CN113444816B

CN113444816B - 一种基于CRISPR-Cas系统可视化检测炭疽芽胞杆菌及其耐药性的方法

Info

Publication number: CN113444816B
Application number: CN202110515707.6A
Authority: CN
Inventors: 王东澍; 吕宇飞; 王恒樑; 刘先凯; 陈刚; 冯尔玲
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2041-05-12
Also published as: CN113444816A

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas系统可视化检测炭疽芽胞杆菌及其耐药性的方法。该方法将DNAzyme中ssDNA设计成探针，结合CRISPR‑Cas12a系统对单链DNA的反式剪切活性，完成了对炭疽芽胞杆菌的鉴定和耐药基因的检测，检测结果可以根据反应液颜色变化来判断，方法简单便携，非常适合现场及临床标本的快速检测。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种基于CRISPR-Cas系统可视化检测炭疽芽胞杆菌及其耐药性的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas系统可视化检测炭疽芽胞杆菌及其耐药性的方法。

背景技术

在一些情况下，需要现场部署的检测方法来筛选标本，检测炭疽芽胞杆菌的存在。传统的检测方法(如微生物学、免疫学、分子生物学)虽然达到了很高的灵敏度和特异性，但都需要特殊的仪器设备，不符合简单便携的现场检测要求。目前一般利用 Cas12a的切割活性，直接切割DNAzyme(即G四链体)：如果crRNA与靶序列配对成功，则激活Cas12a切割活性，降解DNAzyme，溶液呈现无色状态(阳性结果)；如果crRNA 不能与靶序列配对，则Cas12a不具有切割活性，DNAzyme形成四链体，溶液呈现绿色 (阴性结果)。实验证明，该方法在检测中具有很高的假阳性，特别是对于SNP位点的检测。原因可能是核酶的显色受缓冲液影响较大，缓冲液中的金属离子等会非特异的抑制DNAzyme的活性。为了实现灵敏、特异、准确并且简单便携的检测目标，需要建立一种新的方法鉴定炭疽芽胞杆菌。

研究发现，有一类特殊的寡核苷酸，与高铁血红素(Hemin)结合后具有过氧化物酶活性，在H₂O₂存在下能够催化无色的ABTS底物显出绿色。这类ssDNA富含鸟嘌呤，能够聚集成G-四联体结构，与Hemin结合可以发挥过氧化物酶活性。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种灵敏、特异且准确的检测炭疽芽胞杆菌的新方法。

本发明保护一种可视化检测炭疽芽胞杆菌的方法，可包括如下步骤：

(1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用引物对进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

所述引物对在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有目标位点；

所述目标位点可为plcR位点、lef位点、capB位点或CR5位点；

所述plcR位点可如SEQ ID NO:1自5’末端起第219位所示；

所述lef位点可如SEQ ID NO:2自5’末端起第103-119位所示；

所述capB位点可如SEQ ID NO:3自5’末端起第182-198位所示；

所述CR5位点可如SEQ ID NO:1自5’末端起第226位所示；

(2)完成步骤(1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；LbCas12a反应体系包括所述RPA扩增产物、探针ProbeCatG4R、crRNA和LbCas12a蛋白；

所述探针ProbeCatG4R的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；

(3)完成步骤(2)后，向反应产物中加入探针ProbeCatG4，变性；之后加入Hemin，反应；最后加入ABTS和H₂O₂；

所述探针ProbeCatG4的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；

(4)完成步骤(3)后，观察颜色，进行如下判断：

如果反应体系的颜色为绿色，则待测菌为炭疽芽胞杆菌或疑似为炭疽芽胞杆菌；

如果反应体系的颜色为无色，则待测菌不为炭疽芽胞杆菌或疑似不为炭疽芽胞杆菌；

所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

上述方法的检测对象可为非人体或动物体的样本。

上述方法中，所述引物对可为引物对1，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有plcR位点。此时crRNA可为crRNA1。所述引物对1可由引物1和引物2组成。引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。 crRNA1的核苷酸序列可如SEQ ID NO:21所示。

上述方法中，所述引物对可为引物对2，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有lef位点。此时crRNA为crRNA2。所述引物对2可由引物3和引物4组成。引物3 的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。crRNA2 的核苷酸序列可如SEQ ID NO:22所示。

上述方法中，所述引物对可为引物对3，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有capB位点。此时crRNA为crRNA3。所述引物对3由引物5和引物6组成。引物5 的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。crRNA3 的核苷酸序列可如SEQ ID NO:23所示。

