CN108291208A

CN108291208A - 用于产生逆转录病毒的稳定细胞系

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Publication number: CN108291208A
Application number: CN201680068650.7A
Authority: CN
Inventors: S.约翰逊; C.帕尔兰特; E.范瓦; C.文克
Original assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Current assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Priority date: 2015-11-24
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2018-07-17
Also published as: WO2017089308A1; EP3380604B1; EP3489353A1; EP3489353B8; US20200123505A1; AU2016360763B2; RU2018122636A3; EP3380604A1; ES2939617T3; AU2016360763A1; IL282603A; EP3489353B1; RU2018122636A; GB2544892B; JP2018534937A; RU2752498C2; KR20180079351A; KR102091957B1; FR3044016A1; EP3489353C0

Abstract

本发明涉及产生逆转录病毒的细胞，其包含编码以下的核酸序列：gag和pol蛋白；包膜蛋白或其功能性替代物；和逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组，其中所述核酸序列全部位于产生逆转录病毒的细胞基因组内的单一基因座。本发明还涉及包含非哺乳动物复制起点且能够保持至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码gag和pol蛋白、和env蛋白或其功能性替代物的逆转录病毒核酸序列。本发明还涉及使用所述核酸载体以产生稳定的逆转录病毒包装和生产细胞系的用途和方法。

Description

用于产生逆转录病毒的稳定细胞系

技术领域

本发明涉及包含产生逆转录病毒所需基因的核酸载体及其用途。还提供了制备包含如本文所述的核酸载体的逆转录病毒包装/生产细胞系的方法。

背景技术

在基因治疗中，将遗传物质递送至需要治疗的受试者中的内源性细胞。遗传物质可将新基因引入受试者，或引入预先存在的基因的附加拷贝，或引入存在于受试者中的基因的不同等位基因或变体。已经提出病毒载体系统作为用于基因治疗的有效基因递送方法(Verma和Somia(1997)Nature 389：239-242)。

特别是，这些病毒载体是基于逆转录病毒家族成员的，因为它们能够将其基因载荷整合到宿主的基因组中。逆转录病毒载体被设计用于保留包装和递送逆转录病毒基因组所需的必需蛋白，但是除去了任何非必需辅助蛋白，包括引起疾病概况的那些。逆转录病毒载体的实例包括慢病毒载体，诸如基于人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的那些，由于它们能够整合到非增殖细胞中而被广泛使用。

目前，大多数病毒载体是通过将病毒基因瞬时共转染到宿主细胞系中产生的。使用存在于宿主细胞中的细菌质粒仅在有限的时间段内导入病毒基因，因为病毒基因保留在质粒上并且不整合到基因组中。因此，瞬时转染的遗传物质在细胞分裂过程中不会传递给后代。

存在与瞬时转染方法相关的几个缺点，诸如批次间差异性、转染试剂的高成本和难以维持质量控制(参见Segura等，(2013)Expert Opin.Biol.Ther.13(7):987-1011)。转染过程本身也是费力的并且难以扩大规模。除去载体制备过程中遗留的质粒杂质也是困难的任务(参见Pichlmair等，(2007)J.Virol.81(2):539-47)。

为了解决与瞬时转染相关的问题，需要开发逆转录病毒包装和生产细胞系以简化逆转录病毒载体的生产。

已经通过转染能够包装具有质粒的逆转录病毒载体的细胞系生成包装细胞系，其中单个质粒携带逆转录病毒包装基因和独特的真核选择标记。包装基因被整合到包装细胞系的基因组中，并被描述为被稳定转染。在过去的20年中，已经做出各种尝试来生成用于逆转录病毒载体的稳定包装和生产细胞系。

经由将逆转录病毒载体成分整合到宿主细胞基因组中产生的包装和生产细胞系中存在许多报道的问题。首先，顺序引入逆转录病毒载体成分可能是费力且不灵活的。当逆转录病毒载体成分被整合到宿主细胞基因组中时，也存在遗传和/或转录不稳定性的问题，因为整合位点是不可预测的(Ni等，(2005)J.Gene Med.7:818–834)。在生产细胞系的悬浮适应和增大规模过程中也报道了病毒载体生产力的显著下降(Farson等，(2001)Hum.GeneTher.12:981–997；Guy等，(2013)Hum.Gene Ther.Methods.24(2):125-39)。

因此，本发明的目的是提供一种制备稳定逆转录包装和生产细胞系的方法，它克服了与现有方法相关的一个或多个缺点。

发明内容

本发明人开发了一种制备包装和生产细胞系的新方法，其涉及使用包含非哺乳动物复制起点并且能够保持至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，诸如包含逆转录病毒载体生产所必需的逆转录病毒基因的细菌人工染色体。这允许表达逆转录病毒基因以改善与瞬时转染方法相关的问题，所述基因为产生复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒所需。

包含非哺乳动物复制起点并且能够保持至少25kb DNA(即，大型构建体DNA)的核酸载体的使用具有几个优点。首先，可以先在非哺乳动物细胞(例如，微生物细胞，诸如细菌细胞)而不是哺乳动物宿主细胞中操作载体，这使得它们更易于使用(例如，细菌人工染色体可以首先在大肠杆菌中操作)。一旦制备了核酸载体，就可以将其引入哺乳动物宿主细胞中，并且可以选择具有整合到内源染色体中的核酸载体的任何哺乳动物细胞以分离稳定的细胞系。

将逆转录病毒核酸引入哺乳动物宿主细胞也可以在一个步骤中发生，这有助于减少选择压力和沉默时间范围。这使得可以更快地筛选潜在的包装细胞并降低材料成本，因为仅使用了单一载体，而不是像先前方法那样使用多个质粒载体。特别是，通过节省质粒成本、所需的转染试剂(例如聚乙烯亚胺[PEI])，减少所需的Benzonase处理量(在慢病毒收获中DNA的量减少，因此需要较少的Benzonase来除去下游处理中的过量)并降低测试成本(不需要测试慢病毒产物中的残留质粒)，本系统的使用降低了生产成本。

此外，产生逆转录病毒所必需的逆转录病毒基因(带有或不带有转移载体)存在于核酸载体内，以便当载体被引入哺乳动物宿主细胞时，所有被掺入核酸载体的逆转录病毒基因将整合到内源性哺乳动物宿主细胞基因组内的一个基因座。这可以克服诸如当逆转录病毒基因随机整合并在宿主细胞基因组内的不同基因座处整合时发生的基因沉默的问题。

因此，使用本发明的核酸载体在生成逆转录病毒包装和生产细胞系方面提供了优势。

因此，根据本发明的第一方面，提供了一种产生逆转录病毒细胞，其包含编码以下的核酸序列：

gag和pol蛋白；

env蛋白或其功能性替代物；和

逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组，

其中所述核酸序列全部位于产生逆转录病毒细胞基因组内的单一基因座处。

根据本发明的另一方面，提供了包含非哺乳动物复制起点且能够保持至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的逆转录病毒核酸序列：

gag和pol蛋白，和

env蛋白或其功能性替代物，

其中每种逆转录病毒核酸序列在核酸载体内作为单独的表达构建体排列。

根据本发明的另一方面，提供了生产稳定的逆转录病毒包装细胞系的方法，其包括：

(a)将如本文所定义的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和

(b)在培养物中选择具有在被整合到哺乳动物宿主细胞的内源染色体内的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。

根据本发明的另一方面，提供了通过如本文所定义的方法获得的逆转录病毒包装细胞。

根据本发明的另一方面，提供了一种产生复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的方法，包括：

(a)将如本文定义的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；

(b)在培养物中选择具有在被整合到哺乳动物宿主细胞的内源染色体内的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞；和

(c)在产生复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的条件下进一步培养哺乳动物宿主细胞。

根据本发明的另一方面，提供了通过如本文所定义的方法获得的复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒。

