JP6768645B2 - 微生物の非存在の検出の方法およびキット - Google Patents
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Description
しかしながら、汚染活性を除去するための、WO2010/119270において使用される条件は20分間の高pH(約pH11)でのインキュベーションを含む。有用である一方で、これらの条件は、H.インフルエンザ(H.influenzae)の特定の臨床株などの特定の菌株に有害であると、発明者らにより見出された。
(a)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(b)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること
を含む、方法である。この基本的なアッセイ形式の様々な開発が本明細書に提示される。
(a)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(b)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。
(a)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(b)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子が少なくとも2nMであるが50nM未満の濃度で試料に加えられることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。
(a)高pH条件下で試料を、非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために、8分間以内で処理すること、
(b)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(c)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(d)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法を提供する。
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)任意に、試料中のインタクト(intact)な微生物(もしあれば)からの溶解細胞物質の分離
(iii)試料中の(分離された)インタクトな微生物(もしあれば)を高pH試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために5分間以内でインキュベートすること
(iv)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(v)試料中に存在する場合には、pH改変試薬からの微生物の分離
(vi)任意の分離された微生物の溶解
(vi)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(vii)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(viii)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法を提供する。
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(iii)ペレットからの上清の除去
(iv)高pH試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために8分間以内でインキュベートすること
(v)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(vi)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
(vi)ペレットからの上清の除去
(vii)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(viii)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(ix)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(x)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること。
1.界面活性剤/洗剤
2.アルブミン(例えばBSA)などの血清タンパク質
3.緩衝液
4.dNTPなどのヌクレオチド
5.核酸分子(本発明のアッセイにおいて基質として作用する)。
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの、溶解細胞物質の分離および/または溶解細胞物質の不活性化
(iii)分離および/または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
(iv)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(v)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(vi)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。
(a)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(b)ペレットからの上清の除去
(c)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(d)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(e)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(f)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法を提供する
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの、溶解細胞物質の分離および/または溶解細胞物質の不活性化
(iii)分離および/または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
(iv)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(v)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(vi)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。
(a)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(b)ペレットからの上清の除去
(c)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(d)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(e)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(f)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする、
を含む、方法がさらに提供される。
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)任意に、試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの溶解細胞物質の分離
(iii)試料中の(分離された)インタクトな微生物(もしあれば)を高pH試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために5分間以内でインキュベートすること
(iv)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(v)試料中に存在する場合には、pH改変試薬からの微生物の分離
(vi)任意の分離された微生物の溶解
(vii)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(viii)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(ix)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、
を含む、方法をさらに提供する。
(a)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(b)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(c)ペレットからの上清の除去
(d)高pH試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために5分間以内でインキュベートすること
(e)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(f)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
