JP2018534937A - レトロウイルス産生のための安定な細胞株 - Google Patents

Abstract

本発明は、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質；エンベロープタンパク質またはその機能的置換物；ならびにレトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムをコードする核酸配列を含んでなるレトロウイルス産生細胞に関し、前記核酸配列は総てレトロウイルス産生細胞 ゲノムの単一の遺伝子座に位置する。本発明はまた、非哺乳動物複製起点と少なくとも２５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡを保持する能力とを含んでなる核酸ベクターであって、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質、ならびにｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体をコードするレトロウイルス核酸配列を含んでなることを特徴とする核酸ベクターに関する。本発明はまた、安定なレトロウイルスパッケージングおよび産生細胞株を製造するための前記核酸ベクターの使用および使用方法に関する。

Description

本発明は、レトロウイルス産生に必要とされる遺伝子を含んでなる核酸ベクターおよびそれらの使用に関する。また、本明細書に記載の核酸ベクターを含んでなるレトロウイルスパッケージング／産生細胞株を作製する方法も提供される。

遺伝子療法では、遺伝物質が処置を必要とする対象の内在細胞に送達される。この遺伝物質は、対象に新規な遺伝子を導入するか、または既存の遺伝子の付加的コピーを導入するか、または対象に存在する遺伝子の異なる対立遺伝子もしくは変異体を導入する。遺伝子療法で使用するために有効な遺伝子送達法としてウイルスベクター系が提案されている(Verma and Somia (1997) Nature 389: 239-242)。

特に、これらのウイルスベクターはレトロウイルス科のメンバーに基づき、これは宿主のゲノムへそれらの遺伝子弾頭を組み込むそれらの能力によるものである。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノムのパッケージングおよび送達に必要とされる必須タンパク質を維持するが、それらの疾患の原因となるものを含む必須でない補助的タンパク質が除去されるよう設計される。レトロウイルスベクターの例としては、レンチウイルスベクター、例えば、非増殖細胞に組み込むことができるために広く使用されている１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）に基づくものが挙げられる。

現在のところ、大部分のウイルスベクターは、宿主細胞株へのウイルス遺伝子の一時的同時トランスフェクション(transient co-transfection)により作製される。ウイルス遺伝子は、ウイルス遺伝子がプラスミドに留まりゲノム内に組み込まれないために限定された期間だけ宿主細胞内に存在する細菌プラスミドを用いて導入される。従って、一時的にトランスフェクトされた遺伝物質は、細胞分裂の際に次世代に受け渡されない。

一時的トランスフェクションに関しては、バッチごとの変動、高コストのトランスフェクション試薬および品質管理の維持の難しさなどのいくつかの欠点がある（Segura et al. (2013) Expert Opin. Biol. Ther. 13(7): 987-1011参照）。トランスフェクションのプロセス自体も労働集約的であり、スケールアップが困難である。また、ベクター作製の際に持ち越されるプラスミド不純物を除去するという困難な作業もある（Pichlmair et al. (2007) J. Virol. 81(2): 539-47参照）。

一時的トランスフェクションに付随する問題に取り組むために、レトロウイルスベクター産生を簡単にするためのレトロウイルスパッケージングおよび産生細胞株の開発が望まれてきた。

パッケージング細胞株は、レトロウイルスベクターのパッケージング能のある細胞株をプラスミド（個々のプラスミドはレトロウイルスパッケージング遺伝子およびユニークな真核生物選択マーカーを有する）でトランスフェクトすることにより作製されてきた。パッケージング遺伝子は、パッケージング細胞株のゲノムに組み込まれ、安定にトランスフェクトされると言われる。ここ２０年間、レトロウイルスベクター用の安定なパッケージングおよび産生細胞株を作製するために様々な試みがなされてきた。

レトロウイルスベクター成分の宿主細胞ゲノムへの組込みを介して作出されるパッケージングおよび産生細胞株には報告されている多くの問題がある。第一に、レトロウイルスベクター成分の連続的導入は労力がかかり、融通が利かないものであり得る。また、宿主細胞ゲノムに組み込まれる場合、組込み部位が予測できないために、レトロウイルスベクター成分の遺伝的および／または転写的不安定性という問題もある(Ni et al. (2005) J. Gene Med. 7: 818-834)。また、産生細胞株の懸濁適応およびスケールアップの際の、ウイルスベクター生産性の著しい低下も報告されている(Farson et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12: 981-997; Guy et al. (2013) Hum. Gene Ther. Methods. 24(2): 125-39)。

よって、本発明の目的は、既存の方法に付随する欠点の１以上を克服する、安定なレトロウイルスパッケージングおよび産生細胞株の作製方法を提供することである。

本発明者らは、レトロウイルスベクター産生に必須のレトロウイルス遺伝子を含んでなり、非哺乳動物複製起点と少なくとも２５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡ、例えば細菌人工染色体、を保持する能力を含んでなる核酸ベクターの使用を含む、パッケージングおよび産生細胞株を作製する新規な方法を開発した。これにより、一時的トランスフェクション法に付随する問題を改善するための、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子の産生に必要とされるレトロウイルス遺伝子の発現が可能となる。

非哺乳動物複製起点を含んでなり、かつ、少なくとも２５ｋｂのＤＮＡ（すなわち、大型構築物ＤＮＡ）を保持する能力を有する核酸ベクターの使用にはいくつかの利点がある。第一に、これらのベクターは、哺乳動物宿主細胞ではなく、それらの使用をはるかに容易にする非哺乳動物細胞（例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞）でまず操作することができる（例えば、細菌人工染色体は大腸菌(E. coli)でまず操作することができる）。ひと度、核酸ベクターが作製されれば、それを哺乳動物宿主細胞に導入することができ、核酸ベクターが内在性染色体に組み込まれた哺乳動物細胞を、安定な細胞株を単離するために選択することができる。

また、レトロウイルス核酸の哺乳動物宿主細胞への導入は単一工程で起こり、これは選択圧およびサイレンシング時間枠を低減する助けとなる。これにより潜在的パッケージング細胞のより速いスクリーニングが可能となり、１つのベクターが使用されるだけであるので、複数のプラスミドベクターを使用する従来の方法よりも材料のコストが削減される。特に、現行の系を使用すると、プラスミドコスト、必要とされるトランスフェクション試薬（例えば、ポリエチレンイミン［ＰＥＩ］）の節約、必要とされるベンゾナーゼ処理の量の削減（レンチウイルス収穫物中のＤＮＡの量が少なくなるので、下流処理で余分なものを除去するために必要なベンゾナーゼが少なくなる）および検査コストの削減（レンチウイルス産物中の残留プラスミドを検査する必要がなくなる）により生産コストが削減される。

さらに、レトロウイルス産生（移入ベクターを用いるまたは用いない(with our without)）に必須のレトロウイルス遺伝子は、そのベクターが哺乳動物宿主細胞に導入された際に核酸ベクターに組み込まれたレトロウイルス遺伝子の総てが内在哺乳動物宿主細胞ゲノム内の１つの遺伝子座で統合するように、核酸ベクター内に存在する。これにより、レトロウイルス遺伝子が宿主細胞ゲノム内に無作為に異なる遺伝子座で統合される場合に起こり得る遺伝子サイレンシングなどの問題が克服できる。

よって、本発明の核酸ベクターの使用は、レトロウイルスパッケージングおよび産生細胞株の作製に利点をもたらす。

よって、本発明の第１の面によれば、
ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質；
ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体；ならびに
レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノム
をコードする核酸配列を含んでなるレトロウイルス産生細胞であって、
前記核酸配列が総て前記レトロウイルス産生細胞ゲノム内の単一の遺伝子座に位置するレトロウイルス産生細胞が提供される。

本発明のさらなる面によれば、
非哺乳動物複製起点と少なくとも２５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡを保持する能力を含んでなる核酸ベクターであって、
ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質、ならびに
ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体
をコードするレトロウイルス核酸配列を含んでなり、
前記レトロウイルス核酸配列のそれぞれが核酸ベクター内に個々の発現構築物として配置されている
ことを特徴とする核酸ベクターが提供される。

本発明のさらなる面によれば、安定なレトロウイルスパッケージング細胞株の製造方法であって、
（ａ）本明細書で定義される核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物に導入すること；および
（ｂ）前記培養物内で、前記ベクターにコードされている核酸配列が哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれた哺乳動物宿主細胞を選択すること
を含んでなる方法が提供される。

本発明のさらなる面によれば、本明細書に定義される方法により得られたレトロウイルスパッケージング細胞が提供される。

本発明のさらなる面によれば、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子の製造方法であって、
（ａ）本明細書に定義される核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物に導入すること；
（ｂ）前記培養物内で、前記ベクターにコードされている核酸配列が哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれた哺乳動物宿主細胞を選択すること；および
（ｃ）前記哺乳動物宿主細胞を複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が産生される条件下でさらに培養すること
を含んでなる方法が提供される。

本発明のさらなる面によれば、本明細書に定義される方法により得られた複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が提供される。

図１：ＢＡＣｐａｃｋ−ＷＴＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５およびＢＡＣｐａｃｋ−ＳＹＮＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５の構築の段階的ガイド。 図２：安定なポリクローナルプールの選択。ＨＥＫ２９３Ｔ接着細胞を、リン酸カルシウムを用いてＢＡＣｐａｃｋＷＴＧａｇＰｏｌ−トランスファーでトランスフェクトした。安定なプールが２週間のゼオシン選択後に作出された。安定なトランスフェクタントにウイルス生成能があるかどうか調べるために、安定なポリプールにドキシサイクリンで４８時間誘導を行った。誘導４８時間後にウイルス上清を採取し、０．２２μｍフィルターで濾過し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入することにより力価を測定した。ＧＦＰ陽性形質導入細胞を用いて形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍＬ）を計算した． 図３：安定なトランスフェクション懸濁クローンの作製。ＨＥＫ２９３ ６Ｅ細胞を、２９３フェクチン試薬を用いて、ＢＡＣｐａｃｋＷＴＧａｇＰｏｌ−トランスファーでトランスフェクトした。安定なプールが２週間のゼオシン選択後に作出された。これらの安定なプールを９６ウェルプレートでの限界希釈によりクローニングして単細胞クローンを得、これを次に拡大培養した。接着培地（ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ）とその後の懸濁適応（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地）で得られた最良のクローン１、１４、１５および１６の蛍光顕微鏡により検出されたＧＦＰ。 図４：懸濁クローンにおけるレンチウイルスの誘導。安定なＨＥＫ６Ｅトランスフェクタントにウイルス生成能があるかどうか調べるために、２０ｍｌの安定な懸濁クローンにドキシサイクリン（２μｇ／ｍｌ）で４８時間誘導を行った。誘導４８時間後にウイルス上清を採取し、０．４５μｍフィルターで濾過し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入することにより力価を測定した。ＧＦＰ陽性形質導入細胞を用いて形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍＬ）を算出した。 図５：実施例４に従って作製されたクローンのベクター力価。結果は、５代〜２１代の間に中等度の増殖を示したクローン１および１６のベクター力価を示す。

