CN111926041B - 一种SARS-CoV-2假病毒小鼠体内包装系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种假病毒小鼠体内包装系统的制备方法，包括以下步骤：S1基于慢病毒包装质粒系统和睡美人转座子系统构建SARS‑CoV‑2假病毒包装质粒系统，S2将步骤S1中SARS‑CoV‑2假病毒包装质粒系统与睡美人转座酶表达质粒混合通过水动力注射的方式转染小鼠肝细胞，然后睡美人转座子系统将SARS‑CoV‑2假病毒包装所需序列以剪切粘贴的方式整合到小鼠肝细胞的基因组。本发明可在小鼠体内持续制造分泌SARS‑CoV‑2假病毒，可模拟靶器官被SARS‑CoV‑2病毒持续侵入攻击的过程，从而可模拟出新冠肺炎（COVID‑19）的病理特征。基于SARS‑CoV‑2假病毒小鼠体内包装系统的动物模型安全性高，不需要P3级实验室就能开展研究。利用水动力注射的方式引入SARS‑CoV‑2假病毒包装质粒系统操作简单，成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种SARS-CoV-2假病毒小鼠体内包装系统及其制备方法。
背景技术
SARS-CoV-2假病毒是表面包裹着SARS-CoV-2 Spike蛋白（S蛋白）的缺陷病毒颗粒，因而可以利用SARS-CoV-2同样的病毒侵入机制（以ACE2作为受体）将携带的DNA或RNA序列导入细胞，但其携带的是不能指导再次生成病毒的序列，所以可用于研究单次侵入过程的机制及测试药物干预效果，一般情况下实验动物和操作者没有实质性感染的风险。
目前假病毒包装通常都是在体外培养的细胞系中完成，可用于SARS-CoV-2假病毒包装的体系由human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)或murine leukemia virus(MLV)等逆转录病毒改造而成。比如常用的慢病毒包装质粒系统（由HIV-1改造而成）经改造后就可用于包装SARS-CoV-2假病毒，即将包膜蛋白质粒中的VSV-G替换成SARS-CoV-2 S蛋白，转染HEK293T细胞，即可生成SARS-CoV-2假病毒。
但是，体外包装的SARS-CoV-2假病毒用于动物实验时，只能逐次注射假病毒（比如尾静脉注射）去感染动物，实验的时间窗口短，而不能模拟SARS-CoV-2病毒对动物靶器官的持续侵入，且最佳时间窗口难以确定，评估药物干预效果。
发明内容
本发明的目的是将现有的慢病毒包装质粒体系改造成SARS-CoV-2假病毒包装质粒体系，并通过注射方法导入到小鼠体内肝脏，让小鼠肝脏能持续产生并分泌SARS-CoV-2假病毒颗粒。
为实现本发明的目的采用以下技术方案：
一种假病毒小鼠体内包装系统的制备方法，包括以下步骤：
S1构建SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统；
S2将SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统与睡美人转座酶（Sleeping Beautytransposase）表达质粒混合通过水动力注射的方式转染小鼠肝细胞，然后睡美人转座子系统将SARS-CoV-2假病毒包装所需序列以剪切粘贴的方式整合到小鼠肝细胞的基因组。
作为本发明优选实施方式，所述步骤S1中的假病毒包装质粒系统由包膜蛋白质粒（envelope plasmid）、包装质粒（packaging plasmid）和转移质粒（transfer plasmid）组成，其中所述包膜蛋白质粒中的包膜蛋白（ENV）由VSV-G替换成SARS-CoV-2 S蛋白。发明人首先将常用的慢病毒包装系统的包膜蛋白替换成SARS-CoV-2 S蛋白，然后将包膜蛋白质粒、包装质粒和转移质粒中参与病毒包装的序列作为目标序列分别插入到睡美人转座子载体的一对反向末端重复序列（ITR）之间，构建成可以利用睡美人转座子系统整合到细胞基因组中的SARS-CoV-2 S假病毒包装质粒系统。
作为本发明优选实施方式，所述步骤S2具体步骤为：将睡美人转座酶表达质粒与步骤S1构建的假病毒包装质粒系统按比例混合后，从尾静脉采用水动力注射进小鼠体内，获得在小鼠体内持续生产的SARS-CoV-2假病毒。水动力注射方法（将质粒混合在小鼠体重8%-10%的液体中，在10秒内从尾静脉注射进小鼠体内）可以让所有质粒一起进入小鼠的肝细胞。随后睡美人转座酶表达，将包膜蛋白质粒、包装质粒和转移质粒中参与病毒包装的序列(即ITR之间的序列)以剪切粘贴的方式插入到到基因组中。这些SARS-CoV-2假病毒包装元件从小鼠肝细胞的基因组上持续表达，组装成SARS-CoV-2假病毒，从肝细胞分泌到血液中去，可感染表达有人血管紧张素转化酶2（ACE2）的靶器官。但其侵入细胞后，携带的RNA序列只包含转移质粒的部分序列，不能利用感染的细胞制造新的病毒颗粒，安全可控。如果将转移质粒中引入luciferase、GFP等标记蛋白，则可以利用活体/细胞成像技术方便追踪SARS-CoV-2假病毒感染靶器官的情况。
