CN109929949B - 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于CRISPR‑Cas12a和G四链体‑血红素的EBV的检测方法及应用，过程如下：以EBV患者血清中提取到的DNA为模板，将含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH2O的RPA反应体系加入冻干酶粉中，再加入MgAc混匀，孵育，得到PRA产物；PS2.M DNA溶解在Tris‑HCL溶液，向溶液中加入Hemin溶液，制得PS2.M/Hemin溶液；将FnCas12a和EBV crRNA加入到Tris‑HCl缓冲液中，孵育，制得Cas12a/crRNA复合物溶液；将RPA产物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA复合物溶液孵育，加入ABTS和H2O2处理后测定吸光度。本发明是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性和设备简单的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法及应用。
背景技术
B病毒(Epstein-Barrvirus；EBV)属于疱疹病毒家族，主要侵犯B淋巴细胞，引起传染性单核细胞增多症，并与多种淋巴瘤的发生有密切关系。EBV在人群中广泛感染，约90％以上的成人血清EBV抗体呈阳性。
生理状态下，在机体免疫系统作用下，EBV再激活和EBV特异CD8+T细胞的抗病毒免疫控制处于一种平衡状态，使EBV处于未活化状态而长期潜伏在人体淋巴组织中，受感染者终生携带病毒而不发病。以往EBV检测方法主要包括采用免疫酶染色法或免疫荧光技术检测血清中EBV特异性抗体，以及核酸杂交和PCR等方法检测细胞内EBV基因组及其表达产物。但是常规PCR检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，且耗时较长，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。与传统PCR相比，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase poly-meraseamplification，RPA)一种新型的恒温核酸扩增技术，其最显著的优势就是可在37-42℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，可以在10～40min内完成数十亿的DNA拷贝。RPA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应，无需精密仪器。
CRISPR-Cas是细菌抵抗病毒和质粒侵染的获得性免疫防御系统，几乎存在于所有的古菌和约50％的现代细菌。CRISPR-Cas平台是出色的基因组编辑工具，其层出不穷的科研进展及其应用更新给生物学界带来巨大革命。CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR系统要由多个Cas蛋白组成的效应复合物才能发挥功能；第二大类Cas是依靠单个Cas效应蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2等)就能发挥功能。
2015年，张锋等人发现了新的CRISPR相关蛋白内切酶Cas12a(之前称为Cpf1)，它与常用的Cas9蛋白一样是RNA引导的特异性DNA核酸内切酶，但与相比Cas9，Cas12a又有它自身特点，比如仅需要crRNA即可引导特异性切割双链DNA，并产生粘性末端等。Cas12a一旦识别并切割由crRNA序列指定的靶标DNA，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它能将任意非靶标的单链DNA切成碎片。这种作用称之为附属活性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法及应用，通过采用重组酶聚合酶扩增技术提高检测灵敏度，且是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性和设备简单的检测方法。
为解决上述问题，
一方面，本发明在于提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法，包括如下步骤：
1)制备RPA产物：以EBV患者血清中提取到的DNA为模板，将含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH2O的RPA反应体系加入冻干酶粉中，再加入MgAc混匀，孵育，得到RPA产物；
2)制备PS2.M/Hemin溶液：PS2.M DNA溶解在Tris-HCL溶液，向溶液中加入Hemin(血红素)溶液，制得PS2.M/Hemin溶液；
3)制备Cas12a/crRNA复合物溶液：将FnCas12a和EBV crRNA加入到Tris-HCl缓冲液中，孵育，制得Cas12a/crRNA复合物溶液；
4)检测EBV：将RPA产物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA复合物溶液孵育，加入ABTS和H2O2处理后测定吸光度。
进一步地，步骤1)中，所述DNA提取采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒进行提取。
进一步地，步骤1)中，所述扩增引物对包括RPA引物对1
RPA-1上游引物:5'CACCTTCATCACCGTCGCTGACTCCGCCATC3'，序列如SEQ ID NO.4所示
RPA-1下游引物:5'GCGACCGGTGCCTTCTTAGGAGCTGTCCGAG3'；序列如SEQ ID NO.5所示
或RPA引物对2
RPA-2上游引物:5'ATTTCTGGTCGCATCAGAGCGCCAGGAGTC3'，序列如SEQ ID NO.6所示
RPA-2下游引物：5'GCAAGACGAGGGAGGGAAGGGGAAAAGTTAGA3'，序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，步骤1)中，所述孵育过程如下：涡旋混匀后，37℃水浴锅中孵育20min。
进一步地，所述Tris-HCL溶液的浓度为20mm/L，PH7.5，含100mm/LKCl、40mm/LMgCl2、0.008％Triton X-100。
进一步地，所述Hemin溶液由Hemin用DMSO配制成。
进一步地，所述FnCas12a的制备过程如下：使用化学合成法进行FnCas12基因合成，并将FnCas12克隆入PET-32a原核表达载体中；经Sanger法测序鉴定插入序列正确后，将重组质粒转化大肠杆菌E.coli.BL21；用IPTG诱导表达6His-TRX-TCRP1融合蛋白，进行亲和层析纯化融和蛋白；用EK酶切去除融合蛋白6His标签，并纯化鉴定FnCas12蛋白。
进一步地，所述EBV crRNA的制备过程如下：合成如序列SEQ ID NO.8所示的正义链序列、如序列SEQ ID NO.9所示的反义链序列；将二者经退火形成双链DNA；经T7polymerase体外转录成crRNA，并使用亲和层析纯化得到如序列SEQ ID NO.10所示的EBVcrRNA；
所述正义链序列为
5’TAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATCTGCTAAGCCCAACACTCCA3’；