(g)ペレットからの上清の除去
(h)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(i)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(j)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(k)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、
を含む、方法を提供する。
AS
Uaggcgucggugacaaacggccagcguuguugucucu−DDC(3’末端はジデオキシ−Cである)(配列番号6)
S1
Gccgatatcggacaacggccgaactgggaaggcgagactgaccgaccgataagctagaacagagagacaacaac(配列番号7)
gcc gat atc gga caa cgg ccg aac tgg gaa ggc gag atc agc agg cca cac gtt aaa gac aga gag aca aca acg ctg gcc gtt tgt cac cga cgc cta(配列番号3)
(1)薬剤は、対象に対して無毒で、かつ有害な副作用が無いべきであり、
(2)薬剤は、対象に対して非アレルゲン性であるべきであり、
(3)薬剤は、対象の天然細菌叢を除去しないべきであり、
(4)薬剤は、安定であるべきであり、
(5)薬剤は、好ましくは安価かつ容易に入手可能/製造が容易であるべきであり;かつ
(6)薬剤は、病原体耐性が(顕著な程度まで)発達しないほど強力であるべきである。この特徴は、上記に記載される方法により試験されてもよい。
(i)微生物細胞をインタクトなままにしておく条件下での血小板の溶解。これは主に、核酸改変活性の存在について試験する前に微生物の選択的濃縮を可能にする。従って、哺乳類細胞により提供される核酸改変活性は、試験前に除去され得る
(ii)微生物の濃縮(例えば細菌細胞を含有するペレットを生産するための遠心分離による)
(iii)微生物の溶解または核酸改変活性を放出させるための微生物の透過性を増加させる処理。
(a)少なくとも1つの核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、少なくとも1つの試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子
(b)核酸分子とIPCの両方を含有する、核酸増幅反応におけるプライマー結合に対して競合があるように、核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、少なくとも1つの内部陽性対照(IPC)核酸分子
を含む、本明細書中に記載される方法を実施するためのキットが提供される。
試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(b)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法。
2. 改変がメチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護および合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項1に記載の方法。
3. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項2に記載の方法。
4. 試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(b)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子が少なくとも2nMであるが50nM未満の濃度で試料に加えられることを特徴とする、
を含む、方法。
5. 工程(a)および/または(b)が少なくとも100μMの濃度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸を試料に加えることを含む、項4に記載の方法。
6. 試料(非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)高pH条件下で試料を、非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために、5分間以内で処理すること、
(b)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(c)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(d)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法。
7. 高pH条件が、試料をNaOHまたはNa2CO3と接触させることを含む、項6に記載の方法。
8. NaOHまたはNa2CO3の濃度が約5mM以上である、項7に記載の方法。
9. 高pH条件下での処理が、pHを低下させるための試薬を加えることにより停止される、項6から8のいずれかに記載の方法。
10. pHが緩衝液または酸を加えることにより低下される、項9に記載の方法。
11. 緩衝液がTris−HCl緩衝液(例えばpH7.2または8)を含む、項10に記載の方法。
12. 工程(a)が摂氏15から30度の間の温度で実施される、項6から11のいずれかに記載の方法。
13. 工程(a)が、室温で実施される、項6から12のいずれかに記載の方法。
14. 方法が、摂氏15から30度の間の温度で実施される、項1から13のいずれかに記載の方法。
15. 方法が室温で実施される、項1から14のいずれかに記載の方法。
16. 試料(非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)任意に、試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの溶解細胞物質の分離
(iii)試料中の(分離された)インタクトな微生物(もしあれば)を高pH試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために5分間以内でインキュベートすること
(iv)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(v)試料中に存在する場合には、pH改変試薬からの微生物の分離
(vi)任意の分離された微生物の溶解
(vi)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(vii)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(viii)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること。
または
(b)
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(iii)ペレットからの上清の除去
(iv)高pH試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために8分間以内でインキュベートすること
(v)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(vi)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
(vi)ペレットからの上清の除去
(vii)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(viii)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(ix)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(x)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法。
17. 高pH試薬がNaOHまたはNa2CO3を含む、項16に記載の方法。
18. 高pH試薬の濃度が約5mM以上である、項16または17に記載の方法。
19. pH低下試薬が緩衝液または酸を含む、項16から18のいずれかに記載の方法。
20. 緩衝液がTris−HCl緩衝液(pH7.2または8)を含む、項19に記載の方法。
21. 工程(a)(iii)または(b)(iv)が摂氏15から30度の間の温度で実施される、項16から20のいずれかに記載の方法。
22. 工程(a)(iii)または(b)(iv)が、室温で実施される、項16から21のいずれかに記載の方法。
23. 方法が、摂氏15から30度の間の温度で実施される、項16から22のいずれかに記載の方法。
24. 方法が室温で実施される、項16から23のいずれかに記載の方法。
25. (液体)試料(潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの、溶解細胞物質の分離および/または溶解細胞物質の不活性化
(iii)分離および/または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