附图说明

图1：构建BACpack-WTGP-277delU5和BACpack-SYNGP-277delU5的分步指南

图2：选择稳定的多克隆集合体。使用磷酸钙用BACpackWTGagPol-Transfer转染HEK293T贴壁细胞。Zeocin选择2周后生成稳定的集合体。为了观察稳定转染子是否能够生成病毒，用多西环素(Doxycycline)诱导稳定的多集合体48小时。诱导48小时后收获病毒上清液，通过0.22μm过滤器过滤并通过转导HEK293T细胞进行滴定。GFP阳性转导细胞用于计算转导单元/ml(TU/mL)。

图3：生成稳定的转染悬浮克隆。使用293fectin试剂用BACpackWTGagPol-Transfer转染HEK293 6E细胞。Zeocin选择2周后生成稳定的集合体。通过有限稀释将稳定集合体克隆到96孔板中以获得单细胞克隆，随后将其扩增。通过荧光显微法检测GFP得到最佳克隆1、14、15和16，其用贴壁培养基(DMEM+FBS)然后通过悬浮适应(FreeStyle培养基)获得。

图4：在悬浮克隆中诱导慢病毒。为了观察稳定的HEK6E转染子是否能够生成病毒，用多西环素(2μg/ml)诱导20ml稳定悬浮克隆48小时。诱导48小时后收获病毒上清液，通过0.45μm过滤器过滤并通过转导HEK293T细胞进行滴定。使用GFP阳性转导细胞计算转导单元/ml(TU/mL)。

图5：根据实施例4产生的克隆的载体滴度。结果显示来自克隆1和16的载体滴度在第5代和第21代之间适度增加。

具体实施方案

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文提到的所有专利和出版物都通过引用整体并入。

术语“包含(comprising)”涵盖了“包括(including)”或“由……组成(consisting)”，例如,“包含(comprising)”X的组合物可以仅由X组成或可以包括附加的某物，例如X+Y。

术语“基本上由...组成”将特征的范围限制为具体的材料或步骤以及不会实质影响所要求保护的特征的基本特性的那些。

术语“由......组成”排除任何附加成分的存在。

关于数值x的术语“约”是指例如x±10％、5％、2％或1％。

术语“载体”或“核酸载体”是指能够将外来(即外源)遗传物质人工携带到另一个细胞中的媒介物，它可以在细胞中被复制和/或表达。载体的实例包括非哺乳动物核酸载体，诸如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1-衍生的人工染色体(PAC)、黏粒或福斯黏粒(fosmid)。

载体的其他实例包括病毒载体，诸如逆转录病毒载体和慢病毒载体，其在本申请中特别感兴趣。慢病毒载体，诸如基于人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的那些被广泛使用，因为它们能够整合到非增殖细胞中。通过将病毒基因组分开成分离的部分，例如通过置于不同的质粒上，可以使病毒载体复制缺陷。例如，由萨尔克生物研究所(Salk Institute forBiological Studies)开发的所谓的第一代慢病毒载体被构建为由安装表达盒、包膜(envelope)表达盒和载体表达盒组成的三质粒表达系统。“包装质粒”含有完整的gag-pol序列，调控(tat和rev)和辅助(vif、vpr、vpu、nef)序列。“包膜质粒”在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下保持用水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSVg)代替天然HIV-1包膜蛋白。第三个质粒(“转移质粒”)携带长末端重复序列(LTR)、包封序列(ψ)、Rev响应元件(RRE)序列和CMV启动子以在宿主细胞内表达转基因。

第二代慢病毒载体的特征在于缺失了毒性序列vpr、vif、vpu和nef。包装载体被减少到gag、pol、tat和rev基因，因此增加了系统的安全性。

为改进慢病毒系统，设计了第三代载体，即从包装构建体中去除tat基因并从载体盒中对LTR尽兴灭活，从而减少与插入诱变效应有关的问题。

以下参考文献描述了各种慢病毒世代：第一代：Naldini等，(1996)Science272(5259):263-7；第二代：Zufferey等，(1997)Nat.Biotechnol.15(9):871-5；第三代：Dull等，(1998)J.Virol.72(11):8463-7，所有这些通过引用整体并入本文。关于慢病毒载体发展的综述可见于Sakuma等，(2012)Biochem.J.443(3):603-18和-Castro等，(2008)Exp.Opin.Therap.Patents18(5):525–539。

术语“非哺乳动物复制起点”是指引发复制并源自非哺乳动物源的核酸序列。这使得本发明的核酸载体能够在合适的宿主细胞(例如，微生物细胞，诸如细菌或酵母细胞)中与内源染色体一起稳定复制和分离，从而使其可以传递给宿主细胞后代(除了当宿主细胞是哺乳动物宿主细胞时)。在哺乳动物宿主细胞中，具有非哺乳动物复制起点的核酸载体将整合到哺乳动物宿主细胞的内源染色体中或在哺乳动物宿主细胞复制时丢失。例如，具有非哺乳动物复制起点的核酸载体诸如细菌人工染色体(BAC)、P1-衍生的人工染色体(PAC)、黏粒或福斯黏粒能够在细菌细胞(诸如大肠杆菌)中与内源染色体一起稳定复制和分离，但是如果将它们引入哺乳动物宿主细胞，BAC、PAC、黏粒或福斯黏粒将整合或在哺乳动物宿主细胞复制时丢失。酵母人工染色体(YAC)能够在酵母细胞中与内源染色体一起稳定复制和分离，然而如果它们被引入哺乳动物宿主细胞，YAC将整合或在哺乳动物宿主细胞复制时丢失。因此，在本文中，本发明的核酸载体作为DNA存储库(即，对于产生逆转录病毒所必需的基因)，其可容易地转移到哺乳动物细胞中以产生用于产生逆转录病毒的稳定细胞系。非哺乳动物复制起点的实例包括细菌的复制起点，诸如oriC、oriV或oriS，或酵母的复制起点，也称为自主复制序列(ARS元件)。

本发明的核酸载体包含非哺乳动物的复制起点并且能够保持至少25千碱基(kb)的DNA。在一个实施方案中，核酸载体能够保持至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340或350kb的DNA。应该理解的是，提及“保持能力”具有其通常的含义，并且暗示核酸载体的插入片段大小的上限不小于要求保护的大小(即不小于25kb的DNA)。

本发明的目的是在单一构建体(即核酸载体)中包含逆转录病毒包装所必需的基因。因此，本发明的核酸载体必须能够保持大的DNA插入片段。为避免疑义，应理解的是，提及“核酸载体”或“人工染色体”不是指天然细菌质粒(例如，诸如目前在瞬时转染方法中使用的质粒)，因为它们不能够保持至少25kb的DNA。质粒可包含的最大尺寸插入片段约为15kb。此类核酸载体也不是指通常仅保留5-11kb的最大插入片段的噬菌体。因此，在一个实施方案中，本发明的核酸载体不是质粒、噬菌体或附加体。

术语“内源染色体”是指在产生或引入外源核酸载体诸如细菌人工染色体之前在宿主细胞中发现的基因组染色体。

如本文所用，术语“转染(transfection)”、“转化(transformation)”和“转导(transduction)”可用于描述将非哺乳动物或病毒的载体插入靶细胞。插入载体通常称为细菌细胞转化和真核细胞转染，尽管插入病毒载体也可称为转导。本领域技术人员将了解通常使用的不同的非病毒转染方法，其包括但不限于使用物理方法(例如，电穿孔、细胞挤压(cell squeezing)、声致穿孔、光学转染、原生质体融合、撞击转染(impalefection)、磁转染、基因枪或颗粒轰击)、化学试剂(例如，磷酸钙、高度支化的有机化合物或阳离子聚合物)或阳离子脂质(例如，脂质转染)。许多转染方法需要使质粒DNA溶液接触细胞，然后使其生长并选择用于标记基因表达。

术语“启动子”是指驱动基因表达的序列。为了驱动高水平表达，使用高效启动子诸如非逆转录病毒高效启动子可以是有益的。合适的启动子的实例可以包括诸如人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或人延伸因子1-α(pEF)启动子。