所述反义链序列为
5’
TGGAGTGTTGGGCTTAGCAGATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA3’；
所述EBV crRNA序列为
5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUGCUAAGCCCAACACUCCA3’。
进一步地，所述Tris-HCl缓冲液包括20mM/L Tris-HCl，pH 7.5，100mM/L KCl，5mM/LMgCl2，1mM/LDTT，5％甘油。
进一步地，步骤3)中，所述孵育的过程为：37度孵育30min。
进一步地，步骤4)中，所述孵育的过程为：37度孵育60min。
进一步地，步骤4)中，所述处理的时间为5min。
进一步地，所述测定吸光度可采用普通分光光度计、酶标仪在波长420nm处测定。优选为Biotek多功能酶标仪。
一方面，本发明在于提供一种在基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV检测方法中运用的RPA引物对，包括
RPA引物对1
RPA-1上游引物:5'CACCTTCATCACCGTCGCTGACTCCGCCATC3'，
RPA-1下游引物:5'GCGACCGGTGCCTTCTTAGGAGCTGTCCGAG3'；
或RPA引物对2
RPA-2上游引物:5'ATTTCTGGTCGCATCAGAGCGCCAGGAGTC3'，
RPA-2下游引物：5'GCAAGACGAGGGAGGGAAGGGGAAAAGTTAGA3'。
进一步地，所述RPA引物对为RPA引物对1
RPA-1上游引物:5'CACCTTCATCACCGTCGCTGACTCCGCCATC3'，
RPA-1下游引物:5'GCGACCGGTGCCTTCTTAGGAGCTGTCCGAG3'。
一方面，本发明在于提供一种在基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV检测中运用的试剂，包括PS2.M/Hemin溶液和/或Cas12a/crRNA复合物溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法及应用，通过采用重组酶聚合酶扩增技术检测EBV，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，检测灵敏度高，最低可以检测到1×101拷贝/ul EBV重组质粒DNA。
检测过程中不需将RNA转化为DNA再进行扩增，只需要将Cas12a与RNA结合形成复合物，再与RPA扩增的靶标DNA形成三元复合体；激活的Cas12a不但可以切割靶标EBV DNA，而且可将体系中PS2.M DNA单链切成碎片，使PS2.M不能形成G-四链体，G-四链体/Hemin复合体不能形成，抑制了ABTS2-H2O2体系的氧化还原反应，响应体系吸光度即可实现检测，且该检测可以通过普通分光光度计、酶标仪检测，甚至肉眼可见。
本发明的检测过程采用重组酶聚合酶扩增技术，可在20min内完成反应，无需精密仪器。
本发明设计了多条检测引物对，可使引物尽量与EBV序列吻合，可保证全面的与世界各地不同基因型和不同感染EBV病毒的检测。
本发明的检测方法简单、高效、快速、低成本、高准确度、高敏感性、通用性好、特异性强，设备简单。
附图说明
图1纯化的Cas12a蛋白考马斯亮蓝染色图。1，纯化的Cas12a蛋白；2，总蛋白；3，蛋白Marker
图2 RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法灵敏度检测比对图
图3 RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法检测效果评价比对图(图中P1-P5为通过qPCR方法证实为EBV阳性的病人；N1-N5为通过qPCR方法证实为EBV阴性的健康人)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
1)RPA引物及试剂：
以EBV基因组保守的BamHI-W区域片段为靶标，根据RPA引物的设计原则，设计2对RPA引物。引物序列如下：
RPA-1上游引物:5'CACCTTCATCACCGTCGCTGACTCCGCCATC3'，
RPA-1下游引物:5'GCGACCGGTGCCTTCTTAGGAGCTGTCCGAG3'；
RPA-2上游引物:5'ATTTCTGGTCGCATCAGAGCGCCAGGAGTC3'，
RPA-2下游引物：5'GCAAGACGAGGGAGGGAAGGGGAAAAGTTAGA3'。优选地所述的RPA引物RPA-1上、下游引物对，扩增片段大小为219bp。
RPA引物的选择：
RPA试剂盒购自TwistDx公司Basic kit。RPA的反应体系是50ul，包括：50ulRPA反应体系包括：10uM上、下游引物各2.4ul，重泡胀缓冲液(Rehydration Buffer)29.5ul，EBV阳性对照品1ul，ddH2O 13.2ul，混匀，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的TwistAmp Basic管中，加入2.5μl 280mM MgAc，混匀。涡旋混匀后，37℃水浴锅中孵育20min。取RPA产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，选择最佳引物。凝胶电泳显示引物对1扩增效率最高。因些选择RPA-1游引物对作为RPA引物来扩增EBV DNA。所优选的RPA引物序列为：RPA-1上游引物:5'CACCTTCATCACCGTCGCTGACTCCGCCATC3'，RPA-1下游引物:5'GCGACCGGTGCCTTCTTAGGAGCTGTCCGAG3'。扩增片段大小为219bp，RPA扩增产物序列如SEQ ID NO:1所示。
2)纯化的Cas12a蛋白：
本发明所述的Cas12a为土拉弗朗西斯菌Francisella tularensis来源的Cas12a，简称FnCas12。
制备纯化的FnCas12蛋白：使用化学合成法进行FnCas12基因合成，并将FnCas12克隆入PET-32a原核表达载体中。经Sanger法测序鉴定插入序列正确后，将重组质粒转化大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)。用IPTG诱导表达6His-TRX-TCRP1融合蛋白，进行亲和层析纯化融和蛋白。用EK酶切去除融合蛋白6His标签，并纯化鉴定FnCas12蛋白。FnCas12蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3)EBV crRNA：
所述的crRNA为含茎环结构的单链RNA，与EBV基因组部分同源。制备EBV crRNA：设计针对RPA扩增靶标区的单链crDNA，并在其5’端添加T7启动子序列，送公司合成正义链和反义链序列，正义链序列为
5’TAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATCTGCTAAGCCCAACACTCCA3’；反义链序列为
5’
TGGAGTGTTGGGCTTAGCAGATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA 3’。正义链和反义链经退火形成双链DNA。经T7polymerase体外转录成crRNA，并使用亲和层析纯化crRNA，crRNA序列如为