発明の具体的説明

定義
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で参照される総ての特許および刊行物は、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。

用語「を含んでなる」は、「含む」または「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含んでなる」組成物は、排他的にＸからなる場合、またはなにかをさらに含む場合、例えば、Ｘ＋Ｙの場合がある。

用語「から本質的になる」は、特徴の範囲を明示された材料または工程および特許請求される特徴の基本的な特性に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。

用語「からなる」は、いずれの付加的成分の存在も排除する。

数値ｘに関して用語「約」は、例えば、ｘ±１０％、５％、２％または１％を意味する。

用語「ベクター」または「核酸ベクター」は、外来の（すなわち、外因性の）遺伝物質を別の細胞に人為的に運び、そこでそれが複製および／または発現され得るビヒクルを意味する。ベクターの例としては、非哺乳動物核酸ベクター、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、コスミドまたはフォスミドが挙げられる。

ベクターの他の例としては、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターが挙げられ、これらは本出願で特に注目される。レンチウイルスベクター、例えば、１型ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）に基づくものは、非増殖細胞に組み込むことができるので、広く使用されている。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを別個の部分に分割することにより、例えば、別個のプラスミドに配置することにより、複製欠陥とすることができる。例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓにより開発された、いわゆる第一世代のレンチウイルスベクターは、パッケージング発現カセット、エンベロープ発現カセットおよびベクター発現カセットからなる３つのプラスミド発現系として構築された。「パッケージングプラスミド」は、全ｇａｇ−ｐｏｌ配列、調節配列（ｔａｔおよびｒｅｖ）および補助配列（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ）を含む。「エンベローププラスミド」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下に、天然ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の代わりに水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（Vesicular stomatitis virus glycoprotein）（ＶＳＶｇ）を保持する。第三のプラスミド（「移入プラスミド」）は、宿主細胞内で導入遺伝子を発現させるため、長い末端反復配列(Long Terminal Repeats)（ＬＴＲ）、カプセル封入配列（ψ）、Ｒｅｖ応答エレメント(Rev Response Element)（ＲＲＥ）配列およびＣＭＶプロモーターを運ぶ。

第二のレンチウイルスベクター世代は、毒性配列ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕおよびｎｅｆの欠失を特徴とする。パッケージングベクターはｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔおよびｒｅｖ遺伝子に減らされ、従って、系の安全性が高まった。

レンチウイルス系を改良するために、パッケージング構築物からｔａｔ遺伝子を除去し、ベクターカセットからＬＴＲを不活化し、従って、挿入突然変異誘発効果に関する問題を軽減することによって、第三世代のベクターが設計された。

種々のレンチウイルス世代が以下の参照文献に記載されている：第一世代：Naldini et al. (1996) Science 272(5259): 263-7；第二世代：Zufferey et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15(9): 871-5；第三世代：Dull et al. (1998) J. Virol. 72(11): 8463-7、これらは総て、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。レンチウイルスベクターの開発についての総説は、Sakuma et al. (2012) Biochem. J. 443(3): 603-18およびPicanco-Castro et al. (2008) Exp. Opin. Therap. Patents 18(5):525-539に見出すことができる。

用語「非哺乳動物複製起点」は、そこで複製が開始され、かつ、非哺乳動物起源に由来する核酸配列を意味する。これは本発明の核酸ベクターが安定に複製すること、および宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である場合を除いてそれが宿主細胞後代に伝達されるように好適な宿主細胞（例えば、細菌または酵母細胞などの微生物細胞）内で内在性染色体とともに分離することを可能とする。哺乳動物宿主細胞において、非哺乳動物複製起点を有する核酸ベクターは、哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれるか、または哺乳動物宿主細胞複製時に失われる。例えば、細菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes)（ＢＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体(P1-derived artificial chromosome)（ＰＡＣ）、コスミドまたはフォスミドなどの、非哺乳動物複製起点を有する核酸ベクターは、細菌細胞（例えば、大腸菌）内で安定に複製し、内在性染色体とともに分離することがきるが、それらがもし哺乳動物宿主細胞に導入されれば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミドまたはフォスミドは哺乳動物宿主細胞複製時に組み込まれるか、または失われる。酵母人工染色体(Yeast artificial chromosomes)（ＹＡＣ）は、酵母細胞内で安定に複製し、内在性染色体とともに分離することがきるが、それらがもし哺乳動物宿主細胞に導入されれば、ＹＡＣは哺乳動物宿主細胞複製時に組み込まれるか、または失われる。従って、これに関して、本発明の核酸ベクターは、レトロウイルス産生用の安定な細胞株を作製するために哺乳動物細胞に容易に移入できるＤＮＡのリザーバーとして（すなわち、レトロウイルス産生に必須の遺伝子のために）働く。非哺乳動物複製起点の例としては、細菌複製起点、例えば、ｏｒｉＣ、ｏｒｉＶもしくはｏｒｉＳ、または自律複製配列（ＡＲＳエレメント）としても知られる酵母複製起点が挙げられる。

本発明の核酸ベクターは非哺乳動物複製起点を含んでなり、かつ、少なくとも２５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡを保持可能である。一つの実施態様では、核酸ベクターは、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０または３５０ｋｂのＤＮＡを保持する能力を有する。「保持する能力」という場合にはその通常の意味を有し、核酸ベクターの挿入サイズの上限が特許請求されるサイズ以上（すなわち、２５ｋｂ以上のＤＮＡ）であることを含意すると理解される。

本発明の目的は、単一の構築物（すなわち、核酸ベクター）にレトロウイルスパッケージングに必須の遺伝子を含めることである。よって、本発明の核酸ベクターは、大きなＤＮＡインサートを保持することができなければならない。疑念を避けるため、「核酸ベクター」または「人工染色体」という場合には、天然細菌プラスミド（例えば、一時的トランスフェクション法で現行使用されているプラスミド）は少なくとも２５ｋｂのＤＮＡを保持することができないので、これらを意味しないものと理解される。プラスミドが含み得る最大サイズのインサートは約１５ｋｂである。このような核酸ベクターはまた、一般に５〜１１ｋｂの最大インサートを保持するにすぎないバクテリオファージも意味しない。よって、一つの実施態様では、本発明の核酸ベクターは、プラスミド、バクテリオファージまたはエピソームではない。

用語「内在性染色体」は、細菌人工染色体などの外因性核酸ベクターの作製または導入の前に宿主細胞に見られるゲノム染色体を意味する。

用語「トランスフェクション」、「形質転換」および「形質導入」は、本明細書で使用する場合、標的細胞への非哺乳類またはウイルスベクターの挿入を表して使用され得る。ベクターの挿入は通常、細菌細胞については形質転換および真核細胞についてはトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入はまた形質導入とも呼ばれ得る。当業者ならば、限定されるものではないが、物理的方法（例えば、エレクトロポレーション、細胞スクイージング、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション(impalefection)、マグネトフェクション(magnetofection)、遺伝子銃または粒子衝撃）、化学試薬（例えば、リン酸カルシウム、高分岐有機化合物または陽イオンポリマー）または陽イオン脂質（例えば、リポフェクション）の使用を含む、慣用される非ウイルストランスフェクション法に気づくであろう。多くのトランスフェクション法は、プラスミドＤＮＡの溶液と細胞との接触を必要とし、次にこれらを増殖させ、マーカー遺伝子発現に関して選択する。

用語「プロモーター」は、遺伝子発現を駆動する配列を意味する。高レベルの発現を駆動するためには、非レトロウイルス高効率プロモーターなどの高効率プロモーターを使用することが有益であり得る。好適なプロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス(cytomegalovirus)（ＣＭＶ）前初期プロモーター、脾フォーカス形成ウイルス(spleen focus-forming virus)（ＳＦＦＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)（ＲＳＶ）プロモーター、またはヒト延長因子１α（ｐＥＦ）プロモーターなどのプロモーターが挙げられる。

Ｔｅｔオペロン（テトラサイクリン制御性転写活性化(Tetracycline-Controlled Transcriptional Activation)）は誘導性遺伝子発現の方法で使用可能であり、ここで、転写は、抗生物質テトラサイクリンまたはその誘導体の１つ（例えば、ドキシサイクリン）の存在下で可逆的にオンまたはオフされる。本来、Ｐｔｅｔプロモーターは、リプレッサーＴｅｔＲとテトラサイクリン抗生物質を細胞外へくみ出すタンパク質ＴｅｔＡを発現する。本発明では、Ｔｅｔオペロンは存在してもしなくてもよく、例えば、一つの実施態様では、Ｔｅｔオペロンはプロモーター内に存在してよい。

用語「選択マーカー」は、挿入された遺伝子（例えば、導入遺伝子）を活発に発現する細胞を選択する助けをする遺伝子を意味する。好適な選択マーカーの例としては、抗生物質（すなわち、抗生物質耐性遺伝子）、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、またはゼオシン耐性をコードする酵素が挙げられる。好適な選択マーカーの別の例としては、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein)（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質(red fluorescent protein)（ＲＦＰ）または青色蛍光タンパク質(blue fluorescent protein)（ＢＦＰ）が挙げられる。

用語「ポリＡシグナル」は、例えば、導入遺伝子の３’側に配置された、宿主因子が転写の際に新生ｍＲＮＡの末端にポリアデノシン（ポリＡ）テールを付加することを可能とするポリアデニル化シグナル配列を意味する。このポリＡテールは、ｍＲＮＡを酵素分解から保護し、また翻訳を補助する、３００までのアデノシンリボヌクレオチドのストレッチである。従って、本発明の核酸ベクターは、ヒトβグロビンまたはウサギβグロビンポリＡシグナル、シミアンウイルス４０(simian virus 40)（ＳＶ４０）前期または後期ポリＡシグナル、ヒトインスリンポリＡシグナル、またはウシ成長ホルモンポリＡシグナルなどのポリＡシグナル配列を含み得る。一つの実施態様では、ポリＡシグナル配列は、ヒトβグロビンポリＡシグナルである。