Tet操纵子(四环素控制的转录激活)可用于可诱导基因表达的方法中，其中在抗生素四环素或其衍生物之一(例如多西环素)存在下可逆地启动或关闭转录。在自然界中，Ptet启动子表达TetR(阻遏蛋白)和TetA(将四环素抗生素泵出细胞的蛋白)。在本发明中，Tet操纵子可以存在或不存在，例如，在一个实施方案中，Tet操纵子可以存在于启动子中。

术语“选择标记”是指将有助于选择活性表达插入基因(例如转基因)的细胞的基因。合适的选择标记的实例包括编码对抗生素具有抗性(即抗生素抗性基因)的酶，例如卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟菌素或zeocin。合适的选择标记的另一个实例是荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或蓝色荧光蛋白(BFP)。

术语“polyA信号”是指聚腺苷酸化信号序列，例如置于转基因的3'，其使得宿主因子能够在转录期间将聚腺苷(polyA)尾部添加至新生mRNA的末端。polyA尾部是一段多达300个腺苷核糖核苷酸的序列，其保护mRNA免于酶促降解并且还有助于翻译。因此，本发明的核酸载体可以包括polyA信号序列，诸如人β珠蛋白或兔β珠蛋白polyA信号、猿病毒40(SV40)早期或晚期polyA信号、人胰岛素polyA信号或牛生长激素polyA信号。在一个实施方案中，polyA信号序列是人β珠蛋白polyA信号。

术语“内含子序列”是指通过RNA剪接从最终基因产物中除去的核苷酸序列。已经显示在增强子/启动子区域的下游和cDNA插入片段的上游使用内含子可以增加基因表达的水平。表达的增加取决于特定的cDNA插入片段。因此，本发明的核酸载体可以包括内含子，例如人β珠蛋白内含子、兔β珠蛋白内含子II或嵌合人β珠蛋白-免疫球蛋白内含子。在一个实施方案中，内含子是人β珠蛋白内含子和/或兔β珠蛋白内含子II。

术语“包装细胞系”是指具有稳定插入的gag和pol蛋白以及包膜糖蛋白基因的细胞系。或者，术语“生产细胞系”是指具有包含感兴趣的转基因的稳定插入的转移载体的包装细胞系。本领域技术人员将理解，本文所述的核酸载体可用于生成包装细胞系(即当至少gag、pol和env基因存在于核酸载体上且并入宿主细胞时)或生产细胞系(即当核酸载体附加地包含将与gag、pol和env基因一起并入宿主细胞中的转移载体成分时)。

术语“稳定转染的”是指能够将引入的逆转录病毒基因传递给它们的后代(即子细胞)的细胞系，这是因为转染的DNA已经并入内源染色体或经由外源染色体的稳定遗传。

核酸载体

根据本发明的一个方面，提供了包含非哺乳动物复制起点和能够保持至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的逆转录病毒核酸序列：

gag和pol蛋白，和

env蛋白或其功能性替代物。

具体而言，每种逆转录病毒核酸序列可作为核酸载体内的单独表达构建体排列。

目前生成逆转录病毒载体的方法涉及将逆转录病毒基因瞬时转染到宿主细胞中。然而，这种方法存在很多缺点，因为这种方法成本高、费力且难以扩大规模。一种解决方案是设计一种稳定整合逆转录病毒包装基因的包装细胞系，以避免与瞬时转染相关的问题并减少可变异的逆转录病毒载体产量。

本发明人已经发现，本文所述的核酸载体可用于生成逆转录病毒包装细胞系，其改善了此前与逆转录病毒载体生产方法有关的困难。例如，生产逆转录病毒包装细胞系的已知方法包括在每个逆转录病毒基因被引入后进行多轮选择。这个过程可需要长达六个月的时间，而且需要大量的劳力。通过将所有逆转录病毒基因包含在核酸载体中，然后可以在单一步骤中将逆转录病毒基因插入哺乳动物宿主细胞的内源染色体中。因此，如本文所提出的，使用核酸载体将减少选择压力，减少沉默时间并且允许更快地筛选潜在的包装细胞。此外，被包含在核酸载体上的逆转录病毒基因将全部在单一基因座处被整合到哺乳动物宿主细胞的内源染色体中，这将降低单个逆转录病毒基因变得沉默的风险并确保所有逆转录病毒基因均匀表达。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列。应该理解，逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组通常被包括在用于瞬时转染方法的“转移载体”上。转移载体质粒通常含有启动子(诸如CMV)、3'LTR(可以是或不是自失活的(即SIN)3'-LTR)、5'LTR(可以包含或不包含U5区域)、壳体化序列(ψ)和与启动子连接的潜在的转基因。

在一个实施方案中，逆转录病毒载体颗粒(即转移载体)的RNA基因组的多个拷贝被包含在核酸载体中。预期转移载体的多个拷贝会导致更高的病毒载体滴度。例如，核酸载体可以包括逆转录病毒载体颗粒(即转移载体)的RNA基因组的两个或更多个，诸如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个拷贝。

在一个实施方案中，核酸载体含有一个或多个重组位点。这允许靶序列在重组酶的存在下以位点特异性方式整合到哺乳动物宿主细胞的内源染色体中。重组酶在两个重组位点之间催化重组反应。

本领域已知许多类型的位点特异性重组系统，并且可以在本发明中使用任何合适的重组系统。例如，在一个实施方案中，重组位点选自或源自λ噬菌体的int/att系统、噬菌体P1的Cre/lox系统、酵母的FLP/FRT系统、噬菌体Mu的Gin/gix重组酶系统、Cin重组酶系统、大肠杆菌的Pin重组酶系统和pSR1质粒的R/RS系统或其任何组合。在另一个实施方案中，重组位点是att位点(例如来自λ噬菌体)，其中att位点允许在λ整合酶存在下的定点整合。应该理解的是，对“λ整合酶”的引用包括对仍与int/att系统相容的突变体整合酶的引用，例如在WO 2002/097059中描述的经修饰的λ整合酶。

在一个实施方案中，核酸载体选自：细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1-衍生人工染色体(PAC)、福斯黏粒或黏粒。在另一个实施方案中，核酸载体是细菌人工染色体(BAC)。

细菌人工染色体

术语“细菌人工染色体”或“BAC”是指源自细菌质粒的DNA构建体，该细菌质粒能够保持大型的外源DNA插入片段。它们通常可以保持约350kb的最大DNA插入片段。BAC是从被充分表征的细菌功能性致育质粒(F-质粒)发展来的，F-质粒含有促进质粒在细菌细胞分裂后均匀分布的分配基因。这使得BAC可以与内源细菌基因组(诸如大肠杆菌)一起被稳定复制和分离。BAC通常含有至少一个复制起点拷贝(诸如oriS或oriV基因)、repE基因(用于质粒复制和拷贝数调控)和分配基因(诸如sopA、sopB、parA、parB和/或parC)这确保了BAC在细菌细胞中的稳定维持。BAC是天然圆形的和超螺旋的，这使得它们比线性人工染色体诸如YAC更容易恢复。它们也可以使用简单的方法诸如电穿孔相对容易地被导入细菌宿主细胞。

在一个实施方案中，细菌人工染色体包含oriS基因。在一个实施方案中，细菌人工染色体包含repE基因。在一个实施方案中，细菌人工染色体包含分配基因。在另一个实施方案中，分配基因选自sopA、sopB、parA、parB和/或parC。在又一个实施方案中，细菌人工染色体包含sopA和sopB基因。

用于本发明的BAC可以从商业来源获得，例如来自LUCIGEN^TM的pSMART BAC(完整骨架序列参见Genome登录号EU101022.1)。该BAC含有L-阿拉伯糖“拷贝”系统，其也含有oriV中等拷贝复制起点，其仅在TrfA复制蛋白存在下才有活性。TrfA的基因可以在阿拉伯糖诱导型启动子araC-P_BAD的控制下整合到细菌宿主细胞的基因组(参见Wild等，(2002)GenomeRes.12(9):1434–1444)。L-阿拉伯糖的添加诱导TrfA的表达，TrfA激活oriV，导致质粒复制多达每个细胞50个拷贝。