5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUGCUAAGCCCAACACUCCA3’。
G4/Hemin显色体系：采用富含G的DNA核苷酸链PS2.M(序列为：5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3')。PS2.M核苷酸链在K+诱导下形成平行G-四链体，所述平行G-四链体与Hemin(氯化血红素)结合，形成稳定的具有过氧化物酶活性的复合物，可催化ABTS2-H2O2系统氧化显色。可以通过普通分光光度计、酶标仪检测，甚至肉眼可见。
EBV阳性对照品的准备:以含BamHI-W片段的重组质粒为阳性对照。制备方法：用化学合成法进行BamHI-W基因片段合成(其核苷酸序列如SEQ No.3所示)，并克隆至PUC57载体获得重组质粒。通过Sanger法测序确定插入序列正确，命名为PUC57/Bam。将重组质粒菌37度培养过夜，抽提质粒，测浓度。根据下列公式，计算PUC57/Bam重组质粒拷贝数。
实施例：
实施例1
RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法的原理：Cas12a与EBV crRNA及RPA扩增的靶标DNA形成三元复合体后，激活的Cas12a不但可以切割靶标EBV DNA，而且可将体系中PS2.M DNA单链切成碎片，使PS2.M不能形成G-四链体，G-四链体/Hemin复合体不能形成，抑制了ABTS2-H2O2体系的氧化还原反应，体系吸光度响应值急剧降低。因此本发明为一种“Turn-off”检测模式。
1.RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法灵敏度检测
(1)将重组质粒PUC57/Bam重组质粒进行稀释，使其浓度为0、101、102、103、104、105、106、107、108拷贝/ul(copies/μl)。
(2)RPA扩增：以上述不同浓度的PUC57/Bam重组质粒为模板，以EBV RPA引物进行RPA扩增。RPA的反应体系是50ul，50ul RPA反应体系包括：10um上、下游引物各2.4ul，重泡胀缓冲液29.5ul，不同浓度的PUC57/Bam重组质粒模板1ul，ddH2O 13.2ul，混匀，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的反应管中，加入2.5μl 280mm MgAc，混匀。37℃水浴锅中孵育20min，RPA产物备用；
(3)Cas12a-crRNA复合物的准备：将纯化的FnCas12a及EBV crRNA加入到用Tris-HCl缓冲液(20mM/L Tris-HCl,pH 7.5,100mM/LKCl,5mM/LMgCl2,1mM/LDTT,5％甘油)中，使FnCas12a及EBV crRNA终浓度分别为400nM/L、500nM/L。37度孵育30min。使Cas12a与crRNA结合形成复合物。
(4)吸光度检测：PS2.M DNA溶解在20mM/L Tris-HCL溶液(PH7.5，含100mM/L KCl、40mM/LMgCl2、0.008％Triton X-100)，浓度为1umol/L，向溶液中加入终浓度为2uM/LHemin(Hemin用DMSO配制成2.38mM/L的母液)。-20度冻存备用。取10ul PS2.M/Hemin溶液、上述Cas12a/crRNA复合物溶液2ul、上述RPA产物8ul加入384微孔板中，共20ul，37度孵育1h。加入ABTS和H2O2(终浓度分别为2mM/L、4mM/L)，反应5分钟后上Biotek多功能酶标仪在波长420nm处测定吸光度。
(5)结果：如图2所示，随着EBV重组质粒浓度的增加，420nm处测得的吸光度逐渐降低，当重组质粒浓度达到106以上时，吸光度进入平台期。本方法最低可以检测到1×101拷贝/ul EBV重组质粒DNA，表明本方法具有较高的灵敏度。
实施例2 RPA-Cas12a-G4/Hemin检测方法检测效果评价
采集血清样本：EBV感染病人及健康人血清样本各6例。均经qPCR检测证实。
病毒核酸提取：采用北京天根生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)进行核酸提取。主要步骤如下：
(1)将20μl蛋白酶K(Proteinase K)加入一个干净的1.5ml离心管中。
(2)向离心管中加入200μl人血清样品。
(3)加入200μl Carrier RNA工作液，涡旋振荡15sec混匀。
(4)在56℃孵育15min。
(5)加入250μl无水乙醇，涡旋振荡15sec，彻底混匀。在室温放置5min。
(6)简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。
(7)仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，8,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
(8)小心打开吸附柱盖子，加入500μl溶液GD，8,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
(9)小心打开吸附柱盖子，加入600μl溶液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，静置2min，8,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
(10)重复步骤9。
(11)小心打开吸附柱盖子，加入500μl无水乙醇，8,000rpm离心1min，弃废液。
(12)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液。
(13)将吸附柱放入一个RNase-Free离心管(1.5ml)中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl RNase-Free ddH2O，室温放置5min。12,000rpm离心1min。
检测方法：以血清DNA为样品，以103-106拷贝/ul EBV重组质粒为阳性对照，以无关序列的质粒为阴性对照(图3中NC)。所有样品及对照进行RPA扩增(方法同实施例1)。取RPA产物8ul、PS2.M/Hemin溶液10ul、Cas12a/crRNA复合物溶液2ul、加入384微孔板中，体系共20ul，37度孵育1h。加入ABTS和H2O2(同实施例1)，反应5分钟后上Biotek多功能酶标仪在波长420nm处测定吸光度。
结果：如图3所示，所有5个EBV病人样品均为阳性(图中，P1-P5)，5个健康人血清样品均为阴性(图中，N1-N5)。与qPCR方法吻合率达100％。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州医科大学附属肿瘤医院
<120> 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的EBV的检测方法及应用
<141> 2019-03-12
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 219
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caccttcatc accgtcgctg actccgccat ccaagcctag gggagaccga agtgaaggcc 60