上述方法中，所述引物对可为引物对4，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有CR5位点。此时crRNA为crRNA4。所述引物对4由引物7和引物8组成。引物7的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。引物8的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。crRNA4 的核苷酸序列可如SEQ ID NO:24所示。

所述步骤(1)中，进行RPA扩增的RPA扩增体系具体可为50μl，包括2.4μl 浓度为10μM的上游引物水溶液、2.4μl浓度为10μM的下游引物水溶液、 2.3μldNTPs(10mM each)、25μl2×Reaction Buffer、5μl10×Probe E-mix、2.5μl20 ×Core Reaction Mix、2.5μl280mMMgOAc、2μl待测菌的基因组DNA(约0.5×10⁴aM) 和5.9μl H₂O。具体见实施例3。

所述步骤(1)中，进行RPA扩增的程序具体可为：37℃反应40min。

所述步骤(2)中，所述LbCas12a反应体系具体可为20μl，由2μlRPA扩增产物、2μl探针ProbeCatG4R(浓度为10μM)、1μl crRNA(10μM)、1μl LbCas12a 蛋白溶液(浓度为0.15mg/mL)、2μl NEBuffer^TM 3(NEB公司)和12μlNuclease-free water组成。

所述步骤(2)中，进行LbCas12a反应的条件具体可为37℃反应60min。

所述步骤(3)具体可为：向反应产物中加入探针ProbeCatG4，95℃变性5min，自然冷却至室温；之后加入MES buffer和Hemin，室温静置20min(目的为使Hemin 和探针ProbeCatG4充分结合)；最后加入ABTS和H₂O₂，10min后观察结果。

本发明的第二个目的是提供一种可视化检测待测炭疽芽胞杆菌耐药性的方法。

本发明所保护的可视化检测待测炭疽芽胞杆菌耐药性的方法，包括如下步骤：

(1)以待测炭疽芽胞杆菌的基因组DNA为模板，采用引物对进行RPA扩增，得到 RPA扩增产物；

所述引物对在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有目标位点且为耐药基因或耐药基因的一部分；

(2)完成步骤(1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；LbCas12a反应体系包括所述RPA扩增产物、探针ProbeCatG4R、crRNA和 LbCas12a蛋白；

所述探针ProbeCatG4R的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；

所述探针ProbeCatG4的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；

(4)完成步骤(3)后，观察颜色，进行如下判断：

如果反应体系的颜色为无色，则待测炭疽芽胞杆菌不耐药；

如果反应体系的颜色为绿色，则待测炭疽芽胞杆菌耐药；

所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

上述方法的检测对象可为非人体或动物体的样本。

上述方法中，所述引物对为引物对5，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有gyrA位点。此时crRNA为crRNA5。gyrA位点如SEQ ID NO:5自5’末端起第254位所示。所述引物对5由引物9和引物10组成。引物9的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。引物10的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。crRNA5的核苷酸序列如SEQ ID NO:25 所示。

上述方法中，所述引物对为引物对6，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有parC位点。此时crRNA为crRNA6。parC位点如SEQ ID NO:6自5’末端起第219位所示。所述引物对6由引物11和引物12组成。引物11的核苷酸序列如SEQ ID NO:17 所示。引物12的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。crRNA6的核苷酸序列如SEQ ID NO:26 所示。

所述步骤(1)中，进行RPA扩增的RPA扩增体系具体可为50μl，包括2.4μl 浓度为10μM的上游引物水溶液、2.4μl浓度为10μM的下游引物水溶液、 2.3μldNTPs(10mM each)、25μl2×Reaction Buffer、5μl10×Probe E-mix、2.5μl20 ×Core Reaction Mix、2.5μl280mMMgOAc、2μl待测炭疽芽胞杆菌的基因组DNA(约 0.5×10⁴aM)和5.9μl H₂O。具体见实施例4。