酵母人工染色体

术语“酵母人工染色体”或“YAC”是指其中酵母DNA被整合到细菌质粒中的染色体。它们含有自主复制序列(ARS)(即复制起点)、着丝粒和端粒。与BAC不同，YAC是线性的，因此在染色体的每个末端含有酵母端粒，以在它传递到宿主细胞后代时保护末端免于降解。YAC可以保持一定范围的DNA插入片段大小；从100-2000kb的任何大小。

P1-衍生人工染色体

术语“P1-衍生人工染色体”或“PAC”是指来源于P1-噬菌体和细菌F-质粒的DNA的DNA构建体。它们通常可以保持大约100-300kb的最大DNA插入片段，并用作大肠杆菌中的克隆载体。PAC具有与BAC类似的优点，例如易于纯化并引入细菌宿主细胞。

黏粒和福斯黏粒

术语“黏粒”是指源自细菌质粒的DNA构建体，其另外含有源自噬菌体λ的cos位点。黏粒通常含有细菌复制起点(诸如oriV)、选择标记、克隆位点和至少一个cos位点。黏粒通常可以接受40-45kb的最大DNA插入片段。已证明黏粒在传染大肠杆菌细胞方面比标准细菌质粒更有效。术语“福斯黏粒”是指与黏粒类似的非哺乳动物核酸载体，除了其基于细菌F-质粒之外。特别是，他们使用F-质粒的复制起点和分配机制来允许克隆大的DNA片段。福斯黏粒通常可以接受40kb的最大DNA插入片段。

逆转录病毒

逆转录病毒是含有假二倍体单链RNA基因组的病毒家族。他们编码逆转录酶，其从RNA基因组产生DNA，然后该DNA可插入宿主细胞DNA。本文所述的发明可用于产生复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒。本发明的逆转录病毒载体颗粒可以选自或源自任何合适的逆转录病毒。

在一个实施方案中，逆转录病毒载体颗粒源自或选自慢病毒，α-逆转录病毒，γ-逆转录病毒或泡沫-逆转录病毒，诸如慢病毒或γ-逆转录病毒，特别是慢病毒。在另一个实施方案中，逆转录病毒载体颗粒是选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV和Visna的慢病毒。慢病毒能够传染不分裂(即静止)的细胞，这使得它们成为用于基因治疗的有吸引力的逆转录病毒载体。在又一个实施方案中，逆转录病毒载体颗粒是HIV-1或源自HIV-1。某些逆转录病毒的基因组结构可以在本领域中找到。例如，关于HIV-1的细节可以从NCBI Genbank(Genome登录号AF033819)中找到。HIV-1是最好理解的逆转录病毒之一，因此经常用作逆转录病毒载体。

逆转录病毒基因

所有逆转录病毒共有的核酸序列可以更详细地解释如下：

长末端重复序列(LTR)：逆转录病毒基因组的基本结构包含5'-LTR和3'-LTR，产生逆转录病毒所需的基因位于其间或其中。LTR是逆转录病毒整合和转录所必需的。它们也可以作为启动子序列来控制逆转录病毒基因的表达(即，它们是顺式作用基因)。LTR由三个划分为U3、R、U5的亚区组成：U3来源于RNA 3'末端特有的序列；R来源于在RNA两端重复的序列；U5来源于RNA 5'末端特有的序列。因此，在一个实施方案中，核酸载体另外包含5'-和3'-LTR。在另一个实施方案中，可以删除5'LTR的U5区并用非HIV-1polyA尾部替换(参见Hanawa等，(2002)Mol.Ther.5(3):242-51)。

为了解决与生成具有复制能力的病毒有关的安全性问题，已经通过删除3'LTR的U3区中的一个区段开发了一种自身失活型(SIN)载体，所述U3区包括TATA盒和转录因子Sp1和NF-κB的结合位点(参见Miyoshi等，(1998)J.Virol.72(10):8150-7)。在逆转录并整合到传染的细胞中后，该缺失被转移到5'LTR中，导致LTR的转录失活。这被称为基于自身失活型慢病毒的载体系统，其可以包括在本发明中。

ψ：借助位于逆转录病毒基因组5'末端的ψ(psi)序列发生逆转录病毒RNA的壳体化。本领域中众所周知的是，psi序列下游并延伸到gag编码区中的序列涉及有效的逆转录病毒载体产生(参见Cui等，(1999)J.Virol.73(7):6171–6176)。在一个实施方案中，核酸载体另外包含Ψ(psi)序列。

引物结合位点(PBS)：逆转录病毒基因组含有在5'-LTR的U5区之后存在的PBS。该位点结合启动逆转录所需的tRNA引物。在一个实施方案中，核酸载体另外包含PBS序列。

PPT：逆转录病毒基因组在逆转录病毒基因组的3'末端附近包含称为多嘌呤片段(PPT)的短延伸嘌呤。这些PPT在逆转录过程中起到用于正链DNA合成的RNA引物的作用。复杂的逆转录病毒(诸如HIV-1)含有第二个更位于中心的PPT(即，中心聚嘌呤区(cPPT))，其提供了用于启动DNA合成的第二个位点。已显示编码cPPT的逆转录病毒载体具有增强的转导和转基因表达(参见Barry等，(2001)Hum.Gene Ther.12(9):1103-8)。在一个实施方案中，核酸载体另外包含3'-PPT序列和/或cPPT序列。

上述非编码区的基因组结构是本领域技术人员所熟知的。例如，关于HIV-1中非编码区的基因组结构的细节可以从NCBI Genbank的Genome登录号AF033819中找到，或对于HIV-1HXB2(常用的HIV-1参考菌株)为Genome登录号K03455。在一个实施方案中，非编码区来源于Genome登录号K03455处的序列，例如来自碱基对454-1126(对于R-U5-PBS-Gag)，7622-8479(对于RRE)或7769-8146(对于RRE)，4781-4898(对于cPPT)，9015-9120和9521-9719(对于dNEF-PPT-sinU3-R-U5)。

Gag/pol：gag和pol基因的表达依赖于gag和gagpol之间的翻译移码。两者都是在成熟过程中被切割的多蛋白。逆转录病毒载体的主要结构基质、衣壳和核衣壳蛋白由gag编码。pol基因编码逆转录病毒酶：i)逆转录酶，逆转录酶对逆转录病毒RNA基因组向双链DNA的逆转录至关重要；ii)整合酶，其使逆转录病毒DNA基因组整合至宿主细胞染色体；以及iii)蛋白酶，其裂解合成的多蛋白以产生逆转录病毒的成熟和功能性蛋白。在一个实施方案中，编码gag和pol蛋白的逆转录病毒核酸序列来源于HIV-1HXB2序列，其可从Genome登录号K03455获得，例如从碱基对790-5105获得。

Env：env(“包膜”)基因编码逆转录病毒包膜的表面和跨膜成分(例如HIV-1的糖蛋白gp120和gp41)并参与逆转录病毒-细胞膜融合。为了拓宽逆转录病毒载体的组织嗜性，本文所述的逆转录病毒载体可以用来自另一种病毒的包膜蛋白假型化。假型化是指通过改变逆转录病毒载体颗粒上的糖蛋白(GP)，逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)的宿主细胞范围可以被扩展或改变的过程(例如，通过使用从其他包膜病毒获得或来源自其他包膜病毒的GP或使用合成/人工GP)。由于其广泛的嗜性和高载体颗粒稳定性，用于假型化逆转录病毒载体的最常用的糖蛋白是水泡性口膜炎病毒GP(VSVg)。然而，本领域技术人员应该理解，其他糖蛋白可以用于假型化(参见Cronin等，(2005)Curr.Gene Ther.5(4):387–398，其全部内容通过引用并入本文)。用于假型化的病毒的选择还可取决于待靶向的细胞和/或器官的类型，因为已经显示一些假型具有组织类型偏好。