本发明还提供了一种由本发明所述的制备方法在模拟SARS-CoV-2病毒对动物靶器官的持续侵入方面的应用。
本发明还提供了一种如上述所述制备方法制备的SARS-CoV-2 假病毒小鼠体内包装系统，是由包膜蛋白质粒（envelope plasmid）、包装质粒（packaging plasmid）和转移质粒（transfer plasmid）组成，其中所述包膜蛋白质粒中的包膜蛋白（ENV）为SARS-CoV-2 S蛋白。
作为本发明优选实施方式，所述步骤S1中的假病毒包装质粒系统通过水动力注射的方式转染小鼠肝细胞，并利用睡美人转座子系统整合到基因组中持续表达。
本发明还提供了上述SARS-CoV-2假病毒小鼠体内包装系统在生产SARS-CoV-2假病毒方面的应用。
本发明还提供了一种持续生产SARS-CoV-2假病毒的动物模型，由如本发明所述的假病毒小鼠体内包装系统的制备方法制备而成。
作为本发明优选实施方式，所述动物为小鼠。
作为本发明优选实施方式，所述小鼠为能表达人血管紧张素转化酶2的小鼠。
本发明的有益效果为：
1.可在小鼠体内持续制造分泌SARS-CoV-2假病毒，如结合在SARS-CoV-2病毒靶器官表达hACE2的技术（比如hACE2 knock-in小鼠），可模拟靶器官被SARS-CoV-2病毒持续侵入攻击的过程，从而可模拟出COVID-19的病理特征。
2.这个侵入过程可方便通过标记蛋白被活体成像技术追踪定量，适合用于测试药物干预效果。
3.基于SARS-CoV-2假病毒小鼠体内包装系统的动物模型安全性高，不需要P3级实验室就能开展研究。
4.利用水动力注射的方式引入SARS-CoV-2假病毒包装质粒体系操作简单，成本低。
附图说明
图1为SARS-CoV-2假病毒包装质粒构建示意图，其中包括包膜蛋白质粒、包装质粒和转移质粒，其中所述包膜蛋白质粒中的包膜蛋白（ENV）为SARS-CoV-2 S蛋白。
图2为替换后的包膜蛋白质粒pMD2.G(SARS-CoV-2-S) 图谱。
图3为构建的包膜蛋白质粒PH-TB-SARS-CoV-2-S图谱。
图4为构建的包装质粒PH-TB-GAG-POL图谱。
图5为构建的中间质粒pCDH-CMV-LUC图谱。
图6构建的转移质粒PH-TB-LUC图谱。
图7为睡美人转座子系统工作原理示意图，将目标序列（Gene X）插入到转座子载体一对反向末端重复序列（ITR）之间，睡美人（Sleeping Beauty，SB）转座酶能够结合到转座子（即ITR）上，将目标序列以剪切粘贴的方式插入到基因组。
图8为水动力注射实现肝细胞转染原理图，水动力注射后，SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统会通过内吞小泡中进入到肝细胞，随后借助睡美人转座子系统整合到基因组中，持续生成假病毒颗粒。
图9为体内活体成像技术在肺部观察到的luciferase活性示意图。
图10为小鼠给不组织HE染色结果示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
实施例1
S1:构建SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统，具体步骤如下：
（1）将包膜蛋白替换成SARS-CoV-2 S蛋白，具体步骤如下：
以pMD2.G载体为骨架，用酶切的方式将VSV-G序列切除，再以gateway的方式用SARS-CoV-2 S蛋白的CDS区替换所述切除序列，替换后的包膜蛋白质粒pMD2.G(SARS-CoV-2-S)图谱如图2所示。
（2）构建包膜蛋白质粒PH-TB-SARS-CoV-2-S，具体步骤如下：
以质粒PH-TB为骨架，以PCR的方式从质粒pMD2.G(SARS-CoV-2-S)上钓取从CMVenhancer到SARS-CoV-2-S序列，用gateway的方式将该段序列插入到ITR(L)和ITR(R)之间，构建的最终质粒图谱如图3所示。
（3）构建包装质粒PH-TB-GAG-POL，具体步骤如下：
以质粒PH-TB为骨架，以PCR的方式从质粒psPAX2上钓取CMV enhancer到GAG-POL序列，用gateway的方式将序列插入到ITR(L)和ITR(R)之间，其最终质粒图谱如图4所示。
（4）构建转移质粒PH-TB-LUC，具体步骤如下：
先以质粒pCDH-CMV为骨架，以gateway的方式将luciferase序列插入到CMVpromoter之后构建成中间质粒pCDH-CMV-LUC。中间质粒图谱如图5所示。
再以质粒PH-TB为骨架，以PCR的方式从中间质粒pCDH-CMV-LUC上钓取5’LTR到3’LTR的序列，最后用gateway的方式将序列插入到ITR(L)和ITR(R)之间，最终转移质粒图谱如图6所示。
S2：将步骤S1构建的SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统（包膜蛋白质粒PH-TB-SARS-CoV-2-S、包装质粒PH-TB-GAG-POL、转移质粒PH-TB-LUC）与睡美人转座酶（SleepingBeauty transposase）表达质粒混合通过注射的方式转染小鼠肝细胞，然后睡美人转座子系统将SARS-CoV-2假病毒包装所需序列以剪切粘贴的方式整合到小鼠肝细胞的基因组（如图7所示），在体内持续产生SARS-CoV-2假病毒，具体操作如下。