用語「イントロン配列」は、ＲＮＡスプライシングにより最終遺伝子産物から除去されるヌクレオチド配列を意味する。エンハンサー／プロモーター領域の下流およびｃＤＮＡインサートの上流でのイントロンの使用は、遺伝子発現のレベルを増強することが示されている。発現の増強は特定のｃＤＮＡインサートに依存する。よって、本発明の核酸ベクターは、ヒトβグロビンイントロン、ウサギβグロビンイントロンＩＩまたはキメラヒトβグロビン−免疫グロブリンイントロンなどのイントロンを含み得る。一つの実施態様では、イントロンは、ヒトβグロビンイントロンおよび／またはウサギβグロビンイントロンＩＩである。

用語「パッケージング細胞株」は、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質およびエンベロープ 糖タンパク質遺伝子が安定に挿入された細胞株を意味する。あるいは、用語「産生細胞株」は、対象とする導入遺伝子を含有する移入ベクターが安定に挿入されたパッケージング細胞株を意味する。本明細書に記載の核酸ベクターは、パッケージング細胞株（すなわち、少なくともｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子が核酸ベクターに存在し、宿主細胞に組み込まれる場合）または産生細胞株（すなわち、核酸ベクターが、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子とともに宿主細胞に組み込まれる移入ベクター成分を付加的に含んでなる場合）を作製するために使用可能であることが当業者には理解されるであろう。

用語「安定にトランスフェクトされる」は、導入されたレトロウイルス遺伝子を後代（すなわち、娘細胞）に受け渡すことができる細胞株を意味し、これはトランスフェクトされたＤＮＡが内在性染色体に組み込まれていたためか、また外因性染色体の安定な継承を介したものである。

核酸ベクター
本発明の１つの面によれば、非哺乳動物複製起点と少なくとも２５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡとを保持する能力を含んでなる核酸ベクターであって、
ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質；ならびに
ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体
をコードするレトロウイルス核酸配列を含んでなることを特徴とする核酸ベクターが提供される。

特に、前記レトロウイルス核酸配列のそれぞれは、核酸ベクター内に個々の発現構築物として配置され得る。

レトロウイルスベクターを作製するための現行の方法は、宿主細胞へのレトロウイルス遺伝子の一時的トランスフェクションを含む。しかしながら、コストと労力がかかり、スケールアップが難しいことから、この方法には多くの欠点が付随してきた。１つの解決策は、一時的トランスフェクションに付随する問題を回避するためおよび変動のあるレトロウイルスベクター生産を減らすためにレトロウイルスパッケージング遺伝子を安定に組み込むパッケージング細胞株を操作により作出することであろう。

本発明者らは、本明細書に記載の核酸ベクターが、レトロウイルスベクター産生法に付随するこれまでの欠点を改善するレトロウイルスパッケージング細胞株を作製するために使用可能であることを見出した。例えば、レトロウイルスパッケージング細胞株を製造する既知の方法は、各レトロウイルス遺伝子が導入された後に複数回の選択を含む。この過程には最大６か月かかり、極めて労働集約的である。核酸ベクターに総てのレトロウイルス遺伝子を含めることにより、これらのレトロウイルス遺伝子は次に単一の工程で哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に挿入することができる。従って、核酸ベクターの使用は、本明細書で提案されるように、選択圧を小さくし、サイレンシング時間枠を短縮し、かつ、潜在的パッケージング細胞のより迅速なスクリーニングを可能とする。さらに、核酸ベクターに含まれるレトロウイルス遺伝子は、総てが哺乳動物宿主細胞の内在性染色体の単一の遺伝子座に組み込まれると考えられ、これにより個々のレトロウイルス遺伝子がサイレントとなるリスクが減り、総てのレトロウイルス遺伝子が一様に発現されることが保証される。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムをコードする核酸配列を付加的に含んでなる。レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムは通常、一時的トランスフェクション法に使用される「移入ベクター」に含まれることが理解されるであろう。移入ベクタープラスミドは一般に、プロモーター（例えば、ＣＭＶ）、３’ＬＴＲ（自己不活性化（すなわち、ＳＩＮ）３’−ＬＴＲであってもなくてもよい）、５’ＬＴＲ（Ｕ５領域を含んでも含まなくてもよい）、キャプシド形成配列（ψ）および可能性としてはプロモーターに連結された導入遺伝子を含有する。

一つの実施態様では、複数コピーの、レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノム（すなわち、移入ベクター）が核酸ベクターに含まれる。複数コピーの移入ベクターは、より高いウイルスベクター力価をもたらすと予想される。例えば、核酸ベクターは、２以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０以上のコピーの、レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノム（すなわち、移入ベクター）を含み得る。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、１または複数の組換え部位を含む。これは、標的配列がリコンビナーゼ酵素の存在下で部位特異的に哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれることを可能とする。リコンビナーゼ酵素は、２つの組換え部位の間の組換え反応を触媒する。

多くのタイプの部位特異的組換え系が当技術分野で公知であり、いずれの好適な組換え系を本発明で使用してもよい。例えば、一つの実施態様では、組換え部位は、λファージのｉｎｔ／ａｔｔ系、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘリコンビナーゼ系、Ｃｉｎリコンビナーゼ系、大腸菌のＰｉｎリコンビナーゼ系およびｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系、またはそれらの任意の組合せから選択されるか、またはそれらに由来する。さらなる実施態様では、組換え部位は、ａｔｔ部位（例えば、λファージ由来）であり、このａｔｔ部位は、λインテグラーゼの存在下で部位指定組込みを可能とする。「λインテグラーゼ」という場合には、ｉｎｔ／ａｔｔ系となお適合する突然変異インテグラーゼ、例えば、ＷＯ２００２／０９７０５９に記載の修飾λインテグラーゼについての言及を含むことが理解されるであろう。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、フォスミドまたはコスミドから選択される。さらなる実施態様では、核酸ベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。

細菌人工染色体
用語「細菌人工染色体」または「ＢＡＣ」は、大きな外因性ＤＮＡインサートを保持することができる細菌プラスミド由来のＤＮＡ構築物を意味する。それらは通常およそ３５０ｋｂの最大ＤＮＡインサートを保持することができる。ＢＡＣは、細菌の細胞分裂後にプラスミドの一様な分布を促進する分配遺伝子を含む、十分に特徴付けられた細菌機能的稔性プラスミド（Ｆプラスミド）から開発された。これはＢＡＣが安定に複製し、内在細菌ゲノム（例えば、大腸菌）とともに分離することを可能とする。ＢＡＣは通常、少なくとも１コピーの複製起点（例えば、ｏｒｉＳまたはｏｒｉＶ遺伝子）、ｒｅｐＥ遺伝子（プラスミド複製およびコピー数の調節のため）および細菌細胞内でのＢＡＣの安定な維持を確保する分配遺伝子（例えば、ｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、ｐａｒＡ、ｐａｒＢおよび／またはｐａｒＣ）を含む。ＢＡＣは通常、環状およびスーパーコイル型であり、これはそれらをＹＡＣなどの直鎖人工染色体よりも回収容易とする。それらはまた、エレクトロポレーションなどの簡単な方法を用い、比較的容易に細菌宿主細胞に導入することもできる。

一つの実施態様では、細菌人工染色体は、ｏｒｉＳ遺伝子を含んでなる。一つの実施態様では、細菌人工染色体は、ｒｅｐＥ遺伝子を含んでなる。一つの実施態様では、細菌人工染色体は、分配遺伝子を含んでなる。さらなる実施態様では、分配遺伝子は、ｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、ｐａｒＡ、ｐａｒＢおよび／またはｐａｒＣから選択される。なおさらなる実施態様では、細菌人工染色体は、ｓｏｐＡおよびｓｏｐＢ遺伝子を含んでなる。

本発明で使用するためのＢＡＣは、例えば、ＬＵＣＩＧＥＮ（商標）（全長骨格配列については、ゲノム受託番号ＥＵ１０１０２２．１を参照）からのｐＳＭＡＲＴ ＢＡＣなど、商業ソースから入手可能である。このＢＡＣはＬ−アラビノース「コピーアップ」系を含み、これはまた、ＴｒｆＡ複製タンパク質の存在下でのみ活性なｏｒｉＶミディアムコピー複製起点も含む。ＴｒｆＡの遺伝子は、細菌宿主細胞のゲノムのＬ−アラビノース誘導プロモーターａｒａＣ−Ｐ _ＢＡＤ の制御下に組み込むことできる（Wild et al. (2002) Genome Res. 12(9): 1434-1444参照）。Ｌ−アラビノースの添加はＴｒｆＡの発現を誘導し、ＴｒｆＡはｏｒｉＶを活性化し、細胞当たり５０コピーまでプラスミドを複製させる。

酵母人工染色体
用語「酵母人工染色体」または「ＹＡＣ」は、酵母ＤＮＡが細菌プラスミドに組み込まれている染色体を意味する。それらは自律的複製配列(autonomous replication sequence)（ＡＲＳ）（すなわち、複製起点）、セントロメアおよびテロメアを含む。ＢＡＣとは異なり、ＹＡＣは直鎖であり、従って、宿主細胞後代に受け渡される際に、染色体の各末端に、その末端を分解から保護する酵母テロメアを含む。ＹＡＣは、１００〜２０００ｋｂであれば、一定範囲のＤＮＡ挿入サイズを保持できる。

Ｐ１由来人工染色体
用語「Ｐ１由来人工染色体」または「ＰＡＣ」は、Ｐ１バクテリオファージおよび細菌ＦプラスミドのＤＮＡに由来するＤＮＡ構築物を意味する。それらは通常、およそ１００〜３００ｋｂ最大ＤＮＡインサートを保持でき、大腸菌においてクローニングベクターとして使用される。ＰＡＣは、精製および細菌宿主細胞への導入が容易など、ＢＡＣと同様の利点を持つ。

