CN111471717A - 一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法 - Google Patents

一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，涉及生物技术领域。本发明包括利用非整合慢病毒载体系统，制备包括且不限于2019新型冠状病毒核酸序列，用于核酸检测的标准质控品的方法，用于核酸检测的标准质控品制备，通过对慢病毒辅助质粒的整合酶的64位氨基酸Asp突变成Asn，262位‑264位氨基酸Arg,Arg，Lys突变成Ala，Ala，His，构建非整合的慢病毒的方法，通过去除慢病毒的启动子等元件的方式提升病毒载体载入量，构建一种可以用于核酸检测全流程质控的假病毒，可以用于冠状病毒的假病毒构建，也可以用于SARS‑COV、MERS‑COV、流感病毒等假病毒的构建。

Description

一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法。
背景技术
2019新型冠状病毒(2019-NCOV)已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。冠状病毒直径约80～120NM，基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有POLY(A)尾，基因组全长约27～32KB，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。
2019新冠病毒疫情爆发，疾病的最终确诊需要通过实验室的核酸检测，而实际核酸检测实验的过程比较复杂，包括病人样本的采集、病毒核酸提取、RNA反转CDNA和QPCR检测等实验环节。由于冠状病毒是烈性传染病所以整个实验中缺乏一个病毒作为全流程的阳性质控样本。以至核酸检测中常出现假阳性/假阴性问题。
慢病毒载体制备系统包括由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达GAG和POL蛋白，另一个质粒表达ENV蛋白。载体质粒与包装质粒互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
因此，利用慢病毒包装系统，构建一种可以用于核酸检测全流程质控的假病毒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，通过对慢病毒辅助质粒的整合酶的64位氨基酸Asp突变成Asn，262位-264位氨基酸Arg，Arg，Lys突变成Ala，Ala，His，构建非整合的慢病毒，通过去除慢病毒的启动子等元件的方式提升病毒载体载入量，用于假病毒的构建，假病毒用于核酸检测全流程质控。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明为一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，包括如下步骤：
步骤SS01：构建剔除慢病毒表达载体的非必须元件的假病毒载体；
步骤S011：将慢病毒载体在37℃水浴条件下酶切2小时；
步骤S012：琼脂糖凝胶电泳及胶回收目的产物：用1％琼脂糖，120V恒压电泳30～40分钟，在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的离心管中用于胶回收纯化；
步骤SS02：将2019新冠状病毒的部分基因组克隆至假病毒载体；
步骤S021：通过全基因合成的方式获得2019新冠状病毒的部分序列，合成至PUC57载体，记为PUC57-ORF 1a/bEN；合成序5’端含有PAC I酶切位点，3’端含有Nhe I酶切位点；
步骤S022：将合成完毕的ORF1 A/B，E基因和N基因通过酶切的方式获得待插入慢病毒载体的片段；
步骤S023：琼脂糖凝胶电泳及胶回收目的产物：用1％琼脂糖，120V恒压电泳30～40分钟，在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的离心管中用于胶回收纯化；
步骤S024：将回收的载体产物和酶切胶回产物连接；
步骤S025：连接产物转化；
步骤SS03：慢病毒包装辅助质粒的整合酶基因进行突变，使慢病毒的整合能力降低或丧失整合性；
步骤SS04：在293T细胞中进行假病毒的包装，获得假病毒颗粒；
步骤SS05：对制备假病毒的产毒量和整合效率检测。
进一步地，所述步骤S025中连接产物转化的方法为：
步骤S0251：取50μl感受态细胞放在冰上融化，取5μl连接产物和感受态细胞混匀；
步骤S0252：冰浴30分钟，42℃水浴热激90秒，继续冰浴2分钟；
步骤S0253：在混合物中加入1mL无抗性SOB液体培养基，摇床37℃，在250rpm/min下摇菌1小时；
步骤S0254：摇菌结束后，在4000rpm下离心2分钟；
步骤S0255：去除部分上清后留200μl混匀沉淀，涂于LB培养平板上，将板倒扣，在37℃细菌培养箱中培养12～16小时，得重组质粒。
进一步地，所述步骤SS03中进行突变的方法为：
步骤SS031：设计突变引物；
步骤SS032：使用点突变试剂盒进行点突变实验；
步骤SS033：反应产物转化、涂板、克隆鉴定。
进一步地，所述步骤SS031中设计的突变引物为：