所述步骤(1)中，进行RPA扩增的程序具体可为：37℃反应40min。

本发明还保护一种用于检测炭疽芽胞杆菌的试剂盒，可为A1)-A4)中的任一种：

A1)包括上述任一所述引物对1、探针ProbeCatG4R、探针ProbeCatG4和上述任一所述crRNA1；

A2)包括上述任一所述引物对2、所述探针ProbeCatG4R、所述探针ProbeCatG4 和上述任一所述crRNA2；

A3)包括上述任一所述引物对3、所述探针ProbeCatG4R、所述探针ProbeCatG4 和上述任一所述crRNA3；

A4)包括上述任一所述引物对4、所述探针ProbeCatG4R、所述探针ProbeCatG4 和上述任一所述crRNA4；

所述探针ProbeCatG4R的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；

所述探针ProbeCatG4的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；

所述试剂盒用于非疾病的诊断与治疗。

上述试剂盒的检测对象可为非人体或动物体的样本。

所述A1)具体可由上述任一所述引物对1、探针ProbeCatG4R、探针ProbeCatG4 和上述任一所述crRNA1组成。

所述A2)具体可由上述任一所述引物对2、所述探针ProbeCatG4R、所述探针ProbeCatG4和上述任一所述crRNA2。

所述A3)具体可由上述任一所述引物对3、所述探针ProbeCatG4R、所述探针ProbeCatG4和上述任一所述crRNA3。

所述A4)具体可由上述任一所述引物对4、所述探针ProbeCatG4R、所述探针ProbeCatG4和上述任一所述crRNA4。

本发明还保护一种用于检测待测炭疽芽胞杆菌耐药性的试剂盒，可为B1)或B2)：

B1)包括上述任一所述引物对5、探针ProbeCatG4R、探针ProbeCatG4和上述任一所述crRNA5；

B2)包括上述任一所述引物对6、所述探针ProbeCatG4R、所述探针ProbeCatG4 和上述任一所述crRNA6；

所述探针ProbeCatG4R的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；

所述探针ProbeCatG4的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；

所述试剂盒用于非疾病的诊断与治疗。

上述试剂盒的检测对象可为非人体或动物体的样本。

所述B1)具体可由上述任一所述引物对5、探针ProbeCatG4R、探针ProbeCatG4 和上述任一所述crRNA5组成。

所述B2)具体可由上述任一所述引物对6、所述探针ProbeCatG4R、所述探针ProbeCatG4和上述任一所述crRNA6组成。

本发明采用CRISPR-Cas12a系统、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和DNAzyme显色法，可以鉴定炭疽芽胞杆菌，还可以检测炭疽芽胞杆菌的耐药性。与现有技术的方法相比，本发明提供的鉴定炭疽芽胞杆菌方法具有如下优点：整个过程不需要任何电力设备，仅需要温水和热水就可以完成，适用于室外操作，尤其是在偏远牧区发生炭疽芽胞杆菌区域性流行时，可以完成对炭疽芽胞杆菌的鉴定工作。与现有技术的方法相比，本发明提供的检测炭疽芽胞杆菌的耐药性的方法、快捷且准确。本发明的创造性在于使用DNAzyme的互补序列作为检测探针，通过碱基互补配对来封闭DNAzyme的酶活性。相比直接显色具有更强的耐干扰性，溶液显绿色则判定为阳性反应，可以降低假阳性率。同时，DNAzyme的互补序列既可以是DNA也可以是RNA，拓宽了显色方法的适用性，既可以用于靶标DNA的检测，也可用于靶标RNA的检测。

本发明将DNAzyme显色方法应用到炭疽芽胞杆菌检测，不仅拓展了检测结果的可视化，而且引入ssRNA探针，具有很大的发展空间。本研究将DNAzyme中ssDNA设计成探针，结合CRISPR-Cas12a系统对单链DNA的反式剪切活性，完成了对炭疽芽胞杆菌的鉴定和耐药基因的检测。检测结果可以根据反应液颜色变化来判断，方法简单便携，非常适合现场及临床标本的快速检测。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为采用DNAzyme显色法检测炭疽芽胞杆菌的原理示意图。

图2为ProbeCatG4和ProbeCatG4R两种探针显色结果比较。

图3为基于CRISPR系统结合RPA方法和DNAzyme显色法区分炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌。

图4为基于CRISPR系统结合RPA方法和DNAzyme显色法对炭疽芽胞杆菌耐药基因检测。

图5为单链RNA探针ProbeCatG4R-RNA的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的PCR扩增引物和RPA扩增引物的核苷酸序列见表1。

表1

注：下划线为PAM序列。

下述实施例中PCR及RPA扩增后所使用的Cas12a检测用crRNA见表2。

表2

注：下划线为通用序列。

下述实施例中所使用的探针的核苷酸序列见表3。

表3

Hemin为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品。H₂O₂(30％)为国药集团化学试剂有限公司的产品。ABTS为Roche Diagnostics的产品。二甲亚砜(DMSO)为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品。MES buffer(0.1M，pH4.7)为宝如亿(北京)生物技术有限公司的产品。

Hemin用DMSO溶解制成100μM的Hemin应用液。

ABTS用DMSO溶解制成50mM的ABTS应用液。

H₂O₂用纯水配制成1M的H₂O₂应用液。

下述实施例中，炭疽芽胞杆菌A16记载于如下文献中：Wang H，Liu X，Feng E， etal.Curing the Plasmid pXO2 from Bacillus anthracis A16 Using PlasmidIncompatibility[J].Current Microbiology，2011，62(3)：703-709.