コスミドおよびフォスミド
用語「コスミド」は、バクテリオファージλに由来するｃｏｓ部位を付加的に含む細菌プラスミドに由来するＤＮＡ構築物を意味する。コスミドは一般に、細菌複製起点（例えば、ｏｒｉＶ）、選択マーカー、クローニング部位および少なくとも１つのｃｏｓ部位を含む。コスミドは通常、４０〜４５ｋｂの最大ＤＮＡインサートを受容する。コスミドは、大腸菌細胞感染において標準的な細菌プラスミドよりも効率的であることが示されている。用語「フォスミド」は、細菌Ｆプラスミドに基づくこと以外はコスミドと同様の非哺乳動物核酸ベクターを意味する。特に、それらは、大きなＤＮＡ断片のクローニングを可能とするＦプラスミド複製起点および分配機構を使用する。フォスミドは通常、４０ｋｂの最大ＤＮＡインサートを受容する。

レトロウイルス
レトロウイルスは、擬似二倍体一本鎖ＲＮＡゲノムを含むウイルス科である。それらは、ＲＮＡゲノムからＤＮＡを産生する逆転写酵素をコードし、このＤＮＡはその後、宿主細胞のＤＮＡに挿入され得る。本明細書に記載の本発明は、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を産生するために使用され得る。本発明のレトロウイルスベクター粒子は、任意の好適なレトロウイルスから選択されるか、またはそれに由来するものであり得る。

一つの実施態様では、レトロウイルスベクター粒子は、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルスまたは泡沫レトロウイルス、例えば、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルス、特に、レンチウイルスに由来するか、またはから選択される。さらなる実施態様では、レトロウイルスベクター粒子は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶおよびＶｉｓｎａからなる群から選択されるレンチウイルスである。レンチウイルスは非分裂（すなわち、静止）細胞に感染することができ、これにより、レンチウイルスは遺伝子療法にとって魅力的なレトロウイルスベクターとなる。なおさらなる実施態様では、レトロウイルスベクター粒子はＨＩＶ−１であるか、またはＨＩＶ−１に由来する。いくつかのレトロウイルスのゲノム構造を当技術分野において見出すことができる。例えば、ＨＩＶ−１の詳細はＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（ゲノム受託番号ＡＦ０３３８１９）から見出すことができる。ＨＩＶ−１は、最も理解されているレトロウイルスの１つであり、従って、レトロウイルスベクターとしてしばしば使用されている。

レトロウイルス遺伝子
総てのレトロウイルスに共通の核酸配列は、次のようにより詳しく説明することができる：
長い末端反復配列（ＬＴＲ）：レトロウイルスゲノムの基本構造は、レトロウイルス産生に必要とされる遺伝子の間またはそれらが位置する範囲内に５’−ＬＴＲおよび３’−ＬＴＲを含んでなる。ＬＴＲはレトロウイルスの組込みおよび転写に必要とされる。それらはまた、レトロウイルス遺伝子の発現を制御するためのプロモーター配列として働くこともできる（すなわち、それらがシス作用遺伝子である）。ＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、Ｕ５と呼ばれる３つの部分領域から構成され、Ｕ３はＲＮＡの３’末端にユニークな配列に由来し；ＲはＲＮＡの量末端で反復する配列に由来し；Ｕ５はＲＮＡの５’末端にユニークな配列に由来する。よって、一つの実施態様では、核酸ベクターは、５’−および３’−ＬＴＲ を付加的に含んでなる。さらなる実施態様では、５’ＬＴＲのＵ５領域を欠失させ、非ＨＩＶ−１ポリＡテールに置換することができる（Hanawa et al. (2002) Mol. Ther. 5(3): 242-51参照）。

複製可能ウイルスの生成に関する安全性の問題に取り組むために、３’ＬＴＲのＵ３領域中の、ＴＡＴＡボックスならびに転写因子Ｓｐ１およびＮＦ−κＢの合部位を含む切片を欠失させることによって自己不活性化(self-inactivating)（ＳＩＮ）ベクターが開発された（Miyoshi et al. (1998) J. Virol. 72(10):8150-7参照）。この欠失は、感染細胞における逆転写および組込みの後に５’ＬＴＲに移入され、これにより、ＬＴＲの転写の不活性化が起こる。これは自己不活性化レンチウイルスに基づくベクター系として知られ、本発明に含まれ得る。

ψ：レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、レトロウイルスゲノムの５’末端に位置するψ（プシー）配列の力で起こる。また、プシー配列の下流にあってｇａｇコード領域へと延伸する配列が効率的なレトロウイルスベクター産生に関与することも当技術分野でよく知られている（Cui et al. (1999) J. Virol. 73(7): 6171-6176参照）。一つの実施態様では、核酸ベクターは、ψ（プシー）配列を付加的に含んでなる。

プライマー結合部位(Primer Binding Site)（ＰＢＳ）：レトロウイルスゲノムは、５’−ＬＴＲのＵ５領域の後に存在するＰＢＳを含む。この部位は、逆転写の開始に必要とされるｔＲＮＡプライマーと結合する。一つの実施態様では、核酸ベクターは、ＰＢＳ配列を付加的に含んでなる。

ＰＰＴ：レトロウイルスゲノムは、レトロウイルスゲノムの３’末端付近に、ポリプリントラクト(polypurine tracts)（ＰＰＴ）と呼ばれるプリンの短いストレッチを含む。これらのＰＰＴは、逆転写中にプラス鎖ＤＮＡ合成のＲＮＡプライマーとして機能する。複雑なレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）は、より中央に位置する第２のＰＰＴ（すなわち、セントラルポリプリントラクト(central polypurine tract)（ｃＰＰＴ））を含み、これはＤＮＡ合成の開始の第２の部位を提供する。ｃＰＰＴをコードするレトロウイルスベクターは、形質導入およびトランス遺伝子発現が増強されることが示されている（Barry et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12(9):1103-8参照）。一つの実施態様では、核酸ベクターは、３’−ＰＰＴ配列および／またはｃＰＰＴ配列を付加的に含んでなる。

上記の非コード領域のゲノム構造は当業者の周知である。例えば、ＨＩＶ−１の非コード領域のゲノム構造に関する詳細は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋからゲノム受託番号ＡＦ０３３８１９として、またはＨＩＶ−１ ＨＸＢ２（慣用ＨＩＶ−１参照株）ではゲノム受託番号Ｋ０３４５５として見出すことができる。一つの実施態様では、非コード領域は、ゲノム受託番号Ｋ０３４５５の、例えば、塩基対４５４〜１１２６（Ｒ−Ｕ５−ＰＢＳ−Ｇａｇの場合）、７６２２〜８４７９（ＲＲＥの場合）または７７６９〜８１４６（ＲＲＥの場合）、４７８１〜４８９８（ｃＰＰＴの場合）、９０１５〜９１２０および９５２１〜９７１９（ｄＮＥＦ−ＰＰＴ−ｓｉｎＵ３−Ｒ−Ｕ５の場合）から取得可能な配列に由来する。

Ｇａｇ／ｐｏｌ：ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子の発現は、ｇａｇとｇａｇｐｏｌの間の翻訳フレームシフトに依存する。両方とも成熟の際に切断されるポリタンパク質である。レトロウイルスベクターの主要な構造マトリックス、キャプシド、およびヌクレオキャプシドタンパク質はｇａｇによりコードされている。ｐｏｌ遺伝子は、レトロウイルス酵素：ｉ）レトロウイルスＲＮＡゲノムの二本鎖ＤＮＡへの逆転写に不可欠な逆転写酵素、ｉｉ）レトロウイルスＤＮＡゲノムの宿主細胞染色体への組込みを可能とするインテグラーゼ、およびｉｉｉ）レトロウイルスの成熟した機能的タンパク質を産生するために合成されたポリタンパク質を切断するプロテアーゼをコードしている。一つの実施態様では、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするレトロウイルス核酸配列はＨＩＶ−１ ＨＸＢ２配列に由来し、この配列は、ゲノム受託番号Ｋ０３４５５の、例えば、塩基対７９０〜５１０５から取得可能である。

Ｅｎｖ：ｅｎｖ（「エンベロープ」）遺伝子は、レトロウイルスエンベロープの表面および膜貫通成分（例えば、ＨＩＶ−１の糖タンパク質ｇｐ１２０およびｇｐ４１）をコードし、レトロウイルス−細胞膜融合に関与する。レトロウイルスベクターの組織向性を拡大するために、本明細書に記載のレトロウイルスベクターは、別のウイルス由来のエンベロープタンパク質を用いてシュードタイピング(pseudotyped)してもよい。シュードタイピング(Pseudotyping)は、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターの宿主細胞範囲が拡大され得る、またはレトロウイルスベクター粒子上の糖タンパク質(glycoproteins)（ＧＰ）を変化させることにより変更され得る（例えば、他のエンベロープウイルスから得られるもしくは他のエンベロープウイルスに由来するＧＰを使用するか、または合成／人工ＧＰを使用することによる）プロセスを意味する。レトロウイルスベクターのシュードタイピングに最も慣用される糖タンパク質は、広い向性と高いベクター粒子安定性に起因して水疱性口内炎ウイルスＧＰ(Vesicular stomatitis virus GP)（ＶＳＶ）である。しかしながら、他の糖タンパク質もシュードタイピングに使用可能であることが当業者には理解されるであろう（引用することによりその全内容が本明細書の一部とされるCronin et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5(4):387-398参照）。シュードタイピングに使用されるウイルスの選択はまた、いくつかのシュードタイプは組織種選好性を持つことが示されていることから、標的とされる細胞および／または器官の種類によっても異なり得る。