(iv)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(v)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(vi)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
または
(a)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(b)ペレットからの上清の除去
(c)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(d)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(e)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(f)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性から保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法。
26. 核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項25に記載の方法。
27. 改変が、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項25または26に記載の方法。
28. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項27に記載の方法。
29. (液体)試料(潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの、溶解細胞物質の分離および/または溶解細胞物質の不活性化
(iii)分離および/または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
(iv)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(v)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(vi)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする。
または
(a)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(b)ペレットからの上清の除去
(c)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(d)内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
(e)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(f)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする、
を含む、方法。
30. 工程(iii)および(iv)または(c)および(d)それぞれが共に実施される、項25から29のいずれかに記載の方法。
31. 核酸分子が、溶解試薬と共に試料に加えられる、項30に記載の方法。
32. 改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することが核酸増幅工程を含む、項1から31のいずれかに記載の方法。
33. 核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、かつ改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定する工程は、相補鎖におけるウラシル残基を分解するために、試料にウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を加えることを含む、項32に記載の方法。
34. 工程(f)において、プライマー結合に対して競合があるように、IPC核酸分子は核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、項25から33のいずれかに記載の方法。
35. 核酸分子(のセンス鎖)内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブが工程(f)において加えられる、項25から34のいずれかに記載の方法。
36. IPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが工程(f)において加えられる、項25から35のいずれかに記載の方法。
37. 核酸プローブがIPC核酸分子に結合せず、かつさらなる核酸プローブが核酸分子に結合しない、項36に記載の方法。
38. 核酸プローブが標識化されている、項35から37のいずれかに記載の方法。
39. さらなる核酸プローブが標識化されている、項35から38のいずれかに記載の方法。
40. 核酸プローブおよびさらなる核酸プローブが異なって標識化されている、項38または39に記載の方法。
41. 核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために3’末端での改変を含む、項33に記載の方法。
42. 改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、項41に記載の方法。
43. 伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)である、項42に記載の方法。
44. ddNTPがジデオキシシチジンである、項43に記載の方法。
45. 核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項29から44のいずれかに記載の方法。
46. 改変がメチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項45に記載の方法。
47. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項46に記載の方法。
48. 試料(非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料)中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(ii)任意に、試料中のインタクトな微生物(もしあれば)からの溶解細胞物質の分離
(iii)試料中の(分離された)インタクトな微生物(もしあれば)を高pH試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために5分間以内でインキュベートすること
(iv)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(v)試料中に存在する場合には、pH改変試薬からの微生物の分離
(vi)任意の分離された微生物の溶解
(vii)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(viii)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(ix)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。
または
(a)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
(b)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
(c)ペレットからの上清の除去
(d)高pH試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する(一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない)ために8分間以内でインキュベートすること
(e)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること
(f)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
(g)ペレットからの上清の除去
(h)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
(i)試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(j)核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(k)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、
を含む、方法。
49. 改変が、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項48に記載の方法。
50. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項49に記載の方法。
51. 核酸分子が、少なくとも2nMおよび50nM未満の濃度で試料に加えられることをさらに特徴とする、項48から50のいずれかに記載の方法。