下述实施例中，蜡样芽胞杆菌BC307由中国医学细菌保藏管理中心提供，编号为CMCC(B)63317。

实施例1、可视化检测炭疽芽胞杆菌的方法的原理

本发明的发明人经过大量实验，建立了可视化检测炭疽芽胞杆菌的方法。该方法利用DNAzyme的过氧化物酶活性使底物显色，通过颜色的变化鉴定炭疽芽胞杆菌。具体的，选用的单链DNA分子结构富含鸟苷酸，能够折叠成鸟苷酸四联体，再与氯高铁血红素结合，形成具有过氧化物酶活性的复合物，该复合物在过氧化氢条件下催化底物ABTS^2-为绿色的物质ABTS^-(Travascio，P.；Li，Y.；Sen，D.(1998)：DNA-enhanced peroxidase activity ofa DNA-aptamer-hemin complex.In Chemistry&biology 5(9)pp.505-517.DOI：10.1016/s1074-5521(98)90006-0.)。分别选用DNAzyme单链 DNA及互补链作为探针，加入到CRISPR反应系统，进行显色反应。从中挑取显色结果明显的互补链作为探针。实验原理见图1。互补链作为探针时，向CRISPR反应产物中加入DNAzyme单链DNA分子，通过变性复性，使两条单链DNA结合。如果CRISPR反应系统可以随机切割探针，则未复性的部分DNAzyme DNA分子可以与氯高铁血红素结合，催化底物出现绿色。反之，CRISPR反应系统没有切割探针，探针会封闭DNAzyme DNA 分子的鸟苷酸四聚体结构，不会催化底物显色，溶液保持无色。

实施例2、DNAzyme显色法单链DNA探针筛选

基于CRISPR-Cas12a系统利用普通PCR扩增技术进行DNAzyme显色法单链DNA探针筛选。

1、PCR扩增

待测菌为炭疽芽胞杆菌A16或蜡样芽胞杆菌BC307。

(1)提取待测菌的基因组DNA。

(2)以待测菌的基因组DNA为模板，采用BA-plcR-F和BA-plcR-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应体系为50μl，由2μl待测菌的基因组DNA、2μlBA-plcR-F水溶液(浓度为10μM)、2μlBA-plcR-R水溶液(浓度为10μM)、25μl ExTaq和19μl水组成。

ExTaq为ExTaq^TM Version 2.0试剂盒(TaKaRa)中的组件。

反应程序为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。

2、LbCas12a反应

(1)制备LbCas12a反应体系。LbCas12a反应体系为20μl，由2μl PCR扩增产物、2μl探针(浓度为10μM)、1μl BA-crRNA-plcR(10μM)、1μlLbCas12a蛋白溶液(浓度为0.15mg/mL)、2μl NEBuffer^TM 3(NEB公司)和12μlNuclease-free water 组成。

探针为ProbeCatG4或ProbeCatG4R。ProbeCatG4R为ProbeCatG4的互补链。

(2)取LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应。反应条件为37℃反应60min。

3、显色反应

探针为ProbeCatG4时，完成步骤2后，先向反应产物中加入74μl MES buffer 和2μl Hemin应用液，室温静置20min(目的为使Hemin和ProbeCatG4充分结合)；之后加入2μlABTS应用液和2μl H₂O₂应用液，10min后观察结果。

探针为ProbeCatG4R时，完成步骤2后，先向反应产物中加入2μl ProbeCatG4 (浓度为10μM)，95℃变性5min，自然冷却至室温；之后加入72μl MES buffer和 2μlHemin应用液，室温静置20min(目的为使Hemin和ProbeCatG4充分结合)；最后加入2μl ABTS应用液和2μl H₂O₂应用液，10min后观察结果。

检测结果见图2(B.anthracis为炭疽芽胞杆菌A16，B.cereus为蜡样芽胞杆菌BC307)。结果表明，探针为ProbeCatG4时，蜡样芽胞杆菌BC307和炭疽芽胞杆菌A16 均呈绿色，颜色基本一致，无法区分；探针为ProbeCatG4R时，炭疽芽胞杆菌A16呈绿色，蜡样芽胞杆菌BC307显无色，颜色完全不同，可以区分。