一つの実施態様では、ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体は、ベジクロウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス）、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス、モコラウイルス）、アレナウイルス（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(Lymphocytic choriomeningitis virus)（ＬＣＭＶ））、アルファウイルス（例えば、ロスリバーウイルス(Ross River virus)（ＲＲＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス(Semliki Forest virus)（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）、フィロウイルス（例えば、レストンエボラウイルス、ザイールエボラウイルス、ラッサ熱ウイルス）、アルファレトロウイルス（例えば、トリ白血病ウイルス(Avian leukosis virus)（ＡＬＶ））、ベータレトロウイルス（例えば、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス(Jaagsiekte sheep retrovirus)（ＪＳＲＶ））、ガンマレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス(Moloney Murine leukaemia virus)（ＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス(Gibbon ape leukaemia virus)（ＧＡＬＶ）、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４））、デルタレトロウイルス（例えば、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１(Human T-lymphotrophic virus 1)（ＨＴＬＶ−１））、スプマウイルス（例えば、ヒト泡沫状ウイルス）、レンチウイルス（例えば、マエディ・ビスナウイルス(Maedi-visna virus)（ＭＶＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、レスピロウイルス（例えば、センダイウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス(Respiratory syncytia virus)（ＲＳＶ））、ヘパチウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス(Hepatitis C virus)（ＨＣＶ））、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザウイルスＡ）および核多角体ウイルス（例えば、オートグラファ・カルフォルニカ多角体病ウイルス(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)（ＡｃＭＮＰＶ））から選択されるウイルスから得られるか、また
はそれらのウイルスに由来する。さらなる実施態様では、ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体は、水疱性口内炎ウイルスから得られるか、またはそのウイルスに由来する。この実施態様では、レトロウイルス粒子がより広い宿主細胞範囲に感染し、野生型エンベロープタンパク質を産生するために組換えの機会を少なくすることを可能とする水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶｇ）タンパク質が使用可能である。さらなる実施態様では、ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体をコードするレトロウイルス核酸配列は、ゲノム受託番号Ｊ０２４２８．１の、例えば、塩基対３０７１〜４７２０から取得可能な配列に由来する。

本明細書に記載の構造遺伝子は、総てのレトロウイルスに共通する。さらなる補助遺伝子は、種々のタイプのレトロウイルスで見出すことができる。例えば、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１は、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ、ｎｅｆおよびｔａｔとして知られるさらに６つの補助遺伝子を含む。他のレトロウイルスは、本明細書に記載の遺伝子に類似する補助遺伝子を持ち得るが、それらは文献に常に同じ名称で示されているわけではない。Tomonaga and Mikami (1996) J. Gen. Virol. 77(Pt 8):1611-1621などの参照文献に種々のレトロウイルス補助遺伝子が記載されている。

Ｒｅｖ：補助遺伝子ｒｅｖ（「ビリオンのレギュレーター(regulator of virion)」は、Ｒｅｖ応答エレメント(Rev Response element)（ＲＲＥ）に結合し、レトロウイルス転写産物の輸出を促進する補助タンパク質をコードする。この遺伝子のタンパク質産物は、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含むレトロウイルスｍＲＮＡの断片が核から細胞質へ輸出されることを可能とする。ＲＲＥ配列は、複雑な折りたたみ構造を形成すると予想される。ｒｅｖのこの特定の役割は、スプライシングステップと核輸出ステップの強固な共役を反映する。一つの実施態様では、核酸ベクターは、ＲＲＥ配列を含んでなる。さらなる実施態様では、ＲＲＥ配列は、ＨＩＶ−１ ＨＸＢ２配列に由来し、この配列はゲノム受託番号Ｋ０３４５５の、例えば、塩基対７６２２〜８４７９、または７７６９〜８１４６、特に、塩基対７６２２〜８４７９から取得可能である。

ＲｅｖはＲＲＥと結合し、シングルスプライシング（ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕ）または非スプライシング（ｇａｇ、ｐｏｌおよびゲノムＲＮＡ）ウイルス転写産物の輸出を促進して、遺伝子翻訳およびパッケージングのような下流事象をもたらす（Suhasini and Reddy (2009) Curr. HIV Res. 7(1): 91-100参照）。一つの実施態様では、核酸ベクターは、補助遺伝子ｒｅｖまたはその類似遺伝子（すなわち、他のレトロウイルスもしくは機能的に類似の系由来）を付加的に含んでなる。ｒｅｖ遺伝子の包含は、特にＲＲＥエレメントもまた輸送される転写産物に含まれる場合に、核から細胞質へのレトロウイルスベクターゲノムのＲＮＡ転写産物の効率的輸出を保証する。さらなる実施態様では、ｒｅｖ遺伝子は、ゲノム受託番号Ｍ１１８４０の塩基対９７０〜１３２０（すなわち、ＨＩＶ−１クローン１２ｃＤＮＡ、ＨＩＶＰＣＶ１２遺伝子座）と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％の配列同一性を含んでなる。もう一つの実施態様では、ｒｅｖ遺伝子は、ゲノム受託番号Ｋ０３４５５．１（すなわち、１型ヒト免疫不全ウイルス、ＨＸＢ２）の塩基対５９７０〜６０４０および８３７９〜８６５３と少なくとも６０％の配列同一性、例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％または１００％の配列同一性を含んでなる。

補助遺伝子はレトロウイルス複製および病因に役割を果たすと思われ、従って、多くの現行のウイルスベクター産生系は、これらの遺伝子のいくつかを含まない。例外は通常存在するｒｅｖであり、またはｒｅｖ／ＲＲＥ系に類似の系は潜在的に使用される。よって、一つの実施態様では、補助遺伝子ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｔａｔおよびｎｅｆ、または類似の補助遺伝子のうち１以上をコードする核酸配列は、前記補助遺伝子がレトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムから除かれるか、または機能的補助タンパク質をコードできないように破壊される。さらなる実施態様では、補助遺伝子ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｔａｔおよびｎｅｆ、または類似の補助遺伝子のうち少なくとも２以上、３以上、４以上、または総てが、記補助遺伝子がレトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムから除かれるか、または機能的補助タンパク質をコードできないように破壊される。機能的補助遺伝子の除去は遺伝子全体の除去を必要とせず、その遺伝子の一部の除去またはその遺伝子の破壊で十分である。

複製欠陥レトロウイルスベクター粒子をコードする核酸配列は、レトロウイルスベクター粒子が基づくレトロウイルスの野生型遺伝子と同じ、またはそれに由来するものであり得、すなわち、それらの配列は、野生型ウイルスに含まれる配列の遺伝的にまたはそれ以外の点で変更されたバージョンであり得ると理解される。よって、核酸ベクターまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれるレトロウイルス遺伝子は、野生型遺伝子のコドン最適化バージョンも意味し得る。

付加的成分
本発明の核酸ベクターは、さらなる付加的成分を含んでなり得る。これらの付加的特徴は、例えば、翻訳のために転写産物を安定化させる、遺伝子発現のレベルを増強する、および遺伝子転写のオン／オフを切り替える助けをするために使用され得る。

本発明により産生されるレトロウイルスベクター粒子は、遺伝子療法の方法で使用され得る。よって、一つの実施態様では、核酸ベクターは、１以上の導入遺伝子を付加的に含んでなる。この導入遺伝子は、標的疾患を治療または改善するために使用され得る遺伝子産物をコードする治療上有効な遺伝子であり得る。導入遺伝子は、例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、タンパク質（例えば、腫瘍抑制タンパク質）、毒素、抗原（抗体誘導する、またはＴ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞を助けるために使用され得る）または抗体（例えば、一本鎖抗体）をコードし得る。一つの実施態様では、導入遺伝子は、βグロビンをコードする。

導入遺伝子を含有する複数コピーの移入ベクターはより高いレトロウイルスベクター力価を生じると予想され、よって、一つの実施態様では、核酸ベクターは、複数コピーの導入遺伝子、例えば、２以上、特に、３以上のコピーの導入遺伝子を含んでなる。場合によっては、疾患を処置するために２以上の遺伝子産物が必要とされ、よって、さらなる実施態様では、核酸ベクターは、２以上、例えば、３以上、または４以上の異なる導入遺伝子を付加的に含んでなる。

本明細書で「導入遺伝子」という場合には、導入される哺乳動物宿主細胞には存在しない、または十分に発現していない異種または外来ＤＮＡを意味する。これは、例えば、標的遺伝子が哺乳動物宿主細胞で適正に発現されず、従って、標的遺伝子の矯正型が導入遺伝子として導入される場合を含み得る。よって、導入遺伝子は、潜在的治療対象の遺伝子であり得る。導入遺伝子は、他の細胞種、または別の種から得られたものであっても、または合成産生されたものであってもよい。あるいは、導入遺伝子は、天然遺伝子に存在するものとは異なる調節領域と機能的に連結された宿主細胞から得られたものであってもよい。あるいは、導入遺伝子は、宿主細胞に存在する遺伝子の異なる対立遺伝子または変異体であってもよい。

遺伝子療法の目的は、治療目的で生細胞の遺伝物質を修飾することであり、それは治療効果を達成するために細胞に機能的遺伝子を導入することを含む。本明細書に記載の核酸ベクターおよび宿主細胞を用いて作製されたレトロウイルスベクターは、標的細胞をトランスフェクトし、潜在的治療対象の遺伝子の発現を誘導するために使用できる。よって、レトロウイルスベクターは、限定されるものではないが、遺伝的障害、癌、および特定のウイルス感染を含む病態に罹患している、ヒト対象などの哺乳動物対象の処置のために使用できる。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、転写調節エレメントを付加的に含んでなる。例えば、本明細書に記載のエレメントはいずれも、発現が制御可能なようにプロモーターに機能的に連結することができる。本明細書に言及されるプロモーターは、構成的に作用し得るか、または例えば、調節タンパク質の存在下で誘導可能な既知のプロモーターの全体または一部を含み得る。一つの実施態様では、核酸ベクターは、高効率プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターを付加的に含んでなる。このプロモーターは、非哺乳動物核酸ベクターにコードされているエレメントの高レベルの発現を促進するという利点を有する。さらなる実施態様では、ＣＭＶプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス株ＡＤ１６９に由来する配列を含んでなる。この配列は、ゲノム受託番号Ｘ１７４０３の、例えば、塩基対１７３７３１〜１７４４０４から取得可能である。