ctggaccaac ccggcccggg ccccccggta tcgggccaga ggtaagtgga ctttaatttt 120
ttctgctaag cccaacactc caccacaccc aggcacacac tacacacacc cacccgtctc 180
agggtcccct cggacagctc ctaagaaggc accggtcgc 219
<210> 2
<211> 1299
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu
1 5 10 15
Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys Ala
20 25 30
Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys Lys
35 40 45
Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu Ile
50 55 60
Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser Asp
65 70 75 80
Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys Asp
85 90 95
Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr Ile
100 105 110
Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile Asp
115 120 125
Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln Ser
130 135 140
Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr Asp
145 150 155 160
Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr Thr
165 170 175
Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser Asn
180 185 190
Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu Pro
195 200 205
Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys Ala
210 215 220
Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu Glu
225 230 235 240
Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg Val
245 250 255
Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr Leu
260 265 270
Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys Phe
275 280 285
Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile Asn
290 295 300
Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys Met
305 310 315 320
Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser Phe
325 330 335
Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met Gln
340 345 350
Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys Ser
355 360 365
Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln Lys
370 375 380
Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr Asp
385 390 395 400
Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala Val
405 410 415
Leu Glu Tyr Ile Thr Gln Gln Ile Ala Pro Lys Asn Leu Asp Asn Pro
420 425 430
Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala Lys
435 440 445
Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn Lys
450 455 460
His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala Asn
465 470 475 480
Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys Asp
485 490 495
Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys Asp
500 505 510
Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp Leu
515 520 525
Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His Ile
530 535 540
Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His Phe
545 550 555 560
Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val Pro
565 570 575
Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser Asp
580 585 590
Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly Trp
595 600 605
Asp Lys Asn Lys Glu Pro Asp Asn Thr Ala Ile Leu Phe Ile Lys Asp
610 615 620
Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile Phe
625 630 635 640
Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys Ile
645 650 655
Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val Phe
660 665 670
Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile Leu
675 680 685
Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln Lys
690 695 700
Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe Ile
705 710 715 720
Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp Phe
725 730 735
Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu Phe
740 745 750
Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn Ile
755 760 765
Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr Leu
770 775 780
Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg Pro
785 790 795 800
Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn Leu
805 810 815
Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr Arg
820 825 830
Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala Ile
835 840 845
Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu Tyr
850 855 860
Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe His
865 870 875 880
Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe Asn
885 890 895
Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His Ile
900 905 910
Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu Val
915 920 925
Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile Gly
930 935 940
Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile Glu
945 950 955 960
Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn Ile
965 970 975
Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile Ala
980 985 990
Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu Asn
995 1000 1005
Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln
1010 1015 1020
Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu Val Phe Lys
1025 1030 1035 1040
Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg Ala Tyr Gln Leu
1045 1050 1055
Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly Lys Gln Thr Gly Ile
1060 1065 1070
Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser Lys Ile Cys Pro Val Thr
1075 1080 1085
Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser
1090 1095 1100
Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys
1105 1110 1115 1120
Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala
1125 1130 1135
Ala Lys Gly Lys Trp Thr Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn
1140 1145 1150
Phe Arg Asn Ser Asp Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr
1155 1160 1165
Pro Thr Lys Glu Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr
1170 1175 1180
Gly His Gly Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys
1185 1190 1195 1200
Lys Phe Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met
1205 1210 1215
Arg Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val
1220 1225 1230
Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys Asn
1235 1240 1245
Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly Leu Lys
1250 1255 1260
Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu Gly Lys Lys
1265 1270 1275 1280
Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu Phe Val Gln Asn
1285 1290 1295
Arg Asn Asn
<210> 3
<211> 335
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccctccaagg actcgggccc agtttctaac ttttcccctt ccctccctcg tcttgccctg 60
cgcccggggc caccttcatc accgtcgctg actccgccat ccaagcctag gggagaccga 120
agtgaaggcc ctggaccaac ccggcccggg ccccccggta tcgggccaga ggtaagtgga 180
ctttaatttt ttctgctaag cccaacactc caccacaccc aggcacacac tacacacacc 240