因此，后续研究选择ProbeCatG4R作为探针。

实施例3、基于CRISPR-Cas12a系统利用RPA扩增技术结合DNAzyme显色法对炭疽芽胞杆菌鉴定位点(plcR，CR5，lef，capB)进行检测

1、分别设计并人工合成plcR位点、lef位点、capB位点和CR5位点的RPA扩增引物。引物序列具体见表1。

2、提取待测菌(炭疽芽胞杆菌A16或蜡样芽胞杆菌BC307)的基因组DNA。

3、以待测菌的基因组DNA为底物，采用RPA扩增引物进行RPA扩增，得到扩增产物。plcR位点、lef位点capB位点和CR5位点的周边序列依次如SEQ ID NO:1—SEQ ID NO:4所示。

RPA扩增体系为50μl，包括2.4μl浓度为10μM的上游引物(名称中含有“F”) 水溶液、2.4μl浓度为10μM的下游引物(名称中含有“R”)水溶液、2.3μldNTPs (10mM each)、25μl2×Reaction Buffer、5μl10×Probe E-mix、2.5μl20×Core Reaction Mix、2.5μl280mMMgOAc、2μl待测菌的基因组DNA(约0.5×10⁴aM)和 5.9μlH₂O。

dNTPs(10mM each)为Thermo Scientific^TM的产品、

2×Reaction Buffer、10×Probe E-mix、20×Core Reaction Mix为

exo 试剂盒的产品。

RPA扩增程序为：37℃反应40min。

4、LbCas12a反应

(1)制备LbCas12a反应体系。LbCas12a反应体系为20μl，由2μl扩增产物、 2μlProbeCatG4R(浓度为10μM)、1μl crRNA(10μM)、1μlLbCas12a蛋白溶液(浓度为0.15mg/mL)、2μl NEBuffer^TM 3(NEB公司)和12μlNuclease-free water组成。

crRNA根据检测的位点选择，具体见表2。

5、显色反应

完成步骤4后，先向反应产物中加入2μl ProbeCatG4(浓度为10μM)，95℃变性5min，自然冷却至室温；之后加入72μl MES buffer和2μl Hemin应用液，室温静置20min(目的为使Hemin和ProbeCatG4充分结合)；最后加入2μl ABTS应用液和2μl H₂O₂应用液，10min后观察结果。

检测结果见图3(B.anthracis为炭疽芽胞杆菌A16，B.cereus为蜡样芽胞杆菌BC307)。结果表明，检测plcR、lef、capB和CR5位点时，炭疽芽胞杆菌A16均呈绿色，而蜡样芽胞杆菌BC307均呈无色。

上述结果表明，加入待测菌后，如果反应液由无色变成绿色，说明该菌为炭疽芽胞杆菌；如果反应液保持无色，说明该菌不为炭疽芽胞杆菌。

实施例4、基于CRISPR-Cas12a系统利用RPA扩增技术结合DNAzyme显色方法对炭疽芽胞杆菌耐药基因(如gyrA、parC)进行检测

1、分别设计并人工合成gyrA位点和parC位点的RPA扩增引物。引物序列具体见表1。

2、以炭疽芽胞杆菌A16的基因组DNA为底物，采用RPA扩增引物进行RPA扩增，得到扩增产物。gyrA位点和parC位点的周边序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6 所示。

RPA扩增体系为50μl，包括2.4μl浓度为10μM的上游引物(名称中含有“F”) 水溶液、2.4μl浓度为10μM的下游引物(名称中含有“R”)水溶液、2.3μldNTPs (10mM each)、25μl2×Reaction Buffer、5μl10×Probe E-mix、2.5μl20×Core Reaction Mix、2.5μl280mMMgOAc、2μl炭疽芽胞杆菌A16的基因组DNA(约0.5× 10⁴aM)和5.9μlH₂O。

RPA扩增程序为：37℃反应40min。

3、LbCas12a反应

crRNA根据检测的位点选择，具体见表2。

4、显色反应

完成步骤3后，先向反应产物中加入2μl ProbeCatG4(浓度为10μM)，95℃变性5min，自然冷却至室温；之后加入72μl MES buffer和2μl Hemin应用液，室温静置20min(目的为使Hemin和ProbeCatG4充分结合)；最后加入2μl ABTS应用液和2μlH₂O₂应用液，10min后观察结果。