以慢病毒包装辅助质粒psPAX2为模板进行点突变，先进行64位氨基酸的碱基突变，将64位氨基酸Asp突变成Asn；
再进行262位-264位氨基酸的突变，将262位-264位氨基酸Arg，Arg，Lys突变成Ala，Ala，His。
进一步地，所述步骤SS033中反应产物转化、涂板、克隆鉴定的方法为：
步骤SS0331：取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，混匀，在冰上放置30分钟；
步骤SS0332：42℃热激90秒，再冰水浴孵育2分钟；
步骤SS0333：加入900μl SOB培养基，37℃孵育10分钟充分复苏；
步骤SS0334：37℃摇菌45分钟，取100μl菌液均匀涂布在含有抗生素的平板上；
步骤SS0335：将平板倒置，于37℃中培养12～16小时，挑取克隆测序鉴定，正取质粒进行质粒扩增。
进一步地，所述步骤SS04中在293T细胞中进行假病毒包装的方法为：步骤SS041：转染前，显微镜下观察293T细胞的状态，确定细胞状态良好、密度达90％，无污染；
步骤SS042：每盘细胞更换10ml含2％FBS的DMEM培养基；
步骤SS043：配制转染体系：转染试剂1X PEI 30μl/盘，混合加入到含500μl OMEM的EP管中，室温静置15min；
步骤SS044：将转染体系分别滴加至细胞培养皿中，保持培养皿水平，晃动培养皿，使得转染复合物均匀分布于细胞表面；
步骤SS045：转染8小时后，每盘细胞更换10ml含2％FBS的DMEM培养基；
步骤SS046：转染48小时后，收集细胞上清液，该上清液中含对应的假病毒颗粒。
进一步地，制备的假病毒的核酸序列，应用于核酸检测的标准质控品的制备，核酸序列包括ORF 1，E基因和N基因，序列包括S基因、E基因、M基因。
进一步地，制备冠状病毒核酸序列在核酸检测的标准质控品的方法中的应用，应用于核酸检测全流程质控。
进一步地，所述步骤S011中进行酶切的酶切体系总体积为20μl，具体包括：
慢病毒载体：5μl；
PACI：1μl；
NHE I：1μl；
NEB 10X BUFFER：2μl；
DDH2O：11μl。
进一步地，所述步骤S022中进行酶切的条件为：37℃水浴下酶切2小时，酶切体系的总体积为20μl，具体包括：
PUC57-ORF 1a/bEN：5μl；
PACI：1μl；
NHE I：1μl；
NEB 10X BUFFER：2μl；
DDH2O：11μl。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过对慢病毒辅助质粒的整合酶的64位氨基酸Asp突变成Asn，262位-264位氨基酸Arg，Arg，Lys突变成Ala，Ala，His，构建非整合的慢病毒，通过去除慢病毒的启动子等元件的方式提升病毒载体载入量，用于假病毒的构建，假病毒用于核酸检测全流程质控；
可以用于2019新冠状病毒的假病毒构建；也可以用于SARS-COV(重症急性呼吸综合征)、MERS-COV(中东呼吸综合症)、流感病毒等假病毒的构建。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明步骤S012中电泳结果示意图；
图2为本发明步骤S0255中质粒电泳结果示意图；
图3为病毒感染细胞检测实验结果图；
图4为实验组、对照组相对整合效率柱状图；
图5为2019-NCOV ORF1 a/bQPCR检测数据扩增曲线图；
图6为2019-NCOV-E GeneQPCR检测数据扩增曲线图；
图7为2019-NCOV-N GeneQPCR检测数据扩增曲线图。
图8为实施例一中慢病毒载体FV011的基因图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，实施如下：
1)剔除慢病毒表达载体的非必须元件的假病毒载体；
2)将需要检测病毒的部分基因组克隆至假病毒载体；
3)将慢病毒的整合酶基因进行突变，使得慢病毒的整合能力降低或丧失整合性；
4)在293T细胞中进行假病毒的包装；
5)对制备的假病毒进行拷贝数测定及整合效率测定。
实施例一：构建剔除慢病毒表达载体的非必须元件的假病毒载体
在现有的慢病毒载体FV011(复百澳公司自有载体，如图8所示)，去除启动子和外源表达框：
步骤S011：将慢病毒载体在37℃水浴条件下酶切2小时，酶切体系具体为：
Figure BDA0002455457620000081
步骤S012：琼脂糖凝胶电泳及胶回收目的产物：用1％琼脂糖，120V恒压电泳30～40分钟，在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的离心管中用于胶回收纯化，上样信息：样品8-9：FV-011-PacI-NheI；电泳结果如图1所示。
实施例二：将需要检测病毒的部分基因组克隆至假病毒载体；
步骤S021：通过全基因合成的方式获得冠状病毒的部分序列，合成至PUC57载体，记为PUC57-ORF 1a/bEN；合成序5’端含有PAC I酶切位点，3’端含有Nhe I酶切位点，具体序列信息如下：
TAATTAAATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGACAATTTAATTGATTCTTACTTTGTAGTTAAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACATGAAGAAACAATTTATAATTTACTTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACATATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAAATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAAGCTAGC；
进一步地，ORF1 A/B序列如下：
ATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGACAATTTAATTGATTCTTACTTTGTAGTTAAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACATGAAGAAACAATTTATAATTTACTTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACAT；
E基因序列如下：
ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAA；
N基因序列如下：
ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAA；
步骤S022：将合成完毕的ORF1 A/B，E基因和N基因通过酶切的方式获得待插入慢病毒载体的片段；酶切的条件为：37℃水浴下酶切2小时，酶切体系为：
Figure BDA0002455457620000111
Figure BDA0002455457620000121
步骤S023：琼脂糖凝胶电泳及胶回收目的产物：用1％琼脂糖，120V恒压电泳30～40分钟，在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的离心管中用于胶回收纯化；
步骤S024：将回收的载体产物和酶切胶回产物连接，连接条件为室温下1小时；具体涉及的试剂及其体积分别为：
Figure BDA0002455457620000122
步骤S025：连接产物转化，连接产物转化的方法为：
步骤S0251：取50μl感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司公司)放在冰上融化，取5μl连接产物和感受态细胞混匀；
步骤S0252：冰浴30分钟，42℃水浴热激90秒，继续冰浴2分钟；
步骤S0253：在混合物中加入1mL无抗性SOB液体培养基，摇床37℃，在250rpm/min下摇菌1小时；
步骤S0254：摇菌结束后，在4000rpm下离心2分钟；
步骤S0255：去除部分上清后留约200μl混匀沉淀，涂于LB培养平板上，将板倒扣，在37℃细菌培养箱中培养12～16小时，得重组质粒，质粒电泳结果如图2所示。
实施例三：慢病毒包装辅助质粒的整合酶基因进行突变，使慢病毒的整合能力降低或丧失整合性：
突变前：
tttttagatggaatagataaggcccaagaagaacatgagaaatatcacagtaattggagagcaatggctagtgattttaacctaccacctgtagtagcaaaagaaatagtagccagctgtgataaatgtcagctaaaaggggaagccatgcatggacaagtagactgtagcccaggaatatggcagctaGattgtacacatttagaaggaaaagttatcttggtagcagttcatgtagccagtggatatatagaagcagaagtaattccagcagagacagggcaagaaacagcatacttcctcttaaaattagcaggaagatggccagtaaaaacagtacatacagacaatggcagcaatttcaccagtactacagttaaggccgcctgttggtgggcggggatcaagcaggaatttggcattccctacaatccccaaagtcaaggagtaatagaatctatgaataaagaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaggctgaacatcttaagacagcagtacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggaaaggaccagcaaagctcctctggaaaggtgaaggggcagtagtaatacaagataatagtgacataaaagtagtgccaAGaAGaAaAgcaaagatcatcagggattatggaaaacagatggcaggtgatgattgtgtggcaagtagacaggatgaggat；
突变后：