在一个实施方案中，env蛋白或其功能替代物是从选自以下的病毒获得或来源自选自以下的病毒：水泡病毒属(例如水泡性口膜炎病毒)，狂犬病病毒属(例如，狂犬病病毒、莫克拉病毒(Mokola virus))，沙粒病毒(例如，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV))，甲病毒属(例如，罗斯河病毒(RRV)、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)、委内瑞拉马脑炎病毒)，线状病毒(例如，埃博拉病毒雷斯顿株、埃博拉病毒扎伊尔株、拉沙病毒)，α逆转录病毒属(例如，禽白血病病毒(ALV))，β逆转录病毒属(例如，绵羊肺腺瘤逆转录病毒(JSRV))，γ逆转录病毒(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)，长臂猿白血病病毒(GALV)、猫内源性逆转录病毒(RD114))，δ-逆转录病毒(例如人嗜T淋巴细胞病毒1型(HTLV-1))，泡沫病毒属(例如人泡沫病毒)，慢病毒(例如梅迪-维斯纳病毒(MVV))，冠状病毒(例如SARS-CoV)，呼吸道病毒(例如，仙台病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV))，丙型肝炎病毒属(例如丙型肝炎病毒(HCV))，流感病毒(例如A型流感病毒)和核型多角体病毒(例如苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV))。在另一个实施方案中，env蛋白或其功能性替代物得自或来自水泡性口膜炎病毒。在该实施方案中，可以使用水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSVg)的蛋白，其使逆转录病毒颗粒传染更广泛的宿主细胞范围并消除重组产生野生型包膜蛋白的机会。在另一个实施方案中，编码env蛋白或其功能性替代物的逆转录病毒核酸序列来自Genome登录号J02428.1处的序列，例如来自碱基对3071至4720。

本文所述的结构基因对于所有逆转录病毒都是共同的。其他辅助基因可存在于不同类型的逆转录病毒中。例如，慢病毒，诸如HIV-1，含有另外六种称为rev、vif、vpu、vpr、nef和tat的辅助基因。其他逆转录病毒可能具有与本文描述的基因类似的辅助基因，然而它们可能并不总是被赋予与文献中相同的名称。诸如Tomonaga和Mikami(1996)J.Gen.Virol.77(Pt8):1611–1621描述了各种逆转录病毒辅助基因。

Rev：辅助基因rev(“病毒粒子的调节子”)编码与Rev应答元件(RRE)结合并促进逆转录病毒转录物输出的辅助蛋白。该基因的蛋白产物允许含有Rev应答元件(RRE)的逆转录病毒mRNA片段从细胞核输出到细胞质中。预测RRE序列以形成复杂的折叠结构。rev的这一特殊作用反映了拼接和核输出步骤的紧密结合。在一个实施方案中，核酸载体包含RRE序列。在另一个实施方案中，RRE序列来自HIV-1HXB2序列，其可从Genome登录号K03455处获得，例如从碱基对7622至8479或7769至8146，特别是碱基对7622至8479。

Rev与RRE结合并促进单一剪接(env、vif、vpr和vpu)或非剪接(gag、pol和基因组RNA)病毒转录物的输出，从而导致下游事件如基因翻译和包装(参见Suhasini和Reddy(2009)Curr.HIV Res.7(1):91-100)。在一个实施方案中，核酸载体另外包含辅助基因rev或类似它的基因(即，来自其它逆转录病毒或功能类似系统)。包含rev基因确保了逆转录病毒载体基因组的RNA转录物从细胞核有效地输出到细胞质，特别是如果RRE元件也包含在待转运的转录物中。在另一个实施方案中，rev基因与Genome登录号M11840(即HIV-1克隆12cDNA，HIVPCV12基因座)的碱基对970至1320具有至少60％序列同一性，诸如至少70％序列同一性。在可选的实施方案中，rev基因与Genome登录号K03455.1(即人类免疫缺陷病毒1型，HXB2)的碱基对5970至6040和8379至8653具有至少60％序列同一性，诸如至少70％、80％、90％或100％序列同一性。

辅助基因被认为在逆转录病毒复制和发病机制中起作用，因此许多当前的病毒载体生产系统不包括这些基因中的一些。通常存在的rev是一个例外，或者可使用类似于rev/RRE系统的系统。因此，在一个实施方案中，编码一种或多种辅助基因vpr、vif、vpu、tat和nef或类似辅助基因的核酸序列被破坏，使得所述辅助基因从逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组中被去除或不能编码功能辅助蛋白。在另一个实施方案中，至少两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或全部辅助基因vpr、vif、vpu、tat和nef或类似辅助基因被破坏，使得所述辅助基因从逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组中被去除或不能编码功能辅助蛋白。去除功能辅助基因可不需要去除整个基因；除去部分基因或破坏基因就足够了。

应该理解，编码复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的核酸序列可以与逆转录病毒载体颗粒所基于的逆转录病毒的野生型基因相同或来源于该逆转录病毒的野生型基因，即，序列可以是包含在野生型病毒中的遗传上或其他方式改变版本的序列。因此，引入核酸载体或宿主细胞基因组中的逆转录病毒基因也可以指野生型基因的密码子优化版本。

附加成分

本发明的核酸载体可以包含另外的附加成分。例如，可以使用这些附加特征例如来帮助稳定转录物进行翻译，增加基因表达水平并打开/关闭基因转录。

本发明产生的逆转录病毒载体颗粒可用于基因治疗的方法中。因此，在一个实施方案中，核酸载体另外包含一种或多种转基因。该转基因可以是治疗活性基因，其编码可用于治疗或改善靶疾病的基因产物。转基因可编码例如反义RNA、核酶、蛋白(例如肿瘤抑制蛋白)、毒素、抗原(其可用于诱导抗体或辅助性T细胞或细胞毒性T细胞)或抗体(诸如单链抗体)。在一个实施方案中，转基因编码β珠蛋白。

预期含有转基因的转移载体的多个拷贝导致更高的逆转录病毒载体滴度，因此在一个实施方案中，核酸载体包含转基因的多个拷贝，例如两个或更多个，特别是三个或更多个转基因的拷贝。在一些情况下，需要多于一种的基因产物来治疗疾病，因此在另一个实施方案中，核酸载体附加地包含两种或更多种，诸如三种或更多种或四种或更多种不同的转基因。

本文中提到的“转基因”是指异源或外源DNA，其在其被导入的哺乳动物宿主细胞中不存在或未充分表达。这可包括，例如，当靶基因在哺乳动物宿主细胞中没有正确表达时，因此导入了靶基因的修正版本作为转基因。因此，转基因可以是具有潜在治疗意义的基因。转基因可已经从另一种细胞类型或其他物种获得，或合成制备。或者，转基因可已从宿主细胞获得，但可操作地连接至与天然基因中存在的那些不同的调控区。或者，转基因可以是存在于宿主细胞中的基因的不同等位基因或变体。

基因治疗的目的是为了治疗目的而修饰活细胞的遗传物质，并且它涉及将功能基因插入细胞中以达到治疗效果。使用本文所述的核酸载体和宿主细胞产生的逆转录病毒载体可以用于转染靶细胞并诱导具有潜在治疗意义的基因的表达。因此逆转录病毒载体可用于治疗患有包括但不限于遗传性疾病、癌症和某些病毒感染的病症的哺乳动物受试者，诸如人受试者。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含转录调控元件。例如，本文描述的任何元件可以可操作地连接至启动子，以便可以控制表达。本文提及的启动子可以包括已知的启动子(完整的或一部分)，其可以是持续性活化的或可诱导的，例如，在调控蛋白存在的情况下。在一个实施方案中，核酸载体另外包含高效启动子，诸如CMV启动子。该启动子具有促进在非哺乳动物核酸载体上编码的元件的高水平表达的优点。在另一个实施方案中，CMV启动子包含源自人巨细胞病毒株AD169的序列。该序列可从Genome登录号X17403处获得，例如从碱基对173731至174404。