将步骤2替换为步骤2A，其它步骤均不变，作为阳性对照1。

步骤2A：以Plasmid gyrA(T)为底物，采用gyrA位点的RPA扩增引物进行RPA 扩增，得到扩增产物。

Plasmid gyrA(T)为炭疽芽胞杆菌gyrA基因(Ames株基因组NC_003997.1 (6595-9066)第254位碱基由C突变为T(C254T)，全基因合成后克隆到pUC19载体，得到的重组质粒。

RPA扩增体系为50μl，包括2.4μl浓度为10μM的上游引物(名称中含有“F”) 水溶液、2.4μl浓度为10μM的下游引物(名称中含有“R”)水溶液、2.3μldNTPs (10mM each)、25μl2×Reaction Buffer、5μl10×Probe E-mix、2.5μl20×Core Reaction Mix、2.5μl280mMMgOAc、2μl Plasmid gyrA(T)(浓度为20ng/μl)和 5.9μlH₂O。

RPA扩增程序为：37℃反应40min。

将步骤2替换为步骤2B，其它步骤均不变，作为阳性对照2。

步骤2A：以Plasmid parC(T)为底物，采用parC位点的RPA扩增引物进行RPA 扩增，得到扩增产物。

Plasmid parC(T)为炭疽芽胞杆菌parC基因(Ames株基因组NC_003997.1(3362578-3365001)第242位碱基由C突变为T(C242T)，全基因合成后插入到pUC19 载体，得到的重组质粒。

RPA扩增体系为50μl，包括2.4μl浓度为10μM的上游引物(名称中含有“F”) 水溶液、2.4μl浓度为10μM的下游引物(名称中含有“R”)水溶液、2.3μldNTPs (10mM each)、25μl2×Reaction Buffer、5μl10×Probe E-mix、2.5μl20×Core Reaction Mix、2.5μl280mMMgOAc、2μl Plasmid parC(T)(浓度为20ng/μl)和 5.9μlH₂O。

RPA扩增程序为：37℃反应40min。

检测结果见图4(B.anthracis为炭疽芽胞杆菌A16)。结果表明，阳性对照1和阳性对照2均呈绿色，而炭疽芽胞杆菌A16均呈无色。对比发现，当耐药基因检测位点发生突变时，反应液颜色由无色变成绿色。

上述结果表明，检测炭疽芽胞杆菌耐药基因时，如果反应液呈绿色，说明被检测菌株在检测位点发生突变，已产生耐药性。

实施例5、DNAzyme显色法单链RNA探针检测

为了进一步扩展DNAzyme显色法的适用性，设计并合成了与ProbeCatG4互补的单链RNA探针ProbeCatG4R-RNA，通过ssRNA与ProbeCatG4杂交，封闭鸟苷酸四联体的活性位点，抑制过氧化物酶活性，使反应液不显色。如果利用CRISPR-Cas13a检测系统对ssRNA的反式剪切活性，使阳性标本出现颜色变化，由无色变成绿色，那么该显色方法同样适用于RNA病毒的检测。

1、人工合成ProbeCatG4R-RNA。

2、制备反应体系。反应体系为20μl，由2μlProbeCatG4R-RNA(浓度为10μM) 和18μl无菌水组成。

3、完成步骤2后，取所述反应体系，加入2μl ProbeCatG4(浓度为10μM)，95℃ 变性5min，自然冷却至室温；之后加入72μl MES buffer和2μl Hemin应用液，室温静置20min(目的为使Hemin和ProbeCatG4充分结合)；最后加入2μl ABTS应用液和2μl H₂O₂应用液，10min后观察结果。

按照上述步骤，将ProbeCatG4R-RNA替换为无菌水，作为阴性对照。

检测结果见图5(-为阴性对照)。结果表明，加入ProbeCatG4R-RNA后，反应液颜色发生了明显的变化。ProbeCatG4R-RNA的反应液呈现浅绿色，而阴性对照为深绿色。

上述结果表明，ProbeCatG4R-RNA可以与ProbeCatG4杂交并封闭其活性位点，所以该显色方法，理论上适用于RNA病毒的检测。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种基于CRISPR-Cas系统可视化检测炭疽芽胞杆菌及其耐药性的方法