tttttagatggaatagataaggcccaagaagaacatgagaaatatcacagtaattggagagcaatggctagtgattttaacctaccacctgtagtagcaaaagaaatagtagccagctgtgataaatgtcagctaaaaggggaagccatgcatggacaagtagactgtagcccaggaatatggcagctaAattgtacacatttagaaggaaaagttatcttggtagcagttcatgtagccagtggatatatagaagcagaagtaattccagcagagacagggcaagaaacagcatacttcctcttaaaattagcaggaagatggccagtaaaaacagtacatacagacaatggcagcaatttcaccagtactacagttaaggccgcctgttggtgggcggggatcaagcaggaatttggcattccctacaatccccaaagtcaaggagtaatagaatctatgaataaagaattaaagaaaattataggacaggtaagagatcaggctgaacatcttaagacagcagtacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggaaaggaccagcaaagctcctctggaaaggtgaaggggcagtagtaatacaagataatagtgacataaaagtagtgccaGCaGCaCaTgcaaagatcatcagggattatggaaaacagatggcaggtgatgattgtgtggcaagtagacaggatgaggat；
整合酶基因的64位氨基酸Asp、116位氨基酸Asp、262位-264位氨基酸Arg,Arg，Lys三个氨基酸突变将会降低慢病毒的整合效率，提高其安全性。介于此，进行了组合突变设计，64位氨基酸Asp突变成Asn，262位-264位氨基酸Arg，Arg，Lys突变成Ala，Ala，His；进行突变的具体方法为：
步骤SS031：设计突变引物：以慢病毒包装辅助质粒psPAX2为模板进行点突变，先进行64位氨基酸的碱基突变，将64位氨基酸Asp突变成Asn：
F：gcccaggaatatggcagctaAattgtacacatttagaaggaaaagttatc
R：tccttctaaatgtgtacaatTtagctgccatattcctgggctac
再在此基础上再进行262位-264位氨基酸的突变，将262位-264位氨基酸Arg，Arg，Lys突变成Ala，Ala，His：
F:gtgacataaaagtagtgccaGCAGCACATgcaaagatcatcagg
R:taatccctgatgatctttgcATGTGCTGCtggcactacttttatg；
步骤SS032：使用点突变试剂盒进行点突变实验，试剂盒使用：诺唯赞，C215-01，具体方法如下：
步骤SS0321：将试剂盒中的除了Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase外的各组分按要求充分解冻；
步骤SS0322：配制反应体系如下：
Figure BDA0002455457620000151
步骤SS0323：PCR扩增反应程序如下：
Figure BDA0002455457620000152
Figure BDA0002455457620000161
步骤SS0324：PCR扩增产物加入1μl DpnI酶消化，去除模板DNA；
步骤SS0325：消化后的产物进行环化重组，37℃水浴反应30分钟，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5分钟，反应体系如下：
Figure BDA0002455457620000162
步骤SS033：反应产物转化、涂板、克隆鉴定，具体方法为：
步骤SS0331：取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30分钟；
步骤SS0332：42℃热激90秒，再冰水浴孵育2分钟；
步骤SS0333：加入900μl SOB培养基，37℃孵育10分钟充分复苏；
步骤SS0334：37℃摇菌45分钟，取100μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上；
步骤SS0335：将平板倒置，于37℃中培养12～16小时，挑取克隆测序鉴定，正取质粒进行质粒扩增
实施例四：在293T细胞中进行假病毒的包装，获得假病毒颗粒，具体方法为：
步骤SS041：转染前，显微镜下观察293T细胞的状态，确定细胞状态良好、密度达90％左右，无污染；
步骤SS042：每盘细胞更换10ml含2％FBS的DMEM培养基；
步骤SS043：配制转染体系如下：
Figure BDA0002455457620000171
转染试剂1X PEI 30μl/盘，混合加入到含500μl OMEM的EP管中，室温静置15min；
步骤SS044：将转染体系分别缓慢滴加至细胞培养皿中，保持培养皿水平，晃动培养皿，使得转染复合物均匀分布于细胞表面；
步骤SS045：转染8小时后，每盘细胞更换10ml含2％FBS的DMEM培养基；
步骤SS046：转染48小时后，收集细胞上清液，该上清液中已经含对应的假病毒颗粒。
实施例五：对制备假病毒的产毒量和整合效率检测；
1、病毒产毒量检测：
①使用病毒RNA提取试剂盒(Beaverbio,Cat.NO.70406)进行病毒上清液的中RNA的提取，提取实验按照实验说明书执行；
②病毒RNA提取后使用一步法QPCR检测试剂盒进行QPCR检测，该试剂盒可以同时完成RT-PCR将RNA反转成cDNA和QPCR实时定量检测；
③所构建的假病毒序列和慢病毒转录调控序列WPRE共一条核酸RNA，通过测量WPRE的含量计算拷贝数。