在一个实施方案中，启动子(诸如CMV启动子)另外包含至少一个Tet操纵子。Tet操纵子系统可用于控制核酸载体内所含逆转录病毒序列的表达。简而言之，Tet阻遏蛋白通过结合被导入启动子的Tet操纵子位点来阻断表达。因此，当Tet阻遏蛋白与Tet操纵子结合时，没有基因表达。在添加四环素或多西环素时，Tet阻遏蛋白被隔离以允许启动子活性，因此开启基因表达。Tet操纵子系统是广泛可用的，诸如可从Invitrogen获得的pcDNA^TM4/TO哺乳动物表达载体中使用的Tet操纵子。

在一个实施方案中，核酸载体附加地包含四环素抗性操纵子阻遏蛋白(“Tet阻遏蛋白”或“TetR”)。在另一个实施方案中，Tet阻遏蛋白是密码子优化的。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含绝缘子，诸如染色质绝缘子。术语“绝缘子”是指阻断启动子和增强子之间相互作用的基因序列。在另一个实施方案中，绝缘子(诸如染色质绝缘子)存在于每个逆转录病毒核酸序列之间。这有助于防止相邻逆转录病毒核酸序列之间的启动子干扰(即，来自一个转录单元的启动子削弱相邻转录单元的表达)。将理解的是，如果绝缘子存在于各逆转录病毒核酸序列之间的核酸载体中，那么它们可以作为核酸载体内的单独表达构建体排列。例如，编码逆转录病毒核酸序列的每个序列都具有其自身的启动子和/或内含子和/或polyA信号。在一个实施方案中，染色质绝缘子与鸡(Gallusgallus)HS4绝缘子序列(例如参见Genome登录号U78775.2，碱基对1至1205)具有至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含选择标记。这使得可以选择被引入了编码复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的核酸序列的细胞。在另一个实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因，诸如zeocin、卡那霉素或嘌呤霉素抗性基因，特别是zeocin(ZeoR)抗性基因。在又一个实施方案中，zeocin抗性基因源自Streptoalloteichus hindustans ble基因，例如参见GenBank登录号X52869.1，从碱基对3至377。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含polyA信号。polyA信号的使用具有保护mRNA免于酶促降解并帮助翻译的优点。在另一个实施方案中，polyA信号得自或源自SV40、牛生长激素和/或人β珠蛋白40。在一个实施方案中，polyA信号源自SV40早期polyA信号(例如参见Genome登录号EF579804.1，来自负链的碱基对2668至2538)。在一个实施方案中，polyA信号源自人β珠蛋白polyA信号(例如，参见Genome登录号GU324922.1，碱基对3394至4162)。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含内含子序列。已知在增强子/启动子区下游和cDNA插入片段(即转基因)上游使用内含子增加了插入片段的表达水平。在另一个实施方案中，内含子序列是人β珠蛋白内含子或兔β珠蛋白内含子II序列。在一个实施方案中，人β珠蛋白内含子源自Genome登录号KM504957.1处的序列(例如来自碱基对476至1393)。在一个实施方案中，兔β珠蛋白内含子II源自Genome登录号V00882.1处的序列(例如，来自碱基对718至1290)。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。WPRE的存在已经显示出增强表达，因此可有利于获得高水平的表达。在另一个实施方案中，WPRE源自Genome登录号J04514.1处可获得的序列(例如，来自碱基对1093至1684)。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含内部核糖体进入位点(IRES)。IRES是结构化的RNA元件，其通常存在于5'-帽下游的5'-非翻译区(其是装配起始复合物所需的)。IRES被翻译起始因子所识别，并允许不依赖帽翻译。在另一个实施方案中，IRES源生自脑心肌炎病毒(EMCV)基因组(例如，参见Genome登录号KF836387.1，碱基对151至724)。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含多克隆位点(MCS)。MCS是含有多个限制性位点(例如10、15或20个位点)的核酸载体内的DNA短片段。这些位点通常在核酸载体内仅出现一次，以确保核酸内切酶仅在一个位点处切割。这允许使用合适的核酸内切酶(即限制酶)容易地插入逆转录病毒基因。

本领域技术人员将理解，构建体可以在核酸载体内以任何顺序排列。在一个示例性实施方案中，核酸载体包含以下插入片段：编码gag和pol蛋白的逆转录病毒核酸序列，编码env蛋白或其功能性替代物(诸如VSVg)的逆转录病毒核酸序列，编码辅助基因rev(例如密码子优化的rev序列)或其类似基因或功能类似系统的逆转录病毒核酸序列，四环素抗性操纵子阻遏蛋白(TetR)，内部核糖体进入位点和选择标记(诸如zeocin抗性选择标记)(即，GagPol-Env-Rev-Tet阻遏蛋白-IRES-抗生素抗性标记-剩余的BAC序列(“BAC骨架”)；诸如：GagPol-(野生型)VSVg-(密码子优化的)Rev–Tet阻遏蛋白-IRES-Zeocin抗性-pSMARTBAC)。在另一个实施方案中，绝缘子(诸例如染色质绝缘子)存在于每个gagpol、env和rev序列之间。在另一个实施方案中，启动子存在于每个gagpol、env和rev序列之前。在又一个实施方案中，转移载体序列的至少一个拷贝(即，包含编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列)存在于gagpol序列之前。

在一个实施方案中，核酸载体包含以下插入片段：绝缘体(诸如染色质绝缘子)，启动子(诸如任选包含Tet操纵子序列的CMV启动子)，内含子(诸如人β珠蛋白内含子)，编码gag和pol蛋白的逆转录病毒核酸序列，编码RRE的逆转录病毒核酸，polyA信号(例如人β珠蛋白polyA信号)，绝缘子(诸如染色质绝缘子)，启动子(诸如任选地包含Tet操纵子序列的CMV启动子)，内含子(诸如人β珠蛋白内含子)，编码env蛋白或其功能性替代物的逆转录病毒核酸序列(诸如VSVg)，polyA信号(诸如人β珠蛋白polyA信号)，绝缘子(诸如染色质绝缘子)，启动子(诸如任选包含Tet操纵子序列的CMV启动子)，编码辅助基因rev或其类似基因或功能性相似系统的逆转录病毒核酸序列，polyA信号(诸如人β珠蛋白polyA信号)，绝缘体(诸如染色质绝缘子)，启动子(诸如CMV启动子)，内含子(诸如兔β珠蛋白内含子)，四环素抗性操纵子阻遏蛋白(TetR)，内部核糖体进入位点，选择标记(诸如zeocin抗性选择标记)，polyA信号和多克隆位点。

可以将核酸序列依次引入核酸载体中。这允许在每次整合后进行选择，以确保所有需要的核酸序列均成功整合到核酸载体中。或者，将至少两个或更多个核酸序列同时引入核酸载体中。

应该理解，可以通过本领域已知的标准分子克隆技术，例如使用限制性核酸内切酶和连接技术，将本文所述的附加基因引入核酸载体中。此外，可以通过标准技术(诸如，电穿孔)将核酸载体，特别是BAC、PAC、福斯黏粒和/或黏粒引入细菌宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞，特别是大肠杆菌菌株DH10B)。

用途

根据本发明的另一方面，提供了用于产生逆转录病毒包装或生产细胞系的如本文所定义的核酸载体。

本文描述的核酸载体可用于产生逆转录病毒包装细胞系，其将大大简化逆转录病毒载体的生产。应该理解，如果转基因被包含在核酸载体上，那么这将用于产生生产细胞系。

如本文所述，开发稳定的逆转录病毒包装(或生产)细胞系以克服与瞬时转染相关的困难将是有用的。本文所述的核酸载体可以用于制备所述包装细胞系，因为它们能够保持含有逆转录病毒包装所需的必需基因的大型DNA插入片段，然后可以在一个步骤中将该基因整合到哺乳动物宿主细胞的内源基因组中。