cacccgtctc agggtcccct cggacagctc ctaagaaggc accggtcgcc cagtcctacc 300
agagggggcc aagaacccag acgagtccgt agaag 335
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caccttcatc accgtcgctg actccgccat c 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcgaccggtg ccttcttagg agctgtccga g 31
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atttctggtc gcatcagagc gccaggagtc 30
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gcaagacgag ggagggaagg ggaaaagtta ga 32
<210> 8
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
taatacgact cactataggg taatttctac taagtgtaga tctgctaagc ccaacactcc 60
a 61
<210> 9
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tggagtgttg ggcttagcag atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60
a 61
<210> 10
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
uaauuucuac uaaguguaga ucugcuaagc ccaacacucc a 41
Claims (9)
1.CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，所述试剂的制备过程如下：
1）制备RPA产物：以EBV患者血清中提取到的DNA为模板，将含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH2O的RPA反应体系加入冻干酶粉中，再加入MgAc混匀，孵育，得到RPA产物；
2）制备PS2.M/Hemin溶液：PS2.M DNA溶解在Tris-HCl溶液，向溶液中加入Hemin溶液，制得PS2.M/Hemin溶液；
3）制备Cas12a/crRNA复合物溶液：将FnCas12a和EBV crRNA加入到Tris-HCl缓冲液中，孵育，制得Cas12a/crRNA复合物溶液；
4）检测EBV：将RPA产物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA复合物溶液孵育，加入ABTS和H2O2处理后测定吸光度。
2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，步骤1）中，所述DNA提取采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒进行提取；
所述扩增引物对包括RPA引物对1、
RPA-1上游引物: 5' CACCTTCATCACCGTCGCTGACTCCGCCATC3'，序列如SEQ ID NO.4所示；
RPA-1下游引物: 5' GCGACCGGTGCCTTCTTAGGAGCTGTCCGAG3'；序列如SEQ ID NO.5所示；
或RPA引物对2
RPA-2上游引物: 5' ATTTCTGGTCGCATCAGAGCGCCAGGAGTC3'，序列如SEQ ID NO.6所示；
RPA-2下游引物：5' GCAAGACGAGGGAGGGAAGGGGAAAAGTTAGA3'，序列如SEQ ID NO.7所示；
所述孵育过程如下：37℃水浴锅中孵育20min。
3.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，所述Tris-HCl溶液的浓度为20mmol/L，pH7.5，含100 mmol/L KCl、40mmol/L MgCl2、0.008% Triton X-100；所述Hemin溶液由Hemin用DMSO配制成。
4.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，所述FnCas12a的制备过程如下：使用化学合成法进行FnCas12基因合成，并将FnCas12克隆入PET-32a原核表达载体中；经Sanger法测序鉴定插入序列正确后，将重组质粒转化大肠杆菌E.coli. BL21；用IPTG诱导表达6His-TRX-TCRP1融合蛋白，进行亲和层析纯化融和蛋白；用EK酶切去除融合蛋白6His标签，并纯化鉴定FnCas12蛋白。
5.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，所述EBV crRNA的制备过程如下：合成正义链序列、反义链序列；将二者经退火形成双链DNA；经T7 polymerase体外转录成crRNA，并使用亲和层析纯化得到EBVcrRNA；
所述正义链序列为
5’TAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATCTGCTAAGCCCAACACTCCA3’；
所述反义链序列为
5’ TGGAGTGTTGGGCTTAGCAGATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA 3’；
所述EBV crRNA序列为
5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUGCUAAGCCCAACACUCCA3’。
6.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液包括20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，100 mmol/LKCl，5 mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT，5%甘油。
7.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，步骤3）中，所述孵育的过程为：37度孵育30min。
8.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素在制备检测EBV的试剂中的用途，其特征在于，步骤4）中，所述孵育的过程为：37度孵育60 min；
所述处理的时间为5min。
9.权利要求1~8任一项所述用途中用于EBV检测的试剂，其特征在于，包括PS2.M/Hemin溶液和Cas12a/crRNA复合物溶液。
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| Discriminating cyclic from linear nucleotides-CRISPR/Cas-related cyclic hexaadenosine monophosphate as a case study;Modi Wang等;《Analytical Biochemistry》;20181128;第567卷;第21-26页 * |
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