一つの実施態様では、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）は、少なくとも１つのＴｅｔオペロンを付加的に含んでなる。Ｔｅｔオペロン系は、核酸ベクター内に含まれるレトロウイルス配列の発現を制御するために使用され得る。簡単に述べれば、Ｔｅｔ リプレッサータンパク質は、プロモーターに導入されるＴｅｔオペロン部位に結合することにより発現を遮断する。よって、ＴｅｔリプレッサーがＴｅｔオペロンと結合している場合には、遺伝子発現は見られない。テトラサイクリンまたはドキシサイクリンを添加すると、Ｔｅｔリプレッサーは隔離されてプロモーター活性を可能とし、よって、遺伝子発現がオンにされる。Ｔｅｔオペロン系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅから入手可能なｐｃＤＮＡ（商標）４／ＴＯ哺乳動物発現ベクターで使用されるＴｅｔオペロンなど、広く入手可能である。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、テトラサイクリン耐性オペロンリプレッサータンパク質（「Ｔｅｔリプレッサー」または「ＴｅｔＲ」）を付加的に含んでなる。さらなる実施態様では、Ｔｅｔリプレッサーは、コドンが最適化されている。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、クロマチンインスレーターなどのインスレーターを付加的に含んでなる。用語「インスレーター」は、プロモーターとエンハンサーの間の相互作用を遮断する遺伝子配列を意味する。さらなる実施態様では、インスレーター（例えば、クロマチンインスレーター）は、レトロウイルス核酸配列のそれぞれの間に存在する。これは、隣接するレトロウイルス核酸配列間のプロモーター干渉（すなわち、ある転写単位からのプロモーターが隣接する転写単位の発現を障害する場合）を防ぐ助けをする。核酸ベクターの、レトロウイルス核酸配列のそれぞれの間にインスレーターが存在すれば、これらは核酸ベクター内に個々の発現構築物として配置されてもよいと理解される。例えば、レトロウイルス核酸配列をコードする各配列は、その固有のプロモーターおよび／またはイントロンおよび／またはポリＡシグナルを有する。一つの実施態様では、クロマチンインスレーターは、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ＨＳ４インスレーター配列（例えば、ゲノム受託番号Ｕ７８７７５．２、塩基対１〜１２０５参照）と少なくとも９０％の配列同一性、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を有する。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、選択マーカーを付加的に含んでなる。これは、 複製欠陥レトロウイルスベクター粒子をコードする核酸配列が組み込まれている細胞を選択することを可能とする。さらなる実施態様では、選択マーカーは、ゼオシン、カナマイシンまたはピューロマイシン耐性遺伝子、特に、ゼオシン（ＺｅｏＲ）耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子である。なおさらなる実施態様では、ゼオシン耐性遺伝子は、ストレプトアロテイカス・ヒンダスタンス(Streptoalloteichus hindustans)ｂｌｅ遺伝子に由来する、例えば、ゲノム受託番号Ｘ５２８６９．１の塩基対３〜３７７参照。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、ポリＡシグナルを付加的に含んでなる。ポリＡシグナルの使用は、ｍＲＮＡを酵素分解から保護し、翻訳を補助するという利点を有する。さらなる実施態様では、ポリＡシグナルは、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモンおよび／またはヒトβグロビンから得られるか、またはそれに由来する。一つの実施態様では、ポリＡシグナルは、ＳＶ４０前記ポリＡシグナル（例えば、ゲノム受託番号ＥＦ５７９８０４．１、マイナス鎖由来の塩基対２６６８〜２５３８参照）に由来する。一つの実施態様では、ポリＡシグナルは、ヒトβグロビンポリＡシグナル（例えば、ゲノム受託番号ＧＵ３２４９２２．１、塩基対３３９４〜４１６２参照）に由来する。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、イントロン配列を付加的に含んでなる。エンハンサー／プロモーター領域の下流およびｃＤＮＡインサート（すなわち、導入遺伝子）の上流でのイントロンの使用は、そのインサートの発現レベルを増強することが知られている。さらなる実施態様では、イントロン配列は、ヒトβグロビンイントロンまたはウサギβグロビンイントロンＩＩ配列である。一つの実施態様では、ヒトβグロビンイントロンは、ゲノム受託番号ＫＭ５０４９５７．１（例えば、塩基対４７６〜１３９３由来）で取得可能な配列に由来する。一つの実施態様では、ウサギβグロビンイントロンＩＩは、ゲノム受託番号Ｖ００８８２．１（例えば、塩基対７１８〜１２９０由来）で取得可能な配列に由来する。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element)（ＷＰＲＥ）を付加的に含んでなる。ＷＰＲＥの存在は発現を増強することが示されており、従って、高レベルの発現を達成する上で有益である可能性がある。さらなる実施態様では、ＷＰＲＥは、ゲノム受託番号Ｊ０４５１４．１（例えば、塩基対１０９３〜１６８４由来）で取得可能な配列に由来する。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、内部リボソーム進入部位(internal ribosome entry site)（ＩＲＥＳ）を付加的に含んでなる。ＩＲＥＳは、５’キャップの下流の５’非翻訳領域（開始複合体のアセンブリに必要とされる）に通常見られる構造化されたＲＮＡエレメントである。ＩＲＥＳは翻訳開始因子によって認識され、キャップ非依存的翻訳を可能とする。さらなる実施態様では、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス(Encephalomyocarditis virus)（ＥＭＣＶ）ゲノム（例えば、ゲノム受託番号ＫＦ８３６３８７．１、塩基対１５１〜７２４参照）に由来する。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、多重クローニング部位(Multiple Cloning Site)（ＭＣＳ）を付加的に含んでなる。ＭＣＳは、核酸ベクター内の、多重制限部位（例えば、１０、１５または２０部位）を含む短いＤＮＡセグメントである。これらの部位は通常、エンドヌクレアーゼが一箇所でのみ切断することを保証するために核酸ベクター内に一度しか見られない。これはレトロウイルス遺伝子が適当なエンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）を用いて容易に挿入されることを可能とする。

これらの構築物は核酸ベクター内にいずれの順序で配置されていてもよいことが当業者には理解されるであろう。例示的実施態様では、核酸ベクターは、以下のインサートを含んでなる：ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするレトロウイルス核酸配列、ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体（例えば、ＶＳＶｇ）をコードするレトロウイルス核酸配列、補助遺伝子ｒｅｖ（例えば、コドン最適化ｒｅｖ配列）もしくはその類似遺伝子または機能的に類似の系をコードするレトロウイルス核酸配列、テトラサイクリン耐性オペロンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）、内部リボソーム進入部位、および選択マーカー（例えば、ゼオシン耐性選択マーカー）（すなわち、ＧａｇＰｏｌ−Ｅｎｖ−Ｒｅｖ−Ｔｅｔリプレッサー−ＩＲＥＳ−抗生物質耐性マーカー−残りのＢＡＣ配列（「ＢＡＣ骨格」）；例えば、ＧａｇＰｏｌ−（野生型）ＶＳＶｇ−（コドン最適化）Ｒｅｖ−Ｔｅｔリプレッサー−ＩＲＥＳ−ゼオシン耐性−ｐＳＭＡＲＴＢＡＣ）。さらなる実施態様では、インスレーター（例えば、クロマチンインスレーター）が、ｇａｇｐｏｌ、ｅｎｖおよびｒｅｖ配列のそれぞれの間に存在する。さらなる実施態様では、プロモーターがｇａｇｐｏｌ、ｅｎｖおよびｒｅｖ配列のそれぞれの前に存在する。なおさらなる実施態様では、少なくとも１コピーの移入ベクター配列（すなわち、レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムをコードする核酸配列を含んでなる）がｇａｇｐｏｌ配列の前に存在する。

一つの実施態様では、核酸ベクターは、以下のインサートを含んでなる：インスレーター（例えば、クロマチンインスレーター）、プロモーター（例えば、場合によりＴｅｔオペロン配列を含んでなるＣＭＶプロモーター）、イントロン（例えば、ヒトβグロビンイントロン）、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするレトロウイルス核酸配列、ＲＲＥをコードするレトロウイルス核酸、ポリＡシグナル（例えば、ヒトβグロビンポリＡシグナル）、インスレーター（例えば、クロマチンインスレーター）、プロモーター（例えば、場合によりＴｅｔオペロン配列を含んでなるＣＭＶプロモーター）、イントロン（例えば、ヒトβグロビンイントロン）、ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体（例えば、ＶＳＶｇ）をコードするレトロウイルス核酸配列、ポリＡシグナル（例えば、ヒトβグロビンポリＡシグナル）、インスレーター（例えば、クロマチンインスレーター）、プロモーター（例えば、場合によりＴｅｔオペロン配列を含んでなるＣＭＶプロモーター）、補助遺伝子ｒｅｖもしくはその類似遺伝子または機能的に類似の系をコードするレトロウイルス核酸配列、ポリＡシグナル（例えば、ヒトβグロビンポリＡシグナル）、インスレーター（例えば、クロマチンインスレーター）、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、イントロン（例えば、ウサギβグロビンイントロン）、テトラサイクリン耐性オペロンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）、内部リボソーム進入部位、選択マーカー（例えば、ゼオシン耐性選択マーカー）、ポリＡシグナルおよび多重クローニング部位。

核酸配列は核酸ベクターに順次導入してよい。これは必要とされる核酸配列の総てが核酸ベクターに首尾良く組み込まれることを保証するように、各組込み後の選択を可能とする。あるいは、少なくとも２以上の核酸配列が同時に核酸ベクターに導入される。

本明細書に記載の付加的遺伝子は、当技術分野で公知の標準的な分子クローニング技術により、例えば、制限エンドヌクレアーゼおよびライゲーション技術を用いて、核酸ベクターに導入され得ることが理解されるであろう。さらに、核酸ベクター、特に、ＢＡＣ、ＰＡＣ、フォスミドおよび／またはコスミドは、エレクトロポレーションなどの標準的技術によって細菌宿主細胞（例えば、大腸菌細胞、特に、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株）に導入され得る。

使用
本発明のさらなる面によれば、レトロウイルスパッケージングまたは産生細胞株を作製する上で使用するための本明細書に定義される核酸ベクターが提供される。

本明細書に記載の核酸ベクターは、レトロウイルスベクター作製を大幅に簡単にするレトロウイルスパッケージング細胞株を作出するために使用可能である。導入遺伝子が核酸ベクターに含まれていれば、これが産生細胞株の作出のために使用されることが理解されるであろう。

本明細書に記載されるように、一時的トランスフェクションに付随する欠点を克服するためには、安定なレトロウイルスパッケージング（または産生）細胞株を開発することが有用となろう。本明細書に記載の核酸ベクターは、レトロウイルスパッケージングに必要とされる必須遺伝子を含有する大きなＤＮＡインサートを保持することができ、これは次に哺乳動物宿主細胞の内在ゲノムに一工程で組み込まれ得るので、前記パッケージング細胞株の作製に使用可能である。

宿主細胞
本発明のさらなる面によれば、
ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質；ならびに
ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体
をコードする核酸配列を含んでなるレトロウイルスパッケージング細胞
が提供され、
前記核酸配列は総て、レトロウイルスパッケージング細胞ゲノム内の単一の遺伝子座に位置する。