本实施例中睡美人转座酶表达质粒选择的是pCMV/SB10，各种质粒的混合比例为PH-TB-LUC： PH-TB-GAG-POL：PH-TB-SARS-Cov-2-S：pCMV/SB10=12:9:6:2，每只小鼠共需要约30μg质粒DNA，将质粒混合后制备成约2 mL液体（约占小鼠体重8%-10%），在5-7秒内从尾静脉注射进小鼠体内。水动力注射可以高效转染肝细胞（可能是通过快速注射压强增高导致肝细胞膜破损或形成内吞小泡的方式，如图8所示），随后睡美人转座子系统再将PH-TB-LUC、PH-TB-GAG-POL和PH-TB-SARS-Cov-2-S质粒的 ITR(L)和ITR(R)之间序列以剪切粘贴的方式插入到小鼠基因组中。
应用实例
初步尝试了用体内假病毒感染方式构建新冠肺炎（COVID-19）小鼠模型。按本发明所述方法水动力注射SARS-CoV-2 假病毒包装质粒系统后，再通过Ad5-hACE2腺病毒载体经鼻感染BALB/c小鼠肺部，使其肺部高表达hACE2，3天后通过体内活体成像技术在肺部可观察到luciferase活性（见下图），且 2周后信号仍未衰减，证明体内包装的SARS-CoV-2 假病毒可以入侵表达hACE2的靶器官。
进一步尝试了用体外假病毒感染和体内假病毒感染两种方式构建新冠肺炎（COVID-19）小鼠模型。体外假病毒感染组用体外包装SARS-CoV-2假病毒按1×106 TCID50的剂量尾静脉注射感染用Ad5-ACE2腺病毒载体经鼻感染BALB/c小鼠，一次注射后其肺部也会持续观察到luciferase活性，但其肺部的HE染色和正常对照小鼠相比没有差异，而体内假病毒感染组则可以观察到炎症，提示在体内持续产生SARS-CoV-2的假病毒可诱导新冠肺炎相关病理特征，更适合模拟SARS-CoV-2的感染过程。
本实施例所述的新冠肺炎（COVID-19）小鼠模型即经病毒SARS-CoV-2感染后获得新冠肺炎病症的小鼠。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种假病毒小鼠体内包装系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1构建SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统：首先构建含有SARS-CoV-2 S蛋白的包膜蛋白质粒，再构建包装质粒，最后构建转移质粒，获得SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统；
其中所述构建含有SARS-CoV-2 S蛋白的包膜蛋白质粒的方法为：首先，以pMD2.G载体为骨架，用酶切的方式将其VSV-G序列切除，用SARS-CoV-2 S蛋白的CDS区替换所述切除序列，获得替换后的包膜蛋白质粒pMD2.G(SARS-CoV-2-S) ，其质粒图谱如图2所示；然后，以PCR扩增方式从质粒pMD2.G(SARS-CoV-2-S)上获取从CMV enhancer到SARS-CoV-2-S的序列片段，用gateway的方式将该段序列插入到骨架质粒PH-TB的两个ITR(L)和ITR(R)序列之间，获得包膜蛋白质粒PH-TB-SARS-CoV-2-S，其质粒图谱如图3所示；
所述构建包装质粒的方法为：以PCR扩增方式从质粒psPAX2上获取从CMV enhancer到GAG-POL的序列片段，用gateway的方式将该段序列插入到骨架质粒PH-TB的两个ITR(L)和ITR(R)序列之间，获得包装质粒PH-TB-GAG-POL，其质粒图谱如图4所示；
所述构建转移质粒的方法为：首先，以gateway的方式将luciferase序列插入到骨架质粒pCDH-CMV中的CMV promoter序列之后，获得中间质粒pCDH-CMV-LUC，其质粒图谱如图5所示；其次，以PCR扩增方式从中间质粒pCDH-CMV-LUC上获取从5’LTR到3’ LTR的序列片段，用gateway的方式将该段序列插入到骨架质粒PH-TB的ITR(L)和ITR(R) 序列之间，获得转移质粒PH-TB-LUC，所述转移质粒图谱如图6所示；
S2将SARS-CoV-2假病毒包装质粒系统与睡美人转座酶表达质粒混合通过水动力注射的方式转染小鼠肝细胞，然后睡美人转座子系统将所述质粒PH-TB-LUC、质粒PH-TB-GAG-POL和质粒PH-TB-SARS-Cov-2-S中ITR(L)和ITR(R)之间的序列片段以剪切粘贴的方式插入到小鼠基因组中；
所述步骤S2具体步骤为：将睡美人转座子表达质粒与步骤S1构建的假病毒包装质粒系统按比例混合后，从尾静脉采用水动力注射进小鼠体内，获得在小鼠体内持续生产的SARS-CoV-2假病毒；
其中，所述小鼠为能表达人血管紧张素转化酶2的小鼠。
2.一种如权利要求1所述的制备方法在模拟SARS-CoV-2病毒对动物靶器官的持续侵入方面的应用。
3.一种SARS-CoV-2 S假病毒小鼠体内包装系统，其特征在于，由权利要求1所述的制备方法制备而成。