52. 工程(vii)または(i)それぞれが少なくとも100μMの濃度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸を試料に加えることを含む、項48から51のいずれかに記載の方法。
53. 高pH試薬がNaOHまたはNa2CO3を含む、項48から52のいずれかに記載の方法。
54. 高pH試薬の濃度が約5mM以上である、項48から53のいずれかに記載の方法。
55. pH低下試薬が緩衝液または酸を含む、項48から54のいずれかに記載の方法。
56. 緩衝液がTris−HCl緩衝液(pH7.2または8)を含む、項55に記載の方法。
57. 工程(iv)または(d)のそれぞれが、摂氏15から30度の間の温度で実施される、項48から56のいずれかに記載の方法。
58. 工程(iv)または(d)のそれぞれが、室温で実施される、項48から57のいずれかに記載の方法。
59. 方法が摂氏15から30度の間の温度で実施される、項48から58のいずれかに記載の方法。
60. 方法が室温で実施される、項48から59のいずれかに記載の方法。
61. 工程(vi)または(i)それぞれが、内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、ここでIPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用される、項48から60のいずれかに記載の方法。
62. 工程(vi)または(i)それぞれが、内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項48から60のいずれかに記載の方法。
63. 改変が、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項62に記載の方法。
64. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項63に記載の方法。
65. 工程(vi)および(vii)または(h)および(i)それぞれが共に実施される、項48から64のいずれかに記載の方法。
66. 核酸分子が、溶解試薬と共に試料に加えられる、項65に記載の方法。
67. 工程(xi)または(k)それぞれが、核酸増幅工程を含む、項48から66のいずれかに記載の方法。
68. 核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、かつ工程(k)が相補鎖におけるウラシル残基を分解するために、試料にウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を加えることを含む、項48から67のいずれかに記載の方法。
69. 工程(xi)または(k)それぞれにおいてプライマー結合に対して競合があるように、IPC核酸分子は核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、項64から68のいずれかに記載の方法。
70. 核酸分子(のセンス鎖)内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブが工程(xi)または(k)それぞれにおいて加えられる、項48から69のいずれかに記載の方法。
71. IPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが工程(xi)または(k)それぞれにおいて加えられる、項70に記載の方法。
72. 核酸プローブがIPC核酸分子に結合せず、そしてさらなる核酸プローブは、核酸分子に結合しない、項71に記載の方法。
73. 核酸プローブが標識化されている、項70から72のいずれかに記載の方法。
74. さらなる核酸プローブが標識化されている、項71から73のいずれかに記載の方法。
75. 核酸プローブおよびさらなる核酸プローブが異なって標識化されている、項74に記載の方法。
76. 核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために3’末端での改変を含む、項68から75のいずれかに記載の方法。
77. 改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、項76に記載の方法。
78. 伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)である、項77に記載の方法。
79. ddNTPがジデオキシシチジンである、項78に記載の方法。
80. 核酸改変活性がポリメラーゼ活性を含む、項1から79のいずれかに記載の方法。
81. 微生物に対する薬剤に対する微生物の耐性についてスクリーニングするための、項1から80のいずれかに記載の方法の使用。
82. 1つ以上の微生物を死滅させ、または増殖を防ぐことができてもよい、候補薬剤をスクリーニングするための、項1から80のいずれかに記載の方法の使用。
83. 感染、対象中の微生物の存在に関連する疾患を診断するための、項1から80のいずれかに記載の方法の使用。
84. 試料を含有する血小板における微生物汚染の存在を検出するための、項1から80のいずれかに記載の方法の使用。
85. 項1から84のいずれかに記載の方法を実行するための以下を含むキット:
(a)少なくとも1つの核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、少なくとも1つの試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子
(b)核酸分子とIPCの両方を含有する、核酸増幅反応におけるプライマー結合に対して競合があるように、核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、少なくとも1つの内部陽性対照(IPC)核酸分子。
86. キットが核酸分子(のセンス鎖)内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブをさらに含む、項85に記載のキット。
87. キットがIPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブをさらに含む、項85または86に記載のキット。
88. 核酸プローブがIPC核酸分子に結合せず、そしてさらなる核酸プローブは、核酸分子に結合しない、項86または87に記載のキット。
89. 核酸プローブが標識化されている、項86から88のいずれかに記載のキット。
90. さらなる核酸プローブが標識化されている、項87から89のいずれかに記載のキット。
91. 核酸プローブおよびさらなる核酸プローブが異なって標識化されている、項87から90のいずれかに記載のキット。
92. 核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために3’末端での改変を含む、項85から91のいずれかに記載のキット。
93. 改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む項92に記載のキット。
94. 伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)である、項93に記載のキット。
95. ddNTPがジデオキシシチジンである、項94に記載のキット。
96. IPCがヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項85から95のいずれかに記載のキット。
97. 改変が、メチル化の組み込み、3’および/または5’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項96に記載のキット。
98. 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項97に記載のキット。
99. キットが高pH試薬をさらに含む、項85から98のいずれかに記載のキット。
100. 高pH試薬がNaOHまたはNa2CO3を含む、項99に記載のキット。
101. 高pH試薬の濃度が約5mM以上である、項99または100に記載のキット。
102. pH低下剤をさらに含む、項85から101のいずれかに記載のキット。
103. pH低下試薬が緩衝液または酸を含む、項102に記載のキット。
104. 緩衝液がTris−HCl緩衝液(pH7.2または8)を含む、項103に記載のキット。
本発明は、以下の非限定的な実施例に関して理解されるだろう:
方法−一般的なプロトコール
それぞれの試料に関して、1mLの血液培養(加えられた微生物の有無に関わらず、血液の有無に関わらず)を、1.5mLのマイクロ遠心チューブにおいて0.333mLの試薬A(5%w/vのサポニン、5%w/vのTween20、8.5g/Lの塩化ナトリウム)と混合し、室温で15分間インキュベートした。それぞれの試料を、3分間、7300gで遠心分離し、その後、上清を注ぎ出し、そしてチューブの縁をきれいな実験用ティッシュペーパーの上にたたいた。次いで、それぞれのペレットを、0.75mLの試薬B(5mMのNaOH)において再懸濁し、5分間インキュベートし、その後0.5mLの試薬C(1.32g/Lのアンモニウム硫酸、0.49g/Lのマグネシウム硫酸七水和物、0.75g/Lの塩化カリウム、20mMのTris−HCl、pH8.0)を加えることによりpHを低下させた。インキュベーション後、試料を再度遠心分離し、上清を注ぎ出すことにより除去した。残っているペレットを、0.5mLの試薬Cにおいて再懸濁し、すぐにガラスビーズの混合物を含有する新しいチューブ(0.1mmおよび0.5mmのガラスビーズ;CamBio cat 13118−400および13116−400によってそれぞれ供給される)に移した。さらなる遠心分離を、ガラスビーズと任意の懸濁した細胞をペレット化するために実施し、再度上清を除去し、廃棄した。