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 488

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<222> （219）…（219）

<223> m为a或c

<400> 1

ttatttcttc attcttttta taattgattc ttttaatgta tggtttccta atatatcgaa 60

aaagaagtaa gctttttcgt aagcatcttc aatttctgct ctatcacact ctagcttttc 120

taggcattca acttttcgat agtataactg tccaatcaat gtcatactat taatttgaca 180

cgatagttca atagctttat ttgcatgaca aagcgcttmt tcgtattgat tgtccaagta 240

taatgctttt gcatgattat gtctcacctt cacatcaaac tctttattat catgtaatac 300

ttctaattgc tttaatatat tttcatataa ctcaatactc ttcttaaaat ggccattttc 360

agcgtaaatg tttgcaattg cgttttcaat atacaggttc tgatatacat ctattcctgc 420

caattgttga ttgagcaatt tctttaattc taaaatgcaa tattcgtaat caattttttt 480

caatatgt 488

<210> 2

<211> 400

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tattcatatt ttcatacaaa taaattttat tgtacaaggt acttccaatg gattgatgta 60

ataaagcatc aatattttga atatcccttt tatactgctt tcttacatca agattaattg 120

acggactatc aattaaccct cctgtatctt gcaacctttg attaatatca tatggttgaa 180

tatcaagttt cagctttttt aaaaactctt tttctttttc agataaagga ttactactat 240

ccacctgtat tctatttaaa agctcttttt cttcttcaga taaagaatca cgaatatcaa 300

tttgtagctt ttttaaaaac tctttttcct cagtagataa aaaatcacta ctatcaattt 360

gtattctttt tagaagctct ttttcttctt gagataaaga 400

<210> 3

<211> 400

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ttggagctag attactatat ccaaaatcat ccacacgttc ccaaatacgt aatgttgatg 60