4.如权利要求3所述的SARS-CoV-2 S假病毒小鼠体内包装系统在动物体内持续生产SARS-CoV-2假病毒方面的应用。
5.一种持续生产SARS-CoV-2假病毒的动物模型的制备方法，其特征在于，采用以下步骤实现：
S1采用权利要求1的制备方法制备假病毒小鼠体内包装系统中的包膜蛋白质粒PH-TB-SARS-CoV-2-S、包装质粒PH-TB-GAG-POL和转移质粒PH-TB-LUC；
S2将步骤S1的包装系统与睡美人转座酶表达质粒混合后，采用水动力方式从尾静脉注射进动物体内；
S3 所述步骤S2中的混合质粒经静脉血流通过内皮细胞之间的间隙进入肝细胞，并在肝细胞中形成内吞小泡，由此转染肝细胞，将SARS-CoV-2假病毒包装系统的目的序列整合到肝细胞的基因组中，获得能续生产SARS-CoV-2假病毒的动物；所述动物为小鼠；所述小鼠为能表达人血管紧张素转化酶2的小鼠。
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| CN113475463B (zh) * | 2021-02-03 | 2023-02-24 | 湖州市中心医院 | 一种新型冠状病毒致肺损伤动物模型的建立方法及其小鼠模型 |
| CN113293178A (zh) * | 2021-04-14 | 2021-08-24 | 中国食品药品检定研究院 | 基于SARS-CoV-2假病毒的中和抗体检测方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101289671A (zh) * | 2008-05-30 | 2008-10-22 | 扬州大学 | 一种转基因动物的制备方法 |
| CN109312361A (zh) * | 2016-02-26 | 2019-02-05 | 波赛伊达治疗学股份有限公司 | 转座子系统及应用方法 |
| CN110747232A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-02-04 | 宁夏医科大学 | 一种长效稳定表达的杆状病毒载体及其构建方法 |
| CN111471717A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-07-31 | 复百澳（苏州）生物科技有限公司 | 一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法 |
| CN111593073A (zh) * | 2020-03-18 | 2020-08-28 | 苏州奥特铭医药科技有限公司 | 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒 |
| US20200283495A1 (en) * | 2019-03-08 | 2020-09-10 | ST Phi Therapeutics | Chimeric Endocytic Receptors and Method of Use Thereof |
| CN111662884A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-09-15 | 中吉当康(北京)基因技术有限公司 | 一种假病毒及其包装方法和药物评估系统 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010151793A1 (en) * | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Therapeutic antibody target validation and screening in vivo |
| CA2888931C (en) * | 2012-10-26 | 2023-09-05 | Vrije Universiteit Brussel | Vector for liver-directed gene therapy of hemophilia and methods and use thereof |
| CN104862336B (zh) * | 2015-04-29 | 2018-12-18 | 中国人民解放军第四五八医院 | 一种表达乙肝病毒受体——人ntcp的小鼠模型的构建方法 |
| CN111926041B (zh) * | 2020-10-16 | 2020-12-25 | 广州吉妮欧生物科技有限公司 | 一种SARS-CoV-2假病毒小鼠体内包装系统及其制备方法 |
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101289671A (zh) * | 2008-05-30 | 2008-10-22 | 扬州大学 | 一种转基因动物的制备方法 |
| CN109312361A (zh) * | 2016-02-26 | 2019-02-05 | 波赛伊达治疗学股份有限公司 | 转座子系统及应用方法 |
| US20200283495A1 (en) * | 2019-03-08 | 2020-09-10 | ST Phi Therapeutics | Chimeric Endocytic Receptors and Method of Use Thereof |
| CN110747232A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-02-04 | 宁夏医科大学 | 一种长效稳定表达的杆状病毒载体及其构建方法 |
| CN111593073A (zh) * | 2020-03-18 | 2020-08-28 | 苏州奥特铭医药科技有限公司 | 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒 |
| CN111471717A (zh) * | 2020-04-17 | 2020-07-31 | 复百澳（苏州）生物科技有限公司 | 一种用于2019新冠病毒核酸检测的假病毒的制备方法 |
| CN111662884A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-09-15 | 中吉当康(北京)基因技术有限公司 | 一种假病毒及其包装方法和药物评估系统 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| AAV9-hACE2小鼠模型建立及新冠假病毒体内验证;中吉当康公众号;《中吉当康公众号》;https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI3OTk4NDQ3OA==&mid=2247483749&idx=1&sn=4588dfa60170bf87298744134bbcb292&chksm=ebbe2154dcc9a8427f34c4c22737303f4deb9d37fc02440539b55af9a5f136c4bd5ccf215e57&scene=21#wechat_redirect;20200615;公众号全文 * |
| Helper-Independent Sleeping Beauty Transposon–Transposase Vectors for Efficient Nonviral Gene Delivery and Persistent Gene Expression in Vivo;Jacob Giehm Mikkelsen等;《MOLECULAR THERAPY》;20031231;第1-12页 * |
| Vaccine Development against COVID-19 Prior to Pandemic Outbreaks, using In Vitro Evolution and Reverse Genetics;Hatem Zayed;《Frontiers in Immunology》;20200831;第1-5页 * |
| 基于Sleeping Beauty转座子系统快速构建不同基因型乙型肝炎病毒稳定整合细胞株方法的研究;吴勇;《万方学位论文》;20170621;第1-67页 * |
| 新冠病毒药物筛选的利器——SPIKEY假病毒感染系统;中吉当康公众号;《中吉当康公众号》;https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI3OTk4NDQ3OA==&mid=2247483675&idx=1&sn=c6dbfba6ab4e1d3ff19ff98c40088879&chksm=ebbe212adcc9a83c72cdb8468933683367d1c7adb8f9607ea42aac4d13517e0b9e462ab1764d&scene=21#wechat_redirect;20200331;公众号全文 * |
| 水动力注射法构建乙型肝炎病毒感染小鼠模型;刘霜等;《胃肠病学和肝病学杂志》;20090930;第18卷(第9期);第840-842页 * |
| 水动力转染基因在小鼠体内的长期高效表达;贾帅争等;《生物技术通讯》;20050531;第16卷(第3期);第307页左栏第1段至右栏第2段，第308页右栏倒数第3段 * |
| 高纯度慢病毒应用案例——动物体内注射;中吉当康公众号;《中吉当康公众号》;https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI3OTk4NDQ3OA==&mid=2247483732&idx=1&sn=ebfe60ce934c0cb94e45e05591fb837d&chksm=ebbe2165dcc9a8733e24a97cc2f12ec458799956ccaee1d603596b7bd19ead099f9ff71d1c2e&scene=21#wechat_redirect;20200525;公众号全文 * |
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