1サイクル;40℃、10分、50℃、10分、95℃、5分
40−50サイクル:95℃、5秒、61℃、20秒、72℃、20秒。
増幅を、SmartCyclerのTexas RedおよびFAM励起/検出チャネルにおいて、リアルタイムで反応を通してモニターした。
Fam標識化されたプローブ(分子ビーコン):
FAM−cgc tgc gac cga ccg ata agc tag aac agg cag cg−BHQ1
(配列番号1)
Texas red標識化されたプローブ(分子ビーコン):
TxR− cgc gat cag cag gcc aca cgt taa aga cat cgc g−BHQ2
(配列番号2)
IPC
gcc gat atc gga caa cgg ccg aac tgg gaa ggc gag atc agc agg cca cac gtt aaa gac aga gag aca aca acg ctg gcc gtt tgt cac cga cgc cta
(配列番号3)
フォワードプライマー
ccg ata tcg gac aac ggc cga act gg (配列番号4)
リバースプライマー
tag gcg tcg gtg aca aac ggc cag c (配列番号5)
基質要素は;
AS
uaggcgucggugacaaacggccagcguuguugucucu−DDC(3’末端はジデオキシ−Cである)(配列番号6)
S1
gccgatatcggacaacggccgaactgggaaggcgagactgaccgaccgataagctagaacagagagacaacaac (配列番号7)
である。
一般的なプロトコールを、LM中のETGA基質の量を10倍まで(0.001μMから0.01μMまで)増加させること、およびdNTPの量を2倍(50μMから100μMまで)増加させることにより改変した。
ETGA基質分子と同時にIPC分子を加えることは、元のプロトコールの改良であると考えられた。IPCをLM中に加えた場合、IPCはETGA基質と全く同一の試験条件の対象であり、したがって、より正確な試験対照を提供するだろう。例えば、基質を消化できるヌクレアーゼ活性などの、基質分子に負の影響を与え得る条件もまた、IPCに影響する。IPCが後に加えられる場合(例えばMMにおいて)、同一の条件の対象ではなく、データの誤った解釈をもたらし得る。ETGA基質と同時にIPCを加える場合、核酸鋳型への試験条件の影響の大きさが測定され得る。
IPC分子はLM中に含まれるべきであり、ヌクレアーゼ活性はETGA試験に有害な効果を有し得るという仮定に基づいて、ヌクレアーゼ分解からDNA標的(IPCおよびETGA基質)を保護する試みがなされた。
標準ETGA基質およびIPCオリゴは、一般的なプロトコールにおけるLM中の同一のヌクレオチド配列を有するホスホロチオエートオリゴ(PTO)と置き換えられた。PTO−改変されたETGA基質を、0.01μMでLMに加え、PTO−改変されたIPCを十分な量で加え、50サイクルPCR反応において37−41のCt値を達成した。
一般的なプロトコール
10mLの検体に関して
それぞれの試料に関して、10mLの血液培養(加えられた微生物の有無に関わらず、血液の有無に関わらず)を、15mLのファルコンチューブにおいて3.33mLの試薬A(5%w/vのサポニン、5%w/vのTween20、8.5g/Lの塩化ナトリウム)と混合し、室温で15分間インキュベートした。それぞれの試料を8分間3600gで遠心分離し、その後、上清を注ぎ出し、そしてチューブの縁をきれいな実験用ティッシュペーパーの上にたたいた。次いで、それぞれのペレットを、5mLの試薬B(5mMのNaOH)において再懸濁し、5分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を再度遠心分離分離し、上清を注ぎ出すことにより除去した。残っているペレットを、1mLの試薬C(1.32g/Lのアンモニウム硫酸、0.49g/Lのマグネシウム硫酸七水和物、0.75g/Lの塩化カリウム、20mMのTris−HCl、pH8.0)において再懸濁し、すぐにガラスビーズの混合物を含有する1.5mLのマイクロ遠心チューブに移した。3分間7300xgでのさらなる遠心分離を、ガラスビーズと任意の懸濁した細胞をペレット化するために実施し、再度上清を除去し、廃棄した。
1サイクル;40℃、10分、50℃、10分、95℃、5分
40−50サイクル:95℃、5秒、61℃、20秒、72℃、20秒。
増幅を、SmartCyclerのTexas RedおよびFAM励起/検出チャネルにおいて、リアルタイムで反応を通してモニターした。
それぞれの試料に関して、1mLの血液培養を、1.5mLのマイクロ遠心チューブにおいて0.333mLの試薬A(5%w/vのサポニン、5%w/vのTween20、8.5g/Lの塩化ナトリウム)と混合し、室温で15分間インキュベートした。それぞれの試料を、3分間、7300gで遠心分離し、その後、上清を注ぎ出し、そしてチューブの縁をきれいな実験用ティッシュペーパーの上にたたいた。次いで、それぞれのペレットを、1mLの試薬B(5mMのNaOH)において再懸濁し、5分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を再度遠心分離し、上清を注ぎ出すことにより除去した。残っているペレットを、0.5mLの試薬C(1.32g/Lのアンモニウム硫酸、0.49g/Lのマグネシウム硫酸七水和物、0.75g/Lの塩化カリウム、20mMのTris−HCl、pH8.0)において再懸濁し、すぐにガラスビーズの混合物を含有する新しいチューブに移した。さらなる遠心分離を、ガラスビーズと任意の懸濁した細胞をペレット化するために実施し、再度上清を除去し、廃棄した。
ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)として同定された単一の臨床微生物単離物は臨床性能評価の間にETGA試験において偽陰性結果を示した。微生物がBiomerieux Bact/ALERT血液培養培地において標準的な自動血液培養により検出された。
一般的な10mLのプロトコールでは、試料を遠心分離するのに要する時間は、試料がNaOHに曝される合計時間を8分まで増加させるということに注意されたい。時間の短縮は、アルカリの中和により、またはインキュベーション時間の至適な期間後に、NaOHに1mLの200mMのTris−HCl緩衝液、pH7.2を加えることにより少なくとも試料のpHを低下させることで達成され、制御され得る。
H.インフルエンザおよびS.アウレウスの両方の検出は、元のNaOH工程を、0.75mLのNaOHにおける再懸濁、室温で5分間のインキュベーションからなるより複雑な工程に置き換え、その後0.5mLの試薬Cを加えてpHを低下させることにより、1mLの検体についての一般的なプロトコールで改善することができた。図8に要約された結果は、全ての微生物含有試料でのETGA試験からのCt値は、元の1mLのプロトコールと比較してpH低下プロトコールを使用する場合により低く、これはpH低下プロトコールが検出を改善したことを示すことを示した。
目的
この実施例において概説される研究の目的は、コグニターマイナス試験の性能での95℃工程の影響を評価することであった。コグニターマイナス試験を95℃工程の有無について細菌添加血液ブロス試料を使用して実施して、以下の特徴を比較した:
・得られたCt値
・試料調製の完了後の異なる時点でのQPCRにより測定されるETGA鋳型DNAの安定性
・溶解混合物(LM)が、ホスホロチオエート改変オリゴヌクレオチド(PTO)ETGA基質とは対照的に、未改変のオリゴヌクレオチド(UMO)ETGA基質を含有する場合に、得られたCt値およびETGA鋳型DNAの安定性。
コグニターマイナス試験における初期段階は、血液細胞を溶解し、かつ非微生物由来のETGA鋳型DNAを生産するDNAポリメラーゼ、および微生物由来のETGA鋳型DNAを消化し得るヌクレアーゼ酵素などの血液由来のタンパク質を洗い流すことを目指す。任意の得られたインタクトな微生物をその後、溶解混合物(LM)およびビーズ粉砕物の添加により溶解した。微生物溶解およびETGA反応の後、試料は、微生物タンパク質、LM成分、新しく合成されたETGA鋳型DNAおよび残留している血液細胞タンパク質の混合物を含有する。95℃工程は、QPCRによりうまく検出され得るように、ヌクレアーゼ消化からETGA鋳型DNAおよび内部プロセス対照(IPC)DNAを保護するために全てのタンパク質変性させることを意図している。
使用した試薬
試薬A−5%(w/v)サポニン、5%(v/v)Tween20および146mMの塩化ナトリウム
試薬B−5mMの水酸化ナトリウム。
試薬C−10mMのアンモニウム硫酸、2mMのマグネシウム硫酸七水和物、10mMの塩化カリウムおよび20mMのTris−HCl[pH8.0]。
L1、L2、L3、dNTP、PTO−IPCストックを含む溶解混合物(LM):
L1(360mLのLM中の252mL)−1.46%(w/v)BSA、0.15%(v/v)Triton X100および0.15%(v/v)Tween20;