agggatcatt cgctgcaaaa ccatttacga agaacgcagg cttagattgg tcagcaaaac 120

gtgtaattct cattgctcct ggatccggat gagcattcaa cataccacgg aatgctgttt 180

cctcatcaat cccaagagcc tctgctaccg ctaaagcaag cgatgcatta tctgggaaga 240

ccatgtaatc aaattttcgt aagaattctt ctgaaattct agaattatcc gcaacaatca 300

cttttgtatt tctctcttct gcaacctctt taaagtaatc caagtattca ctttcaatag 360

tgactaaatg tccattatat ggaatggtag cagtgaaagc 400

<210> 4

<211> 470

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<222>（226）…（226）

<223> n为g 或 t

<400> 1

tgttattgca acttttttct cgaaattgag tatttttata taaaaataaa aaaatcagct 60

ctcctagtga gaactgattt tttcactttc ttattcttgt gaagaagaac tattagatga 120

ttctgtagaa ccatttgttg atttttcttc tttcttcggt tcttcttttt tgtcactagt 180

cgaaccgctt gttgatttct cttctttttg agacttatct tctgtnttac tttctggtgt 240

cgtgctcgtt gacttctctt ctttttgaga tttgtcatca gcttttttac cagaggcatt 300

cgttgccttt gcagcacctg catcagcttt aatttctgct actgatttat ttaagtagcg 360

ctcagggttc acagccacgt tgtctttacg tacttcaaag tgaacgtgag aacctgcttc 420

tttattcatt gcacttaaac cggattttcc taatacttca ccttgtacaa 470

<210> 5

<211> 490

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<222>（254）…（254）

<223> k为c 或 t

<400> 5

atgtcagaca atcaacaaca agcacgaatt cgagaaatta atattagcca tgaaatgcgt 60

acctcatttt tagattacgc aatgagtgtt atcgtatctc gtgcattacc agatgttcgt 120

gatggattaa aacctgtgca tcgtagggtt ttatatgcga tgaatgattt aggaattacg 180

gctgataaag cgtataaaaa atcagcacgt attgttggtg aagtaatcgg taagtatcac 240

cctcatggtg attkagctgt ttatgaaacg atggtacgta tggcgcaaga tttcagtcaa 300

cgttatatgc ttgttgatgg gcatggtaac tttggatctg tcgatggaga ttcagcggca 360

gcaatgcgtt atacagaagc aagaatgtct aaaatctcta tggaattaat acgtgatatt 420

tcaaaaaata caattgatta tcaagataac tatgatggtt ctgaaagaga gccgattgtg 480

ttaccagcgc 490

<210> 6

<211> 490

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<222>（219）…（219）

<223> k为c 或 t

<400> 6

cctcccgctt gaagacgtgt taggtgaccg ctttgcacgt tatagtaaat atattattca 60

agatcgcgca cttccagatg cgcgtgacgg cttaaaacca gtacaaagac gtattttata 120

ttctatgtat gtagaaggaa acgtacatga taaagcgttc cgtaagtcgg ctaaaacagt 180

cggtaacgtt attggtaact atcacccgca cggtgattkc tctgtatatg aagcgatggt 240

acgtttaagt caaacttgga aagtacgtaa tgttttagtt gagatgcatg gtaataatgg 300

tagtgttgac ggggatccgg cagcagcaat gcgttatacg gaagcccgat tatcaccaat 360

tgcatctgag ttattacgtg atcttgataa agaaacagta gaattcgtat ctaattttga 420

tgatacgagt gaagaaccgg ttgttttacc agcagcgttc ccgaacttat tagtgaacgg 480

atctacagga 490

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gttcaatagc tttatttgca tgactttgcg ctt 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

agagtttgat gtgaaggtga gacataatca tgc 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

gcatcaatat tttgaatatc ccttttatac tgc 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

cttgatattc aaccatatga tattaatcaa agg 33

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

ccggatgagc attcaacata ccacggaatg ctg 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

ttgattacat ggtcttccca gataatgcat cgc 33

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

gagaagtcaa cgagcacgac accagatttt aa 32

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

gtgaagaaga actattagat gattctgtag aac 33

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

tgcgccatac gtaccatcgt ttcataaatt tct 33

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

aatgatttag gaattacggc tgataaagcg tat 33

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

acgttattgg taactatcac ccgcattttg att 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

ctgccggatc cccgtcaaca ctaccattat tac 33

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

agctttattt gcatgacttt gcgctt 26

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

gagtttgatg tgaaggtgag acataatcat gc 32

<210> 21

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

aauuucuacu guuguagauc gcuuauucgu auugau 36

<210> 22

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

aauuucuacu guuguagauu uacaucaaga uuaauu 36

<210> 23

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

aauuucuacu guuguagauc ucaucaaucc caagag 36

<210> 24

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

aauuucuacu guuguagaua acacagaaga uaaguc 36

<210> 25

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

aauuucuacu guuguagauu aaaucaccau gagggu 36

<210> 26

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

aauuucuacu guuguagaug auuucucugu auauga 36

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

tgggtagggc gggttgggaa a 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 28

tttcccaacc cgccctaccc a 21

<210> 29

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

uuucccaacc cgcccuaccc a 21

Claims

1.一种可视化检测炭疽芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：

所述目标位点为plcR位点、lef位点、capB位点或CR5位点；

所述plcR位点如SEQ ID NO:1自5’末端起第219位所示；

所述lef位点如SEQ ID NO:2自5’末端起第103-119位所示；

所述capB位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第182-198位所示；

所述CR5位点如SEQ ID NO:1自5’末端起第226位所示；

所述探针ProbeCatG4R的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；

所述探针ProbeCatG4的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；

(4)完成步骤(3)后，观察颜色，进行如下判断：

所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述引物对为引物对1，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有plcR位点；此时crRNA为crRNA1；

所述引物对1由引物1和引物2组成；引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述引物对为引物对2，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有lef位点；此时crRNA为crRNA2；

所述引物对2由引物3和引物4组成；引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述引物对为引物对3，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有capB位点；此时crRNA为crRNA3；

所述引物对3由引物5和引物6组成；引物5的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述引物对为引物对4，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有CR5位点；此时crRNA为crRNA4；

所述引物对4由引物7和引物8组成；引物7的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；引物8的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；crRNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。

6.一种可视化检测待测炭疽芽胞杆菌耐药性的方法，包括如下步骤：

(1)以待测炭疽芽胞杆菌的基因组DNA为模板，采用引物对进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

所述探针ProbeCatG4R的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；

所述探针ProbeCatG4的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；

(4)完成步骤(3)后，观察颜色，进行如下判断：

如果反应体系的颜色为无色，则待测炭疽芽胞杆菌不耐药；

如果反应体系的颜色为绿色，则待测炭疽芽胞杆菌耐药；

所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述引物对为引物对5，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有gyrA位点；此时crRNA为crRNA5；gyrA位点如SEQ ID NO:5自5’末端起第254位所示；

所述引物对5由引物9和引物10组成；引物9的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；引物10的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；crRNA5的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述引物对为引物对6，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有parC位点；此时crRNA为crRNA6；parC位点如SEQ ID NO:6自5’末端起第219位所示；

所述引物对6由引物11和引物12组成；引物11的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；引物12的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；crRNA6的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。