宿主细胞

根据本发明的另一方面，提供了逆转录病毒包装细胞，其包含编码以下的核酸序列：

gag和pol蛋白；和

env蛋白或其功能性替代物，

其中所述核酸序列全部位于逆转录病毒包装细胞基因组内的单一基因座。

将所有逆转录病毒基因包括在大型核酸载体中的优点在于，它们可以首先在微生物细胞(诸如细菌或酵母细胞)中制备，其易于操作和操纵，然后在单一步骤中整合到哺乳动物细胞中。一旦逆转录病毒基因被整合到哺乳动物宿主细胞中，这就减轻了选择压力并减少沉默时间。该方法的特征在于，创建包装细胞系所需的所有逆转录病毒基因都存在于内源基因组的单一基因座中，而不是随机分散在整个内源基因组中。这具有产生以同一水平表达所有逆转录病毒基因的逆转录病毒包装细胞的优点，因为所有的逆转录病毒基因都位于同一基因座，相比之下，在先前的方法中逆转录病毒基因随机整合到整个内源基因组中，这可导致不均匀的水平的表达。

在一个实施方案中，逆转录病毒包装细胞附加地包含编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列。其也可以与编码gag和pol蛋白以及env蛋白或其功能性替代物的核酸序列位于单一基因座中。

因此，根据本发明的另一方面，提供了一种产生逆转录病毒的细胞，其包含编码以下的核酸序列：

gag和pol蛋白；

env蛋白或其功能性替代物；和

逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组，

其中所述核酸序列全部位于产生逆转录病毒的细胞基因组内的单一基因座。

在一个实施方案中，逆转录病毒包装细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，哺乳动物细胞选自HEK 293细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、KS62细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物或功能等同物。在又一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞是HEK 293细胞，或源自HEK 293细胞。这样的细胞可以是贴壁细胞系(即它们以附着于表面的单层生长)或悬浮适应/非贴壁细胞系(即它们在培养基中悬浮生长)。在又一个实施方案中，HEK 293细胞是HEK293T细胞。术语“HEK 293细胞”是指通常用于生物技术的人胚肾293细胞系。具体而言，HEK293T细胞通常用于生产各种逆转录病毒载体。合适的市售细胞系的其他实例包括T-REX^TM(Life Technologies)细胞系。

应该理解的是，上文针对核酸载体描述的所有实施方案也可以应用于本发明的逆转录病毒包装/生产细胞。

方法

(a)将如本文所述的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和

(b)在培养物中选择具有在整合到哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。

在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞选自HEK 293细胞、HEK 6E细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、KS62细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物或功能等同物。在另一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞是HEK 293细胞，或源自HEK 293细胞。这样的细胞可以是贴壁细胞系(即它们以附着于表面的单层生长)或悬浮适应/非贴壁细胞系(即它们在培养基中悬浮生长)。在又一个实施方案中，HEK 293细胞是HEK 293T细胞或HEK 6E细胞。合适的市售细胞系的其他实例包括T-REX^TM(Life Technologies)细胞系。

本领域技术人员将意识到，可以使用本领域已知的合适方法，例如脂质介导的转染、显微注射、细胞(如微细胞)融合、电穿孔或微粒轰击，以将核酸载体引入宿主细胞。在一个实施方案中，通过电穿孔将核酸载体引入宿主细胞。应该理解，用于引入核酸载体的方法的选择可以根据使用的哺乳动物宿主细胞的类型来选择。

一旦进入哺乳动物宿主细胞内，核酸载体将被随机整合到哺乳动物宿主细胞的内源基因组中。因此，该方法还包括选择其中已经整合了在核酸载体上编码的核酸的哺乳动物宿主细胞(例如，使用抗生素抗性选择标记，诸如zeocin抗性标记)。

本领域技术人员将知晓促进核酸载体整合的方法，例如，如果核酸载体是天然的环状(例如，BAC、PAC、黏粒或福斯黏粒)，则线性化该核酸载体。核酸载体可以另外包含与哺乳动物宿主细胞的内源染色体共有同源性的区域，以引导整合至内源基因组内的选定位点。此外，如果重组位点存在于核酸载体上，则这些可用于靶向重组。例如，核酸载体可含有loxP位点，其与Cre重组酶(即使用来自P1噬菌体的Cre/lox系统)组合时允许靶向整合。或者(或另外)，重组位点是att位点(例如来自λ噬菌体)，其中att位点允许在λ整合酶存在下进行定点整合。这将允许逆转录病毒基因靶向内源基因组中的基因座，其允许高表达和/或稳定表达。

其他靶向整合方法在本领域中是众所周知的。例如，可以使用诱导基因组DNA的靶向切割的方法来促进选定染色体基因座处的靶向重组。这些方法通常涉及使用工程化切割系统来诱导内源基因组中的双链断裂(DSB)或切口以通过天然过程(例如非同源性末端接合(NHEJ))修复断裂或使用修复模板修复(即，同源性定向修复或HDR)。

通过使用特定的核酸酶诸如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子(诸如效应物核酸酶)(TALEN)、使用CRISPR/Cas9系统和工程化的crRNA/tracr RNA('单向导RNA')指导特异性切割和/或使用基于Argonaute系统的核酸酶(例如来自嗜热菌(T.thermophilus)，称为'TtAgo'，参见Swarts等，(2014)Nature507(7491):258-261)可发生切割。使用这些核酸酶系统之一的靶向切割可以利用HDR或NHEJ介导的过程将核酸插入特定的靶位置。因此，在一个实施方案中，该方法还包括使用至少一种核酸酶将在核酸载体上编码的核酸序列整合到哺乳动物宿主细胞的基因组(即内源染色体)中，其中所述至少一种核酸酶切割哺乳动物宿主细胞的基因组，使得核酸序列整合到细胞的基因组中。在另一个实施方案中，所述至少一种核酸酶选自锌指核酸酶(ZFN)，TALE核酸酶(TALEN)，CRISPR/Cas核酸酶系统及其组合。

根据本发明的另一方面，提供了通过本文定义的方法获得的逆转录病毒包装细胞。

使用本文定义的方法获得的细胞系可用于产生高滴度的逆转录病毒载体。

本文中对术语“高滴度”的引用是指能够转导靶细胞诸如患者细胞的有效量的逆转录病毒载体或颗粒。在一个实施方案中，高滴度为，超过10⁶TU/ml而没有浓缩(TU＝转导单位)。

(a)将如本文所定义的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；

(b)在培养物中选择具有在被整合到哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞；和

如上所述，在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞选自HEK 293细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、KS62细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物或功能等同物。在另一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞是HEK 293细胞，或源自HEK 293细胞。这样的细胞可以是贴壁细胞系(即它们以附着于表面的单层生长)或悬浮适应/非贴壁细胞系(即它们在培养基中悬浮生长)。在又一个实施方案中，HEK 293细胞是HEK 293T细胞。合适的市售细胞系的其他实例包括T REX^TM(Life Technologies)细胞系。

本领域技术人员将理解，在此描述的方法中使用的条件将取决于所使用的宿主细胞。典型的条件，例如要使用的培养基或温度，是本领域众所周知的。在一个实施方案中，培养是通过在潮湿条件下孵育哺乳动物宿主细胞来进行的。在另一个实施方案中，加湿条件包括在37℃、5％CO₂下温育转染的细胞。在一个实施方案中，使用选自以下的培养基进行培养：包含10％(vol/vol)胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良伊格尔培养基(DMEM)，无血清UltraCULTURE^TM培养基(Lonza，目录号12-725F)或FreeStyle^TM表达培养基(Thermofisher，目录号12338-018)。

在一个实施方案中，该方法还包括分离复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒。例如，在一个实施方案中，通过使用过滤器来进行分离。在另一个实施方案中，过滤器是低蛋白质结合膜(例如，0.22μm低蛋白质结合膜或0.45μm低蛋白质结合膜)，诸如聚偏氟乙烯(PVDF)或聚醚砜(PES)人造膜。