L2(360mLのLM中の36mL)−100mMのアンモニウム硫酸、20mMのマグネシウム硫酸七水和物、100mMの塩化カリウムおよび200mMのTris−HCl[pH8.0];
L3(360mLのLM中の36mL)−0.1μMのPTO−ASオリゴ、0.1μMのPTO−S1オリゴ、20mMのTris−HCl[pH8.5]、10mMの塩化カリウムおよび10μMのEDTA;
10mMのdNTP(360mLのLM中の3.6mL)
PTO−IPCストック(360mLのLM中の、〜180μL)*注釈:可変濃度
H2O(360mLのLM中において、〜32.22mL)
Escherichia coli(ATCC(登録商標)25922TM)を18時間37℃で栄養ブロス中で増殖させた。BacT/ALERT SA血液ブロス(ヒツジ血液)にE.コリを、およそ1x107cfu/mL、1x106cfu/mL、1x105cfu/mL、1x104cfu/mL、および1x103cfu/mL播種した。2セットの1mlの試料を、95℃工程の有無についての試験のために調製した。総生存数(TVC)プレートを、cfu/mL値を確認するために調製した。2セットの血液ブロスのみ‘無スパイク’対照(NSC)、陽性対照(ブロスのみプラスDNAポリメラーゼ)および陰性対照(ブロスのみ)はまた、合計16試料を与えるよう調製した(表2を参照されたい)。
表2−試験試料
BacT/ALERT血液ブロスSAにE.コリを、およそ1x107cfu/mLおよび1x104cfu/mL播種した。4セットの1mlの試料を、95℃工程の有無について、PTOの使用の有無に関するコグニターマイナス試験結果を比較するために調製した。TVCプレートを、cfu/mL値を確認するために調製した。NSCおよび陽性対照もまた、調製した(表3を参照されたい)。上記「方法1」に記載される一般的なプロトコールにより全ての試料を処理した。37℃の微生物溶解(ETGA)工程後に、95℃(−)試料(試料9−16)をすぐにQPCRセットアップに進め、一方で95℃(+)試料(試料1−8)を、QPCRセットアップ前に95℃で、5分間インキュベートした。すぐに両方の試料セットをQPCRにより解析した。室温で2時間後に、およびさらに4℃で18時間後にまた、同一の試料をQPCRにより解析した。
表3−試験試料
結果1:95℃工程の除去は、経時的なシグナルにおける減少なしのETGA QPCRシグナルを改善する
試料調製(n=3)後の0、2および20時間で95℃工程を伴って、または伴わずに処理された試料の結果を図9A−Cに示す。個々の実験の中で、95℃工程の除去は、全てのE.コリが添加された血液ブロス希釈液および陽性対照について、Ct値の減少(ETGAシグナルの増加)をもたらした(図9A−C)。0、2および20時間で同一の試料について得られたCt値は、95℃(+)試料について最大ΔCt値0.07Ctユニットから1.07Ctユニットまで(0.30Ctユニットの平均最大ΔCt値)および95℃(−)試料について最大ΔCt値0.03Ctユニットから0.58Ctユニットまで(0.38Ctユニットの平均最大ΔCt値)で、3つの反復実験にわたって非常に一貫している。全てのNSCおよび陰性対照は、40より大きいCt値が得られたか、またはQPCR増幅を全く有さなかった(データは示されない)。図10は、共にプロットされたE.コリが添加された血液ブロス試料についての全てのデータを示し、いくつかの傾向が明らかである。第一に、95℃(−)試料と比較して95℃(+)試料のCt値間に、95℃(−)試料のCt値においておよそ1.0Ctユニット減少しており、明らかな差がある。第二に、95℃(+)および95℃(−)試料の両方について異なる時点で得られたCt値間に非常にわずかな差がある。しかしながら、95℃工程が除去される場合、貯蔵時間が増加するにつれてCt値における小さい減少があり、図10における傾向線から明らかであり、実験3(図9B)においてより明白である。
表4−異なる時点および95℃工程の有無についての、E.コリ添加血液培養希釈系列に関するCt値検量線を比較するための線形モデル(Rを使った)。
図11A−Bは、E.コリが添加された血液ブロス試料(1x107cfu/mLおよび1x104cfu/mL)ならびに95℃工程の有無について、UMO LM(図11A)もしくはPTO LM(図11B)のいずれかを使用して処理された陽性対照について得られたCt値を示す。ここに示されるデータは、単一の実験からのものである。UMO LMを使用するNSCについてのCt値は全て、1x103cfu/mLのE.コリが添加された血液ブロス試料について得られたCt値より、少なくとも5Ctユニット高いが、PTO LM NSC Ct値は全て、42.0Ctユニットより大きいか、またはQPCR増幅を全く有さなかった(データは示されない)。結果は、UMO LM試料についてのCt値は、PTO LM試料についてのCt値より平均10.2Ctユニット低いことを示す。95℃工程が除去される場合に、PTO LM試料についてよりも、UMO LM試料についてのCt値において、より大きい減少もある。もっとも重要なのは、ETGA鋳型DNA安定性に関して、得られたUMO LM試料についてのCt値は、PTO LM試料についてのCt値よりも異なる時点にわたって、特に一貫していない。UMO LM 95℃(+)データセットにおけるE.コリが添加された血液ブロス試料についてのCt値は、2時間から20時間までおよそ1.0Ctユニット増加したが、対応する陽性対照は、Ct値において0.24Ctユニットの減少を示した。これは、細菌および/または宿主血液細胞が存在する場合、95℃工程のタンパク質変性の影響にもかかわらずETGA鋳型DNAのヌクレアーゼ消化が試料中で生じ得ることを示すが、DNAポリメラーゼ酵素のみが加えられた陽性対照においては生じない。95℃工程が除去される場合に、UMO LM試料についてのCt値は試料貯蔵時間の増加に伴って減少する。これは、タンパク質変性の非存在下において、継続するETGA鋳型生成は、ヌクレアーゼ消化における任意の増加を打ち負かすことができ、それ故にETGA QPCRシグナルの増加をもたらすことを示す。PTO LMデータ(図11B)は、95℃(+)および95℃(−)試料の両方についての全ての時点にわたって非常に一貫しているCt値を示す。これらのデータは、PTO基質DNAから形成されたETGA鋳型DNAは、37℃のETGA反応後のヌクレアーゼ分解および/またはさらなるETGA鋳型DNA生成のいずれかによる変化に対してより耐性であることを示す。
ここに示されるデータは、95℃工程が除去される場合に、ETGA鋳型DNA検出が改善されることを示す。さらに、ETGA QPCRシグナルは、95℃工程の非存在下で試料貯蔵時間の増加と共に劣化しない。UMO LMとPTO LMの比較は、ETGA鋳型DNAの高い安定性は、PTO ETGA基質DNAの使用に依存していることを示す。全てのここに示されるデータは、コグニターマイナス試験からの95℃工程の除去を支持する。試験の感度の増加がバックグラウンドシグナル(血液−由来のETGAシグナル)を検出する機会を増加させ得ることは注目に値するが、血液溶解/洗浄性能およびQPCR結果の解釈などの他の因子の最適化は、この影響を除去するべきである。
目的
この報告に掲載された研究の目的:
1.全ての主要パネル微生物(E.コリ;S.アウレウス;およびC.アルビカンス)についての、95℃工程の有無についてのコグニターマイナス結果を比較する
2.ホスホロチオエート改変オリゴヌクレオチド(PTO)LMと未改変のオリゴヌクレオチド(UMO)LM間の比較に関する実施例3の知見を確認する
3.PTO LMおよびUMO LMを使用するそれぞれの主要パネル微生物のQPCR結果に対する延長した試料貯蔵持続時間(72時間まで)の効果を試験する
コグニターマイナス試験における初期段階は、血液細胞を溶解し、かつ非微生物由来のETGA鋳型DNAを生産するDNAポリメラーゼ、および微生物由来のETGA鋳型DNAを消化し得るヌクレアーゼ酵素などの血液由来のタンパク質を洗い流すことを目指す。このプロセスは、血液試料に存在する任意の微生物に害がないべきである。単離されたインタクトな微生物はその後、溶解混合物(LM)およびビーズ粉砕物の添加により溶解された。微生物溶解およびETGA反応の後、試料は、微生物タンパク質、LM成分、新しく合成されたETGA鋳型DNAおよび残留している血液細胞タンパク質の混合物を含有する。現在のコグニターマイナス試験プロトコールでは、95℃工程は、QPCRによりうまく検出され得るように、ヌクレアーゼ消化からETGA鋳型DNAおよび内部プロセス対照(IPC)DNAを保護するために全てのタンパク質変性させることを意図している。95℃工程はまた、DNAポリメラーゼを失活させ、それによってETGA反応を停止する。しかしながら、プロトコールに95℃工程を組み込んで以来、LM中でETGA基質(およびIPC)を形成するために使用されたUMOは、ヌクレアーゼ耐性のPTOに置き換えられた。ETGA鋳型を形成するETGA伸長鎖は標準dNTPから構築されるが、それがアニールされたPTO基質DNAは、ヌクレアーゼ消化に対する保護を与えることができる。プロトコールの簡素化および試験を実行するために必要な時間の短縮などの、95℃工程を除去することの利点に起因して、95℃工程の必要性を再評価することが重要であると考えられた。
試薬の詳細に関して。実施例3を参照されたい。
表5−試験試料
表6−材料
0、2、24、48および72時間の時点での、95℃工程の有無についてPTO LMまたはUMO LMのいずれかを使用して処理された試料の結果(n=3)が、図12A−Eに示される。
