG3'；
RPA-2上游引物:5'CACATTCATCACTGTCGCTGTAGCGCCAGGAGTC3'，
RPA-2下游引物:5'GAGACCGTTGCATTCTTAGCCAAGACGAGGGAG3’。
5.根据权利要求4所述基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，其特征在于，所述HPV16型或HPV18型DNA提取采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒进行提取。
6.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，其特征在于，所述PS2.M/Hemin溶液：PS2.M DNA、Tris-HCL溶液和Hemin(血红素)溶液。
7.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，其特征在于，所述Cas12a/gRNA复合物溶液：FnCas12a、HPV gRNA和Tris-HCl缓冲液；
所述检测溶液：ABTS和H2O2。
8.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCL溶液的浓度为20mm/L，PH7.5，含100mm/L KCl、40mm/L MgCl2、0.008％Triton X-100；所述Hemin溶液由Hemin用DMSO配制成。
9.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，其特征在于，所述HPV gRNA的制备过程如下：合成正义链序列、反义链序列；将二者经退火形成双链DNA；经T7 polymerase体外转录成gRNA，并使用亲和层析纯化得到HPV gRNA；
所述正义链序列为5’GCACCAAAAGAGAACTGCAATGT3’；
所述反义链序列为5’CATATACCTCACGTCGCAGTAACT3’；
所述HPV gRNA序列为5’UCUAAAAUUUACUGUGUAUGGAUCCCACCUAAGACACUCCA3’。
10.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HPV的检测试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液包括20mM/L Tris-HCl，pH 7.5，100mM/L KCl，5mM/LMgCl2，1mM/L DTT，5％甘油。
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