④WPRE的qPCR引物序列如下：F：5’-GTCCTTTCCATGGCTGCTC-3’，R:5’-CCGAAGGGACGTAGCAGA-3’；
⑤通过自行构建WPRE的标准质粒制备拷贝数标准品，浓度梯度如下：107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl；
⑥QPCR反应体系配制如下：
Figure BDA0002455457620000181
病毒产毒量检测实验结果如下表所示：
Figure BDA0002455457620000182
Figure BDA0002455457620000191
通过标准品比对计算所产生的病毒量，实验组：1.19×107copy/mL对照组：8.32×106copy/mL，即改造后的载体可以较为稳定的产生假病毒颗粒。
2、病毒整合效率检测：
①实验前24H，接种293T细胞于24孔板中，约1*105个/孔，500μl/孔，于37℃，5％CO2条件下培养；
②实验前在显微镜下，对实验用细胞进行观察，确定细胞饱满、分部均匀、无污染后再进行后续实验；
③按照MOI＝5分别取实验组和对照组的病毒液感染24孔板中293T细胞，每组三个复孔；
④72H后显微镜观察感染后的细胞荧光比例，并提取基因进行QPCR检测整合病毒量，使用的引物序列为病毒包装元件WPRE；
⑤WPRE的qPCR引物序列如下：F：5’-GTCCTTTCCATGGCTGCTC-3’，R:5’-CCGAAGGGACGTAGCAGA-3’；
⑥通过自行构建WPRE的标准质粒制备拷贝数标准品，浓度梯度如下：107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl；
⑦QPCR反应体系配制如下：
Figure BDA0002455457620000201
病毒感染细胞检测实验结果，如图3所示。
病毒整合比例检测数据——QPCR检测基因组如下：
Figure BDA0002455457620000211
Figure BDA0002455457620000221
实验结果，两组病毒分别以同样的MOI值感染293T细胞，通过荧光比例和强弱显示，实验组(非整合假病毒组)数量和荧光强度略低于对照组，通过对比感染后的荧光比例。
通过分析两组细胞的基因组中所整合病毒基因数量分析，实验组(非整合假病毒组)的整合量为：3.56×104copy/mL，对照组的整合量为：1.48×106copy/mL，和对照组相比实验组(非整合假病毒组)的整合率为2.412％，实验组(非整合假病毒组)与对照组相对整合率柱状图如图4所示，实验组(非整合假病毒组)的基因整合效率显著低于对照组。
2019新冠病毒核酸检测验证：
试剂盒抽提假病毒total RNA：利用苏州海狸生物医学工程有限公司生产的病毒DNA/RNA提取试剂盒抽提假病毒total RNA，利用复百澳公司提供的DNase-DEPC-H2O洗脱并溶解total RNA；
荧光定量法检测目的基因含量：利用南京诺维赞生物科技有限公司生产的
Figure BDA0002455457620000223
ⅡU+One Step qRT-PCR Probe Kit试剂盒直接将抽提的病毒核酸为模板，配制QPCR反应体系，同时使用复百澳公司生产的WPRE标准品作为病毒滴度检测的标准品，同时上机检测，测定样品和标准品的CP值；
QPCR检测的引物和探针信息如下：
Figure BDA0002455457620000222
Figure BDA0002455457620000231
QPCR检测数据结果如下：
Figure BDA0002455457620000232
Figure BDA0002455457620000241
其中，QPCR检测数据扩增曲线如图5-7所示。
一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，可以用于2019新型冠状病毒的假病毒构建，也可以用于SARS-COV(重症急性呼吸综合征)、MERS-COV(中东呼吸综合症)、流感病毒等假病毒的构建，制备的假病毒的核酸序列，应用于核酸检测的标准质控品的制备，核酸序列包括且不限于ORF 1，E基因和N基因，不限于的序列包括S基因、E基因、M基因；不限于的病毒包括SRAS非典型肺炎病毒、MERS中东呼吸综合症、流感病毒等其RNA类病毒，制备冠状病毒核酸序列在核酸检测的标准质控品的方法中的应用，应用于核酸检测全流程质控。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (10)

1.一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤SS01：构建剔除慢病毒表达载体的非必须元件的假病毒载体；
步骤S011：将慢病毒载体在37℃水浴条件下酶切2小时；
步骤S012：琼脂糖凝胶电泳及胶回收目的产物：用1％琼脂糖，120V恒压电泳30～40分钟，在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的离心管中用于胶回收纯化；
步骤SS02：将2019新冠状病毒的部分基因组克隆至假病毒载体；
步骤S021：通过全基因合成的方式获得2019新冠状病毒的部分序列，合成至PUC57载体，记为PUC57-ORF 1a/bEN；合成序5’端含有PAC I酶切位点，3’端含有Nhe I酶切位点；