大きな核酸ベクターにレトロウイルス遺伝子の総てを含めることの利点は、それらがまず、取り扱いおよび操作がはるかに容易な微生物細胞（例えば、細菌または酵母細胞）で調製でき、その後、一工程で哺乳動物細胞に組み込まれるということである。これは選択圧を和らげ、ひと度レトロウイルス遺伝子が哺乳動物宿主細胞に組み込まれればサイレンシング時間枠を減じる。この方法の特有な特徴は、パッケージング細胞株を作出するために必要とされるレトロウイルス遺伝子の総てが、内在ゲノム中に無作為に分散するのではなく、内在ゲノム内の単一の遺伝子座に存在するということである。これは、レトロウイルス遺伝子が内在ゲノムに無作為に組み込まれ、一様でないレベルの発現を生じ得る従来の方法に比べて、レトロウイルス遺伝子の総てが同じ遺伝子座に位置するので同じレベルで発現するレトロウイルスパッケージング細胞を作製するという利点を持つ。

一つの実施態様では、レトロウイルスパッケージング細胞は、レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムをコードする核酸配列を付加的に含んでなる。これもまた、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質およびｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体をコードする核酸配列とともに単一の遺伝子座に位置し得る。

よって、本発明のさらなる面によれば、
ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質；
ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体；ならびに
レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノム
をコードする核酸配列を含んでなるレトロウイルス産生細胞が提供され、
前記核酸配列は総て、レトロウイルス産生細胞ゲノム内の単一の遺伝子座に位置する。

一つの実施態様では、レトロウイルスパッケージング細胞は、哺乳動物細胞である。さらなる実施態様では、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＫＳ６２細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＨｅＬａ細胞またはそれらの誘導体もしくは機能的等価物から選択される。なおさらなる実施態様では、哺乳動物宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞であるか、またはＨＥＫ２９３細胞に由来する。このような細胞は、接着細胞株（すなわち、それらは表面に結合して単層として増殖する）または懸濁適応／非接着細胞株（すなわち、それらは培養培地中、懸濁状態で増殖する）であり得る。なおさらなる実施態様では、ＨＥＫ２９３細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。用語「ＨＥＫ２９３細胞」は、バイオテクノロジーに慣用されるヒト胎児腎２９３細胞を意味する。特に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、種々のレトロウイルスベクターの産生に慣用される。好適な市販の細胞株の他の例としては、Ｔ−ＲＥＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞株が挙げられる。

核酸ベクターに関して以上に記載した実施態様は総て、本発明のレトロウイルスパッケージング／産生細胞にも適用可能であることが理解されるであろう。

方法
本発明のさらなる面によれば、安定なレトロウイルスパッケージング細胞株の製造方法であって、
（ａ）本明細書に記載の核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物に導入すること；および
（ｂ）前記培養物内で、前記ベクターにコードされている核酸配列が哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれた哺乳動物宿主細胞を選択すること
を含んでなる方法が提供される。

一つの実施態様では、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ６Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＫＳ６２細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＨｅＬａ細胞またはそれらの誘導体もしくは機能的等価物から選択される。さらなる実施態様では、哺乳動物宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞であるか、またはＨＥＫ２９３細胞に由来する。このような細胞は接着細胞株（すなわち、それらは表面に結合して単層として増殖する）または懸濁適応／非接着細胞株（すなわち、それらは培養培地中、懸濁状態で増殖する）であり得る。なおさらなる実施態様では、ＨＥＫ２９３細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ６Ｅ細胞である。好適な市販の細胞株の他の例としては、Ｔ−ＲＥＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞株が挙げられる。

当業者ならば、核酸ベクターを宿主細胞に導入することは、当技術分野で公知の好適な方法、例えば、脂質媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、細胞（例えば、マイクロセル）融合、エレクトロポレーションまたは微粒子衝撃を用いて実施され得ることに気づくであろう。一つの実施態様では、核酸ベクターは、エレクトロポレーションにより宿主細胞に導入される。核酸ベクターの導入に使用するための方法の選択は、使用する哺乳動物宿主細胞の種類に応じて選択され得ることが理解されるであろう。

ひと度、哺乳動物宿主細胞にあれば、核酸ベクターは、哺乳動物宿主細胞の内在ゲノムに無作為に組み込まれる。よって、本方法は、核酸ベクターにコードされる核酸が組み込まれた哺乳動物宿主細胞を選択することを付加的に含んでなる（例えば、ゼオシン耐性マーカーなどの抗生物質耐性選択マーカーを使用する）。

当業者ならば、例えば、核酸ベクターが自然状態で環状であれば（例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミドまたはフォスミド）それを線状化するなど、核酸ベクターの組込みを助長する方法に気づくであろう。核酸ベクターは、内在ゲノム内の選択された部位に組込みをガイドするための、哺乳動物宿主細胞の内在性染色体と相同性を共有する領域を付加的に含んでなり得る。さらに、組換え部位が核酸ベクター上に存在すれば、これらは標的組換えに使用可能である。例えば、核酸ベクターは、Ｃｒｅリコンビナーゼと組み合わせた場合に（すなわち、Ｐ１バクテリオファージに由来するＣｒｅ／ｌｏｘ系を使用する）、標的組込みを可能とするｌｏｘＰ部位を含み得る。あるいは（または加えて）、組換え部位は、ａｔｔ部位（例えば、λファージ由来）であり、このａｔｔ部位は、λインテグラーゼの存在下での部位指定組込みを可能とする。これは、レトロウイルス遺伝子が高いかつ／または安定な発現を可能とする内在ゲノム内の遺伝子座に標的化されることを可能とする。

標的化組込みの他の方法も当技術分野で周知である。例えば、選択された染色体遺伝子座での標的組換えを助長するために、ゲノムＤＮＡの標的切断を誘導する方法を使用することができる。これらの方法は多くの場合、二重鎖切断(double strand break)（ＤＳＢ）を誘導するための操作された切断系または非騒動末端結合(non-homologous end joining)（ＮＨＥＪ）もしくは修復鋳型（すなわち、相同性組換え修復(homology directed repair)またはＨＤＲ）を用いる修復などの天然プロセスにより切断の修復を誘導するための内在ゲノムのニックの使用を含む。

切断は、特異的切断をガイドするためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を、操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「シングルガイドＲＮＡ」）とともに使用する、および／またはアルゴノート系に基づくヌクレアーゼ（例えば、Ｔ．サーモフィラス(T. thermophilus）由来、「ＴｔＡｇｏ」として知られる、Swarts et al. (2014) Nature 507(7491): 258-261）を使用する、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ(zinc finger nucleases)（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(transcription-activator like effector nucleases)（ＴＡＬＥＮ）などの特異的ヌクレアーゼの使用を介して起こり得る。これらのヌクレアーゼ系の使用を用いた標的切断は、ＨＤＲまたはＮＨＥＪのいずれかにより媒介されるプロセスを用いて、特定の標的位置に核酸を挿入するために活用することができる。よって、一つの実施態様では、本方法は、少なくとも１つのヌクレアーゼを用いて、核酸ベクターにコードされる核酸配列を哺乳動物宿主細胞のゲノム（すなわち、内在性染色体）に組み込むことを付加的に含んでなり、前記少なくとも１つのヌクレアーゼは、前記核酸配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、哺乳動物宿主細胞のゲノムを切断する。さらなる実施態様では、少なくとも１つのヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系およびそれらの組合せからなる群から選択される。

本発明のさらなる面によれば、本明細書に定義される方法により得られるレトロウイルスパッケージング細胞が提供される。

本明細書に定義される方法を用いて得られる細胞株は、高力価のレトロウイルスベクターを産生するために使用され得る。

本明細書で用語「高力価」についての言及は、患者細胞などの標的細胞を形質導入できるレトロウイルスベクターまたは粒子の有効量を意味する。一つの実施態様では、高力価は、濃縮なく１０^６ＴＵ／ｍｌ（ＴＵ＝形質導入単位）を超えるものである。

本発明のさらなる面によれば、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子の製造方法であって、
（ａ）本明細書で定義される核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物に導入すること；
（ｂ）前記培養物内で、前記ベクターにコードされている核酸配列が哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれた哺乳動物宿主細胞を選択すること；および
（ｃ）前記哺乳動物宿主細胞を複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が産生される条件下でさらに培養すること
を含んでなる方法が提供される。

以上に記載されるように、一つの実施態様では、哺乳動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＫＳ６２細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＨｅＬａ細胞またはそれらの誘導体もしくは機能的等価物から選択される。さらなる実施態様では、哺乳動物宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞であるか、またはＨＥＫ２９３細胞に由来する。このような細胞は接着細胞株（すなわち、それらは表面に結合して単層として増殖する）または懸濁適応／非接着細胞株（すなわち、それらは培養培地中、懸濁状態で増殖する）であり得る。なおさらなる実施態様では、ＨＥＫ２９３細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。好適な市販の細胞株の他の例としては、Ｔ ＲＥＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞株が挙げられる。

本明細書に記載の方法において使用される条件は使用される宿主細胞によって異なることが当業者により理解されるであろう。典型的な条件は、例えば、使用される培養培地または温度は当技術分野で周知である。一つの実施態様では、培養は哺乳動物宿主細胞を加湿条件下でインキュベートすることによって実施される。さらなる実施態様では、加湿条件は、トランスフェクト細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートすることを含んでなる。一つの実施態様では、培養は、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、無血清ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（商標）培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１２−７２５Ｆ）、またはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１２３３８−０１８）から選択される培養培地を用いて実施される。

一つの実施態様では、本方法は、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を単離することを付加的に含んでなる。例えば、一つの実施態様では、単離は、フィルターを使用することにより実施される。さらなる実施態様では、フィルターは、低タンパク質結合膜（例えば、０．２２μｍ低タンパク質結合膜または０．４５μｍ低タンパク質結合膜）、例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）またはポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）人工膜である。

ひと度、哺乳動物宿主細胞にあれば、核酸ベクターに存在するレトロウイルス核酸は、内在ゲノム内の無作為な単一遺伝子座に組み込まれ得る。組込み工程は、以上に記載されるように、例えば、線状化および／または共通相同性領域を用いて助長され得る。組換え部位もまた標的化組換えのために使用され得る。