一旦进入哺乳动物宿主细胞内，存在于核酸载体上的逆转录病毒核酸可被整合到内源基因组内的随机、单一基因座中。整合步骤可以如上文所述被促进，例如使用线性化和/或共享同源性的区域。重组位点也可用于靶向重组。

如果靶基因被整合到具有选择标记(诸如抗生素抗性基因)的内源染色体中，则该方法可以还包括选择其中逆转录病毒核酸已被成功整合的哺乳动物宿主细胞。

一旦分离，逆转录病毒载体颗粒可以浓缩用于体内应用。浓缩方法包括例如超速离心、沉淀或阴离子交换色谱。超速离心作为小规模逆转录病毒载体浓缩的快速方法是有用的。或者，阴离子交换色谱(例如使用Mustang Q阴离子交换膜盒)或沉淀(例如使用PEG6000)对于处理大体积的慢病毒载体上清液特别有用。

根据本发明的另一方面，提供了通过本文定义的方法获得的复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒。

现在将参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。

实施例

实施例1：构建指南

图1显示了构建BACpack-WTGP-277delU5和BACpack-SYNGP-277delU5的分步指南。由于XbaI和NheI消化物的相容末端，慢病毒包装基因逐渐被加载到pSmart BAC载体中。在添加GagPol时，制备了2种构建体，其含有野生型GagPol(WTGP)或密码子优化的GagPol，SYNGP。这些被分别命名为BACpack-WTGP和BACpack-SYNGP。然后将转移盒加载到这两种构建体上，并因此生成BACpackWTGP-277delU5和BACpackSYNGP-277delU5。

实施例2：选择稳定的多克隆集合体

通过用BACpackSYNGP-277delU5或BACpackWTGP-277delU5转染贴壁细胞系HEK293T生成多克隆稳定转染子集合体。然后用Zeocin选择成功的整合事件。

为了评估这些多克隆集合体生成慢病毒载体的能力，将细胞用多西环素诱导(I)或保持未诱导(UI)并与未转染的HEK293T细胞进行比较。

结果显示了从每种转染条件收获的慢病毒载体上清液的滴度，单位为转导单位(TU)/mL。从图2的滴定结果可以看出，用BACpackSYNGP-277delU5或BACpackWTGP-277delU5生成的稳定多克隆集合体能够产生10e7TU/mL数量级浓度的慢病毒载体，其与当前的瞬时转染系统相当。

结果证实含有慢病毒生产所必需的所有包装基因的单一BAC载体可以生成能够产生合适滴度的慢病毒载体的细胞系。

实施例3：生成稳定的转染悬浮克隆

使用BAC技术生成慢病毒载体产生细胞系的主要目的是迅速将新的进展应用于平台。这些进展可包括修改特定细胞系。例如，通过在悬浮细胞中生产生物产品来增加产量是行业标准，因为它们的生长密度高于贴壁细胞。然而，目前的慢病毒载体生产系统依赖于高转染率，其在悬浮细胞中比贴壁HEK293T细胞更难以实现。由于选择了成功的整合体，当生成稳定的细胞系时转染效率不太受关注，BAC构建体是生成慢病毒载体产生悬浮细胞系的理想解决方案。

如前所述，BAC构建体能够从贴壁HEK293T细胞生成慢病毒载体生产细胞系。为了证明BAC构建体的灵活性，从悬浮细胞系HEK293 6E生成稳定的转染细胞系。用BAC构建体BACpackWTGP-277delU5转染HEK293 6E细胞，然后用Zeocin选择。随后通过克隆生成克隆细胞系。图3中的结果显示稳定细胞系所生成的GFP信号。这表明在转移载体片段中存在Zeocin抗性和功能性GFP表达盒。

该结果表明BAC构建体能够从多种细胞系生成稳定的克隆。

实施例4：在悬浮克隆中诱导慢病毒

为了证实稳定悬浮克隆产生慢病毒载体的能力，用2μg/ml多西环素诱导克隆1、14、15和16，通过转导HEK293T细胞测量上清液的病毒滴度。

图4中的结果显示了从每个克隆收获的慢病毒载体上清液的滴度，以转导单位(TU)/mL示出。结果清楚地表明通过用BACpackWTGP-277delU5稳定转染悬浮细胞系HEK2936E生成的细胞系能够产生与现有的瞬时转染系统相当的产量的慢病毒载体。

实施例5：克隆的载体滴度

将如图4所述的克隆1和16在培养物中传代并在稍后的时间点诱导和滴定，以确定从这些高产克隆的载体生产是否稳定。如图5A和5B所示，来自这些克隆的载体滴度实际上在第5代和第21代之间适度增加，这是由于引入诱导方法中的丁酸钠浓度的增加。

应该理解，这里描述的实施方案可以应用于本发明的所有方面。此外，在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，通过引用并入本文，如同完全阐述一样。

Claims

1.一种产生逆转录病毒的细胞，其包含编码以下核酸序列：

gag和pol蛋白；

env蛋白或其功能性替代物；和

逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组，

2.如权利要求1所述的产生逆转录病毒的细胞，还包含辅助基因rev或其类似基因或功能类似系统。

3.如权利要求1或2所述的产生逆转录病毒的细胞，其中逆转录病毒核酸序列源自选自慢病毒、α-逆转录病毒、γ-逆转录病毒或泡沫逆转录病毒的逆转录病毒。

4.如权利要求3所述的产生逆转录病毒的细胞，其中逆转录病毒核酸序列源自选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV和Visna的慢病毒。

5.如权利要求4所述的产生逆转录病毒的细胞，其中逆转录病毒核酸序列源自HIV-1。

6.如权利要求1至5中任一项所述的产生逆转录病毒的细胞，其中env蛋白或其功能性替代物源自水泡性口膜炎病毒。

7.如权利要求1至6中任一项所述的产生逆转录病毒的细胞，还包含转录调控元件。

8.如权利要求7所述的产生逆转录病毒的细胞，其中转录调控元件是CMV启动子。

9.如权利要求8所述的产生逆转录病毒的细胞，其中CMV启动子还包含至少一个Tet操纵子。

10.如权利要求1至9中任一项所述的产生逆转录病毒的细胞，还包含四环素抗性操纵子阻遏蛋白(TetR)。

11.如权利要求1至10中任一项所述的产生逆转录病毒的细胞，还包含绝缘子。

12.如权利要求11所述的产生逆转录病毒的细胞，其中在每个逆转录病毒核酸序列之间存在绝缘子。

13.如权利要求1至12中任一项所述的产生逆转录病毒的细胞，还包含选择标记。

14.如权利要求1至13中任一项所述的产生逆转录病毒的细胞，还包含一个或多个转基因。

15.如权利要求1至14中任一项所述的产生逆转录病毒的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

16.一种包含非哺乳动物复制起点且能够保持至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的逆转录病毒核酸序列：

gag和pol蛋白，和

env蛋白或其功能性替代物，

其中每个逆转录病毒核酸序列在核酸载体内作为单独的表达构建体排列。

17.如权利要求16所述的核酸载体，还包含编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列。

18.如权利要求16或17所述的核酸载体，还包含辅助基因rev或其类似基因或功能类似系统。

19.如权利要求16至18中任一项所述的核酸载体，其中载体选自：细菌人工染色体、酵母人工染色体、P1-衍生的人工染色体、福斯黏粒或黏粒。

20.如权利要求19所述的核酸载体，其中载体为细菌人工染色体。

21.一种生产稳定的逆转录病毒包装细胞系的方法，包括：

(a)将权利要求16至20中任一项所述的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和

(b)在培养物中选择具有在被整合到哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。

22.如权利要求21所述的方法，其中哺乳动物细胞是HEK 293细胞。

23.一种由权利要求21或22所述的方法获得的逆转录病毒包装细胞。

24.一种生产复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的方法，包括：

(a)将权利要求16至20中任一项所述的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；

25.如权利要求24所述的方法，还包括分离复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒。

26.一种由权利要求24或25所述的方法获得的复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒。