DE102016122316A1 - Stabile zelllinien für retrovirale produktion - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft retrovirale Produzentenzelle, die Nukleinsäuresequenzen umfasst, die codieren: gag- und pol-Proteine, Hüllprotein oder ein funktionelles Substitut davon; und das RNA-Genom des retroviralen Vektorpartikels, wobei die Nukleinsäuresequenzen alle an einem einzigen Locus innerhalb des retroviralen Produzentenzellgenoms liegen.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft Nukleinsäurevektoren, die Gene umfassen, die für retrovirale Produktion erforderlich sind, und Verwendungen davon. Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren zum Herstellen retroviraler Verpackungs-/Produzentenzelllinien, welche die Nukleinsäurevektoren umfassen, wie sie hierin beschrieben sind.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • In der Gentherapie wird genetisches Material endogenen Zellen in einem Subjekt, welches einer Behandlung bedarf, zugeführt. Das genetische Material kann neue Gene in das Subjekt einbringen, oder zusätzliche Kopien bereits existierender Gene einbringen, oder verschiedene Allele oder Varianten von Genen, die in dem Subjekt vorliegen, einbringen. Virale Vektorsysteme wurden als wirksames Genzuführungsverfahren zur Verwendung in der Gentherapie vorgeschlagen (Verma und Somia (1997) Nature 389: 239–242).
  • Insbesondere basieren diese viralen Vektoren auf Mitgliedern der Retrovirus-Familie aufgrund ihrer Fähigkeit, ihre genetische Fracht in das Genom des Wirts zu integrieren. Retrovirale Vektoren sind so ausgestaltet, dass sie die essentiellen Proteine, die für die Verpackung und Zuführung des retroviralen Genoms erforderlich sind, behalten, jedoch werden jegliche nicht-essentiellen akzessorischen Proteine, einschließlich jener, die für ihr Erkrankungsprofil verantwortlich sind, entfernt. Beispiele retroviraler Vektoren schließen lentivirale Vektoren ein, wie beispielsweise jene, die auf humanem Immunschwächevirus-Typ 1 (HIV-1) basieren, die weitläufig verwendet werden, da sie dazu fähig sind, in nicht-proliferierende Zellen zu integrieren.
  • Derzeit wird die Mehrzahl viraler Vektoren durch transiente Co-Transfektion viraler Gene in eine Wirtszelllinie produziert. Die viralen Gene werden unter Verwendung bakterieller Plasmide eingebracht, die in der Wirtszelle nur für eine begrenzte Zeitdauer existieren, da die viralen Gene auf den Plasmiden verbleiben und nicht in das Genom integriert werden. Damit wird transient transfiziertes genetisches Material während der Zellteilung nicht an nachfolgende Generationen weitergegeben.
  • Es gibt mehrere Nachteile, die mit transienter Transfektion assoziiert sind, wie beispielsweise Variabilität von Charge zu Charge, die hohen Kosten von Transfektionsreagenzien und die Schwierigkeit, Qualitätskontrolle aufrechtzuerhalten (siehe Segura et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(7): 987–1011). Der Prozess der Transfektion selbst ist ebenfalls arbeitsintensiv, und eine Maßstabsvergrößerung stellt eine Herausforderung dar. Es besteht auch die schwierige Aufgabe, Plasmidverunreinigungen zu entfernen, die während der Vektorherstellung übertragen werden (siehe Pichlmair et al. (2007) J. Virol. 81(2): 539–47).
  • Um mit transienter Transfektion assoziierte Probleme anzugehen, bestand der Wunsch, retrovirale Verpackungs- und Produzentenzelllinien zu entwickeln, um die Produktion retroviraler Vektoren zu vereinfachen.
  • Verpackungszelllinien wurden erzeugt durch Transfizieren einer Zelllinie, die zum Verpacken retroviraler Vektoren mit Plasmiden fähig ist, wobei einzelne Plasmide die retroviralen Verpackungsgene und einzigartige eukaryotische Selektionsmarker tragen. Die Verpackungsgene sind in das Genom der Verpackungszelllinie integriert und werden als stabil transfiziert beschrieben. In den vergangenen 20 Jahren wurden diverse Versuche unternommen, stabile Verpackungs- und Produzentenzelllinien für retrovirale Vektoren zu erzeugen.
  • Es gab viele gemeldete Probleme in den Verpackungs- und Produzentenzelllinien, die mittels Integration von retroviralen Vektorkomponenten in das Wirtszellgenom produziert wurden. In erster Linie kann die sequentielle Einbringung retroviraler Vektorkomponenten aufwändig und unflexibel sein. Es gab auch Probleme mit genetischer und/oder transkriptioneller Instabilität retroviraler Vektorkomponenten, wenn sie in das Wirtszellgenom integriert werden, da die Stelle der Integration nicht vorhersagbar ist (Ni et al. (2005) J. Gene Med. 7: 818–834). Ein signifikanter Abfall in der Produktivität viraler Vektoren während der Suspensionsanpassung und der Maßstabsvergrößerung der Produzentenzelllinien wurde ebenfalls berichtet (Farson et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12: 981–997; Guy et al. (2013) Hum. Gene Ther. Methods. 24(2): 125–39).
  • Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen stabiler retroviraler Verpackungs- und Produzentenzelllinien bereitzustellen, welches einen oder mehrere der mit existierenden Verfahren assoziierten Nachteile überwindet.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine neue Weise der Herstellung von Verpackungs- und Produzentenzelllinien entwickelt, welche die Verwendung von Nukleinsäurevektoren beinhaltet, die einen Nicht-Säugetier-Replikationsursprung und die Fähigkeit, wenigstens 25 Kilobasen (kb) DNA zu halten, umfassen, wie beispielsweise bakterielle artifizielle Chromosomen, die die retroviralen Gene umfassen, die für die Produktion retroviraler Vektoren essentiell sind. Dies erlaubt die Expression der retroviralen Gene, die für die Produktion replikationsdefekter retroviraler Vektorpartikel erforderlich sind, um mit transienten Transfektionsverfahren assoziierte Probleme zu verbessern.
  • Die Verwendung eines Nukleinsäurevektors, welcher einen Nicht-Säugetier-Replikationsursprung umfasst und welcher die Fähigkeit besitzt, wenigstens 25 kb DNA (d. h. Großkonstrukt-DNA) zu halten, hat mehrere Vorteile. In erster Linie können die Vektoren zuerst in Nicht-Säugetierzellen (z. B. mikrobiellen Zellen, wie beispielsweise Bakterienzellen) anstelle von Säugetier-Wirtszellen manipuliert werden, was ihre Verwendung viel leichter macht (z. B. können bakterielle artifizielle Chromosomen zuerst in E. coli manipuliert werden). Sobald der Nukleinsäurevektor hergestellt wurde, kann er in eine Säugetier-Wirtszelle eingebracht werden, und jegliche Säugetierzellen, in welchen der Nukleinsäurevektor in die endogenen Chromosomen integriert ist, können ausgewählt werden, um eine stabile Zelllinie zu isolieren.
  • Die Einbringung der retroviralen Nukleinsäuren in die Säugetier-Wirtszelle erfolgt auch in einem einzigen Schritt, was dazu beiträgt, Selektionsdruck und Stilllegungs-Zeitrahmen („silencing timeframe”) zu reduzieren. Dies erlaubt ein schnelleres Screening potentieller Verpackungszellen und reduziert die Materialkosten, da, anders als in früheren Verfahren, die mehrere Plasmidvektoren verwenden, nur ein einziger Vektor verwendet wird. Insbesondere reduziert die Verwendung des derzeitigen Systems die Herstellungskosten durch Einsparungen bei Plasmidkosten, erforderlichen Transfektionsreagenzien (z. B. Polyethylenimin [PEI]), Reduzieren des Umfangs an erforderlicher Benzonase-Behandlung (es gibt eine reduzierte Menge an DNA in der lentiviralen Ernte, deshalb ist weniger Benzonase notwendig, um den Überschuss in der nachgeschalteten Verarbeitung zu entfernen) und reduzierte Testkosten (es besteht keine Notwendigkeit, hinsichtlich Restplasmid in dem lentiviralen Produkt zu testen).
  • Weiterhin liegen die retroviralen Gene, die für die retrovirale Produktion (mit dem oder ohne den Transfervektor) essentiell sind, innerhalb des Nukleinsäurevektors vor, so dass, wenn der Vektor in Säugetier-Wirtszellen eingebracht wird, alle der in den Nukleinsäurevektor inkorporierten retroviralen Gene an einem Locus innerhalb des endogenen Säugetier-Wirtszellgenoms integrieren werden. Dies kann Probleme wie Gen-Stilllegung („gene silencing”) überwinden, die auftreten kann, wenn die retroviralen Gene nach dem Zufallsprinzip und an unterschiedlichen Loci innerhalb des Wirtszellgenoms integriert werden.
  • Die Verwendung von Nukleinsäurevektoren der Erfindung stellt daher Vorteile in der Erzeugung von retroviralen Verpackungs- und Produzentenzelllinien bereit.
  • Daher wird gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung eine retrovirale Produzentenzelle bereitgestellt, die Nukleinsäuresequenzen umfasst, die codieren:
    gag- und pol-Proteine,
    env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon; und
    das RNA-Genom des retroviralen Vektorpartikels,
    wobei die Nukleinsäuresequenzen alle an einem einzigen Locus innerhalb des retroviralen Produzentenzellgenoms liegen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1: Eine schrittweise Anleitung zur Konstruktion von BACpack-WTGP-277delU5 und BACpack-SYNGP-277delU5.
  • 2: Auswahl eines stabilen polyklonalen Pools. HEK293T adhärente Zellen wurden mit BACpackWTGagPol-Transfer unter Verwendung von Calciumphosphat transfiziert. Stabile Pools wurden nach 2-wöchiger Zeocin-Selektion erzeugt. Um zu sehen, ob die stabilen Transfektanten dazu fähig waren, Virus zu erzeugen, wurden die stabilen Poly-Pools für 48 Stunden mit Doxycyclin induziert. Viraler Überstand wurde 48 Stunden nach Induzierung geerntet, durch einen 0,22 μm-Filter filtriert und durch Transduzieren von HEK293T-Zellen titriert. GFP-positive transduzierte Zellen wurden verwendet, um die Transduktionseinheiten/ml (TU/ml) zu berechnen.
  • 3: Erzeugen stabiler Transfektions-Suspensionsklone. HEK293 6E-Zellen wurden mit BACpackWTGagPol-Transfer unter Verwendung von 293fectin-Reagens transfiziert. Stabile Pools wurden nach 2-wöchiger Zeocin-Selektion erzeugt. Die stabilen Pools wurden durch limitierende Verdünnung in 96-Well-Platten kloniert, um einzelne Zellklone zu erhalten, die anschließend expandiert wurden. GFP detektiert durch Fluoreszenzmikroskopie der besten Klone 1, 14, 15 und 16, erhalten mit adhärentem Medium (DMEM + FBS), gefolgt von Suspensionsanpassung (FreeStyle-Medium).
  • 4: Induzierung von Lentivirus in den Suspensionsklonen. Um zu sehen, ob die stabilen HEK6E-Transfektanten dazu fähig waren, Virus zu erzeugen, wurden 20 ml der stabilen Suspensionsklone mit Doxycyclin (2 μg/ml) für 48 Stunden induziert. Viraler überstand wurde 48 Stunden nach Induzierung geerntet, durch einen 0,45 μm-Filter filtriert und durch Transduzieren von HEK293T-Zellen titriert. GFP-positive transduzierte Zellen wurden verwendet, um die Transduktionseinheiten/ml (TU/ml) zu berechnen.
  • 5: Vektortiter von gemäß Beispiel 4 produzierten Klonen. Die Ergebnisse zeigen, dass Vektortiter der Klone 1 und 16 zwischen Passage 5 und Passage 21 leicht anstiegen.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • DEFINITIONEN
  • Wenn es nicht anders definiert ist, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, üblicherweise verstanden wird.
  • Alle Patente und Veröffentlichungen, auf die hierin Bezug genommen wird, sind durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.
  • Der Begriff „umfassend” umfasst „einschließlich” oder „bestehend aus”; z. B. kann eine X „umfassende” Zusammensetzung ausschließlich aus X bestehen, oder sie kann etwas zusätzlich einschließen, z. B. X + Y.
  • Der Ausdruck „im Wesentlichen bestehend aus” beschränkt den Umfang des Merkmals auf die spezifizierten Materialien oder Schritte und jene, die das Grundcharakteristikum/die Grundcharakteristika des beanspruchten Merkmals nicht maßgeblich beeinflussen.
  • Der Ausdruck „bestehend aus” schließt das Vorliegen jeglicher zusätzlicher Komponente(n) aus.
  • Der Begriff „etwa” in Bezug auf einen numerischen Wert x bedeutet zum Beispiel x ± 10%, 5%, 2% oder 1%.
  • Der Begriff „Vektor” oder „Nukleinsäurevektor” bezieht sich auf ein Vehikel, welches dazu fähig ist, fremdes (d. h. exogenes) genetisches Material artifiziell in eine andere Zelle zu tragen, wo es repliziert und/oder exprimiert werden kann. Beispiele von Vektoren schließen Nicht-Säugetier-Nukleinsäurevektoren, wie beispielsweise bakterielle artifizielle Chromosomen (BACs), Hefe-artifizielle Chromosomen (YACs), P1-abgeleitete artifizielle Chromosomen (PACs), Cosmide oder Fosmide, ein.
  • Andere Beispiele von Vektoren schließen virale Vektoren ein, wie beispielsweise retrovirale und lentivirale Vektoren, die in der vorliegenden Anmeldung von besonderem Interesse sind. Lentivirale Vektoren, wie beispielsweise jene, die auf humanem Immunschwächevirus-Typ 1 (HIV-1) basieren, werden weit verbreitet verwendet, da sie dazu fähig sind, in nicht-proliferierende Zellen zu integrieren. Virale Vektoren können replikationsdefekt gemacht werden, indem das virale Genom in separate Teile aufgeteilt wird, z. B. durch Platzieren auf separaten Plasmiden. Zum Beispiel wurde die sogenannte erste Generation lentiviraler Vektoren, entwickelt vom Salk Institute for Biological Studies, als ein Expressionssystem mit drei Plasmiden aufgebaut, welches aus einer Verpackungs-Expressionskassette, der Hüll-Expressionskassette und der Vektor-Expressionskassette bestand. Das „Verpackungsplasmid” enthält die gesamten gag-pol-Sequenzen, die regulatorischen (tat- und rev-) und die akzessorischen (vif-, vpr-, vpu-, nef-)Sequenzen. Das „Hüllplasmid” hält das Glycoprotein des vesikulären Stomatitisvirus (VSVg) als Ersatz für das native HIV-1-Hüllprotein unter der Kontrolle eines Cytomegalovirus-(CMV-)Promotors. Das dritte Plasmid (das „Transferplasmid”) trägt die langen terminalen Wiederholungen („Long Terminal Repeats”, LTRs), die Einkapselungssequenz (ψ), die auf Rev ansperchendes Element(„Rev Response Element”, RRE)-Sequenz und den CMV-Promotor, um das Transgen innerhalb der Wirtszelle zu exprimieren.
  • Die zweite Generation lentiviraler Vektoren war gekennzeichnet durch die Deletion der Virulenzsequenzen vpr, vif, vpu und nef. Der Verpackungsvektor war auf gag-, pol-, tat- und rev-Gene reduziert, so dass die Sicherheit des Systems gesteigert wurde.
  • Um das lentivirale System zu verbessern, wurden die Vektoren der dritten Generation gestaltet, indem das tat-Gen aus dem Verpackungskonstrukt entfernt und die LTR von der Vektorkassette inaktiviert wurde, so dass Probleme im Zusammenhang mit Insertionsmutageneseeffekten reduziert wurden.
  • Die verschiedenen Lentivirus-Generationen sind in den folgenden Dokumenten beschrieben: Erste Generation: Naldini et al. (1996) Science 272(5259): 263–7; zweite Generation: Zufferey et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15(9): 871–5; dritte Generation: Dull et al. (1998) J. Virol. 72(11): 8463–7, die allesamt durch Bezugnahme vollständig hierin aufgenommen sind. Ein Review über die Entwicklung lentiviraler Vektoren ist zu finden in Sakuma et al. (2012) Biochem. J. 443(3): 603–18 und Picanço-Castro et al. (2008) Exp. Opin. Therap. Patents 18(5): 525–539.
  • Der Ausdruck „Nicht-Säugetier-Replikationsursprung” bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, wo Replikation initiiert wird und die von einer Nicht-Säugetier-Quelle abgeleitet ist. Dies befähigt die Nukleinsäurevektoren der Erfindung, neben endogenen Chromosomen in einer geeigneten Wirtszelle (z. B. einer mikrobiellen Zelle, wie beispielsweise einer Bakterien- oder Hefezelle) stabil zu replizieren und zu segregieren, so dass sie auf Nachkommen der Wirtszelle übertragbar ist, außer wenn die Wirtszelle eine Säugetier-Wirtszelle ist. In Säugetier-Wirtszellen werden Nukleinsäurevektoren mit Nicht-Säugetier-Replikationsursprüngen entweder in die endogenen Chromosomen der Säugetier-Wirtszelle integrieren oder bei der Replikation der Säugetier-Wirtszelle verloren gehen. Zum Beispiel sind Nukleinsäurevektoren mit Nicht-Säugetier-Replikationsursprüngen, wie beispielsweise bakterielle artifizielle Chromosomen (BAC), P1-abgeleitetes artifizielles Chromosom (PAC), Cosmide oder Fosmide, fähig, neben endogenen Chromosomen in bakteriellen Zellen (wie beispielsweise E. coli) stabil zu replizieren und zu segregieren; wenn sie jedoch in Säugetier-Wirtszellen eingebracht werden, wird das BAC, PAC, Cosmid oder Fosmid entweder integrieren oder bei der Replikation der Säugetier-Wirtszelle verloren gehen. Hefe-artifizielle Chromosomen (YAC) sind fähig, neben endogenen Chromosomen in Hefezellen stabil zu replizieren und zu segregieren; wenn sie jedoch in Säugetier-Wirtszellen eingebracht werden, wird das YAC entweder integrieren oder bei der Replikation der Säugetier-Wirtszelle verloren gehen. Daher wirken in diesem Kontext die Nukleinsäurevektoren der Erfindung als Reservoirs von DNA (d. h. für die Gene, die für die retrovirale Produktion essentiell sind), die leicht in Säugetierzellen übertragen werden können, um stabile Zelllinien für die retrovirale Produktion zu erzeugen. Beispiele von Nicht-Säugetier-Replikationsursprüngen schließen bakterielle Replikationsursprünge, wie beispielsweise oriC, oriV oder oriS, oder Hefe-Replikationsursprünge, auch bekannt als autonom replizierende Sequenzen (ARS-Elemente), ein.
  • Die Nukleinsäurevektoren der vorliegenden Erfindung umfassen einen Nicht-Säugetier-Replikationsursprung und sind fähig, wenigstens 25 Kilobasen (kb) DNA zu halten. In einer Ausführungsform hat der Nukleinsäurevektor die Fähigkeit, wenigstens 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 oder 350 kb DNA zu halten. Es versteht sich, dass Bezugnahmen auf „Fähigkeit zu halten” die übliche Bedeutung haben und implizieren, dass die Obergrenze für die Insertgröße für den Nukleinsäurevektor nicht kleiner als die beanspruchte Größe ist (d. h. nicht kleiner als 25 kb DNA).
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Gene, die für retrovirale Verpackung essentiell sind, in einem einzigen Konstrukt (d. h. dem Nukleinsäurevektor) einzuschließen. Daher müssen die Nukleinsäurevektoren der Erfindung fähig sein, große Inserts von DNA zu halten. Um Missverständnisse zu vermeiden, versteht es sich, dass Bezugnahmen auf „Nukleinsäurevektoren” oder „artifizielle Chromosomen” sich nicht auf natürliche bakterielle Plasmide (z. B. wie die Plasmide, die derzeit in transienten Transfektionsverfahren verwendet werden) beziehen, da diese nicht fähig sind, wenigstens 25 kb DNA zu halten. Die maximale Insertgröße, die ein Plasmid enthalten kann, ist etwa 15 kb. Solche Nukleinsäurevektoren beziehen sich auch nicht auf Bakteriophagen, die im Allgemeinen nur maximale Inserts von 5–11 kb halten. Daher ist in einer Ausführungsform der Nukleinsäurevektor der Erfindung kein Plasmid, Bakteriophage oder Episom.
  • Der Ausdruck „endogene Chromosomen” bezieht sich auf genomische Chromosomen, die vor der Erzeugung oder Einbringung eines exogenen Nukleinsäurevektors, wie beispielsweise eines bakteriellen artifiziellen Chromosoms, in der Wirtszelle zu finden sind.
  • Die Begriffe „Transfektion”, „Transformation” und „Transduktion”, wie sie hierin verwendet werden, können verwendet werden, um die Insertion des Nicht-Säugetier- oder viralen Vektors in eine Zielzelle zu beschreiben. Die Insertion eines Vektors wird üblicherweise für bakterielle Zellen Transformation und für eukaryotische Zellen Transfektion genannt, obwohl die Insertion eines viralen Vektors auch Transduktion genannt werden kann. Der Fachmann wird sich der unterschiedlichen üblicherweise verwendeten nicht-viralen Transfektionsverfahren bewusst sein, die ohne Beschränkung hierauf die Verwendung physikalischer Verfahren (z. B. Elektroporation, Pressen von Zellen („cell squeezing”), Sonoporation, optische Transfektion, Protoplastenfusion, Impalefektion, Magnetofektion, Genpistole oder Partikelbeschuss), chemischer Reagenzien (z. B. Calciumphosphat, hochverzweigter organischer Verbindungen oder kationischer Polymere) oder kationischer Lipide (z. B. Lipofektion) einschließen. Viele Transfektionsverfahren erfordern den Kontakt von Lösungen von Plasmid-DNA mit den Zellen, die dann herangezogen und für eine Markergenexpression ausgewählt werden.
  • Der Begriff „Promotor” bezieht sich auf eine Sequenz, die die Genexpression steuert. Um ein hohes Expressionsniveau zu steuern, kann es von Vorteil sein, einen hocheffizienten Promotor, wie beispielsweise einen nicht-retroviralen, hocheffizienten Promotor, zu verwenden. Beispiele geeigneter Promotoren können einen Promotor, wie beispielsweise den humanen Cytomegalovirus-(CMV-)unmittelbaren frühen Promotor („immediate early promoter”), den Milz-fokusbildenden Virus-(„spleen focus-forming virus”, SFFV-)Promotor, Rous-Sarkomvirus-(RSV-)Promotor, oder humanen Elongationsfaktor 1-alpha-(pEF-)Promotor, einschließen.
  • Ein Tet-Operon (Tetracyclin-kontrollierte Transkriptionsaktivierung) kann in einem Verfahren induzierbarer Genexpression verwendet werden, wobei die Transkription in der Gegenwart des Antibiotikums Tetracyclin oder eines seiner Derivate (z. B. Doxycyclin) reversibel an- oder abgeschaltet wird. In der Natur exprimiert der Ptet-Promotor TetR, den Repressor, und TetA, das Protein, das Tetracyclin-Antibiotikum aus der Zelle pumpt. In der vorliegenden Erfindung kann das Tet-Operon vorliegen oder nicht vorliegen; zum Beispiel kann in einer Ausführungsform das Tet-Operon in dem Promotor vorliegen.
  • Der Ausdruck „selektierbarer Marker” bezieht sich auf ein Gen, das dabei helfen wird, Zellen auszuwählen, die ein eingefügtes Gen (z. B. ein Transgen) aktiv exprimieren. Beispiele geeigneter Selektionsmarker schließen Enzyme, die Resistenz gegen ein Antibiotikum codieren (d. h. ein Antibiotika-Resistenzgen), z. B. Kanamycin, Neomycin, Puromycin, Hygromycin, Blasticidin oder Zeocin, ein. Ein anderes Beispiel geeigneter Selektionsmarker sind fluoreszierende Proteine, zum Beispiel grün fluoreszierendes Protein (GFP), rot fluoreszierendes Protein (RFP) oder blau fluoreszierendes Protein (BFP).
  • Der Ausdruck „polyA-Signal” bezieht sich auf eine Polyadenylierungssignalsequenz, die zum Beispiel 3' von einem Transgen platziert ist, die Wirtsfaktoren befähigt, einen Polyadenosin-(polyA-)Schwanz an das Ende der naszierenden mRNA während der Transkription anzufügen. Der polyA-Schwanz ist ein Abschnitt von bis zu 300 Adenosin-Ribonukleotiden, der mRNA vor enzymatischem Abbau schützt und auch die Translation unterstützt. Dementsprechend können die Nukleinsäurevektoren der vorliegenden Erfindung eine polyA-Signalsequenz, wie beispielsweise die humanen Betaglobin- oder Kaninchen-Betaglobin-polyA-Signale, die frühen oder späten polyA-Signale von Simian-Virus 40 (SV40), das humane Insulin-polyA-Signal oder das Rinder-Wachstumshormon-polyA-Signal, einschließen. In einer Ausführungsform ist die polyA-Signalsequenz das humane Betaglobin-polyA-Signal.
  • Der Begriff „Intronsequenz” bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die durch RNA-Spleißen aus dem Gen-Endprodukt entfernt wird. Es wurde gezeigt, dass die Verwendung eines Introns strangabwärts der Enhancer/Promotor-Region und strangaufwärts des cDNA-Inserts das Genexpressionsniveau steigert. Die Steigerung der Expression hängt von dem speziellen cDNA-Insert ab. Dementsprechend kann der Nukleinsäurevektor der vorliegenden Erfindung Introns, wie beispielsweise humanes Betaglobin-Intron, Kaninchen-Betaglobin-Intron II oder ein chimäres humanes Betaglobin-Immunglobulin-Intron, einschließen. In einer Ausführungsform ist das Intron ein humanes Betaglobin-Intron und/oder ein Kaninchen-Betaglobin-Intron II.
  • Der Begriff „Verpackungszelllinie” bezieht sich auf eine Zelllinie mit stabil eingefügten gag- und pol-Protein- und Hüll-Glycoprotein-Genen. Alternativ bezieht sich der Begriff „Produzentenzelllinie” auf eine Verpackungszelllinie mit einem stabil eingefügten Transfervektor, der ein interessierendes Transgen enthält. Für einen Fachmann auf dem Gebiet versteht es sich, dass die hierin beschriebenen Nukleinsäurevektoren verwendet werden können, um Verpackungszelllinien (d. h. wenn wenigstens die gag-, pol- und env-Gene auf dem Nukleinsäurevektor vorliegen und in eine Wirtszelle inkorporiert sind) oder Produzentenzelllinien (d. h. wenn der Nukleinsäurevektor zusätzlich die Transfervektorkomponenten umfasst, die zusammen mit den gag-, pol- und env-Genen in eine Wirtszelle inkorporiert werden sollen) zu erzeugen.
  • Der Ausdruck „stabil transfiziert” bezieht sich auf Zelllinien, die fähig sind, eingebrachte retrovirale Gene an ihre Nachkommen (d. h. Tochterzellen) weiterzugeben, entweder weil die transfizierte DNA in die endogenen Chromosomen inkorporiert wurde oder mittels stabiler Vererbung exogener Chromosomen.
  • NUKLEINSÄUREVEKTOREN
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Nukleinsäurevektor bereitgestellt, welcher einen Nicht-Säugetier-Replikationsursprung und die Fähigkeit umfasst, wenigstens 25 Kilobasen (kb) DNA zu halten, dadurch gekennzeichnet, dass der Nukleinsäurevektor retrovirale Nukleinsäuresequenzen umfasst, die codieren:
    gag- und pol-Proteine, und
    ein env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon.
  • Insbesondere kann jede der retroviralen Nukleinsäuresequenzen als individuelle Expressionskonstrukte innerhalb des Nukleinsäurevektors angeordnet sein.
  • Derzeitige Verfahren zum Erzeugen retroviraler Vektoren beinhalten die transiente Transfektion der retroviralen Gene in eine Wirtszelle. Mit diesem Verfahren waren jedoch viele Nachteile assoziiert, da es kostenintensiv und aufwändig ist und eine Maßstabsvergrößerung schwierig ist. Eine Lösung würde darin bestehen, eine Verpackungszelllinie zu konstruieren, die die retroviralen Verpackungsgene stabil inkorporiert, um die mit transienter Transfektion assoziierten Probleme zu vermeiden und variablen Ertrag an retroviralem Vektor zu reduzieren.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass hierin beschriebene Nukleinsäurevektoren verwendet werden können, um eine retrovirale Verpackungszelllinie zu erzeugen, die frühere, mit Verfahren zur Produktion retroviraler Vektoren assoziierte Schwierigkeiten verbessert. Zum Beispiel beinhalten bekannte Verfahren zum Produzieren retroviraler Verpackungszelllinien mehrere Runden der Selektion, nachdem jedes retrovirale Gen eingebracht wurde. Dieser Prozess kann bis zu sechs Monate dauern und ist extrem arbeitsintensiv. Durch Einschließen aller der retroviralen Gene in den Nukleinsäurevektor können die retroviralen Gene dann in einem einzigen Schritt in die endogenen Chromosomen einer Säugetier-Wirtszelle eingefügt werden. Daher würde die Verwendung eines Nukleinsäurevektors, wie hierin vorgeschlagen, Selektionsdruck reduzieren, den Stilllegungs-Zeitrahmen („silencing timeframe”) reduzieren und ein schnelleres Screening potentieller Verpackungszellen erlauben. Weiterhin würden die in den Nukleinsäurevektor eingeschlossenen retroviralen Gene alle an einem einzigen Locus in die endogenen Chromosomen der Säugetier-Wirtszelle integriert werden, was das Risiko, dass einzelne retrovirale Gene stillgelegt („silenced”) würden, reduzieren würde und sicherstellen würde, dass alle der retroviralen Gene gleichmäßig exprimiert werden.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich Nukleinsäuresequenzen, die das RNA-Genom eines retroviralen Vektorpartikels codieren. Es versteht sich, dass das RNA-Genom des retroviralen Vektorpartikels üblicherweise auf dem „Transfervektor”, der in transienten Transfektionsverfahren verwendet wird, eingeschlossen ist. Das Transfervektorplasmid enthält im Allgemeinen einen Promotor (wie beispielsweise CMV), die 3'-LTR (die eine selbst-inaktivierende (d. h. SIN-)3'-LTR sein kann oder nicht sein kann), die 5'-LTR (die die U5-Region enthalten oder nicht enthalten kann), die Einkapselungssequenz (ψ) und potentiell das Transgen, das mit einem Promotor verknüpft ist.
  • In einer Ausführungsform sind mehrere Kopien des RNA-Genoms des retroviralen Vektorpartikels (d. h. des Transfervektors) in dem Nukleinsäurevektor eingeschlossen. Es wird erwartet, dass mehrere Kopien des Transfervektors zu einem höheren viralen Vektortiter führen. Zum Beispiel kann der Nukleinsäurevektor zwei oder mehr, wie beispielsweise drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun oder zehn oder mehr, Kopien des RNA-Genoms des retroviralen Vektorpartikels (d. h. des Transfervektors) einschließen.
  • In einer Ausführungsform enthält der Nukleinsäurevektor eine oder eine Mehrzahl von Rekombinationsstelle(n). Dies erlaubt es, dass Zielsequenzen in ortsspezifischer Weise in der Gegenwart eines Rekombinaseenzyms in die endogenen Chromosomen der Säugetier-Wirtszelle integriert werden. Das Rekombinaseenzym katalysiert die Rekombinationsreaktion zwischen zwei Rekombinationsstellen.
  • Viele Typen von ortsspezifischen Rekombinationssystemen sind im Stand der Technik bekannt, und jegliches geeignete Rekombinationssystem kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel ist/sind in einer Ausführungsform die Rekombinationsstelle(n) ausgewählt aus oder abgeleitet von dem int/att-System von Lambda-Phage, dem Cre/lox-System von Bakteriophage P1, dem FLP/FRT-System von Hefe, dem Gin/gix-Rekombinasesystem von Phage Mu, dem Cin-Rekombinasesystem, dem Pin-Rekombinasesystem von E. coli und dem R/RS-System des pSR1-Plasmids, oder irgendeiner Kombination davon. In einer weiteren Ausführungsform ist die Rekombinationsstelle eine att-Stelle (z. B. von Lambda-Phage), wobei die att-Stelle ortsgerichtete Integration in der Gegenwart einer Lambda-Integrase gestattet. Es versteht sich, dass die Bezugnahme auf „Lambda-Integrase” Bezugnahmen auf mutierte Integrasen einschließt, die immer noch kompatibel mit dem int/att-System sind, zum Beispiel die in der WO 2002/097059 beschriebenen modifizierten Lambda-Integrasen.
  • In einer Ausführungsform ist der Nukleinsäurevektor ausgewählt aus: einem bakteriellen artifiziellen Chromosom (BAC), einem Hefe-artifiziellen Chromosom (YAC), einem P1-abgeleiteten artifiziellen Chromosom (PAC), Fosmid oder einem Cosmid. In einer weiteren Ausführungsform ist der Nukleinsäurevektor ein bakterielles artifizielles Chromosom (BAC).
  • Bakterielle artifizielle Chromosomen
  • Der Ausdruck „bakterielles artifizielles Chromosom” oder „BAC” bezieht sich auf ein von bakteriellen Plasmiden abgeleitetes DNA-Konstrukt, das fähig ist, ein großes Insert exogener DNA zu halten. Sie können üblicherweise ein maximales DNA-Insert von ungefähr 350 kb halten. BACs wurden aus dem gut charakterisierten bakteriellen funktionellen Fertilitätsplasmid (F-Plasmid) entwickelt, das Partitionierungsgene enthält, die die gleichmäßige Verteilung von Plasmiden nach der bakteriellen Zellteilung fördern. Dies erlaubt es den BACs, neben endogenen bakteriellen Genomen (wie beispielsweise E. coli) stabil repliziert und segregiert zu werden. Das BAC enthält üblicherweise wenigstens eine Kopie eines Replikationsursprungs (wie beispielsweise das oriS- oder oriV-Gen), das repE-Gen (für Plasmidreplikation und Regulation der Kopienzahl) und Partitionierungsgene (wie beispielsweise sopA, sopB, parA, parB und/oder parC), was eine stabile Aufrechterhaltung des BAC in bakteriellen Zellen sicherstellt. BACs sind naturgemäß kreisförmig und superspiralisiert („supercoiled”), was sie leichter gewinnbar macht als lineare artifizielle Chromosomen, wie beispielsweise YACs. Sie können unter Verwendung einfacher Verfahren, wie beispielsweise Elektroporation, auch relativ leicht in bakterielle Wirtszellen eingebracht werden.
  • In einer Ausführungsform umfasst das bakterielle artifizielle Chromosom ein oriS-Gen. In einer Ausführungsform umfasst das bakterielle artifizielle Chromosom ein repE-Gen. In einer Ausführungsform umfasst das bakterielle artifizielle Chromosom Partitionierungsgene. In einer weiteren Ausführungsform sind die Partitionierungsgene aus sopA, sopB, parA, parB und/oder parC ausgewählt. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das bakterielle artifizielle Chromosom ein sopA- und sopB-Gen.
  • BAC zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann von kommerziellen Quellen erhalten werden, zum Beispiel das pSMART BAC von LUCIGENTM (siehe Genom-Hinterlegungsnummer EU101022.1 für die gesamte Rückgrat-Sequenz). Dieses BAC enthält das L-Arabinose-„Copy-Up”-System, das auch den oriV-Mittel-Kopie(„medium-copy”)-Replikationsursprung enthält, der nur in der Gegenwart des TrfA-Replikationsproteins aktiv ist. Das Gen für TrfA kann in das Genom bakterieller Wirtszellen unter Kontrolle des L-Arabinose induzierbaren Promotors araC-PBAD inkorporiert sein (siehe Wild et al. (2002) Genome Res. 12(9): 1434–1444). Die Zugabe von L-Arabinose induziert die Expression von TrfA, was oriV aktiviert, was das Plasmid dazu bringt, bis zu 50 Kopien pro Zelle zu replizieren.
  • Hefe-artifizielle Chromosomen
  • Der Ausdruck „artifizielles Hefe-Chromosom” oder „YAC” bezieht sich auf Chromosomen, in denen Hefe-DNA in bakterielle Plasmide inkorporiert ist. Sie enthalten eine autonome Replikationssequenz (ARS) (d. h. einen Replikationsursprung), ein Centromer und Telomere. Anders als BACs ist das YAC linear und enthält daher Hefe-Telomere an jedem Ende des Chromosoms, um die Enden vor Abbau zu schützen, wenn es an Nachkommen der Wirtszelle weitergegeben wird. YACs können eine Reihe von DNA-Insertgrößen halten, und zwar alles von 100–2000 kb.
  • P1-abgeleitete artifizielle Chromosomen
  • Der Ausdruck „P1-abgeleitetes artifizielles Chromosom” oder „PAC” bezieht sich auf DNA-Konstrukte, die von der DNA des P1-Bakteriophagen und bakteriellem F-Plasmid abgeleitet sind. Sie können üblicherweise ein maximales DNA-Insert von ungefähr 100–300 kb halten und werden als Klonierungsvektoren in E. coli verwendet. PACs haben ähnliche Vorteile wie BACs, wie beispielsweise dass sie leicht aufzureinigen und in bakterielle Wirtszellen einzubringen sind.
  • Cosmide und Fosmide
  • Der Begriff „Cosmid” bezieht sich auf DNA-Konstrukte, die von bakteriellen Plasmiden abgeleitet sind, die zusätzlich cos-Stellen enthalten, die vom Bakteriophagen Lambda abgeleitet sind. Cosmide enthalten im Allgemeinen einen bakteriellen Replikationsursprung (wie beispielsweise oriV), einen Selektionsmarker, eine Klonierungsstelle und wenigstens eine cos-Stelle. Cosmide können üblicherweise ein maximales DNA-Insert von 40–45 kb annehmen. Es wurde gezeigt, dass Cosmide beim Infizieren von E. coli-Zellen wirksamer sind als standardmäßige bakterielle Plasmide. Der Begriff „Fosmide” bezieht sich auf Nicht-Säugetier-Nukleinsäurevektoren, die Cosmiden ähnlich sind, außer dass sie auf dem bakteriellen F-Plasmid basieren. Insbesondere verwenden sie den F-Plasmid-Replikationsursprung und Partitionierungsmechanismen, um das Klonieren großer DNA-Fragmente zu erlauben. Fosmide können üblicherweise ein maximales DNA-Insert von 40 kb annehmen.
  • RETROVIREN
  • Retroviren sind eine Familie von Viren, die ein pseudo-diploides, einzelsträngiges RNA-Genom enthalten. Sie codieren eine reverse Transkriptase, die DNA aus dem RNA-Genom produziert, die dann in die Wirtszell-DNA eingefügt werden kann. Die hierin beschriebene Erfindung kann verwendet werden, um replikationsdefekte retrovirale Vektorpartikel zu produzieren. Das retrovirale Vektorpartikel der vorliegenden Erfindung kann aus jeglichem geeignetem Retrovirus ausgewählt oder davon abgeleitet sein.
  • In einer Ausführungsform ist das retrovirale Vektorpartikel von/aus einem Lentivirus, Alpha-Retrovirus, Gamma-Retrovirus oder Foamy-Retrovirus, wie beispielsweise einem Lentivirus oder Gamma-Retrovirus, insbesondere einem Lentivirus, abgeleitet oder ausgewählt. In einer weiteren Ausführungsform ist das retrovirale Vektorpartikel ein Lentivirus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, EIAV und Visna. Lentiviren sind dazu fähig, sich nicht teilende (d. h. ruhende) Zellen zu infizieren, was sie zu attraktiven retroviralen Vektoren für die Gentherapie macht. In noch einer weiteren Ausführungsform ist das retrovirale Vektorpartikel HIV-1 oder es ist von HIV-1 abgeleitet. Die genomische Struktur einiger Retroviren ist im Stand der Technik zu finden. Zum Beispiel sind Einzelheiten zu HIV-1 aus der NCBI-Genbank (Genom-Hinterlegungs-Nr. AF033819) zu finden. HIV-1 ist einer der am besten verstandenen Retroviren und wird daher oft als retroviraler Vektor verwendet.
  • Retrovirale Gene
  • Die allen Retroviren gemeinsamen Nukleinsäuresequenzen können wie folgt näher erläutert werden:
    Lange terminale Wiederholungen (Long Terminal Repeats, LTRs): Die Grundstruktur eines Retrovirusgenoms umfasst eine 5'-LTR und eine 3'-LTR, zwischen denen oder innerhalb derer die Gene liegen, die für die retrovirale Produktion erforderlich sind. Die LTRs sind für die retrovirale Integration und Transkription erforderlich. Sie können auch als Promotorsequenzen wirken, um die Expression der retroviralen Gene zu kontrollieren (d. h. sie sind cis-wirkende Gene). Die LTRs sind aus drei Subregionen zusammengesetzt, die mit U3, R, U5 bezeichnet sind: U3 ist von der Sequenz abgeleitet, die für das 3'-Ende der RNA einzigartig ist; R ist von einer Sequenz abgeleitet, die an beiden Enden der RNA wiederholt wird; und U5 ist von der Sequenz abgeleitet, die für das 5'-Ende der RNA einzigartig ist. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Nukleinsäurevektor zusätzlich eine 5'- und eine 3'-LTR. In einer weiteren Ausführungsform kann die U5-Region der 5'-LTR deletiert und durch einen Nicht-HIV-1-polyA-Schwanz ersetzt sein (siehe Hanawa et al. (2002) Mol. Ther. 5(3): 242–51).
  • Um Sicherheitsbedenken in Bezug auf die Erzeugung von replikationskompetentem Virus anzugehen, wurde ein selbst-inaktivierender(SIN-)Vektor entwickelt, indem ein Abschnitt in der U3-Region der 3'-LTR, der die TATA-Box und Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren Sp1 und NF-κB einschließt, deletiert wurde (siehe Miyoshi et al. (1998) J. Virol. 72(10): 8150–7). Die Deletion wird nach reverser Transkription und Integration in infizierte Zellen auf die 5'-LTR übertragen, was zur transkriptionellen Inaktivierung der LTR führt. Dies ist als ein selbst-inaktivierendes, Lentiviren-basiertes Vektorsystem bekannt, das in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein kann.
  • Ψ: Einkapselung der retroviralen RNAs erfolgt aufgrund einer Ψ-(psi-)Sequenz, die am 5'-Ende des retroviralen Genoms liegt. Es ist auch im Stand der Technik gut bekannt, dass Sequenzen strangabwärts der psi-Sequenz und die in die gag codierende Region hineinreichen, an effizienter retroviraler Vektorproduktion beteiligt sind (siehe Cui et al. (1999) J. Virol. 73(7): 6171–6176). In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich eine ψ-(psi-)Sequenz.
  • Primerbindungsstelle (PBS): Das retrovirale Genom enthält eine PBS, die nach der U5-Region der 5'-LTR vorliegt. Diese Stelle bindet an den tRNA-Primer, der für die Initiierung der reversen Transkription erforderlich ist. In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich eine PBS-Sequenz.
  • PPT: Retrovirale Genome enthalten kurze Abschnitte von Purinen, bezeichnet als Polypurin-Trakte (PPTs), in der Nähe des 3'-Endes des retroviralen Genoms. Diese PPTs funktionieren als RNA-Primer für Plus-Strang-DNA-Synthese während der reversen Transkription. Komplexe Retroviren (wie beispielsweise HIV-1) enthalten einen zweiten, zentraler liegenden PPT (d. h. einen zentralen Polypurin-Trakt (cPPT)), der eine zweite Stelle für die Initiierung der DNA-Synthese bereitstellt. Es wurde gezeigt, dass retrovirale Vektoren, die einen cPPT codieren, erhöhte Transduktion und Transgen-Expression aufweisen (siehe Barry et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12(9): 1103–8). In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich eine 3'-PPT-Sequenz und/oder eine cPPT-Sequenz.
  • Die oben beschriebene genomische Struktur der nicht-codierenden Regionen ist einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Zum Beispiel sind Einzelheiten zur genomischen Struktur der nicht-codierenden Regionen in HIV-1 aus der NCBI-Genbank mit Genom-Hinterlegungs-Nr. AF033819, oder für HIV-1 HXB2 (ein üblicherweise verwendeter HIV-1-Referenzstamm) mit Genom-Hinterlegungs-Nr. K03455 zu finden. In einer Ausführungsform sind die nicht-codierenden Regionen von den Sequenzen abgeleitet, die bei Genom-Hinterlegungs-Nr. K03455 erhältlich sind, zum Beispiel von den Basenpaaren 454–1126 (für R-U5-PBS-Gag), 7622–8479 (für RRE) oder 7769–8146 (für RRE), 4781–4898 (für cPPT), 9015–9120 & 9521–9719 (für dNEF-PPT-sinU3-R-U5).
  • Gag/pol: Die Expression von gag- und pol-Genen stützt sich auf eine translationale Rasterverschiebung („translational frameshift”) zwischen gag und gagpol. Beide sind Polyproteine, die während der Reifung gespalten werden. Die hauptsächlichen strukturellen Matrix-, Kapsid- und Nukleokapsidproteine des retroviralen Vektors werden durch gag codiert. Das pol-Gen codiert für die retroviralen Enzyme: i) reverse Transkriptase, die für die reverse Transkription des retroviralen RNA-Genoms zu doppelsträngiger DNA essentiell ist, ii) Integrase, die die Integration des retroviralen DNA-Genoms in ein Wirtszellchromosom ermöglicht, und iii) Protease, die das synthetisierte Polyprotein spaltet, um die reifen und funktionellen Proteine des Retrovirus zu produzieren. In einer Ausführungsform ist die retrovirale Nukleinsäuresequenz, die die gag- und pol-Proteine codiert, von der HIV-1 HXB2-Sequenz abgeleitet, die bei Genom-Hinterlegungs-Nr. K03455 erhältlich ist, zum Beispiel von den Basenpaaren 790–5105.
  • Env: Das env-(„envelope”-; Hüll-)Gen codiert für die Oberflächen- und Transmembrankomponenten der retroviralen Hülle (z. B. Glycoproteine gp120 und gp41 von HIV-1) und ist an der Retrovirus-Zellmembran-Fusion beteiligt. Um den Gewebetropismus des retroviralen Vektors zu verbreitern, können die hierin beschriebenen retroviralen Vektoren mit einem Hüllprotein von einem anderen Virus pseudotypisiert werden. Pseudotypisierung bezieht sich auf den Prozess, wodurch der Wirtszellbereich von retroviralen Vektoren, einschließlich lentiviralen Vektoren, ausgeweitet oder geändert werden kann, indem die Glycoproteine (GPs) auf den retroviralen Vektorpartikeln verändert werden (z. B. durch Verwendung von GPs, die von anderen umhüllten Viren oder unter Verwendung synthetischer/artifizieller GPs erhalten oder abgeleitet wurden). Das am häufigsten verwendete Glycoprotein zum Pseudotypisieren retroviraler Vektoren ist das vesikuläre Stomatitisvirus-GP (VSVg) aufgrund seines breiten Tropismus und hoher Vektorpartikelstabilität. Für den Fachmann versteht es sich jedoch, dass andere Glycoproteine für die Pseudotypisierung verwendet werden können (siehe Cronin et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5(4): 387–398; durch Bezugnahme vollständig hierin aufgenommen). Die Wahl des für die Pseudotypisierung verwendeten Virus kann auch vom Typ der/des anzuzielenden Zelle und/oder Organs abhängen, da gezeigt wurde, dass manche Pseudotypen Gewebetyppräferenzen haben.
  • In einer Ausführungsform wird das env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon von einem Virus erhalten oder abgeleitet, ausgewählt aus einem Vesiculovirus (z. B. vesikulärem Stomatitisvirus), Lyssavirus (z. B. Tollwutvirus, Mokolavirus), Arenavirus (z. B. lymphozytärem Choriomeningitis-Virus (LCMV)), Alphavirus (z. B. Ross-River-Virus (RRV), Sindbis-Virus, Semliki-Forest-Virus (SFV), venezolanisches Pferdeenzephalitisvirus), Filovirus (z. B. Ebolavirus Reston, Ebolavirus Zaire, Lassavirus), Alpharetrovirus (z. B. Vogel-Leukosevirus (Avian leukosis Virus, ALV)), Betaretrovirus (z. B. Jaagsiekte-Schaf-Retrovirus (JSRV)), Gammaretrovirus (z. B. Moloney-Maus-Leukämievirus (MLV), Gibbonaffen-Leukämievirus (GALV), felinem endogenem Retrovirus (RD114)), Deltaretrovirus (z. B. humanem T-lymphotropem Virus 1 (HTLV-1)), Spumavirus (z. B. humanem Foamy-Virus), Lentivirus (z. B. Maedi-visna-Virus (MVV)), Coronavirus (z. B. SARS-CoV), Respirovirus (z. B. Sendaivirus, respiratorischem Synzytialvirus (RSV)), Hepacivirus (z. B. Hepatitis C-Virus (HCV)), Influenzavirus (z. B. Influenzavirus A) und Nukleopolyhedrovirus (z. B. Autographa californica multiples Nukleopolyhedrovirus (AcMNPV)). In einer weiteren Ausführungsform wird das env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon von vesikulärem Stomatitisvirus erhalten oder abgeleitet. In dieser Ausführungsform kann das vesikuläre Stomatitisvirus-Glycoprotein-(VSVg-)Protein verwendet werden, was die retroviralen Partikel befähigt, einen breiteren Wirtszellbereich zu infizieren, und die Wahrscheinlichkeiten einer Rekombination, um Wildtyp-Hüllproteine zu produzieren, eliminiert. In einer weiteren Ausführungsform ist die retrovirale Nukleinsäuresequenz, die das env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon codiert, von der Sequenz abgeleitet, die bei Genom-Hinterlegungs-Nr. J02428.1 erhältlich ist, zum Beispiel von den Basenpaaren 3071 bis 4720.
  • Die hierin beschriebenen Strukturgene sind allen Retroviren gemeinsam. Weitere Hilfsgene sind in unterschiedlichen Typen von Retrovirus zu finden. Zum Beispiel enthalten Lentiviren, wie beispielsweise HIV-1, sechs weitere Hilfsgene, die als rev, vif, vpu, vpr, nef und tat bekannt sind. Andere Retroviren können Hilfsgene haben, die analog zu den hierin beschriebenen Genen sind, möglicherweise jedoch haben sie nicht immer den gleichen Namen erhalten wie in der Literatur. Dokumente wie Tomonaga und Mikami (1996) J. Gen. Virol. 77(Pt 8): 1611–1621 beschreiben verschiedene Retrovirus-Hilfsgene.
  • Rev: Das Hilfsgen rev („Regulator von Virion”) codiert ein akzessorisches Protein, das an das auf Rev ansprechende Element („Rev Response Element”, RRE) bindet, und erleichtert den Export von retroviralen Transkripten. Das Proteinprodukt des Gens erlaubt es, dass Fragmente retroviraler mRNA, die das auf Rev ansprechende Element („Rev Response Element”, RRE) enthalten, aus dem Nukleus ins Zytoplasma exportiert werden. Es wird vorhergesagt, dass die RRE-Sequenz eine komplexe gefaltete Struktur bildet. Diese besondere Rolle von rev spiegelt eine enge Kopplung der Spleiß- und Zellkernexport-Schritte wider. In einer Ausführungsform umfasst Nukleinsäurevektor eine RRE-Sequenz. In einer weiteren Ausführungsform ist die RRE-Sequenz von HIV-1 HXB2-Sequenz abgeleitet, die bei Genom-Hinterlegungs-Nr. K03455 erhältlich ist, zum Beispiel von den Basenpaaren 7622 bis 8479, oder 7769 bis 8146, insbesondere den Basenpaaren 7622 bis 8479.
  • Rev bindet an RRE und erleichtert den Export von einfach gespleißten (env, vif, vpr und vpu) oder nicht-gespleißten (gag, pol und genomischer RNA) viralen Transkripten, was somit zu Downstream-Ereignissen wie Gentranslation und Verpackung führt (siehe Suhasini und Reddy (2009) Curr. HIV Res. 7(1): 91–100). In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich das Hilfsgen rev oder ein dazu analoges Gen (d. h. von anderen Retroviren oder einem funktionell analogen System). Der Einschluss des rev-Gens stellt einen effizienten Export von RNA-Transkripten des retroviralen Vektorgenoms aus dem Nukleus ins Zytoplasma sicher, insbesondere wenn ein RRE-Element ebenfalls in dem zu transportierenden Transkript enthalten ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das rev-Gen wenigstens 60% Sequenzidentität, wie beispielsweise wenigstens 70% Sequenzidentität, zu den Basenpaaren 970 bis 1320 von Genom-Hinterlegungs-Nr. M11840 (d. h. HIV-1 Klon 12 cDNA, der HIVPCV12-Locus). In einer alternativen Ausführungsform umfasst das rev-Gen wenigstens 60% Sequenzidentität, wie beispielsweise wenigstens 70%, 80%, 90% oder 100% Sequenzidentität zu den Basenpaaren 5970 bis 6040 und 8379 bis 8653 von Genom-Hinterlegungs-Nr. K03455.1 (d. h. humanes Immunschwächevirus Typ 1, HXB2).
  • Es wird angenommen, dass Hilfsgene eine Rolle in der retroviralen Replikation und Pathogenese spielen; daher schließen viele derzeitige Systeme zur Produktion viraler Vektoren manche dieser Gene nicht ein. Die Ausnahme ist rev, das üblicherweise vorliegt, oder ein zu dem rev/RRE-System analoges System wird potentiell verwendet. Daher sind in einer Ausführungsform die Nukleinsäuresequenzen, die eines oder mehrere der Hilfsgene vpr, vif, vpu, tat und nef oder analoge Hilfsgene codieren, gestört, so dass die Hilfsgene aus dem RNA-Genom des retroviralen Vektorpartikels entfernt werden oder unfähig sind, funktionelle Hilfsproteine zu codieren. In einer weiteren Ausführungsform sind wenigstens zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr oder alle der Hilfsgene vpr, vif, vpu, tat und nef, oder analoge Hilfsgene, gestört, so dass die Hilfsgene aus dem RNA-Genom des retroviralen Vektorpartikels entfernt werden oder unfähig sind, funktionelle Hilfsproteine zu codieren. Die Entfernung des funktionellen Hilfsgens erfordert möglicherweise nicht die Entfernung des gesamten Gens; die Entfernung eines Teils des Gens oder die Störung des Gens wird ausreichend sein.
  • Es versteht sich, dass die Nukleinsäuresequenzen, die das replikationsdefekte retrovirale Vektorpartikel codieren, die gleichen sein können wie die, oder abgeleitet sein können von den Wildtyp-Gene(n) des Retrovirus, auf welchem das retrovirale Vektorpartikel basiert, d. h. die Sequenzen können genetisch oder auf andere Weise veränderte Versionen von Sequenzen sein, die in dem Wildtyp-Virus enthalten sind. Daher können sich die in die Nukleinsäurevektoren oder Wirtszellgenome inkorporierten retroviralen Gene auch auf Codon-optimierte Versionen der Wildtyp-Gene beziehen.
  • ZUSÄTZLICHE KOMPONENTEN
  • Die Nukleinsäurevektoren der Erfindung können weitere zusätzliche Komponenten umfassen. Diese zusätzlichen Merkmale können zum Beispiel verwendet werden, um die Stabilisierung von Transkripten für die Translation zu unterstützen, das Niveau der Genexpression zu steigern und die Gentranskription an-/abzuschalten.
  • Die durch die Erfindung produzierten retroviralen Vektorpartikel können in Verfahren der Gentherapie verwendet werden. Daher umfasst in einer Ausführungsform der Nukleinsäurevektor zusätzlich ein oder mehrere Transgene. Dieses Transgen kann ein therapeutisch aktives Gen sein, das ein Genprodukt codiert, das verwendet werden kann, um eine Zielerkrankung zu behandeln oder zu lindern. Das Transgen kann zum Beispiel eine Antisense-RNA, ein Ribozym, ein Protein (zum Beispiel ein Tumorsuppressorprotein), ein Toxin, ein Antigen (das verwendet werden kann, um Antikörper oder Helfer-T-Zellen oder zytotoxische T-Zellen zu induzieren) oder einen Antikörper (wie beispielsweise einen einzelkettigen Antikörper) codieren. In einer Ausführungsform codiert das Transgen Betaglobin.
  • Es wird erwartet, dass mehrere Kopien des Transfervektors, der das Transgen enthält, zu einem höheren retroviralen Vektortiter führen; daher umfasst in einer Ausführungsform der Nukleinsäurevektor mehrere Kopien des Transgens, wie beispielsweise zwei oder mehr, insbesondere drei oder mehr Kopien des Transgens. In manchen Fällen ist mehr als ein Genprodukt erforderlich, um eine Erkrankung zu behandeln; daher umfasst in einer weiteren Ausführungsform der Nukleinsäurevektor zusätzlich zwei oder mehr, wie beispielsweise drei oder mehr oder vier oder mehr unterschiedliche Transgene.
  • Bezugnahmen auf „Transgen” hierin beziehen sich auf heterologe oder fremde DNA, die in der Säugetier-Wirtszelle, in die sie eingebracht wird, nicht vorliegt oder nicht ausreichend exprimiert wird. Dies kann zum Beispiel den Fall einschließen, wenn ein Zielgen in der Säugetier-Wirtszelle nicht korrekt exprimiert wird; daher wird eine korrigierte Version des Zielgens als das Transgen eingebracht. Daher kann das Transgen ein Gen von potentiellem therapeutischem Interesse sein. Das Transgen kann von einem anderen Zelltyp oder einer anderen Spezies erhalten oder synthetisch hergestellt worden sein. Alternativ kann das Transgen von der Wirtszelle erhalten, jedoch funktionsfähig mit regulatorischen Regionen verknüpft worden sein, die sich von jenen, die in dem nativen Gen vorliegen, unterscheiden. Alternativ kann das Transgen ein(e) unterschiedliche(s) Allel oder Variante eines in der Wirtszelle vorliegenden Gens sein.
  • Das Ziel der Gentherapie besteht darin, das genetische Material lebender Zellen für therapeutische Zwecke zu modifizieren, und es umfasst die Insertion eines funktionellen Gens in eine Zelle, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Der unter Verwendung der hierin beschriebenen Nukleinsäurevektoren und Wirtszellen produzierte retrovirale Vektor kann verwendet werden, um Zielzellen zu transfizieren und die Expression des Gens von potentiellem therapeutischem Interesse zu induzieren. Der retrovirale Vektor kann daher für die Behandlung eines Säugetier-Subjekts verwendet werden, wie beispielsweise eines menschlichen Subjekts, das an einem Zustand einschließlich jedoch nicht beschränkt auf Erbkrankheiten, Krebs und bestimmter viraler Infektionen leidet.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich ein Transkriptionsregulationselement. Zum Beispiel kann jedes der hierin beschriebenen Elemente funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft sein, so dass die Expression kontrolliert werden kann. Hierin erwähnte Promotoren können bekannte Promotoren ganz oder teilweise einschließen, die konstitutiv wirken oder induzierbar sein können, z. B. in der Gegenwart eines regulatorischen Proteins. In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich einen hocheffizienten Promotor, wie beispielsweise einen CMV-Promotor. Dieser Promotor hat den Vorteil, dass er ein hohes Expressionsniveau der Elemente fördert, die auf dem Nicht-Säugetier-Nukleinsäurevektor codiert sind. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der CMV-Promotor eine Sequenz, die von dem humanen Cytomegalovirus-Stamm AD169 abgeleitet ist. Diese Sequenz ist bei Genom-Hinterlegungs-Nr. X17403 erhältlich, zum Beispiel von den Basenpaaren 173731 bis 174404.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Promotor (wie beispielsweise ein CMV-Promotor) zusätzlich wenigstens ein Tet-Operon. Das Tet-Operonsystem kann verwendet werden, um die Expression der retroviralen Sequenzen, die innerhalb des Nukleinsäurevektors enthalten sind, zu kontrollieren. Kurzgefasst blockiert das Tet-Repressorprotein die Expression durch Binden an die Tet-Operonstelle, die in den Promotor eingebracht wird. Daher gibt es keine Genexpression, wenn der Tet-Repressor an das Tet-Operon gebunden ist. Bei Zugabe von Tetracyclin oder Doxycyclin wird der Tet-Repressor sequestriert, was Promotoraktivität erlaubt; daher wird die Genexpression eingeschaltet. Tet-Operonsysteme sind weit verbreitet erhältlich, wie beispielsweise das Tet-Operon, das in dem pcDNATM4/TO-Säugetier-Expressionsvektor verwendet wird, der von Invitrogen erhältlich ist.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich ein Tetracyclin-Resistenz-Operon-Repressorprotein („Tet-Repressor” oder „TetR”). In einer weiteren Ausführungsform ist der Tet-Repressor Codon-optimiert.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich einen Isolator, wie beispielsweise einen Chromatin-Isolator. Der Begriff „Isolator” bezieht sich auf eine genetische Sequenz, die die Wechselwirkung zwischen Promotoren und Enhancern blockiert. In einer weiteren Ausführungsform liegt der Isolator (wie beispielsweise ein Chromatin-Isolator) zwischen jeder der retroviralen Nukleinsäuresequenzen vor. Dies hilft, Promotor-Interferenz (d. h. wenn der Promotor aus einer Transkriptionseinheit die Expression einer benachbarten Transkriptionseinheit beeinträchtigt) zwischen benachbarten retroviralen Nukleinsäuresequenzen zu verhindern. Es versteht sich, dass, wenn die Isolatoren in dem Nukleinsäurevektor zwischen jeder der retroviralen Nukleinsäuresequenzen vorliegen, diese dann als individuelle Expressionskonstrukte innerhalb des Nukleinsäurevektors angeordnet sein können. Zum Beispiel hat jede Sequenz, die die retroviralen Nukleinsäuresequenzen codiert, ihren eigenen Promotor und/oder ein Intron und/oder polyA-Signal. In einer Ausführungsform hat der Chromatin-Isolator wenigstens 90% Sequenzidentität, zum Beispiel wenigstens 95% Sequenzidentität, zu der Huhn-(Gallus gallus)HS4-Isolator-Sequenz (siehe zum Beispiel Genom-Hinterlegungs-Nr. U78775.2, Basenpaare 1 bis 1205).
  • In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich einen selektierbaren Marker. Dies erlaubt die Auswahl der Zellen, die die Nukleinsäuresequenzen, die ein replikationsdefektes retrovirales Vektorpartikel codieren, inkorporiert haben. In einer weiteren Ausführungsform ist der selektierbare Marker ein Antibiotika-Resistenzgen, wie beispielsweise ein Zeocin-, Kanamycin- oder Puromycin-Resistenzgen, insbesondere ein Zeocin-(ZeoR-)Resistenzgen.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Zeocin-Resistenzgen von dem Streptoalloteichus hindustans ble-Gen abgeleitet; siehe zum Beispiel Genom-Hinterlegungs-Nr. X52869.1 von den Basenpaaren 3 bis 377.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich ein polyA-Signal. Die Verwendung eines polyA-Signals hat den Vorteil, dass mRNA vor enzymatischem Abbau geschützt und die Translation unterstützt wird. In einer weiteren Ausführungsform wird das polyA-Signal von SV40, Rinder-Wachstumshormon und/oder humanem Betaglobin erhalten oder abgeleitet. In einer Ausführungsform ist das polyA-Signal von dem SV40 frühen polyA-Signal abgeleitet (siehe zum Beispiel Genom-Hinterlegungsnummer EF579804.1, Basenpaare 2668 bis 2538 vom Minus-Strang). In einer Ausführungsform ist das polyA-Signal von dem humanen Betaglobin-polyA-Signal abgeleitet (siehe zum Beispiel Genom-Hinterlegungs-Nr. GU324922.1, Basenpaare 3394 bis 4162).
  • In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich eine Intronsequenz. Es ist bekannt, dass die Verwendung eines Introns strangabwärts der Enhancer/Promotor-Region und strangaufwärts des cDNA-Inserts (d. h. des Transgens) das Expressionsniveau des Inserts steigert. In einer weiteren Ausführungsform ist die Intronsequenz ein humanes Betaglobin-Intron oder die Kaninchen-Betaglobin-Intron II-Sequenz. In einer Ausführungsform ist das humane Betaglobin-Intron von der Sequenz abgeleitet, die bei Genom-Hinterlegungs-Nr. KM504957.1 erhältlich ist (zum Beispiel von den Basenpaaren 476 bis 1393). In einer Ausführungsform ist das Kaninchen-Betaglobin-Intron II von der Sequenz abgeleitet, die bei Genom-Hinterlegungs-Nr. V00882.1 erhältlich ist (zum Beispiel von den Basenpaaren 718 bis 1290).
  • In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich ein Woodchuck-Hepatitisvirus posttranskriptionelles regulatorisches Element (WPRE). Es wurde gezeigt, dass das Vorliegen von WPRE die Expression erhöht und als solches wahrscheinlich vorteilhaft ist, um hohe Expressionsniveaus zu erzielen. In einer weiteren Ausführungsform ist das WPRE von der Sequenz abgeleitet, die bei Genom-Hinterlegungs-Nr. J04514.1 erhältlich ist (zum Beispiel von den Basenpaaren 1093 bis 1684).
  • In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES). Eine IRES ist ein strukturiertes RNA-Element, das üblicherweise in der 5'-untranslatierten Region strangabwärts zu der 5'-Kappe (die für den Aufbau des Initiierungskomplexes erforderlich ist) zu finden ist. Die IRES wird durch Translationsinitiationsfaktoren erkannt und erlaubt eine kappenunabhängige Translation. In einer weiteren Ausführungsform ist die IRES von dem Enzephalomyocarditisvirus-(EMCV-)Genom abgeleitet (siehe zum Beispiel Genom-Hinterlegungs-Nr. KF836387.1, Basenpaare 151 bis 724).
  • In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor zusätzlich eine Mehrfachklonierungsstelle (MCS). Eine MCS ist ein kurzes Segment von DNA innerhalb des Nukleinsäurevektors, das mehrere Restriktionsstellen enthält (zum Beispiel 10, 15 oder 20 Stellen). Diese Stellen kommen üblicherweise nur einmal innerhalb des Nukleinsäurevektors vor, um sicherzustellen, dass die Endonuklease nur an einer Stelle schneidet. Dies erlaubt eine einfache Insertion der retroviralen Gene unter Verwendung der angemessenen Endonukleasen (d. h. Restriktionsenzyme).
  • Für einen Fachmann auf dem Gebiet versteht es sich, dass die Konstrukte in jeglicher Reihenfolge innerhalb des Nukleinsäurevektors angeordnet sein können. In einer beispielhaften Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor das folgende Insert: eine retrovirale Nukleinsäuresequenz, die die gag- und pol-Proteine codiert, eine retrovirale Nukleinsäuresequenz, die das env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon (wie beispielsweise VSVg) codiert, eine retrovirale Nukleinsäuresequenz, die das Hilfsgen rev (wie beispielsweise eine Codon-optimierte rev-Sequenz) oder ein dazu analoges Gen oder ein funktionell analoges System codiert, ein Tetracyclin-Resistenz-Operon-Repressorprotein (TetR), eine interne Ribosomeneintrittsstelle und einen selektierbaren Marker (wie beispielsweise einen Zeocin-Resistenz-Selektionsmarker) (d. h. GagPol-Env-Rev-TetRepressor-IRES-Antibiotika-Resistenzmarker-verbleibende BAC-Sequenz („BAC-Gerüst”); wie beispielsweise: GagPol-(Wildtyp-)VSVg-(Codon-optimiertes)Rev-TetRepressor-IRES-ZeocinResistenz-pSMARTBAC). In einer weiteren Ausführungsform liegt ein Isolator (wie beispielsweise ein Chromatin-Isolator) zwischen jeder der gagpol-, env- und rev-Sequenzen vor. In einer weiteren Ausführungsform liegt ein Promotor vor jeder der gagpol-, env- und rev-Sequenzen vor. In noch einer weiteren Ausführungsform liegt wenigstens eine Kopie der Transfervektorsequenz (d. h. umfassend Nukleinsäuresequenzen, die das RNA-Genom eines retroviralen Vektorpartikels codieren) vor der gagpol-Sequenz vor.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Nukleinsäurevektor das folgende Insert: einen Isolator (wie beispielsweise einen Chromatin-Isolator), einen Promotor (wie beispielsweise einen CMV-Promotor, der optional eine Tet-Operonsequenz umfasst), ein Intron (wie beispielsweise ein humanes Betaglobin-Intron), eine retrovirale Nukleinsäuresequenz, die die gag- und pol-Proteine codiert, eine retrovirale Nukleinsäure, die RRE codiert, ein polyA-Signal (wie beispielsweise ein humanes Betaglobin-polyA-Signal), einen Isolator (wie beispielsweise einen Chromatin-Isolator), einen Promotor (wie beispielsweise einen CMV-Promotor, der optional eine Tet-Operonsequenz umfasst), ein Intron (wie beispielsweise ein humanes Betaglobin-Intron), eine retrovirale Nukleinsäuresequenz, die das env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon (wie beispielsweise VSVg) codiert, ein polyA-Signal (wie beispielsweise ein humanes Betaglobin-polyA-Signal), einen Isolator (wie beispielsweise einen Chromatin-Isolator), einen Promotor (wie beispielsweise einen CMV-Promotor, der optional eine Tet-Operonsequenz umfasst), eine retrovirale Nukleinsäuresequenz, die das Hilfsgen rev oder ein dazu analoges Gen oder ein funktionell analoges System codiert, ein polyA-Signal (wie beispielsweise ein humanes Betaglobin-polyA-Signal), einen Isolator (wie beispielsweise einen Chromatin-Isolator), einen Promotor (wie beispielsweise einen CMV-Promotor), ein Intron (wie beispielsweise ein Kaninchen-Betaglobin-Intron), ein Tetracyclin-Resistenz-Operon-Repressorprotein (TetR), eine interne Ribosomeneintrittsstelle, einen selektierbaren Marker (wie beispielsweise einen Zeocin-Resistenz-Selektionsmarker), ein polyA-Signal und eine Mehrfachklonierungsstelle.
  • Die Nukleinsäuresequenzen können sequentiell in den Nukleinsäurevektor eingebracht werden. Dies erlaubt eine Selektion nach jeder Integration, um sicherzustellen, dass alle der erforderlichen Nukleinsäuresequenzen erfolgreich in den Nukleinsäurevektor integriert werden. Alternativ werden wenigstens zwei oder mehr der Nukleinsäuresequenzen gleichzeitig in den Nukleinsäurevektor eingebracht.
  • Es versteht sich, dass die hierin beschriebenen zusätzlichen Gene durch standardmäßige molekulare Klonierungstechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, zum Beispiel unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen und Ligationstechniken, in den Nukleinsäurevektor eingebracht werden können. Weiterhin kann der Nukleinsäurevektor, insbesondere BACs, PACs, Fosmide und/oder Cosmide, durch Standardtechniken, wie beispielsweise Elektroporation, in bakterielle Wirtszellen (wie beispielsweise E. coli-Zellen, insbesondere den E. coli-Stamm DH10B) eingebracht werden.
  • VERWENDUNGEN
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird der Nukleinsäurevektor, wie er hierin definiert ist, zur Verwendung beim Produzieren einer retroviralen Verpackungs- oder Produzentenzelllinie bereitgestellt. Die hierin beschriebenen Nukleinsäurevektoren können verwendet werden, um eine retrovirale Verpackungszelllinie zu kreieren, die die retrovirale Vektorproduktion erheblich vereinfachen würde. Es versteht sich, dass, wenn ein Transgen in dem Nukleinsäurevektor eingeschlossen ist, dies dann verwendet würde, um eine Produzentenzelllinie zu kreieren.
  • Wie hierin beschrieben, wäre es nützlich, eine stabile retrovirale Verpackungs-(oder Produzenten-)Zelllinie zu entwickeln, um die mit transienter Transfektion assoziierten Schwierigkeiten zu überwinden. Die hierin beschriebenen Nukleinsäurevektoren können verwendet werden, um die Verpackungszelllinien herzustellen, da sie fähig sind, große DNA-Inserts zu halten, die die essentiellen Gene enthalten, die für die retrovirale Verpackung erforderlich sind, die dann in einem Schritt in das endogene Genom von Säugetier-Wirtszellen integriert werden können.
  • WIRTSZELLEN
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine retrovirale Verpackungszelle bereitgestellt, die Nukleinsäuresequenzen umfasst, die codieren:
    gag- und pol-Proteine; und
    env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon,
    wobei die Nukleinsäuresequenzen alle an einem einzigen Locus innerhalb des retroviralen Verpackungszellgenoms liegen.
  • Der Vorteil des Einschließens aller der retroviralen Gene auf einem großen Nukleinsäurevektor besteht darin, dass sie zuerst in mikrobiellen Zellen (wie beispielsweise bakteriellen oder Hefezellen) hergestellt werden können, die viel leichter zu handhaben und zu manipulieren sind, ehe sie in einem einzigen Schritt in Säugetierzellen integriert werden. Dies vermindert den Selektionsdruck und reduziert den Stilllegungs-Zeitrahmen („silencing timeframe”), sobald die retroviralen Gene in eine Säugetier-Wirtszelle integriert wurden. Das charakteristische Merkmal dieses Verfahrens ist es, dass alle der retroviralen Gene, die erforderlich sind, um eine Verpackungszelllinie zu kreieren, in einem einzigen Locus in dem endogenen Genom vorliegen, statt nach dem Zufallsprinzip in dem gesamten endogenen Genom verstreut zu sein. Dies hat den Vorteil, dass eine retrovirale Verpackungszelle produziert wird, die alle der retroviralen Gene auf dem gleichen Niveau exprimiert, da sie in dem gleichen Locus liegen, verglichen mit früheren Verfahren, bei denen die retroviralen Gene nach dem Zufallsprinzip in dem gesamten endogenen Genom integriert werden, was ungleichmäßige Expressionsniveaus verursachen kann.
  • In einer Ausführungsform umfasst die retrovirale Verpackungszelle zusätzlich Nukleinsäuresequenzen, die das RNA-Genom des retroviralen Vektorpartikels codieren. Dieses kann auch an dem einzelnen Locus mit den Nukleinsäuresequenzen liegen, die die gag- und pol-Proteine und das env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon codieren.
  • Daher wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung eine retrovirale Produzentenzelle bereitgestellt, die Nukleinsäuresequenzen umfasst, die codieren:
    gag- und pol-Proteine;
    env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon; und
    das RNA-Genom des retroviralen Vektorpartikels,
    wobei die Nukleinsäuresequenzen alle an einem einzigen Locus innerhalb des retroviralen Produzentenzellgenoms liegen.
  • In einer Ausführungsform ist die retrovirale Verpackungszelle eine Säugetierzelle. In einer weiteren Ausführungsform ist die Säugetierzelle aus einer HEK293-Zelle, CHO-Zelle, Jurkat-Zelle, KS62-Zelle, PerC6-Zelle, HeLa-Zelle oder einem Derivat oder funktionellen Äquivalent davon ausgewählt. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Säugetier-Wirtszelle eine HEK293-Zelle oder von einer HEK293-Zelle abgeleitet. Solche Zellen könnten adhärente Zelllinien (d. h. sie wachsen in einer einzelnen Schicht, die an eine Oberfläche angeheftet ist) oder Suspensions-angepasste/nicht-adhärente Zelllinien (d. h. sie wachsen in Suspension in einem Kulturmedium) sein. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die HEK293-Zelle eine HEK293T-Zelle. Der Ausdruck „HEK293-Zelle” bezieht sich auf die humane embryonale Nieren(„Human Embryonic Kidney”)-293-Zelllinie, die üblicherweise in der Biotechnologie verwendet wird. Insbesondere werden HEK293T-Zellen üblicherweise für die Produktion verschiedener retroviraler Vektoren verwendet. Andere Beispiele geeigneter kommerziell erhältlicher Zelllinien schließen T-REXTM-(Life Technologies)Zelllinien ein.
  • Es versteht sich, dass alle hierin zuvor beschriebenen Ausführungsformen für den Nukleinsäurevektor auch auf die retroviralen Verpackungs-/Produzentenzellen der Erfindung angewandt werden können.
  • VERFAHREN
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Produzieren einer stabilen retroviralen Verpackungszelllinie bereitgestellt, welches umfasst:
    • (a) Einbringen des Nukleinsäurevektors, wie er hierin beschrieben ist, in eine Kultur von Säugetier-Wirtszellen; und
    • (b) Auswählen, innerhalb der Kultur, hinsichtlich einer Säugetier-Wirtszelle, die die Nukleinsäuresequenzen aufweist, die auf dem Vektor codiert sind, der in ein endogenes Chromosom der Säugetier-Wirtszelle integriert ist.
  • In einer Ausführungsform ist die Säugetier-Wirtszelle aus einer HEK293-Zelle, HEK6E-Zelle, CHO-Zelle, Jurkat-Zelle, KS62-Zelle, PerC6-Zelle, HeLa-Zelle oder einem Derivat oder funktionellen Äquivalent davon ausgewählt. In einer weiteren Ausführungsform ist die Säugetier-Wirtszelle eine HEK293-Zelle oder von einer HEK293-Zelle abgeleitet. Solche Zellen könnten adhärente Zelllinien (d. h. sie wachsen in einer einzelnen Schicht, die an eine Oberfläche angeheftet ist) oder Suspensions-angepasste/nicht-adhärente Zelllinien (d. h. sie wachsen in Suspension in einem Kulturmedium) sein. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die HEK293-Zelle eine HEK293T-Zelle oder HEK6E-Zelle. Andere Beispiele von geeigneten kommerziell erhältlichen Zelllinien schließen T-REXTM-(Life Technologies)Zelllinien ein.
  • Dem Fachmann wird bewusst sein, dass das Einbringen des Nukleinsäurevektors in die Wirtszelle unter Verwendung geeigneter Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, zum Beispiel Lipid-vermittelte Transfektion, Mikroinjektion, Zell-(wie beispielsweise Mikrozell-)Fusion, Elektroporation oder Mikroprojektilbeschuss, durchgeführt werden kann. In einer Ausführungsform wird der Nukleinsäurevektor durch Elektroporation in die Wirtszelle eingebracht. Es versteht sich, dass die Auswahl des zu verwendenden Verfahrens zum Einbringen des Nukleinsäurevektors in Abhängigkeit von dem verwendeten Typ von Säugetier-Wirtszelle getroffen werden kann.
  • Sobald er innerhalb der Säugetier-Wirtszelle ist, wird der Nukleinsäurevektor nach dem Zufallsprinzip in das endogene Genom der Säugetier-Wirtszelle integrieren. Daher umfasst das Verfahren zusätzlich das Auswählen hinsichtlich der Säugetier-Wirtszelle, in der sich die Nukleinsäuren, die auf dem Nukleinsäurevektor codiert sind, integriert haben (zum Beispiel unter Verwendung eines Antibiotika-Resistenz-Selektionsmarkers, wie beispielsweise eines Zeocin-Resistenzmarkers).
  • Der Fachmann wird sich Verfahren zum Fördern der Integration des Nukleinsäurevektors, zum Beispiel Linearisieren des Nukleinsäurevektors, wenn er naturgemäß kreisförmig ist (zum Beispiel BACs, PACs, Cosmide oder Fosmide), bewusst sein. Der Nukleinsäurevektor kann zusätzlich Bereiche gemeinsamer Homologie mit den endogenen Chromosomen der Säugetier-Wirtszelle umfassen, um die Integration an eine ausgewählte Stelle innerhalb des endogenen Genoms zu führen. Weiterhin können, wenn Rekombinationsstellen auf dem Nukleinsäurevektor vorliegen, diese dann für gezielte Rekombination verwendet werden. Zum Beispiel kann der Nukleinsäurevektor eine loxP-Stelle enthalten, die eine gezielte Integration erlaubt, wenn sie mit Cre-Rekombinase kombiniert wird (d. h. unter Verwendung des von P1-Bakteriophage abgeleiteten Cre/lox-Systems). Alternativ (oder zusätzlich) ist die Rekombinationsstelle eine att-Stelle (z. B. von Lambda-Phage), wobei die att-Stelle ortsgerichtete Integration in der Gegenwart einer Lambda-Integrase gestattet. Dies würde erlauben, dass die retroviralen Gene auf einen Locus innerhalb des endogenen Genoms ausgerichtet werden, was eine hohe und/oder stabile Expression erlaubt.
  • Andere Verfahren gezielter Integration sind im Stand der Technik gut bekannt. Zum Beispiel können Verfahren zum Induzieren gezielter Spaltung genomischer DNA verwendet werden, um gezielte Rekombination an einem ausgewählten chromosomalen Locus zu fördern. Diese Verfahren beinhalten oft die Verwendung technisch veränderter Spaltungssysteme, um einen Doppelstrangbruch (DSB) oder eine Diskontinuität („nick”) in dem endogenen Genom zu induzieren, um die Reparatur des Bruchs durch natürliche Prozesse, wie beispielsweise nicht-homologe Endverknüpfung („non-homologous end joining”, NHEJ) oder Reparatur unter Verwendung einer Reparaturmatrize (d. h. Homologie-gerichtete Reparatur oder HDR), zu induzieren.
  • Spaltung kann durch die Verwendung spezifischer Nukleasen auftreten, wie beispielsweise modifizierter Zinkfinger-Nukleasen (ZFN), Transkriptionsaktivator-artiger Effektornukleasen (TALENs), unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems mit einer modifizierten crRNA/tracr RNA („single guide RNA”), um die spezifische Spaltung zu führen, und/oder unter Verwendung von Nukleasen auf Basis des Argonauten-Systems (z. B. von T. thermophilus, bekannt als „TtAgo", siehe Swarts et al. (2014) Nature 507(7491): 258–261). Gezielte Spaltung unter Verwendung eines dieser Nukleasesysteme kann genutzt werden, um eine Nukleinsäure an eine bestimmte Zielposition unter Verwendung entweder HDR- oder NHEJ-vermittelter Prozesse einzufügen. Daher umfasst in einer Ausführungsform das Verfahren zusätzlich das Integrieren der Nukleinsäuresequenzen, die auf dem Nukleinsäurevektor codiert sind, in das Genom (d. h. ein endogenes Chromosom) der Säugetier-Wirtszelle unter Verwendung wenigstens einer Nuklease, wobei die wenigstens eine Nuklease das Genom der Säugetier-Wirtszelle spaltet, so dass die Nukleinsäuresequenzen in das Genom der Zelle integriert werden. In einer weiteren Ausführungsform ist die wenigstens eine Nuklease aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus einer Zinkfinger-Nuklease (ZFN), einer TALE-Nuklease (TALEN), einem CRISPR/Cas-Nukleasesystem und Kombinationen davon.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine retrovirale Verpackungszelle bereitgestellt, die durch das hierin definierte Verfahren erhalten wird.
  • Die unter Verwendung der hierin definierten Verfahren erhaltene Zelllinie kann verwendet werden, um einen hohen Titer von retroviralem Vektor zu produzieren.
  • Verweise hierin auf den Ausdruck „hoher Titer” beziehen sich auf eine wirksame Menge an retroviralem Vektor oder Partikel, die fähig ist, eine Zielzelle, wie beispielsweise eine Patientenzelle, zu transduzieren. In einer Ausführungsform ist ein hoher Titer über 106 TU/ml ohne Konzentrierung (TU = transducing units = Transduktionseinheiten).
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Produzieren eines replikationsdefekten retroviralen Vektorpartikels bereitgestellt, das umfasst:
    • (a) Einbringen des Nukleinsäurevektors, wie er hierin definiert ist, in eine Kultur von Säugetier-Wirtszellen;
    • (b) Auswählen, innerhalb der Kultur, hinsichtlich einer Säugetier-Wirtszelle, die die Nukleinsäuresequenzen aufweist, die auf dem Vektor codiert sind, der in ein endogenes Chromosom der Säugetier-Wirtszelle integriert ist; und
    • (c) weiteres Kultivieren der Säugetier-Wirtszelle unter Bedingungen, in denen das replikationsdefekte retrovirale Vektorpartikel produziert wird.
  • Wie hierin zuvor beschrieben, ist in einer Ausführungsform die Säugetier-Wirtszelle aus einer HEK293-Zelle, CHO-Zelle, Jurkat-Zelle, KS62-Zelle, PerC6-Zelle, HeLa-Zelle oder einem Derivat oder funktionellen Äquivalent davon ausgewählt. In einer weiteren Ausführungsform ist die Säugetier-Wirtszelle eine HEK293-Zelle oder von einer HEK293-Zelle abgeleitet. Solche Zellen könnten adhärente Zelllinien (d. h. sie wachsen in einer einzelnen Schicht, die an eine Oberfläche angeheftet ist) oder Suspensions-angepasste/nicht-adhärente Zelllinien (d. h. sie wachsen in Suspension in einem Kulturmedium) sein. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die HEK293-Zelle eine HEK293T-Zelle. Andere Beispiele geeigneter kommerziell erhältlicher Zelllinien schließen T REXTM-(Life Technologies)Zelllinien ein.
  • Für den Fachmann versteht es sich, dass die in dem hierin beschriebenen Verfahren verwendeten Bedingungen von der verwendeten Wirtszelle abhängig sein werden. Typische Bedingungen, zum Beispiel das Kulturmedium oder die Temperatur, die verwendet werden sollen, sind im Stand der Technik gut bekannt. In einer Ausführungsform wird das Kultivieren durch Inkubieren der Säugetier-Wirtszelle unter befeuchteten Bedingungen durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform umfassen die befeuchteten Bedingungen das Inkubieren der transfizierten Zellen bei 37°C bei 5% CO2. In einer Ausführungsform wird das Kultivieren unter Verwendung eines Kulturmediums durchgeführt, das ausgewählt ist aus: Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 10% (vol/vol) fötales Rinderserum (FBS), serumfreiem UltraCULTURETM-Medium (Lonza, Kat. Nr. 12-725F), oder FreeStyleTM-Expressionsmedium (Thermo fisher, Kat. Nr. 12338-018).
  • In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zusätzlich das Isolieren des replikationsdefekten retroviralen Vektorpartikels. Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform das Isolieren durch Verwenden eines Filters ausgeführt. In einer weiteren Ausführungsform ist der Filter eine Membran mit geringer Proteinbindung (z. B. eine 0,22 μm-Membran mit geringer Proteinbindung oder eine 0,45 μm-Membran mit geringer Proteinbindung), wie beispielsweise Polyvinylidenfluorid-(PVDF-) oder Polyethersulfon-(PES-)artifizielle Membranen.
  • Sobald sie innerhalb der Säugetier-Wirtszelle sind, können sich die retroviralen Nukleinsäuren, die auf dem Nukleinsäurevektor vorliegen, in einen zufälligen, einzelnen Locus innerhalb des endogenen Genoms integrieren. Der Integrationsschritt kann wie hierin zuvor beschrieben gefördert werden, zum Beispiel unter Verwendung von Linearisierung und/oder Bereichen gemeinsamer Homologie. Rekombinationsstellen können ebenfalls für eine gezielte Rekombination verwendet werden.
  • Wenn die Zielgene mit einem selektiven Marker, wie beispielsweise einem Antibiotika-Resistenzgen, in die endogenen Chromosomen integriert werden, dann kann das Verfahren zusätzlich das Selektieren hinsichtlich der Säugetier-Wirtszellen, in die sich die retroviralen Nukleinsäuren erfolgreich integriert haben, umfassen.
  • Sobald sie isoliert wurden, können die retroviralen Vektorpartikel für in vivo-Anwendungen konzentriert werden. Konzentrationsverfahren schließen zum Beispiel Ultrazentrifugation, Präzipitation oder Anionenaustauschchromatographie ein. Ultrazentrifugation ist als ein schnelles Verfahren für die Konzentration retroviraler Vektoren in kleinem Maßstab nützlich. Alternativ sind Anionenaustauschchromatographie (zum Beispiel unter Verwendung von Mustang Q-Anionenaustauschmembrankartuschen) oder Präzipitation (zum Beispiel unter Verwendung von PEG 6000) besonders nützlich zum Verarbeiten großer Volumen lentiviraler Vektorüberstände.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein replikationsdefektes retrovirales Vektorpartikel bereitgestellt, das durch das hierin definierte Verfahren erhalten wird.
  • Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nachfolgenden, nicht beschränkenden Beispiele ausführlicher beschrieben.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1: Konstrukt-Anleitung
  • 1 zeigt eine schrittweise Anleitung zur Konstruktion von BACpack-WTGP-277delU5 und BACpack-SYNGP-277delU5. Aufgrund der kompatiblen Enden eines XbaI- und NheI-Verdaus wurden die lentiviralen Verpackungsgene schrittweise in den pSmart BAC-Vektor geladen. Am Punkt der Zugabe von GagPol wurden 2 Konstrukte hergestellt, die entweder Wildtyp-GagPol (WTGP) oder das Codon-optimierte GagPol, SYNGP, enthielten. Diesen wurde die Nomenklatur BACpack-WTGP bzw. BACpack-SYNGP gegeben. Die Transferkassette wurde dann auf beide dieser Konstrukte geladen, und so wurden BACpackWTGP-277delU5 und BACpackSYNGP-277delU5 erzeugt.
  • BEISPIEL 2: Selektion eines stabilen polyklonalen Pools
  • Polyklonale stabile Transfektantenpools wurden durch Transfizieren der adhärenten Zelllinie, HEK293T, mit BACpackSYNGP-277delU5 oder BACpackWTGP-277delU5 erzeugt. Hinsichtlich erfolgreicher Integrationsereignisse wurde dann mit Zeocin selektiert.
  • Um die Fähigkeit dieser polyklonalen Pools zur Erzeugung von lentiviralem Vektor zu beurteilen, wurden die Zellen mit Doxycyclin induziert (I) oder uninduziert gelassen (UI) und mit nicht-transfizierten HEK293T-Zellen verglichen.
  • Die Ergebnisse zeigen den Titer in Transduktionseinheiten (TU)/ml des aus jeder Transfektionsbedingung geernteten lentiviralen Vektorüberstands. Aus den Titrationsergebnissen in 2 ist zu sehen, dass die stabilen polyklonalen Pools, die mit entweder BACpackSYNGP-277delU5 oder BACpackWTGP-277delU5 erzeugt wurden, fähig sind, lentiviralen Vektor in Konzentrationen im Bereich von 10e7 TU/ml zu produzieren, was mit dem derzeitigen transienten Transfektionssystem vergleichbar ist.
  • Die Ergebnisse bestätigen, dass der einzelne BAC-Vektor, der alle der Verpackungsgene enthält, die für lentivirale Produktion notwendig sind, Zelllinien erzeugen kann, die fähig sind, lentiviralen Vektor in geeignetem Titer zu produzieren.
  • BEISPIEL 3: Erzeugung stabiler Transfektionssuspensionsklone
  • Der primäre Zweck der Erzeugung von lentiviralen Vektor produzierenden Zelllinien unter Verwendung der BAC-Technologie ist es, rasch neue Fortschritte auf die Plattform anzuwenden. Diese Fortschritte schließen wahrscheinlich die Modifikation spezialisierter Zelllinien ein. Zum Beispiel ist es ein Industriestandard, die Ausbeute zu steigern, indem biologische Produkte in Suspensionszellen produziert werden, da sie zu größeren Dichten wachsen als adhärente Zellen. Das derzeitige System zur Produktion lentiviraler Vektoren stützt sich jedoch auf hohe Transfektionsraten, die in Suspensionszellen schwieriger zu erzielen sind als in adhärenten HEK293T-Zellen. Da die Transfektionseffizienz aufgrund der Selektion erfolgreicher Integranten weniger ein Problem darstellt, wenn eine stabile Zelllinie erzeugt wird, ist das BAC-Konstrukt eine ideale Lösung, um lentiviralen Vektor produzierende Suspensionszelllinien zu erzeugen.
  • Wie zuvor demonstriert, ist das BAC-Konstrukt fähig, Produzentenzelllinien für lentiviralen Vektor aus adhärenten HEK293T-Zellen zu erzeugen. Um die Flexibilität der BAC-Konstrukte zu beweisen, wurden stabile Transfektanten-Zelllinien aus der Suspensionszelllinie HEK293 6E erzeugt. Die HEK293 6E-Zellen wurden mit dem BAC-Konstrukt BACpackWTGP-277delU5 transfiziert, dann mit Zeocin selektiert. Hierauf folgte Klonieren, um klonale Zelllinien zu erzeugen. Die Ergebnisse in 3 zeigen das GFP-Signal, das durch die stabilen Zelllinien erzeugt wird. Dies deutet sowohl auf das Vorliegen von Zeocin-Resistenz als auch einer funktionalen GFP-Expressionskassette in dem Transfervektorsegment hin.
  • Dieses Ergebnis deutet an, dass das BAC-Konstrukt fähig ist, stabile Klone aus mehreren Zelllinien zu erzeugen.
  • BEISPIEL 4: Induzierung von Lentivirus in den Suspensionsklonen
  • Um die Fähigkeit der stabilen Suspensionsklone zur Produktion von lentiviralem Vektor zu bestätigen, wurden die Klone 1, 14, 15 und 16 mit 2 μg/ml Doxycyclin induziert, und der Überstand wurde hinsichtlich des viralen Titers durch Transduktion von HEK293T-Zellen gemessen.
  • Die Ergebnisse in 4 zeigen den Titer in Transduktionseinheiten (TU)/ml des lentiviralen Vektorüberstands, der von jedem Klon geerntet wurde. Die Ergebnisse zeigen klar, dass durch stabile Transfektion der Suspensionszelllinie HEK293 6E mit BACpackWTGP-277delU5 erzeugte Zelllinien fähig sind, lentiviralen Vektor in Ausbeuten zu produzieren, die mit dem derzeitigen transienten Transfektionssystem vergleichbar sind.
  • BEISPIEL 5: Vektortiter der Klone
  • Die Klone 1 und 16, wie sie in 4 beschrieben sind, wurden in Kultur passagiert und zu späteren Zeitpunkten induziert und titriert, um zu bestimmen, ob die Vektorproduktion aus diesen hochgradig produktiven Klonen stabil war. Wie in den 5A und 5B gezeigt, stiegen die Vektortiter aus diesen Klonen zwischen Passage 5 und Passage 21 tatsächlich leicht an, möglicherweise aufgrund eines Anstiegs der Natriumbutyratkonzentration, die in das Induzierungsverfahren eingebracht wurde.
  • Es versteht sich, dass die hierin beschriebenen Ausführungsformen auf alle Aspekte der Erfindung angewendet werden können. Weiterhin sind alle Veröffentlichungen, einschließlich jedoch nicht beschränkt auf Patente und Patentanmeldungen,, die in dieser Beschreibung zitiert werden, durch Bezugnahme hierin aufgenommen, als seien sie vollständig ausgeführt.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (15)

  1. Retrovirale Produzentenzelle, die Nukleinsäuresequenzen umfasst, die codieren: gag- und pol-Proteine; env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon; und das RNA-Genom des retroviralen Vektorpartikels, wobei die Nukleinsäuresequenzen alle an einem einzigen Locus innerhalb des retroviralen Produzentenzellgenoms liegen.
  2. Retrovirale Produzentenzelle gemäß Anspruch 1, die zusätzlich das Hilfsgen rev oder ein dazu analoges Gen oder ein funktionell analoges System umfasst.
  3. Retrovirale Produzentenzelle gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die retroviralen Nukleinsäuresequenzen von einem Retrovirus, ausgewählt aus Lentivirus, Alpha-Retrovirus, Gamma-Retrovirus oder Foamy-Retrovirus, abgeleitet sind.
  4. Retrovirale Produzentenzelle gemäß Anspruch 3, wobei die retroviralen Nukleinsäuresequenzen von einem Lentivirus abgeleitet sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, EIAV und Visna.
  5. Retrovirale Produzentenzelle gemäß Anspruch 4, wobei die retroviralen Nukleinsäuresequenzen von HIV-1 abgeleitet sind.
  6. Retrovirale Produzentenzelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das env-Protein oder ein funktionelles Substitut davon von vesikulärem Stomatitisvirus abgeleitet ist.
  7. Retrovirale Produzentenzelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, die zusätzlich ein Transkriptionsregulationselement umfasst.
  8. Retrovirale Produzentenzelle gemäß Anspruch 7, wobei das Transkriptionsregulationselement ein CMV-Promotor ist.
  9. Retrovirale Produzentenzelle gemäß Anspruch 8, wobei der CMV-Promotor zusätzlich wenigstens ein Tet-Operon umfasst.
  10. Retrovirale Produzentenzelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, die zusätzlich ein Tetracyclin-Resistenz-Operon-Repressorprotein (TetR) umfasst.
  11. Retrovirale Produzentenzelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, die zusätzlich einen Isolator umfasst.
  12. Retrovirale Produzentenzelle gemäß Anspruch 11, wobei ein Isolator zwischen jeder der retroviralen Nukleinsäuresequenzen vorliegt.
  13. Retrovirale Produzentenzelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, die zusätzlich einen selektierbaren Marker umfasst.
  14. Retrovirale Produzentenzelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, die zusätzlich ein oder mehrere Transgene umfasst.
  15. Retrovirale Produzentenzelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Zelle eine Säugetierzelle ist.
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