標的遺伝子が抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーとともに内在性染色体に組み込まれる場合、本方法は、レトロウイルス核酸が首尾良く組み込まれた哺乳動物宿主細胞を選択することを付加的に含んでなり得る。

ひと度単離されれば、レトロウイルスベクター粒子はｉｎ ｖｉｖｏ適用のために濃縮され得る。濃縮方法としては、例えば、超遠心分離、沈降または陰イオン交換クロマトグラフィーが含まれる。超遠心分離は、小規模でのレトロウイルスベクター濃縮のための迅速法として有用である。あるいは、陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ陰イオン交換膜カートリッジを使用）または沈降（例えば、ＰＥＧ ６０００を使用）は、大容量のレンチウイルスベクター上清を処理するために得に有用である。

本発明のさらなる面によれば、本明細書で定義される方法により得られる複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が提供される。

以下、本発明を下記の限定されない例を参照してさらに詳細に説明する。

実施例１：構築物ガイド
図１は、ＢＡＣｐａｃｋ−ＷＴＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５およびＢＡＣｐａｃｋ−ＳＹＮＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５の構築のための段階的ガイドを示す。ＸｂａＩおよびＮｈｅＩ消化の適合末端(compatible ends)のために、レンチウイルスパッケージング遺伝子をｐＳｍａｒｔ ＢＡＣベクターに段階的に搭載した。ＧａｇＰｏｌの付加に際して、野生型ＧａｇＰｏｌ（ＷＴＧＰ）またはコドン最適化ＧａｇＰｏｌであるＳＹＮＧＰのいずれかを含有する２つの構築物を作製した。これらをそれぞれＢＡＣｐａｃｋ−ＷＴＧＰおよびＢＡＣｐａｃｋ−ＳＹＮＧＰと呼称した。次に、移入カセットをこれらの構築物の両方に負荷し、このようにしてＢＡＣｐａｃｋＷＴＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５およびＢＡＣｐａｃｋＳＹＮＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５を作出した。

実施例２：安定なポリクローナルプールの選択
接着細胞株ＨＥＫ２９３ＴをＢＡＣｐａｃｋＳＹＮＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５またはＢＡＣｐａｃｋＷＴＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５でトランスフェクトすることにより、ポリクローナルの安定なトランスフェクタントプールを作出した。その後、上手くいった組込み事象をゼオシンで選択した。

これらのポリクローナルプールのレンチウイルスベクター生成能を評価するために、細胞をドキシサイクリン（Ｉ）で誘導するか、または誘導せずに残し（ＵＩ）、非トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較した。

結果は、各トランスフェクション条件から採取したレンチウイルスベクター上清の力価を形質導入単位(transduction units)（ＴＵ）／ｍＬで示す。図２の力価測定結果から、ＢＡＣｐａｃｋＳＹＮＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５またはＢＡＣｐａｃｋＷＴＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５のいずれかを用いて作製した安定なポリクローナルプールは現行の一時的トランスフェクション系に匹敵する１０ｅ７ ＴＵ／ｍＬの領域での濃縮でレンチウイルスベクターを産生する能力があることが見て取れる。

これらの結果から、レンチウイルス産生に必要な総てのパッケージング遺伝子を含有する単一のＢＡＣベクターが好適な力価でレンチウイルスベクターを産生することができる細胞株を作出できることが確認される。

実施例３：安定なトランスフェクション懸濁クローンの産生
ＢＡＣ技術を用いたレンチウイルスベクター産生細胞株を作出する主要な目的は、プラットフォームに新たな進歩(advances)を迅速に適用することである。これらの進歩は、特殊細胞株の修飾を含む可能性がある。例えば、接着細胞よりも高密度まで増殖することから懸濁液細胞で生体産物を産生することにより収量を高めることが業界標準である。しかしながら、現行のレンチウイルスベクター産生系は、接着ＨＥＫ２９３Ｔ細胞よりも懸濁液細胞で達成するほうが困難な高トランスフェクション率に依存している。トランスフェクション効率は、成功した組込み体を選択するために、安定な細胞株を作出する場合をあまり考慮していないので、ＢＡＣ構築物は、レンチウイルスベクター産生懸濁液細胞株を作出するための理想的な解決策である。

従前に実証されたように、ＢＡＣ構築物は、接着ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からレンチウイルスベクター産生細胞株を作出することができる。ＢＡＣ構築物の適用性を証明するために、安定なトランスフェクタント細胞株を懸濁液細胞株ＨＥＫ２９３ ６Ｅから作出した。ＨＥＫ２９３ ６Ｅ細胞をＢＡＣ構築物ＢＡＣｐａｃｋＷＴＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５でトランスフェクトした後にゼオシンで選択した。この後クローニングを行ってクローン細胞株を作出した。図３の結果は、安定な細胞株により生成されたＧＦＰシグナルを示す。これは、移入ベクターセグメントにゼオシン耐性と機能的ＧＦＰ発現カセットの両方が存在していることを示す。

この結果は、ＢＡＣ構築物が複数の細胞株から安定なクローンを作出する能力を有することを示唆する。

実施例４：懸濁クローンにおけるレンチウイルスの誘導
安定な懸濁クローンの、レンチウイルスベクター産生能を確認するために、クローン１、１４、１５および１６に対して２μｇ／ｍｌドキシサイクリンで誘導を行い、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入によって上清のウイルス力価を測定した。

図４の結果は、各クローンから採取したレンチウイルスベクター上清の力価（形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬ）を示す。これらの結果は、懸濁液細胞株ＨＥＫ２９３ ６Ｅの、ＢＡＣｐａｃｋＷＴＧＰ−２７７ｄｅｌＵ５による安定なトランスフェクションによって作出された細胞株は、現行の一時的トランスフェクション系に匹敵する収量でレンチウイルスベクターを産生できることを明らかに示す。

実施例５：クローンのベクター力価
図４に記載されるように、クローン１および１６を継代培養し、誘導を行い、後の時点で力価を測定して、これらの高生産性クローンかのベクター産生が安定であるかどうかを判定した。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、これらのクローンのベクター力価は、おそらくはこの誘導方法に導入された酪酸ナトリウム濃度の増大のために、実際に５代目〜２１代目の間に中等度の増加を見せた。

本明細書に記載の実施態様は本発明の総ての面に当てはまり得ると理解される。さらに、限定されるものではないが、特許および特許出願を含め、本明細書に引用されている総ての刊行物は、引用することにより、完全に示されているかのごとく本明細書の一部とされる。

Claims (26)

1. ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質；
   ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体；ならびに
   レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノム
   をコードする核酸配列を含んでなるレトロウイルス産生細胞であって、
   前記核酸配列が総て前記レトロウイルス産生細胞ゲノム内の単一の遺伝子座に位置する、レトロウイルス産生細胞。
2. 補助遺伝子ｒｅｖもしくはその類似遺伝子または機能的に類似の系を付加的に含んでなる、請求項１に記載のレトロウイルス産生細胞。
3. レトロウイルス核酸配列がレンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルスまたは泡沫状レトロウイルスから選択されるレトロウイルスに由来する、請求項１または請求項２に記載のレトロウイルス産生細胞。
4. レトロウイルス核酸配列がＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶおよびＶｉｓｎａからなる群から選択されるレンチウイルスに由来する、請求項３に記載のレトロウイルス産生細胞。
5. レトロウイルス核酸配列がＨＩＶ−１に由来する、請求項４に記載のレトロウイルス産生細胞。
6. ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体が水疱性口内炎ウイルスに由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のレトロウイルス産生細胞。
7. 転写調節エレメントを付加的に含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のレトロウイルス産生細胞。
8. 転写調節エレメントがＣＭＶプロモーターである、請求項７に記載のレトロウイルス産生細胞。
9. ＣＭＶプロモーターが少なくとも１つのＴｅｔオペロンを付加的に含んでなる、請求項８に記載のレトロウイルス産生細胞。
10. テトラサイクリン耐性オペロンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）を付加的に含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のレトロウイルス産生細胞。
11. インスレーターを付加的に含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のレトロウイルス産生細胞。
12. インスレーターが前記レトロウイルス核酸配列のそれぞれの間に存在する、請求項１１に記載のレトロウイルス産生細胞。
13. 選択マーカーを付加的に含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のレトロウイルス産生細胞。
14. １以上の導入遺伝子を付加的に含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のレトロウイルス産生細胞。
15. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のレトロウイルス産生細胞。
16. 非哺乳動物複製起点と少なくとも２５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡを保持する能力とを含んでなる核酸ベクターであって、
    ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質、ならびに
    ｅｎｖタンパク質またはその機能的置換体
    をコードするレトロウイルス核酸配列を含んでなり、
    前記レトロウイルス核酸配列のそれぞれが核酸ベクター内に個々の発現構築物として配置されている
    、核酸ベクター。
17. レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムをコードする核酸配列を付加的に含んでなる、請求項１６に記載の核酸ベクター。
18. 補助遺伝子ｒｅｖもしくはその類似遺伝子または機能的に類似の系を付加的に含んでなる、請求項１６または請求項１７に記載の核酸ベクター。
19. ベクターが細菌人工染色体、酵母人工染色体、Ｐ１由来人工染色体、フォスミドまたはコスミドから選択される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
20. ベクターが細菌人工染色体である、請求項１９に記載の核酸ベクター。
21. 安定なレトロウイルスパッケージング細胞株の製造方法であって、
    （ａ）請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物に導入すること；および
    （ｂ）前記培養物内で、前記ベクターにコードされている核酸配列が哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれた哺乳動物宿主細胞を選択すること
    を含んでなる、方法。
22. 哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項２１に記載の方法。
23. 請求項２１または請求項２２に記載の方法により得られたレトロウイルスパッケージング細胞。
24. 複製欠陥レトロウイルスベクター粒子の製造方法であって、
    （ａ）請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物に導入すること；
    （ｂ）前記培養物内で、前記ベクターにコードされている核酸配列が哺乳動物宿主細胞の内在性染色体に組み込まれた哺乳動物宿主細胞を選択すること；および
    （ｃ）前記哺乳動物宿主細胞を複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が産生される条件下でさらに培養すること
    を含んでなる、方法。
25. 複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を単離することを付加的に含んでなる、請求項２４に記載の方法。
26. 請求項２４または請求項２５の方法により得られた複製欠陥レトロウイルスベクター粒子。