CN113046393A - 一种重组慢病毒载体、2019-nCoV假病毒及其制备和应用 - Google Patents

一种重组慢病毒载体、2019-nCoV假病毒及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组慢病毒载体、2019‑nCoV假病毒及其制备和应用，通过对慢病毒骨架改造，剔除其元件：CMV promoter、EF1a promoter、puroR抗性基因和WPRE，并以linker序列连接组装而形成的新型病毒表达载体，其大小较原始骨架缩小约十分之三，从而可有效提高慢病毒骨架插入外源基因的容量。将其应用于假病毒的制备中，在此基础上建立的SARS‑CoV‑2假病毒，可降低其生物安全风险、提高效率的同时节省了制备时间以及人力成本；采用本发明制备得到的SARS‑CoV‑2假病毒无致病性，具有安全性好，制备效率高，纯度高，且质控方法准确可靠等特性，可长期稳定大量制备，为后续临床广泛应用提供良好基础。

Description

一种重组慢病毒载体、2019-nCoV假病毒及其制备和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种重组慢病毒载体、2019-nCoV假病毒及其制备和应用。
背景技术
由于天然的病毒存在潜在的传染危险性以及其RNA分子的不稳定性，目前应用的质控品；例如cDNA、质粒DNA、裸露的RNA以及体外转录的RNA、灭活的病毒颗粒，都难以达到试验要求，所以研制稳定的、无生物传染性的质控物和标准品，不但对RNA病毒的RT-PCR检测，而且对商品化的病毒RT-PCR试剂盒的评价都具有重要意义。
病毒样颗粒(Virus like particle，VLP)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，不含病毒核酸，不能自主复制，但可以组装成颗粒样结构，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似，具有很强的免疫原性及很好的安全性。在体外通过特殊方法将病毒样颗粒与重组质粒DNA融合，转录成的重组RNA包入病毒样颗粒内，即形成假病毒(pseudovirus)。假病毒具有模拟真病毒结构、能够抵抗核酸酶降解、稳定、安全性高等优点，给目前RNA病毒检测研究工作提供了一种强有力的工具。
利用野生型病毒株研究病毒的生物学特性及其与宿主细胞相互作用的机制是病毒学领域常用的研究方法，但前提条件是此类病毒能够在体外培养，且传染性和致病性低，对人身安全和环境不构成威胁。对于一些传染性强、致死率高，体外培养难以获得，且需在高级别生物安全实验室操作的病毒，如SARS-CoV-2(2019-nCoV)、SARS-CoV及MERS-CoV均为高致病性冠状病毒，针对这3种病毒的实验操作需要在具备相应资质的生物安全三级实验室内开展，这成为制约药物和疫苗研发的瓶颈。基于反转录病毒或HIV骨架的假病毒可在较大程度上替代真病毒进行药物筛选(限于阻止病毒侵入细胞的药物)和疫苗评价，具有较高安全性且检测方便。但影响假病毒包装效率的因素很多，包括包装骨架质粒的结构、病毒包膜蛋白的表达水平、转染前细胞的生长状态、包装质粒组合比例、质粒转染效率、细胞培养液的血清含量、假病毒上清的收集时间等多种因素。
由于新冠病毒的核酸序列约29kb～30kb，而慢病毒载体一般只能容纳不超过4kb的外源基因序列。如果要把所有的新冠病毒序列都克隆到慢病毒载体里做成假病毒，需要分成7-8个克隆，工作量特别大，且会带来一系列效率低、纯度低的缺陷。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种重组慢病毒载体。
具体技术方案如下：
一种重组病毒载体，所述重组慢病毒载体以pCDH-CMV-MCS-EF1-puro为骨架，通过剔除其元件：CMV promoter、EF1a promoter、puroR抗性基因和WPRE，并以linker序列连接组装而成。
在其中的一些实施例中，上述linker序列如SEQ ID NO.1所示；或为与SEQ IDNO.1完全互补配对的序列，或为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
本发明的目的之一还在于提供一种上述重组慢病毒载体在假病毒制备中的应用。
本发明的目的之一还在于提供一种假病毒的制备方法。
实现上述目的的技术方案如下：
(1)构建权上述重组慢病毒载体pLVmini-MCS；
(2)将病毒的核酸片段克隆至重组慢病毒载体pLVmini-MCS，获得重组表达质粒；
(3)将上述重组表达质粒、假病毒包装质粒和包膜质粒共同转染至细胞后进行假病毒颗粒的包装，获得假病毒颗粒。
在其中的一些实施例中，上述步骤(3)中的假病毒包装质粒选自pCMV-Gag-Pol、pRSV-Rev、pCMV-dR8.91、psPAX2、pMDLg/pRRE、pLP1或pNL4-3；上述假病毒包膜质粒选自pMD2.G、pCMV-VSV-G、pLPVSV-G或pVSV-G。
在其中的一些实施例中，上述病毒是SARS-CoV-2，所述SARS-CoV-2的核酸片段分别为SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9所示序列，将SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9分别通过分成两段扩增，并利用同源重组，将其克隆至重组慢病毒载体pLVmini-MCS。
本发明的目的之一还在于提供一种SARS-CoV-2假病毒。
实现上述目的的技术方案如下：
一种SARS-CoV-2假病毒，所述SARS-CoV-2假病毒为将SARS-CoV-2核酸片段克隆至上述任一项重组慢病毒载体，进行转染包装后获得。
在其中的一些实施例中，上述SARS-CoV-2核酸片段序列为SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
本发明的目的之一还在于提供一种SARS-CoV-2假病毒标准品。
实现上述目的的技术方案如下：
一种SARS-CoV-2假病毒标准品，所述SARS-CoV-2假病毒标准品为将如SEQ IDNO.4～SEQ ID NO.9所示核酸片段中的至少两个分别克隆至重组慢病毒载体pLVmini-MCS，获得重组表达质粒后共转染至293T细胞而得到。
本发明的目的之一还在于提供一种SARS-CoV-2假病毒标准品在SARS-CoV-2疫苗和/或检测试剂制备中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人通过对慢病毒骨架改造，形成新型病毒表达载体，其大小较原始骨架缩小约十分之三，从而可有效提高慢病毒骨架插入外源基因的容量。将其应用于假病毒的制备中，在此基础上建立的SARS-CoV-2假病毒，可降低其生物安全风险、提高效率的同时节省了制备时间以及人力成本；采用本发明制备得到的SARS-CoV-2假病毒无致病性，具有安全性好，制备效率高，纯度高，且质控方法准确可靠等特性，可长期稳定大量制备，为后续临床广泛应用提供良好基础。
附图说明
图1为实施例1中慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-puro的酶切产物电泳图。
图2为实施例1中linker片段的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图3为实施例1中重组慢病毒载体pLVmini-MCS构建图。
图4为实施例2中2019-coV-1-I-A、2019-coV-1-I-B和2019-coV-1-II-B片段的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图5为实施例2中2019-coV-1-II-A片段的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图6为实施例2中2019-coV-1-III-A和2019-coV-1-III-B片段的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图7为实施例2中2019-coV-1-IV-A片段的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图8为实施例2中2019-coV-1-IV-B片段的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图9为实施例2中2019-coV-1-V-A片段的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图10为实施例2中2019-coV-1-V-B片段的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图11为实施例2中2019-coV-1-VI-A片段的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图12为实施例2中2019-coV-1-VI-B片段的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图13为实施例2中重组慢病毒载体pLVmini-MCS酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图14为实施例2中显微镜100x下293T细胞转染前及SARS-CoV-2假病毒转染后的细胞状态对比图。
图15为实施例3中显微镜100x下293T细胞转染前及分别转染1μl、5μl、10μl的SARS-CoV-2假病毒并培养48h后的细胞状态对比图。
图16为实施例3中SARS-CoV-2假病毒QPCR检测程序。
图17为实施例3中QPCR检测的溶解曲线。
图18为实施例3中QPCR检测的内参标准曲线。
图19为实施例3中SARS-CoV-2假病毒QPCR检测的标准曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1重组慢病毒载体pLVmini-MCS构建
通过将慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-puro(7403bp)骨架上的BcuI和KpnI进行酶切去除慢病毒骨架上的CMV promoter、EF1a promoter、puroR抗性基因、WPRE元件，具体步骤如下：
表1-1酶切体系
Figure BDA0003033999180000051
37℃酶切1h，跑胶回收，鉴定，检测结果如图1所示。
通过设计linker序列合成组装到慢病毒骨架中的MCS区域，保留MCS区域的常用酶切位点。具体步骤如下：
linker序列(两端分别设计并添加酶切位点，EcoRI、BamHI，122bp):
actagtattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgcta ttaccatgtctagacccggggctagcgaattcgacggatccggtacc(SEQ ID NO.1)
linker引物序列:
linker-T5F:acaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtattatgcccagtacatgac(SEQ ID NO.2)
linker-T5R:acagctgccttgtaagtcattggtcttaaaggtaccggatccgtcgaattcgct(SEQID NO.3)
表1-2扩增程序
Figure BDA0003033999180000052
Figure BDA0003033999180000061
PCR产物纯化，回收，琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示。将得到的linker序列组装到慢病毒骨架中的MCS区域，具体组装步骤体系配制及程序参考试剂盒IGE-2×T5Mix，说明书P301-S3(广州艾基生物技术有限公司)。从而得到改造后的质粒pLVmini-MCS(5376bp)，其具体构建图如图3所示。
实施例2SARS-CoV-2假病毒制备
从数据库中下载SARS-CoV-2核酸序列SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.9具体序列如下，并在序列两端分别添加酶切位点(5’端EcoRI，GAATTC和3’端BamHI，GGATCC)，对应得到序列：2019-coV-1-I序列(5065bp，包含ORF1ab序列)、2019-coV-1-II序列(5143bp，包含ORF1ab序列)、2019-coV-1-III序列(5142bp，包含ORF1ab序列和mature peptide序列)、2019-coV-1-IV序列(5141bp，包含mature peptide序列)、2019-coV-1-V序列(5040bp，序列包含S protein序列)和2019-coV-1-VI序列(4302bp，序列包含E、M、Nprotein序列)。
其中，2019-coV-1-I分成I-A(2560bp)、I-B(2601bp)两段扩增；2019-coV-1-II分成II-A(2610bp)、II-B(2703bp)两段扩增；2019-coV-1-III分成III-A(2652bp)、III-B(2670bp)两段扩增；2019-coV-1-IV分成IV-A(2650bp)、IV-B(2681bp)两段扩增；2019-coV-1-V分成V-A(1250bp)、V-B(4099bp)两段扩增；2019-coV-1-VI分成VI-A(1110bp)、VI-B(3389bp)两段扩增。
其中引物序列如下表2-1所示：
表2-1
Figure BDA0003033999180000062
Figure BDA0003033999180000071
上述6个2019-coV基因的各自A、B两段扩增程序分别参考如下：
表2-2
Figure BDA0003033999180000081
表2-3
Figure BDA0003033999180000082
PCR产物纯化，琼脂糖凝胶电泳检测，2019-coV-1-I-A、2019-coV-1-I-B和2019-coV-1-II-B片段的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示；2019-coV-1-II-A片段的琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示；2019-coV-1-III-A和2019-coV-1-III-B片段的琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示；2019-coV-1-IV-A、2019-coV-1-IV-B、2019-coV-1-V-A、2019-coV-1-V-B、2019-coV-1-VI-A、2019-coV-1-VI-B片段的琼脂糖凝胶电泳结果如图7-12所示。
将本发明改造的慢病毒载体pLVmini-MCS按照下表体系酶切：
表2-4载体酶切
Figure BDA0003033999180000083
37℃酶切1h，跑胶回收，鉴定，胶图如图6所示。
连接
通过引物的设计使2019-nCoV的基因序列A、基因序列B以及线性化的载体质粒两端具有至少50bp的overlap片段区域，以慢病毒表达载体质粒pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-V制备为例，按以下表2-5所示体系加入各组分，50℃连接30min。
表2-5
Figure BDA0003033999180000091
将同源重组反应后的混合液加入到感受态细胞中进行转化；于氨苄青霉素抗性的细菌培养平板上筛选单克隆；于含有氨苄青霉素抗性的2xYT培养基中扩大培养单克隆，扩增pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-V质粒；
单克隆进行质粒提取后在琼脂糖凝胶电泳上验证pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-V构建成功。并将克隆提取质粒在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证，得到慢病毒表达载体质粒pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-V。
按照上述方法建立关于新冠病毒另5个片段的慢病毒表达质粒，分别得到pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-I、pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-II、pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-III、pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-IV、pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-VI。
将上述6个去内毒质粒及辅助质粒共转染293T细胞，其中具体质量比为慢病毒表达质粒用量(pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-I、pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-II、pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-III、pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-IV和pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-VI)：PsPAX：PMD2G＝10：9：6，72h后观察到正常细胞中产生病变细胞，其中病变细胞膨大、变圆、变亮，与常规死亡细胞相比，存在明显差异，易于区分，具体如图7所示。
实施例3SARS-CoV-2假病毒性能验证
将SARS-CoV-2假病毒表达质粒pLVmini-MCS-2019-nCoV-1-V及空载体分别转染293T细胞，48小时后收集细胞样本并进行病毒浓缩纯化，具体步骤如下；
1)转染293T细胞48小时后，收集含有病毒的培养液(约30mL)至50mL离心管中；
2)4℃、3000rpm离心15分钟，低速离心病毒上清，去除细胞碎片，回收上清；
3)将48小时收集的病毒上清液用0.45μm的滤器过滤至50mL离心管；
4)加入6ml 50％的PEG浓缩液。充分均匀混合液，静置放置于4℃沉淀过夜；
5)次日4℃、1500×g离心30分钟后倒掉上清，再进行4℃、1500×g离心4分钟；
6)用移液枪吸除多余上清，然后用0.5mL HBSS溶解病毒沉淀，用200μL枪头缓慢而充分地吹打沉淀至形成单个病毒悬液；
7)按照每管200μL病毒液分装到0.5mL冻存管中。
分别使用上述1μl、5μl、10μl的浓缩纯化后的慢病毒转染293T细胞，48h后观察细胞的转染情况，结果如图8所示。
分别提取上述转染病毒的293T细胞的RNA，通过Q-PCR的方法(检测慢病毒载体ITR保守区及细胞DNA上的内参基因，确定慢病毒的拷贝数)进行滴度检测，确定病毒的转染效果，具体步骤如下：
1、DNaseI处理样品：
1)在每含有0.5μg模板DNA的反转录反应体系中加入1U DNase I，或1mL浓缩病毒液加入25-35ul DNase I处理。
2)37℃孵育20-30min。
2、样品的Q-PCR检测：
qPCR具体引物
病毒基因
U5-F：ACAGATGCGTAAGGAGAAAATACC(SEQ ID NO.34)
U5-R：TTGTCTACAGCCTTCTGATGTTTC(SEQ ID NO.35)
内参基因
ALB-F：ATGCTGAGGCAAAGGATGTC(SEQ ID NO.36)
ALB-R：TTGGCTTTACACCAACGAAA(SEQ ID NO.37)
表3-1反应体系
Figure BDA0003033999180000101
反应程序如图9所示，检测溶解曲线如图10所示，图中分别仅有内参和SARS-CoV-2假病毒基因两个主峰，无其他杂峰出现；同时得到内参的标准曲线和SARS-CoV-2假病毒基因的标准曲线分别如图11、12所示，通过两个标曲分别获得样品内参基因和病毒基因的拷贝数，然后根据下列公式计算换算确定样品的病毒滴度。具体各组样品的检测滴度结果如下表3-2所示：
表3-2
Figure BDA0003033999180000111
Figure BDA0003033999180000112
Figure BDA0003033999180000113
通过上述样品滴度检测结果可知，由于本发明采用的空载体较小，出毒量大，因此通过本发明制备得到的SARS-CoV-2假病毒滴度可达到9次方。采用本发明重组慢病毒载体并通过实施例2所述假病毒的制备方法所制备得到的SARS-CoV-2假病毒，其制备效率及纯度均得到有效保障。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州金泰生物科技有限公司
广州艾基生物技术有限公司
<120> 一种重组慢病毒载体、2019-nCoV假病毒及其制备和应用
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 122
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
actagtatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 60
tattagtcat cgctattacc atgtctagac ccggggctag cgaattcgac ggatccggta 120
cc 122
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acaaattaca aaattcaaaa ttttatcgat actagtatta tgcccagtac atgac 55
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acagctgcct tgtaagtcat tggtcttaaa ggtaccggat ccgtcgaatt cgct 54
<210> 4
<211> 5053
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atggagagcc ttgtccctgg tttcaacgag aaaacacacg tccaactcag tttgcctgtt 60
ttacaggttc gcgacgtgct cgtacgtggc tttggagact ccgtggagga ggtcttatca 120
gaggcacgtc aacatcttaa agatggcact tgtggcttag tagaagttga aaaaggcgtt 180
ttgcctcaac ttgaacagcc ctatgtgttc atcaaacgtt cggatgctcg aactgcacct 240
catggtcatg ttatggttga gctggtagca gaactcgaag gcattcagta cggtcgtagt 300
ggtgagacac ttggtgtcct tgtccctcat gtgggcgaaa taccagtggc ttaccgcaag 360
gttcttcttc gtaagaacgg taataaagga gctggtggcc atagttacgg cgccgatcta 420
aagtcatttg acttaggcga cgagcttggc actgatcctt atgaagattt tcaagaaaac 480
tggaacacta aacatagcag tggtgttacc cgtgaactca tgcgtgagct taacggaggg 540
gcatacactc gctatgtcga taacaacttc tgtggccctg atggctaccc tcttgagtgc 600
attaaagacc ttctagcacg tgctggtaaa gcttcatgca ctttgtccga acaactggac 660
tttattgaca ctaagagggg tgtatactgc tgccgtgaac atgagcatga aattgcttgg 720
tacacggaac gttctgaaaa gagctatgaa ttgcagacac cttttgaaat taaattggca 780
aagaaatttg acaccttcaa tggggaatgt ccaaattttg tatttccctt aaattccata 840
atcaagacta ttcaaccaag ggttgaaaag aaaaagcttg atggctttat gggtagaatt 900
cgatctgtct atccagttgc gtcaccaaat gaatgcaacc aaatgtgcct ttcaactctc 960
atgaagtgtg atcattgtgg tgaaacttca tggcagacgg gcgattttgt taaagccact 1020
tgcgaatttt gtggcactga gaatttgact aaagaaggtg ccactacttg tggttactta 1080
ccccaaaatg ctgttgttaa aatttattgt ccagcatgtc acaattcaga agtaggacct 1140
gagcatagtc ttgccgaata ccataatgaa tctggcttga aaaccattct tcgtaagggt 1200
ggtcgcacta ttgcctttgg aggctgtgtg ttctcttatg ttggttgcca taacaagtgt 1260
gcctattggg ttccacgtgc tagcgctaac ataggttgta accatacagg tgttgttgga 1320
gaaggttccg aaggtcttaa tgacaacctt cttgaaatac tccaaaaaga gaaagtcaac 1380
atcaatattg ttggtgactt taaacttaat gaagagatcg ccattatttt ggcatctttt 1440
tctgcttcca caagtgcttt tgtggaaact gtgaaaggtt tggattataa agcattcaaa 1500
caaattgttg aatcctgtgg taattttaaa gttacaaaag gaaaagctaa aaaaggtgcc 1560
tggaatattg gtgaacagaa atcaatactg agtcctcttt atgcatttgc atcagaggct 1620
gctcgtgttg tacgatcaat tttctcccgc actcttgaaa ctgctcaaaa ttctgtgcgt 1680
gttttacaga aggccgctat aacaatacta gatggaattt cacagtattc actgagactc 1740
attgatgcta tgatgttcac atctgatttg gctactaaca atctagttgt aatggcctac 1800
attacaggtg gtgttgttca gttgacttcg cagtggctaa ctaacatctt tggcactgtt 1860
tatgaaaaac tcaaacccgt ccttgattgg cttgaagaga agtttaagga aggtgtagag 1920
tttcttagag acggttggga aattgttaaa tttatctcaa cctgtgcttg tgaaattgtc 1980
ggtggacaaa ttgtcacctg tgcaaaggaa attaaggaga gtgttcagac attctttaag 2040
cttgtaaata aatttttggc tttgtgtgct gactctatca ttattggtgg agctaaactt 2100
aaagccttga atttaggtga aacatttgtc acgcactcaa agggattgta cagaaagtgt 2160
gttaaatcca gagaagaaac tggcctactc atgcctctaa aagccccaaa agaaattatc 2220
ttcttagagg gagaaacact tcccacagaa gtgttaacag aggaagttgt cttgaaaact 2280
ggtgatttac aaccattaga acaacctact agtgaagctg ttgaagctcc attggttggt 2340
acaccagttt gtattaacgg gcttatgttg ctcgaaatca aagacacaga aaagtactgt 2400
gcccttgcac ctaatatgat ggtaacaaac aataccttca cactcaaagg cggtgcacca 2460
acaaaggtta cttttggtga tgacactgtg atagaagtgc aaggttacaa gagtgtgaat 2520
atcacttttg aacttgatga aaggattgat aaagtactta atgagaagtg ctctgcctat 2580
acagttgaac tcggtacaga agtaaatgag ttcgcctgtg ttgtggcaga tgctgtcata 2640
aaaactttgc aaccagtatc tgaattactt acaccactgg gcattgattt agatgagtgg 2700
agtatggcta catactactt atttgatgag tctggtgagt ttaaattggc ttcacatatg 2760
tattgttctt tctaccctcc agatgaggat gaagaagaag gtgattgtga agaagaagag 2820
tttgagccat caactcaata tgagtatggt actgaagatg attaccaagg taaacctttg 2880
gaatttggtg ccacttctgc tgctcttcaa cctgaagaag agcaagaaga agattggtta 2940
gatgatgata gtcaacaaac tgttggtcaa caagacggca gtgaggacaa tcagacaact 3000
actattcaaa caattgttga ggttcaacct caattagaga tggaacttac accagttgtt 3060
cagactattg aagtgaatag ttttagtggt tatttaaaac ttactgacaa tgtatacatt 3120
aaaaatgcag acattgtgga agaagctaaa aaggtaaaac caacagtggt tgttaatgca 3180
gccaatgttt accttaaaca tggaggaggt gttgcaggag ccttaaataa ggctactaac 3240
aatgccatgc aagttgaatc tgatgattac atagctacta atggaccact taaagtgggt 3300
ggtagttgtg ttttaagcgg acacaatctt gctaaacact gtcttcatgt tgtcggccca 3360
aatgttaaca aaggtgaaga cattcaactt cttaagagtg cttatgaaaa ttttaatcag 3420
cacgaagttc tacttgcacc attattatca gctggtattt ttggtgctga ccctatacat 3480
tctttaagag tttgtgtaga tactgttcgc acaaatgtct acttagctgt ctttgataaa 3540
aatctctatg acaaacttgt ttcaagcttt ttggaaatga agagtgaaaa gcaagttgaa 3600
caaaagatcg ctgagattcc taaagaggaa gttaagccat ttataactga aagtaaacct 3660
tcagttgaac agagaaaaca agatgataag aaaatcaaag cttgtgttga agaagttaca 3720
acaactctgg aagaaactaa gttcctcaca gaaaacttgt tactttatat tgacattaat 3780
ggcaatcttc atccagattc tgccactctt gttagtgaca ttgacatcac tttcttaaag 3840
aaagatgctc catatatagt gggtgatgtt gttcaagagg gtgttttaac tgctgtggtt 3900
atacctacta aaaaggctgg tggcactact gaaatgctag cgaaagcttt gagaaaagtg 3960
ccaacagaca attatataac cacttacccg ggtcagggtt taaatggtta cactgtagag 4020
gaggcaaaga cagtgcttaa aaagtgtaaa agtgcctttt acattctacc atctattatc 4080
tctaatgaga agcaagaaat tcttggaact gtttcttgga atttgcgaga aatgcttgca 4140
catgcagaag aaacacgcaa attaatgcct gtctgtgtgg aaactaaagc catagtttca 4200
actatacagc gtaaatataa gggtattaaa atacaagagg gtgtggttga ttatggtgct 4260
agattttact tttacaccag taaaacaact gtagcgtcac ttatcaacac acttaacgat 4320
ctaaatgaaa ctcttgttac aatgccactt ggctatgtaa cacatggctt aaatttggaa 4380
gaagctgctc ggtatatgag atctctcaaa gtgccagcta cagtttctgt ttcttcacct 4440
gatgctgtta cagcgtataa tggttatctt acttcttctt ctaaaacacc tgaagaacat 4500
tttattgaaa ccatctcact tgctggttcc tataaagatt ggtcctattc tggacaatct 4560
acacaactag gtatagaatt tcttaagaga ggtgataaaa gtgtatatta cactagtaat 4620
cctaccacat tccacctaga tggtgaagtt atcacctttg acaatcttaa gacacttctt 4680
tctttgagag aagtgaggac tattaaggtg tttacaacag tagacaacat taacctccac 4740
acgcaagttg tggacatgtc aatgacatat ggacaacagt ttggtccaac ttatttggat 4800
ggagctgatg ttactaaaat aaaacctcat aattcacatg aaggtaaaac attttatgtt 4860
ttacctaatg atgacactct acgtgttgag gcttttgagt actaccacac aactgatcct 4920
agttttctgg gtaggtacat gtcagcatta aatcacacta aaaagtggaa atacccacaa 4980
gttaatggtt taacttctat taaatgggca gataacaact gttatcttgc cactgcattg 5040
ttaacactcc aac 5053
<210> 5
<211> 5131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aatggtttaa cttctattaa atgggcagat aacaactgtt atcttgccac tgcattgtta 60
acactccaac aaatagagtt gaagtttaat ccacctgctc tacaagatgc ttattacaga 120
gcaagggctg gtgaagctgc taacttttgt gcacttatct tagcctactg taataagaca 180
gtaggtgagt taggtgatgt tagagaaaca atgagttact tgtttcaaca tgccaattta 240
gattcttgca aaagagtctt gaacgtggtg tgtaaaactt gtggacaaca gcagacaacc 300
cttaagggtg tagaagctgt tatgtacatg ggcacacttt cttatgaaca atttaagaaa 360
ggtgttcaga taccttgtac gtgtggtaaa caagctacaa aatatctagt acaacaggag 420
tcaccttttg ttatgatgtc agcaccacct gctcagtatg aacttaagca tggtacattt 480
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tactgtactg gttacagaga aggctatttg aactctacta atgtcactat tgcaacctac 1860
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tcttggctta tgtggttaat aattaatctt gtacaaatgg ccccgatttc agctatggtt 2160
agaatgtaca tcttctttgc atcattttat tatgtatgga aaagttatgt gcatgttgta 2220
gacggttgta attcatcaac ttgtatgatg tgttacaaac gtaatagagc aacaagagtc 2280
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aatcctactg accagtcttc ttacatcgtt gatagtgtta cagtgaagaa tggttccatc 2520
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gatagtgcgg aagttgcagt taaaatgttt gatgcttacg ttaatacgtt ttcatcaact 2820
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aacatgacac cccgtgacct tggtgcttgt attgactgta gtgcgcgtca tattaatgcg 3120
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ggtggtaaaa ttgttaataa ttggttgaag cagttaatta aagttacact tgtgttcctt 3360
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ttttcaagtg aaatcatagg atacaaggct attgatggtg gtgtcactcg tgacatagca 3480
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ggtggtagtt atactaatga caaagcttgc ccattgattg ctgcagtcat aacaagagaa 3600
gtgggttttg tcgtgcctgg tttgcctggc acgatattac gcacaactaa tggtgacttt 3660
ttgcatttct tacctagagt ttttagtgca gttggtaaca tctgttacac accatcaaaa 3720
cttatagagt acactgactt tgcaacatca gcttgtgttt tggctgctga atgtacaatt 3780
tttaaagatg cttctggtaa gccagtacca tattgttatg ataccaatgt actagaaggt 3840
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gagtactgta ggcacggcac ttgtgaaaga tcagaagctg gtgtttgtgt atctactagt 4020
ggtagatggg tacttaacaa tgattattac agatctttac caggagtttt ctgtggtgta 4080
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attcaaccag gacagacttt ttcagtgtta gcttgttaca atggttcacc atctggtgtt 120
taccaatgtg ctatgaggcc caatttcact attaagggtt cattccttaa tggttcatgt 180
ggtagtgttg gttttaacat agattatgac tgtgtctctt tttgttacat gcaccatatg 240
gaattaccaa ctggagttca tgctggcaca gacttagaag gtaactttta tggacctttt 300
gttgacaggc aaacagcaca agcagctggt acggacacaa ctattacagt taatgtttta 360
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gcttcattaa aagaattact gcaaaatggt atgaatggac gtaccatatt gggtagtgct 600
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gttgtctcaa gggctgttgt tcttgtggat cctgctgcaa atttgatgaa gacgactctg 4920
agccagtgct caaaggagtc aaattacatt acacataaac gaacttatgg atttgtttat 4980
gagaatcttc acaattggaa ctgtaacttt gaagcaaggt gaaatcaa 5028
<210> 9
<211> 4290
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
acgaacttat ggatttgttt atgagaatct tcacaattgg aactgtaact ttgaagcaag 60
gtgaaatcaa ggatgctact ccttcagatt ttgttcgcgc tactgcaacg ataccgatac 120
aagcctcact ccctttcgga tggcttattg ttggcgttgc acttcttgct gtttttcaga 180
gcgcttccaa aatcataacc ctcaaaaaga gatggcaact agcactctcc aagggtgttc 240
actttgtttg caacttgctg ttgttgtttg taacagttta ctcacacctt ttgctcgttg 300
ctgctggcct tgaagcccct tttctctatc tttatgcttt agtctacttc ttgcagagta 360
taaactttgt aagaataata atgaggcttt ggctttgctg gaaatgccgt tccaaaaacc 420
cattacttta tgatgccaac tattttcttt gctggcatac taattgttac gactattgta 480
taccttacaa tagtgtaact tcttcaattg tcattacttc aggtgatggc acaacaagtc 540
ctatttctga acatgactac cagattggtg gttatactga aaaatgggaa tctggagtaa 600
aagactgtgt tgtattacac agttacttca cttcagacta ttaccagctg tactcaactc 660
aattgagtac agacactggt gttgaacatg ttaccttctt catctacaat aaaattgttg 720
atgagcctga agaacatgtc caaattcaca caatcgacgg ttcatccgga gttgttaatc 780
cagtaatgga accaatttat gatgaaccga cgacgactac tagcgtgcct ttgtaagcac 840
aagctgatga gtacgaactt atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag 900
ttaatagcgt acttcttttt cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc 960
ttactgcgct tcgattgtgt gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac 1020
cttcttttta cgtttactct cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc 1080
tggtctaaac gaactaaata ttatattagt ttttctgttt ggaactttaa ttttagccat 1140
ggcagattcc aacggtacta ttaccgttga agagcttaaa aagctccttg aacaatggaa 1200
cctagtaata ggtttcctat tccttacatg gatttgtctt ctacaatttg cctatgccaa 1260
caggaatagg tttttgtata taattaagtt aattttcctc tggctgttat ggccagtaac 1320
tttagcttgt tttgtgcttg ctgctgttta cagaataaat tggatcaccg gtggaattgc 1380
tatcgcaatg gcttgtcttg taggcttgat gtggctcagc tacttcattg cttctttcag 1440
actgtttgcg cgtacgcgtt ccatgtggtc attcaatcca gaaactaaca ttcttctcaa 1500
cgtgccactc catggcacta ttctgaccag accgcttcta gaaagtgaac tcgtaatcgg 1560
agctgtgatc cttcgtggac atcttcgtat tgctggacac catctaggac gctgtgacat 1620
caaggacctg cctaaagaaa tcactgttgc tacatcacga acgctttctt attacaaatt 1680
gggagcttcg cagcgtgtag caggtgactc aggttttgct gcatacagtc gctacaggat 1740
tggcaactat aaattaaaca cagaccattc cagtagcagt gacaatattg ctttgcttgt 1800
acagtaagtg acaacagatg tttcatctcg ttgactttca ggttactata gcagagatat 1860
tactaattat tatgaggact tttaaagttt ccatttggaa tcttgattac atcataaacc 1920
tcataattaa aaatttatct aagtcactaa ctgagaataa atattctcaa ttagatgaag 1980
agcaaccaat ggagattgat taaacgaaca tgaaaattat tcttttcttg gcactgataa 2040
cactcgctac ttgtgagctt tatcactacc aagagtgtgt tagaggtaca acagtacttt 2100
taaaagaacc ttgctcttct ggaacatacg agggcaattc accatttcat cctctagctg 2160
ataacaaatt tgcactgact tgctttagca ctcaatttgc ttttgcttgt cctgacggcg 2220
taaaacacgt ctatcagtta cgtgccagat cagtttcacc taaactgttc atcagacaag 2280
aggaagttca agaactttac tctccaattt ttcttattgt tgcggcaata gtgtttataa 2340
cactttgctt cacactcaaa agaaagacag aatgattgaa ctttcattaa ttgacttcta 2400
tttgtgcttt ttagcctttc tgctattcct tgttttaatt atgcttatta tcttttggtt 2460
ctcacttgaa ctgcaagatc ataatgaaac ttgtcacgcc taaacgaaca tgaaatttct 2520
tgttttctta ggaatcatca caactgtagc tgcatttcac caagaatgta gtttacagtc 2580
atgtactcaa catcaaccat atgtagttga tgacccgtgt cctattcact tctattctaa 2640
atggtatatt agagtaggag ctagaaaatc agcaccttta attgaattgt gcgtggatga 2700
ggctggttct aaatcaccca ttcagtacat cgatatcggt aattatacag tttcctgttt 2760
accttttaca attaattgcc aggaacctaa attgggtagt cttgtagtgc gttgttcgtt 2820
ctatgaagac tttttagagt atcatgacgt tcgtgttgtt ttagatttca tctaaacgaa 2880
caaactaaaa tgtctgataa tggaccccaa aatcagcgaa atgcaccccg cattacgttt 2940
ggtggaccct cagattcaac tggcagtaac cagaatggag aacgcagtgg ggcgcgatca 3000
aaacaacgtc ggccccaagg tttacccaat aatactgcgt cttggttcac cgctctcact 3060
caacatggca aggaagacct taaattccct cgaggacaag gcgttccaat taacaccaat 3120
agcagtccag atgaccaaat tggctactac cgaagagcta ccagacgaat tcgtggtggt 3180
gacggtaaaa tgaaagatct cagtccaaga tggtatttct actacctagg aactgggcca 3240
gaagctggac ttccctatgg tgctaacaaa gacggcatca tatgggttgc aactgaggga 3300
gccttgaata caccaaaaga tcacattggc acccgcaatc ctgctaacaa tgctgcaatc 3360
gtgctacaac ttcctcaagg aacaacattg ccaaaaggct tctacgcaga agggagcaga 3420
ggcggcagtc aagcctcttc tcgttcctca tcacgtagtc gcaacagttc aagaaattca 3480
actccaggca gcagtagggg aacttctcct gctagaatgg ctggcaatgg cggtgatgct 3540
gctcttgctt tgctgctgct tgacagattg aaccagcttg agagcaaaat gtctggtaaa 3600
ggccaacaac aacaaggcca aactgtcact aagaaatctg ctgctgaggc ttctaagaag 3660
cctcggcaaa aacgtactgc cactaaagca tacaatgtaa cacaagcttt cggcagacgt 3720
ggtccagaac aaacccaagg aaattttggg gaccaggaac taatcagaca aggaactgat 3780
tacaaacatt ggccgcaaat tgcacaattt gcccccagcg cttcagcgtt cttcggaatg 3840
tcgcgcattg gcatggaagt cacaccttcg ggaacgtggt tgacctacac aggtgccatc 3900
aaattggatg acaaagatcc aaatttcaaa gatcaagtca ttttgctgaa taagcatatt 3960
gacgcataca aaacattccc accaacagag cctaaaaagg acaaaaagaa gaaggctgat 4020
gaaactcaag ccttaccgca gagacagaag aaacagcaaa ctgtgactct tcttcctgct 4080
gcagatttgg atgatttctc caaacaattg caacaatcca tgagcagtgc tgactcaact 4140
caggcctaaa ctcatgcaga ccacacaagg cagatgggct atataaacgt tttcgctttt 4200
ccgtttacga tatatagtct actcttgtgc agaatgaatt ctcgtaacta catagcacaa 4260
gtagatgtag ttaactttaa tctcacatag 4290
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gctattacca tgtctagacc cggggctagc gaattcatgg agagccttg 49
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tcaagttcaa aagtgatatt cacactcttg taaccttgca cttctatc 48
<210> 12
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
caagagtgtg aatatcactt ttgaacttga tgaaaggatt gataaag 47
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gccttgtaag tcattggtct taaaggtacc ggatccgttg gagtgttaac 50
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gctattacca tgtctagacc cggggctagc gaattcaatg gtttaacttc 50
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ttgtctaagt taacaaaatg agagagagaa tgtctttcat aagtcttttg 50
<210> 16
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ttctctctct cattttgtta acttagacaa cctgagagct aataacac 48
<210> 17
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gccttgtaag tcattggtct taaaggtacc ggatccctgg ttgaatgcg 49
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gctattacca tgtctagacc cggggctagc gaattcgtac ttaagc 46
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ttaggtgtgt ctgtaacaaa cctacaaggt ggttccagtt ctgtatag 48
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
accttgtagg tttgttacag acacacctaa aggtcctaaa gtgaag 46
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gccttgtaag tcattggtct taaaggtacc ggatccccat ttcactc 47
<210> 22
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
gctattacca tgtctagacc cggggctagc gaattccaac gtgttgtag 49
<210> 23
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
gtcataaagg tctctatcag acattatgca aagtatgcct acttttgc 48
<210> 24
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
tgcataatgt ctgatagaga cctttatgac aagttgcaat ttacaagtc 49
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
gccttgtaag tcattggtct taaaggtacc ggatccacac acacacttag 50
<210> 26
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
gctattacca tgtctagacc cggggctagc gaattctcct atggacag 48
<210> 27
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
agtgtatgca gggggtaatt gagttctggt tgtaagatta acacactg 48
<210> 28
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
accagaactc aattaccccc tgcatacact aattctttca cacgtggtg 49
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
gccttgtaag tcattggtct taaaggtacc ggatccttga tttcaccttg 50
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
gctattacca tgtctagacc cggggctagc gaattcacga ac 42
<210> 31
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
atcaggaact ctagaagaat tcagattttt aacacgagag taaacg 46
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
aaaaatctga attcttctag agttcctgat cttctggtct aaac 44
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
gccttgtaag tcattggtct taaaggtacc ggatccctat gtgag 45
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
acagatgcgt aaggagaaaa tacc 24
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
ttgtctacag ccttctgatg tttc 24
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
atgctgaggc aaaggatgtc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
ttggctttac accaacgaaa 20

Claims (10)

1.一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体以pCDH-CMV-MCS-EF1-puro为骨架，通过剔除其元件：CMV promoter、EF1a promoter、puroR抗性基因和WPRE，并以linker序列连接组装而成。
2.根据权利要求1所述重组慢病毒载体，其特征在于，所述linker序列如SEQ ID NO.1所示；或为与SEQ ID NO.1完全互补配对的序列，或为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
3.权利要求1-2任一项重组慢病毒载体在假病毒制备中的应用。
4.一种假病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建权利要求1-2任一项所述重组慢病毒载体pLVmini-MCS；
(2)将病毒核酸片段克隆至重组慢病毒载体pLVmini-MCS，获得重组表达质粒；
(3)将上述重组表达质粒、假病毒包装质粒和包膜质粒共同转染至细胞后进行假病毒颗粒的包装，获得假病毒颗粒。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述假病毒包装质粒选自pCMV-Gag-Pol、pRSV-Rev、pCMV-dR8.91、psPAX2、pMDLg/pRRE、pLP1或pNL4-3；所述假病毒包膜质粒选自pMD2.G、pCMV-VSV-G、pLPVSV-G或pVSV-G。
6.根据权利要求4所述假病毒的制备方法，其特征在于，所述病毒是SARS-CoV-2，所述SARS-CoV-2的核酸片段为SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9所示序列，将SEQ ID NO.4～SEQ IDNO.9分别通过分成两段扩增，并利用同源重组，将其克隆至重组慢病毒载体pLVmini-MCS。
7.一种SARS-CoV-2假病毒，其特征在于，所述SARS-CoV-2假病毒为将SARS-CoV-2核酸片段克隆至权利要求1-2任一项重组慢病毒载体，进行转染包装后获得。
8.根据权利要求7所述SARS-CoV-2假病毒，其特征在于，所述SARS-CoV-2核酸片段序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。
9.一种SARS-CoV-2假病毒标准品，其特征在于，所述SARS-CoV-2假病毒标准品为将核酸片段SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9分别克隆至重组慢病毒载体pLVmini-MCS，获得重组表达质粒后共转染至293T细胞而得到。
10.权利要求9所述SARS-CoV-2假病毒标准品在SARS-CoV-2疫苗和/或检测试剂制备中的应用。
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