步骤S022：将合成完毕的ORF1 A/B，E基因和N基因通过酶切的方式获得待插入慢病毒载体的片段；
步骤S023：琼脂糖凝胶电泳及胶回收目的产物：用1％琼脂糖，120V恒压电泳30～40分钟，在紫外照射下切下单一目的片段放入干净的离心管中用于胶回收纯化；
步骤S024：将回收的载体产物和酶切胶回产物连接；
步骤S025：连接产物转化；
步骤SS03：慢病毒包装辅助质粒的整合酶基因进行突变，使慢病毒的整合能力降低或丧失整合性；
步骤SS04：在293T细胞中进行假病毒的包装，获得假病毒颗粒；
步骤SS05：对制备假病毒的产毒量和整合效率检测。
2.根据权利要求1所述的一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤S025中连接产物转化的方法为：
步骤S0251：取50μl感受态细胞放在冰上融化，取5μl连接产物和感受态细胞混匀；
步骤S0252：冰浴30分钟，42℃水浴热激90秒，继续冰浴2分钟；
步骤S0253：在混合物中加入1mL无抗性SOB液体培养基，摇床37℃，在250rpm/min下摇菌1小时；
步骤S0254：摇菌结束后，在4000rpm下离心2分钟；
步骤S0255：去除部分上清后留200μl混匀沉淀，涂于LB培养平板上，将板倒扣，在37℃细菌培养箱中培养12～16小时，得重组质粒。
3.根据权利要求1所述的一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤SS03中进行突变的方法为：
步骤SS031：设计突变引物；
步骤SS032：使用点突变试剂盒进行点突变实验；
步骤SS033：反应产物转化、涂板、克隆鉴定。
4.根据权利要求3所述的一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤SS031中设计的突变引物为：
以慢病毒包装辅助质粒psPAX2为模板进行点突变，先进行64位氨基酸的碱基突变，将64位氨基酸Asp突变成Asn；
再进行262位-264位氨基酸的突变，将262位-264位氨基酸Arg，Arg，Lys突变成Ala，Ala，His。
5.根据权利要求3所述的一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤SS033中反应产物转化、涂板、克隆鉴定的方法为：
步骤SS0331：取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，混匀，在冰上放置30分钟；
步骤SS0332：42℃热激90秒，再冰水浴孵育2分钟；
步骤SS0333：加入900μl SOB培养基，37℃孵育10分钟充分复苏；
步骤SS0334：37℃摇菌45分钟，取100μl菌液均匀涂布在含有抗生素的平板上；
步骤SS0335：将平板倒置，于37℃中培养12～16小时，挑取克隆测序鉴定，正取质粒进行质粒扩增。
6.根据权利要求1所述的一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤SS04中在293T细胞中进行假病毒包装的方法为：
步骤SS041：转染前，显微镜下观察293T细胞的状态，确定细胞状态良好、密度达90％，无污染；
步骤SS042：每盘细胞更换10ml含2％FBS的DMEM培养基；
步骤SS043：配制转染体系：转染试剂1X PEI 30μl/盘，混合加入到含500μl OMEM的EP管中，室温静置15min；
步骤SS044：将转染体系分别滴加至细胞培养皿中，保持培养皿水平，晃动培养皿，使得转染复合物均匀分布于细胞表面；
步骤SS045：转染8小时后，每盘细胞更换10ml含2％FBS的DMEM培养基；
步骤SS046：转染48小时后，收集细胞上清液，该上清液中含对应的假病毒颗粒。
7.如权利要求1-6任意一项所述的一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，其特征在于，制备的假病毒的核酸序列，应用于核酸检测的标准质控品的制备，核酸序列包括ORF 1、E基因和N基因，序列包括S基因、E基因、M基因。
8.如权利要求1-6任意一项所述的一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，其特征在于，制备冠状病毒核酸序列在核酸检测的标准质控品的方法中的应用，应用于核酸检测全流程质控。
9.根据权利要求1所述的一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤S011中进行酶切的酶切体系总体积为20μl，具体包括：
慢病毒载体：5μl；
PACI：1μl；
NHE I：1μl；
NEB 10X BUFFER：2μl；
DDH2O：11μl。
10.根据权利要求1所述的一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤S022中进行酶切的条件为：37℃水浴下酶切2小时，酶切体系的总体积为20μl，具体包括：
PUC57-ORF 1a/bEN：5μl；
PACI：1μl；
NHE I：1μl；
NEB 10X BUFFER：2μl；
DDH2O：11μl。
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