95℃工程なしで処理された、全ての微生物添加血液ブロス試料および陽性対照試料は、PTO LMおよびUMO LMの両方について、対応する95℃工程で処理された試料よりもより低いCt値(より強いETGAシグナル)を生じた。‘0時間’時点でのPTO LM試料についての平均ΔCt値(95℃(+)から95℃(−)を減算する)は、それぞれE.コリ、S.アウレウスおよびC.アルビカンスならびに陽性対照について、0.98Ctユニット、1.41Ctユニット、0.12Ctユニットおよび1.21Ctユニットであった。‘0時間’時点でのUMO LM試料についての平均ΔCt値(95℃(+)から95℃(−)を減算する)は、それぞれE.コリ、S.アウレウスおよびC.アルビカンスならびに陽性対照について、3.91Ctユニット、4.10Ctユニット、5.36Ctユニットおよび1.20Ctユニットであった。PTO LMで処理されたNSC試料の大部分は、低いQPCR増幅に起因して、Ct値を生産しなかったので、このデータは図12A−Eに示されない。しかしながら、Ct値についての十分な増幅の発生率は、95℃(+)試料よりも95℃(−)試料についての方が高かった(2/15Ct値と比較して7/15Ct値は、貯蔵持続時間について明らかな傾向はなく;および全てのNSC PTO LM Ct値は、42.0Ctユニットと45.0Ctユニットの間だった)。UMO LMで処理されたNSC試料は、‘0時間’時点でCt値を生じ、95℃工程無しで平均0.42Ctユニット低かった。陽性試料について観察されるシグナルにおける一般的な増加を考慮すると、95℃工程なしで処理されたNSC試料についてのQPCRシグナルにおけるこの増加が予想される。
PTO LMデータセット内では、全ての微生物添加血液ブロス試料および陽性対照試料は、試料が95℃工程で処理されたかどうかに関わらず、72時間の貯蔵期間にわたって非常に一貫しているCt値を生じた。UMO LM 95℃(+)データセット内では、E.コリ、S.アウレウスおよび陽性対照試料は、72時間の貯蔵期間にわたってかなり一貫したCt値を生じた一方で、C.アルビカンスおよびNSC試料は、経時的なCt値における増加(ETGAシグナルにおける減少)を示した。C.アルビカンスおよびNSC試料についてのCt値におけるこの増加は、‘0時間’時点でのこれらの試料についてのより高いCt値により示されるように、開始濃度がより低い場合、ETGA鋳型DNA濃度に対するヌクレアーゼ活性のより大きい影響に起因し得る。UMO LM 95℃(−)試料は、C.アルビカンスおよびNSC試料を除くCt値における経時的な減少(ETGA QPCRシグナルにおける増加)を全般に示し、Ct値が72時間の期間にわたって非常に一貫していた。これは、95℃工程(タンパク質変性)なしで処理されたE.コリ、S.アウレウスおよび陽性対照試料について、ETGA反応の継続はQPCRシグナルの増加をもたらし、任意のヌクレアーゼ活性を打ち負かすことを示す。ヌクレアーゼ分解の影響がより明白であると思われるC.アルビカンスおよびNSC試料では、継続するETGA反応は、この分解に対抗して、経時的により安定なQPCRシグナルを提供してもよい。
線形モデリングを実施して(Rを使って)、PTO LMおよびUMO LM95℃工程を伴って、または伴わずに異なる時点で処理された試料について得られたCt値間に統計学的に有意差があるかどうかを決定した。それぞれのデータセット(例えばPTO LMデータセットのE.コリ)に関して、‘Ct’以下の説明変数およびそれらの相互作用に対してモデル化された:‘Log10 cfu’、‘時間’、および‘95℃工程’。非有意(p>0.05)相互作用および変数を段階的にモデルから除去し、その結果モデルが単純化された。しかしながら、それらの相互作用のうちのいずれかが有意(p<0.05)である場合は非有意変数はモデルから除去しなかった。従って、それぞれのデータセットについての最終的なモデルは、有意な相互作用、有意な変数、および有意な相互作用を形成する非有意な変数のみが含有された。それぞれの変数および相互作用についての有意性コード(Significance code)は、表8に示される(有意性コード(Significance code)は、もしモデルから、または最終的なモデルから除去されるならば、モデル単純化の時点でのそれぞれの相互作用または変数についてのp値に基づく)。
表8−Rにおける線形モデリングを使用する、それぞれの説明変数およびそれらの相互作用のp値についての有意性コード(Significance code)
ここに示されるデータは、95℃工程が除去される場合に、ETGA鋳型DNA検出が改善されることを示す。さらに、ETGA QPCRシグナルは、試料が、PTO ETGA基質DNAを使用して処理された場合に、95℃工程の非存在下で試料貯蔵持続時間の増加と共に劣化しない。ETGAシグナルは、試料がUMO ETGA基質DNAを使用して処理された場合に、それほど安定ではなく:95℃工程の非存在下で、ETGA QPCRシグナルは試料貯蔵持続時間と共に増加し続け;および95℃工程では、ETGA QPCRシグナルは、ETGA鋳型DNAの継続する産生を伴わずに、ヌクレアーゼ分解の結果として悪化する可能性がより高い。これらの結果は、実施例3で示された結果と一貫している。
Claims (33)
- 試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって:
(a)試料を、少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、かつ試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(b)ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(c)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を試料に加えること、および核酸増幅を含み、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法。 - 核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに3’および/もしくは5’末端の保護から選択される、請求項1に記載の方法。
- 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項2に記載の方法。
- 工程(a)が内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、ここでIPC核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、試料中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)が内部陽性対照(IPC)核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、ここでIPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- IPC核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに3’および/もしくは5’末端の保護から選択される、請求項5に記載の方法。
- 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項6に記載の方法。
- 工程(c)においてプライマー結合に対して競合があるように、IPC核酸分子が核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、請求項4から7のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸分子内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブが工程(c)において加えられている、請求項4から8のいずれか一項に記載の方法。
- IPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが工程(c)において加えられている、請求項9に記載の方法。
- 核酸プローブがIPC核酸分子に結合せず、かつさらなる核酸プローブが核酸分子に結合しない、請求項10に記載の方法。
- 核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために3’末端での改変を含む、請求項11に記載の方法。
- 3’末端での改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、請求項12に記載の方法。
- 伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)である、請求項13に記載の方法。
- 試料中のヌクレアーゼ活性を不活性化する工程を含まない、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から15のいずれか一項に記載の方法であって、試料が非微生物起源のポリメラーゼ活性を含有し、かつ該方法が:
(a)高pH条件下で試料を、非微生物起源のポリメラーゼ活性を阻害するために、5分間以内で処理すること、
(b)試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(c)ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること;および
(d)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性の作用から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を試料に加えること、および核酸増幅を含み、ここで、高pHが少なくとも10である、
を含む、方法。 - 請求項1から16のいずれか一項に記載の方法であって、試料が、非微生物起源のポリメラーゼ活性を含有し、かつ該方法が:
(a)
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション、
(ii)試料中のインタクトな微生物があれば、溶解細胞物質の分離
(iii)試料中の分離されたインタクトな微生物があれば、高pH試薬と接触させること、および非微生物起源のポリメラーゼ活性を阻害するために5分間以内でインキュベートすること、
(iv)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること、
(v)試料中に存在する場合には、pH改変試薬からの微生物の分離、
(vi)いずれかの分離された微生物の溶解、
(vii)試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(viii)ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および
(ix)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性の作用から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること
ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を試料に加えること、および核酸増幅を含み、かつここで高pHは少なくとも10である;
または
(b)
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション、
(ii)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離、
(iii)ペレットからの上清の除去、
(iv)高pH試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源のポリメラーゼ活性を阻害するために8分間以内でインキュベートすること、
(v)高pHでのインキュベーションを停止するために、pH低下試薬を加えること、
(vi)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離、
(vi)ペレットからの上清の除去、
(vii)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること、
(viii)試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(ix)ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および
(x)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性の作用から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を試料に加えること、および核酸増幅を含み、かつここで高pHは少なくとも10である
を含む、方法。 - 工程(a)(vi)および(a)(vii)またはb(vii)およびb(viii)が共に実施される、請求項17に記載の方法。
- 請求項1から15のいずれか一項に記載の方法であって、試料が非微生物起源のヌクレアーゼ活性を潜在的に含有し、かつ該方法が:
(i)試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション、
(ii)試料中のインタクトな微生物があれば、溶解細胞物質の分離および/または溶解細胞物質の不活性化、
(iii)分離および/または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること、
(iv)試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(v)ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および
(vi)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性の作用から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を試料に加えること、および核酸増幅を含む;
または
(a)試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離、
(b)ペレットからの上清の除去、
(c)ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること、
(d)試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
(e)ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および
(f)微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性の作用から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)を試料に加えること、および核酸増幅を含む、
を含む、方法。 - 工程(iii)および(iv)または(c)および(d)それぞれが共に実施される、請求項19に記載の方法。
- (a)微生物に対する薬剤に対する微生物の耐性についてスクリーニングする;
(b)1つ以上の微生物を死滅、または増殖を防ぐことができてもよい、候補薬剤をスクリーニングする;
(c)感染、または試料中の微生物の存在に関連する疾患を検出する;または
(d)試料を含有する血小板または血液試料における微生物汚染の存在を検出する
ための、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法の使用。 - (a)少なくとも1つの核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用し、かつポリメラーゼ活性により伸長される少なくとも1つの核酸分子、および
(b)核酸分子とIPCの両方を含有する、核酸増幅反応におけるプライマー結合に対して競合があるように、核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、少なくとも1つの内部陽性対照(IPC)核酸分子
を含む、請求項1から21のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。 - 核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに3’および/もしくは5’末端の保護から選択される、請求項22に記載のキット。
- 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項23に記載のキット。
- 核酸分子内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブをさらに含む、請求項22から24のいずれか一項に記載のキット。
- IPC核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブをさらに含む、請求項25に記載のキット。
- 核酸プローブがIPC核酸分子に結合せず、かつさらなる核酸プローブが核酸分子に結合しない、請求項26に記載のキット。
- 核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために3’末端での改変を含む、請求項22から27のいずれか一項に記載のキット。
- 3’末端での改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、請求項28に記載のキット。
- 伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)である、請求項29に記載のキット。
- IPC核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、請求項22から30のいずれか一項に記載のキット。
- IPC核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに3’および/もしくは5’末端の保護から選択される、請求項31に記載のキット。
- 合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび/またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項32に記載のキット。
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