PL185338B1 - Kapsułka otaczająca linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, sposób otrzymywania kapsułki otaczającej linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, zastosowanie kapsułki otaczającej linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej oraz kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Abstract

1. Kapsulka otaczajaca linie komórek pakujacych produkujacych czasteczki retrowi- rusa, znamienna tym, ze zawiera pólprzepuszczalna blone z farmaceutycznie dopuszczal- nego polimeru tworzacego porowata scianke majaca wielkosc porów pozwalajaca na uwalnianie zasadniczo wszystkich czasteczek retrowirusa produkowanych przez te linie komórkowa. 18. Sposób otrzymywania kapsulki otaczajacej linie komórek pakujacych produkuja- cych czasteczki retrowirusa, znamienny tym, ze komórki pakujace zawiesza sie w roztwo- rze wodnym polielektrolitu, po czym zawiesine w postaci wstepnie formowanych czaste- czek wprowadza sie do kapieli straceniowej zawierajacej roztwór wodny polielektrolitu o przeciwnym ladunku. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kapsułka otaczająca linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, sposób otrzymywania kapsułki otaczającej linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, zastosowanie kapsułki otaczającej linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej oraz kompozycja farmaceutyczna. Wynalazek dotyczy zwłaszcza komórek, zawie185 338 rających genom wektora retrowirusowego, będącego nośnikiem genów terapeutycznych, do dostarczania genów, a zwłaszcza genów terapeutycznych do docelowych komórek/organów.

Dostarczanie genów przynoszących korzyści terapeutyczne komórkom docelowym jest zasadniczym celem terapii genowej. Jeśli terapia genowa ma być rutynowym sposobem terapii, to najważniejszym jest opracowanie procedur, które pozwolą na efektywne dostarczanie in vivo genów terapeutycznych do komórek docelowych.

Wektory wirusowe, a zwłaszcza wektory retrowirusowe są najpowszechniej wykorzystywanymi nośnikami w terapii genowej (Morgan i Anderson, 1993). Większość obecnie zatwierdzonych protokołów terapii genowej prezentuje podejście ex vivo, zgodnie z którym komórki są pobierane od pacjenta, genetycznie modyfikowane in vitro i ponownie wprowadzane do jego ciała. Procedura taka jest niewygodna, kosztowna i ograniczona do technologicznie zaawansowanych laboratoriów. Dodatkowo ten sposób podejścia ograniczony jest do komórek, które daje się łatwo izolować, hodować i reimplantować (Gunzburg i wsp., 1995). Chociaż dostarczanie in vivo genów terapeutycznych ma wiele korzyści, to w obecnej postaci sposób ten jest niewydajny i kłopotliwy. Poważnym problemem, związanym z niską wydajnością transferu genów, jest potrzeba wielokrotnego użycia wektora wirusowego. Wymóg wielokrotnego dostarczania wektora jest nie tylko uciążliwy, ale również prawdopodobnie nieefektywny z powodu odpowiedzi odpornościowej skierowanej przeciw cząsteczkom wirusa.

Jednym z możliwych sposobów obejścia tego problemu jest bezpośrednia implantacja komórek produkujących cząsteczki wirusa. Implantacja in situ do docelowych komórek lub organów, komórek produkujących cząsteczki wirusa zawierające genom wektora wirusowego pozwala również na bezpośrednie zastosowanie wektora wirusowego w docelowych komórkach/organach.

Ponadto, jeśli zastosowanym wektorem wirusowym jest wektor retrowirusowy, wówczas taki sposób wykazuje przewagę nad wielokrotnym stosowaniem pojedynczych i wysokich dawek, ponieważ możliwość, że wektor wirusowy będzie obecny w czasie, gdy komórka docelowa będzie ulegać replikacji, będąc wówczas podatną na infekcje, wzrasta. Ponadto, niższe lecz ciągłe uwalnianie cząsteczek wirusa może być korzystne przy unikaniu odpowiedzi odpornościowej gospodarza przeciwko cząsteczkom wirusa.

W celu efektywnego dostarczenia wektorów wirusowych, komórki produkujące cząsteczki wirusa powinny móc przeżyć w organizmie gospodarza przez długi okres czasu po implantacji, i cząsteczki wirusa powinny być w tym czasie produkowane i uwalniane z tych komórek. Przy braku istotnej odpowiedzi odpornościowej, na przykład, po implantacji do mózgu, komórki te mogą przeżyć przez dłuższe okresy czasu (Culver i wsp., 1992; Ram i wsp., 1993). Jednak warunkiem efektywnej implantacji do innych części ciała jest ochrona komórek produkujących przed układem odpornościowym.

Długotrwała efektywność tego sposobu zależy więc od (1) ochrony komórek przed systemem odpornościowym gospodarza, który normalnie eliminuje komórki produkujące cząsteczki wirusa, szczególnie wtedy, gdy komórki produkujące cząsteczki wirusa pochodzą od różnych gatunków, jak to jest zazwyczaj w przypadku takich komórek i (2) przeżycia tych komórek in situ przez dłuższy okres czasu, co może wymagać unaczynienia.

Otoczenie komórek kapsułką o półprzepuszczalnej strukturze, która pozwoliła na uwalnianie pewnych, biologicznie aktywnych cząsteczek, choć zabezpieczała komórki produkujące te cząsteczki przed systemem odpornościowym gospodarza odniosło pewien sukces (patrz publikacja - Chang, 1995). Komórki, które zostały genetycznie zmodyfikowane tak, aby produkować ludzki hormon wzrostu (hGH) (Tai and Sun, 1993) lub wydzielinową postać ludzkiej deaminazy adenozyny (Hughes i wsp., 1994) pokryte zostały kapsułką. W obu tych pracach komórki zostały otoczone mikrokapsułkami z alginianu poli-L-lizyny i wykazano, że komórki takie przeżyły dłuższy okres czasu w hodowli. Towarzyszyła temu długotrwała produkcja enzymu lub hormonu. Następnie wykazano (Tai and Sun, 1993), że po transplantacji mikrokapsułek do myszy, komórki pozostały zdolne do życia przez 1 rok i kontynuowały produkcję hGH, co wskazuje, że kapsułki chroniły transfekowane komórki przed zniszczeniem przez system odpornościowy gospodarza.

185 338

Doniesiono również o użyciu innych materiałów do otaczania komórek. Komórki nerek młodego chomika, zmodyfikowane genetycznie i produkujące czynnik wzrostu nerwów otoczone zostały kapsułką z poliakrylonitrylem/polichlorkiem winylu i zaimplantowane do mózgu szczura. Otoczone kapsułką komórki przeżyły co najmniej 6 miesięcy i kontynuowały produkcję NGF (Winn i wsp., 1994; Deglon i wsp., 1995).

Co więcej, hepatocyty zostały z powodzeniem otoczone kapsułkami z kompleksu polielektrolitów: siarczanu celulozy i polidimetylodiallilu amoniowego (Stange i wsp., 1993). Ponad 90% otoczonych kapsułami hepatocytów zachowało swoją zdolność przeżycia i w przeciwieństwie do hepatocytów rosnących w monowarstwie, otoczone kapsułami komórki wykazywały zwiększoną aktywność metaboliczną. Nie jest jednak wiadome, czy kapsułki z kompleksu siarczanu celulozy i polidimetylodiallilu amoniowego mogą umożliwić wzrost innych typów komórek, takich jak, na przykład, komórek produkujących cząsteczki wirusa, czy też umożliwić cząsteczkom wirusa wydostanie się z takich kapsułek.

Przygotowanie kapsułek z siarczanu celulozy zastosowane w niniejszym wynalazku zostało wyczerpująco opisane w niemieckim opisie patentowym DE 40 21 050 A1, w którym opisana została również synteza siarczanu celulozy. Wyczerpująca charakterystyka kapsułek zamieszczona została w publikacji H. Dautzenberg i wsp., Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., 21(3), 399-405 (1993). Inne kapsułki z siarczanu celulozy zostały opisane w brytyjskim opisie patentowym GB 2 135 954. Własności kapsułek celulozowych, to znaczy ich wymiary, wielkość porów, grubość ścianki i własności mechaniczne zależą od wielu czynników takich jak, na przykład, warunki fizyczne, w jakich je przygotowywano, lepkość płynu inkubacyjnego do precypitacji, jego stężenie jonów, temperatura, szybkość łączenia się zawiesiny komórek i siarczanu celulozy, skład siarczanu celulozy, jak również inne parametry opisane przez grupę Dautzenberg'a.

Z zaskoczeniem stwierdzono, że ciągła produkcja cząsteczek wirusa przez zaimplantowane komórki może być osiągnięta poprzez otoczenie ich kapsułkami z kompleksu polielektrolitu. Chociaż pory takich kapsułek są na tyle duże, aby umożliwić przeciwciałom i dopełniaczowi, mogącym inaktywować wirus (Welsh i wsp., 1975; Cometta i wsp., 1990), wejście do kapsułki, nie stwierdzono żadnych śladów znaczącej odpowiedzi odpornościowej czy zapalnej, czy też nekrozy w sąsiedztwie implantowanych kapsułek. Co więcej, ze zdziwieniem stwierdzono, że kapsułki według niniejszego wynalazku dobrze wszczepiają się w organizm gospodarza i ulegają intensywnemu unaczynieniu. Komórki pokryte kapsułkami, według wynalazku, zapewniają in vivo długotrwałe dostarczanie wektorów wirusowych przenoszących geny terapeutyczne.

Celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie komórek otoczonych kapsułką, produkujących cząsteczki retrowirusa, które to komórki pozwalają na uwalnianie z kapsułek cząsteczek retrowirusa, produkowanych przez te komórki, i jednocześnie nie wywołują istotnej odpowiedzi odpornościowej lub zapalnej gospodarza po implantacji do jego ciała.

Celem niniejszego wynalazku jest też zapewnienie sposobu produkcji takich komórek otoczonych kapsułkami, produkujących cząsteczki retrowirusa.

Jeszcze innym celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie sposobu dostarczania genów, szczególnie genów terapeutycznych, do docelowych organów/komórek przez implantacje takich otoczonych kapsułką komórek, produkujących cząsteczki retrowirusa do ciała gospodarza, i tym sposobem zapewnienie ciągłej produkcji i uwalniania cząsteczek wirusa w organach docelowych lub w pobliżu komórek docelowych.

Zgodnie z wynalazkiem kapsułka otaczająca linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, charakteryzuje się tym, że zawiera półprzepuszczalną błonę z farmaceutycznie dopuszczalnego polimeru tworzącego porowatą ściankę mającą wielkość porów pozwalającą na uwalnianie zasadniczo wszystkich cząsteczek retrowirusa produkowanych przez tę linię komórkową.

Korzystnie, porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks polielektrolitu utworzony z polielektrolitów o przeciwnych ładunkach.

Korzystnie, porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks polielektrolitu złożony z polisacharydów zawierających grupy siarczanowe lub pochodnych polisacharydów lub polimerów

185 338 syntetycznych zawierających grupy sulfonianowe i polimerów z czwartorzędowymi grupami amoniowymi.

Korzystnie, polisacharydy zawierające grupy siarczanowe lub pochodne polisacharydów wybrane są z siarczanu celulozy, siarczanu octanu celulozy, siarczanu karboksymetylocelulozy, siarczanu dekstranu lub siarczanu skrobi, a polimer syntetyczny zawierający grupę sulfonianowąjest sulfonianem polistyrenu.

Korzystnie, polimerem z czwartorzędowymi grupami amoniowymi jest polidimetylodiallil amoniowy lub poliwinylobenzylotrimetyl amoniowy.

Korzystnie, porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks złożony z siarczanu celulozy i polidimetylodiallilu amoniowego.

Korzystnie, kapsułka ma postać mikrokapsułek o średnicy w zakresie od 0,01 do 5 mm, a korzystnie od 0,1 do 1 mm.

Korzystnie, kapsułka zawiera gąbczastą osłonkę tworzącą wnętrze kapsułki otoczoną przez ściankę kapsułki zawierającą pory, przy czym gąbczasta osłonka wypełniona jest komórkami.

Korzystnie, wielkość powierzchniowych porów porowatej ścianki kapsułki wynosi od 80 do 150 nm, a korzystnie od 100 do 120 nm.

Korzystnie, cząsteczka retrowirusa produkowana przez linię komórek pakujących kapsułki zawiera genom wirusa retrowirusowego.

Korzystnie, otoczona kapsułką linia komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa jest transfekowana wektorem ekspresyjnym, przy czym wektor ekspresyjny niesie konstrukt wektora retrowirusowego zdolny do zakażania i sterowania ekspresją, w komórkach docelowych jednej lub więcej sekwencji kodujących niesionych przez ten konstrukt wektora retrowirusowego, a linia komórek pakujących przenosi co najmniej jeden wektor ekspresyjny niosący geny kodujące białka wymagane do pakowania konstruktu wektora retrowirusowego.

Korzystnie, co najmniej jedna z sekwencji kodujących koduje heterologiczne peptydy wybrane z genów markerowych, genów terapeutycznych, genów antywirusowych, genów antynowotworowych i genów cytokin.

Korzystnie, gen markerowy wybrany jest z grupy złożonej z genów markerowych, które kodują takie białka jak β-galaktozydaza, neomycyna, dehydrogenaza alkoholowa, puromycyna, transferaza fosforybozylowa hipoksantyny (HPRT), higromycyna i wydzielana fosfataza alkaliczna, a gen terapeutyczny wybrany jest z genów, które kodują białka takie jak kinaza tymidynowa wirusa opryszczki (Herpes Simplex), deaminaza cytozynowa, transferaza fosforybozylowa guanozyny (gpt), cytochrom P 450, geny regulujące cykl komórkowy takie jak SDI, geny JupreJorów nowotworów, które kodujćąbiałka takie jak p53, geny antyproliferacyjne, które kodująbiałka takie jak melityna, cykropina lub cytokiny takie jak IL-2.

Korzystnie, linia komórek pakujących wybrana jest z psi-2, psi-crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 i GP+envAM-12.

Korzystnie, wektor retrowirusowy jest defektywny pod względem replikacji.

Korzystnie, wektor retrowirusowy zawiera region 5' LTR o budowie U3-R-U5, jedną lub więcej sekwencji wybranych z sekwencji kodujących i niekodujących, i region 3' LTR zawierający całkowicie łub częściowo wydeletowany region U3, przy czym ten wydeletowany region U3 zastąpiony jest przez sekwencję polilinkera i element regulatorowy lub promotor, po którym następuje region R i U5.

Korzystnie, wektorem ekspresyjnym jest pBAG, pLXSN, pl25LX, pLX2Bl lub pc3/2Bl lub jego pochodne.

Z kolei sposób otrzymywania kapsułki otaczającej linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, charakteryzuje się tym, że komórki pakujące zawiesza się w roztworze wodnym polielektrolitu, po czym zawiesinę w postaci wstępnie formowanych cząsteczek wprowadza się do kąpieli strąceniowej zawierającej roztwór wodny polielektrolitu o przeciwnym ładunku.

Korzystnie, tworzenie cząsteczek przeprowadza się przez natryskiwanie.

185 338

Korzystnie, komórki zawiesza się w roztworze wodnym polisacharydu zawierającego grupy siarczanowe lub pochodnej polisacharydu, lub polimeru syntetycznego zawierającego grupę sulfonianową.

Korzystnie, polisacharyd zawierający grupę siarczanową lub pochodną polisacharydu wybiera się z siarczanu celulozy, siarczanu octanu celulozy, siarczanu karboksymetylocelulozy, siarczanu dekstranu lub siarczanu skrobi, a polimer syntetyczny zawierający grupę sulfonianowąjest sulfonianem polistyrenu.

Korzystnie, w sposobie tym stosuje się kąpiel strąceniową, która zawiera roztwór wodny polimeru z czwartorzędowymi grupami amoniowymi.

Korzystnie, jako polimer z czwartorzędowymi grupami amoniowymi stosuje się polidimetylodiallil amoniowy lub poliwinylobenzylotrimetyl amoniowy.

Korzystnie, komórki zawiesza się w roztworze wodnym siarczanu celulozy sodu i wprowadza się do kąpieli strąceniowej zawierającej roztwór wodny chlorku polidimetylodiallilu amoniowego.

Korzystnie, stosuje się roztwór wodny siarczanu celulozy, który złożony jest z 0,5-50%, a korzystnie z 2-5% siarczanu celulozy sodu oraz z 2-10%, a korzystnie z 5% płodowej surowicy cielęcej w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.

Korzystnie, stosuje się roztwór wodny w kąpieli strąceniowej, który złożony jest z 0,5-50%, korzystnie z 2-10%, a najkorzystniej z 3% chlorku polidimetylodiallilu amoniowego w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.

Zgodnie z wynalazkiem kapsułka otaczająca linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa i zawierająca półprzepuszczalną błonę z farmaceutycznie dopuszczalnego polimeru tworzącego porowatą ściankę mającą wielkość porów pozwalającą na uwalnianie zasadniczo wszystkich cząsteczek retrowirusa produkowanych przez tę linię komórkową, znajduje zastosowanie w leczeniu choroby nowotworowej lub związanej z nią innej choroby lub zaburzenia.

Korzystnie, otoczone kapsułką komórki przeznaczone są do wstrzykiwania i/lub implantowania do docelowych narządów/komórek i/lub w pobliżu tych docelowych narządów/komórek.

Korzystnie, docelowe narządy/komórki są tkanką nowotworową.

Korzystnie, docelowymi narządami/komórkami są gruczoł mleczny, trzustka lub mięśnie gładkie otaczające tętnice.

Ponadto, kapsułki otaczające linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa i zawierającej półprzepuszczalną błonę z farmaceutycznie dopuszczalnego polimeru tworzącego porowatą ściankę mającą wielkość porów pozwalającą na uwalnianie zasadniczo wszystkich cząsteczek retrowirusa produkowanych przez tę linię komórkową, są przeznaczone do wytwarzania leku do leczenia choroby nowotworowej lub związanej z nią innej choroby lub zaburzenia.

Natomiast sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej obejmujący mieszanie składnika aktywnego z fizjologicznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub rozcieńczalnikiem, charakteryzuje się tym, że jako składnik aktywny stosuje się kapsułkę otaczającą linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa zawieraj ącą półprzepuszczalną błonę z farmaceutycznie dopuszczalnego polimeru tworzącego porowatą, ściankę mającą wielkość porów pozwalającą na uwalnianie zasadniczo wszystkich cząsteczek retrowirusa produkowanych przez tę linię komórkową.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, której porowata ścianka zawiera kompleks polielektrolitu utworzony z polielektrolitów o przeciwnych ładunkach.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, której porowata ścianka zawiera kompleks polielektrolitu złożony z polisacharydów zawierających grupy siarczanowe lub pochodnych polisacharydów lub polimerów syntetycznych zawierających grupy sulfonianowe i polimerów z czwartorzędowymi grupami amoniowymi.

Korzystnie, polisacharydy zawierające grupy siarczanowe lub pochodne polisacharydów wybiera się z siarczanu celulozy, siarczanu octanu celulozy, siarczanu karboksymetylocelulo185 338 zy, siarczanu dekstranu lub siarczanu skrobi, a polimer syntetyczny zawierający grupę sulfonianowąjest sulfonianem polistyrenu.

Korzystnie, jako polimer z czwartorzędowymi grupami amoniowymi stosuje się polidimetylodiallil amoniowy lub poliwinylobenzylotrimetyl amoniowy.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, której porowata ścianka zawiera kompleks złożony z siarczanu celulozy i polidimetylodiallilu amoniowego.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, mającą postać mikrokapsułek o średnicy w zakresie od 0,01 do 5 mm, a korzystnie od 0,1 do 1 mm.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, która zawiera gąbczastą osłonkę tworzącą wnętrze kapsułki otoczoną przez ściankę kapsułki zawierającą pory, przy czym gąbczasta osłonka wypełniona jest komórkami.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, której wielkość powierzchniowych porów porowatej ścianki wynosi od 80 do 150 nm, a korzystnie od 100 do 120 nm.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, w której cząsteczka retrowirusa produkowana przez linię komórek pakujących zawiera genom wirusa retrowirusowego.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, w której otoczona linia komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa jest transfekowana wektorem ekspresyjnym, przy czym wektor ekspresyjny niesie konstrukt wektora retrowirusowego zdolny do zakażania i sterowania ekspresją w komórkach docelowych jednej lub więcej sekwencji kodujących niesionych przez ten konstrukt wektora retrowirusowego, a linia komórek pakujących przenosi co najmniej jeden wektor ekspresyjny niosący geny kodujące białka wymagane do pakowania konstruktu wektora retrowirusowego.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, w której co najmniej jedna z sekwencji kodujących koduje heterologiczne peptydy wybrane z genów markerowych, genów terapeutycznych, genów antywirusowych, genów antynowotworowych i genów cytokin.

Korzystnie, gen markerowy wybiera się z grupy złożonej z genów markerowych, które kodują takie białka jak β-galaktozydaza, neomycyna, dehydrogenaza alkoholowa, puromycyna, transferaza fosforybozylowa hipoksantyny (HPRT), higromycyna i wydzielana fosfataza alkaliczna, a gen terapeutyczny wybiera się z genów, które kodują białka takie jak kinaza tymidynowa wirusa opryszczki (Herpes Simplex), deaminaza cytozynowa, transferaza fosforybozylowa guanozyny (gpt), cytochrom P 450, geny regulujące cykl komórkowy takie jak SDI, geny supresorów nowotworów, które kodują białka takie jak p53, geny antyproliferacyjne, które kodują białka takie jak melityna, cykropina lub cytokiny takie jak IL-2.

Korzystnie, linię komórek pakujących wybiera się z psi-2, psi-crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 i GP+envAM-12.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, w której wektor retrowirusowy jest defektywny pod względem replikacji.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, w której wektor retrowirusowy zawiera region 5' LTR o budowie U3-R-U5, jedną lub więcej sekwencji wybranych z sekwencji kodujących i niekodujących, i region 3' LTR zawierający całkowicie lub częściowo wydeletowany region U3, przy czym ten wydeletowany region U3 zastąpiony jest przez sekwencję polilinkera i element regulatorowy lub promotor, po któym następuje region R i U5.

Korzystnie, stosuje się kapsułkę, w której wektorem ekspresyjnym jest pBAG, pLXSN, pl25LX, pLX2B1 lub pc3/2B1 lub jego pochodne.

Z kolei kompozycja farmaceutyczna zawierająca składnik aktywny i fizjologicznie dopuszczalny nośnik i/lub rozcieńczalnik, charakteryzuje się tym, że jako składnik aktywny zawiera kapsułkę otaczającą linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, która zawiera półprzepuszczalną błonę z farmaceutycznie dopuszczalnego polimeru tworzącego porowatą ściankę mającą wielkość porów pozwalającą na uwalnianie zasadniczo wszystkich cząsteczek retrowirusa produkowanych przez tę linię komórkową.

Korzystnie, porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks polielektrolitu utworzony z polielektrolitów o przeciwnych ładunkach.

Korzystnie, porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks polielektrolitu złożony z polisacharydów zawierających grupy siarczanowe lub pochodnych polisacharydów lub polimerów

185 338 syntetycznych zawierających grupy sulfonianowe i polimerów z czwartorzędowymi grupami amoniowymi.

Korzystnie, polisacharydy zawierające grupy siarczanowe lub pochodne polisacharydów wybrane są z siarczanu celulozy, siarczanu octanu celulozy, siarczanu karboksymetylocelulozy, siarczanu dekstranu lub siarczanu skrobi, a polimer syntetyczny zawierający grupę sulfonianowąjest sulfonianem polistyrenu.

Korzystnie, polimerem z czwartorzędowymi grupami amoniowymi jest polidimetylodiallil amoniowy lub poliwinylobenzylotrimetyl amoniowy.

Korzystnie, porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks złożony z siarczanu celulozy i polidimetylodiallilu amoniowego.

Korzystnie, kapsułka ma postać mikrokapsułek o średnicy w zakresie od 0,01 do 5 mm, a korzystnie od 0,1 do 1 mm.

Korzystnie, kapsułka zawiera gąbczastą osłonkę tworzącą wnętrze kapsułki otoczoną przez ściankę kapsułki zawierającą pory, przy czym gąbczasta osłonka wypełniona jest komórkami.

Korzystnie, wielkość powierzchniowych porów porowatej ścianki kapsułki wynosi od 80 do 150 nm, a korzystnie od 100 do 120 nm.

Korzystnie, cząsteczka retrowirusa produkowana przez linię komórek pakujących zawiera genom wirusa retrowirusowego.

Korzystnie, otoczona kapsułką linia komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa jest transfekowana wektorem ekspresyjnym, przy czym wektor ekspresyjny niesie konstrukt wektora retrowirusowego zdolny do zakażania i sterowania ekspresją w komórkach docelowych jednej lub więcej sekwencji kodujących niesionych przez ten konstrukt wektora retrowirusowego, a linia komórek pakujących przenosi co najmniej jeden wektor ekspresyjny niosący geny kodujące białka wymagane do pakowania konstruktu wektora retrowirusowego.

Korzystnie, co najmniej jedna z sekwencji kodujących koduje heterologiczne peptydy wybrane z genów markerowych, genów terapeutycznych, genów antywirusowych, genów antynowotworowych i genów cytokin.

Korzystnie, gen markerowy wybrany jest z grupy złożonej z genów markerowych, które kodują takie białka jak β-galaktozydaza, neomycyna, dehydrogenaza alkoholowa, puromycyna, transferaza fosforybozylowa hipoksantyny (HPRT), higromycyna i wydzielana fosfataza alkaliczna, a gen terapeutyczny wybrany jest z genów, które kodują białka takie jak kinaza tymidynowa wirusa opryszczki (Herpes Simplex), deaminaza cytozynowa, transferaza fosforybozylowa guanozyny (gpt), cytochrom P 450, geny regulujące cykl komórkowy takie jak SDI, geny supresorów nowotworów, które kodują białka takie jak p53, geny antyproliferacyjne, które kodują białka takie jak melityna, cykropina lub cytokiny takie jak 11.-2.

Korzystnie, linia komórek pakujących wybrana jest z psi-2, psi-crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 i GP+envAM-12.

Korzystnie, wektor retrowirusowy jest defektywny pod względem replikacji.

Korzystnie, wektor retrowirusowy zawiera region 5' LTR o budowie U3-R-U5, jedną lub więcej sekwencji wybranych z sekwencji kodujących i niekodujących, i region 3' LTR zawierający całkowicie lub częściowo wydeletowany region U3, przy czym ten wydeletowany region U3 zastąpiony jest przez sekwencję polilinkera i element regulatorowy lub promotor, po którym następuje region R i U5.

Korzystnie, wektorem ekspresyjnym jest pBAG, pLXSN, pl25LX, pLX2Bl lub pc3/2Bl lub jego pochodne.

Korzystnie, kompozycja ma postać odpowiednią do wstrzyknięcia i/lub implantacji do docelowych narządów/komórek i/lub w pobliżu tych narządów/komórek.

Korzystnie, docelowe narządy/komórki są tkanką nowotworową.

Korzystnie, docelowymi narządami/komórkami są gruczoł mleczny, trzustka lub mięśnie gładkie otaczające tętnice.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, zapewniono otoczone kapsułką komórki produkujące cząsteczki retrowirusa, które to komórki umożliwią uwalnianie cząsteczek retrowirusa,

185 338 produkowanych przez te komórki w kapsułkach, i jednocześnie nie wywołają istotnej odpowiedzi odpornościowej lub zapalnej po implantacji do organizmu gospodarza.

Otoczone kapsułkami komórki, według wynalazku, mogą być przygotowane przez zawieszenie komórek produkujących cząsteczki wirusa w wodnym roztworze polielektrolitów (na przykład, wybranych spośród polisacharydów zawierających grupy siarczanowe lub pochodnych polisacharydów lub spośród polimerów syntetycznych zawierających grupy sulfonianowe), po czym zawiesina w postaci wstępnie uformowanych cząsteczek umieszczana jest w płynie inkubacyjnym do precypitacji, zawierającym wodny roztwór polielektrolitów o przeciwnych ładunkach (takich jak, na przykład, polimer z czwartorzędowymi grupami amoniowymi).

Polisacharydy zawierające grupy siarczanowe lub pochodne polisacharydów obejmują siarczan celulozy, siarczan octanu celulozy, siarczan karboksymetylocelulozy, siarczan dekstranu lub siarczan skrobi w postaci soli, zwłaszcza soli sodowych. Polimerem syntetycznym zawierającym grupy sulfonianowe może być sól sulfonianowa polistyrenu, korzystnie sól sodowa.

Polimery zawierające czwartorzędowe grupy amonowe obejmują polidimetylodiallil amoniowy lub poliwinylobenzyl-trimetyloamoniowy, w postaci soli, korzystnie soli chlorkowych.

W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, komórki produkujące cząsteczki retrowirusa otoczone są kapsułkami zawierającymi kompleks utworzony z siarczanu celulozy i polidimetyłodiallilu amoniowego.

Takie kapsułki są korzystnie otrzymane przez zawieszenie komórek produkujących cząsteczki wirusa w roztworze wodnym zawierającym 0,5-50%, korzystnie 2-5% siarczanu celulozy sodu i 5% płodowej surowicy cielęcej, opcjonalnie, w roztworze buforowym. Zawiesina jest następnie wkraplana poprzez system dozujący (na przykład, system air-jet lub system piezoelektryczny), przy ciągłym mieszaniu, do płynu inkubacyjnego do precypitacji, zawierającego 0,5-50%, korzystnie 2-10%, lub najkorzystniej około 3% chlorku polidimetyłodiallilu amoniowego, opcjonalnie, w roztworze buforowym. Formowanie kapsułek następuje w ciągu milisekund i kapsułki zawierające komórki trzymane są w płynie inkubacyjnym w celu precypitacji w czasie od 30 sekund do 5 minut i następnie płukane. Szybkość tego sposobu zapewnia to, że komórkom jest oszczędzony szok podczas całej procedury (Stange i wsp., 1993).

Kapsułki, według wynalazku, mają różne średnice, w zakresie od 0,01 do 5 mm, a korzystnie od 0,1 do 1 mm. Kapsułki można tak tworzyć, aby zawierały różną liczbę komórek. Stosując proces otaczania komórek kapsułką, zgodnie z wynalazkiem, do 10¹⁰, a korzystnie 10⁵-10⁷ komórek produkujących cząsteczki wirusa może być otoczonych kapsułką z kompleksu polielektrolitu.

Kapsułki utworzone z siarczanu celulozy i polidimetyłodiallilu amoniowego mają doskonałe własności mechaniczne i mogą być produkowane w wymaganej wielkości i wielkości porów. Wielkość porów mieści się w zakresie od 80 do 150 nm, a korzystnie w zakresie od 100 do 120 nm.

Komórki otoczone kapsułką mogą być hodowane w normalnym środowisku hodowlanym (którego właściwości zależą od komórek otoczonych kapsułką), w standardowych warunkach wilgotności, temperatury i stężenia CO?. Podczas hodowli uwalnianie cząsteczek wirusa z kapsułek do środowiska hodowlanego może być zademonstrowane przy użyciu zarówno reakcji RT-PCR jak i przez przeniesienie supernatantu pozbawionego komórek (filtracja przez 0,45 pm pory) do komórek docelowych i wykazanie infekcji wirusowej w teście na aktywność białek markerowych, kodowanych przez geny przenoszone przez konstrukt wektora wirusowego, który jest zawarty w cząsteczce wirusa. Jeśli genem markerowym przenoszonym przez wektor wirusowy jest gen dający oporność na specyficzne składniki komórek docelowych, to miano wirusa produkowanego przez system może zostać sprawdzone.

Po odpowiednim okresie hodowli (zwykle nie mniej niż 1 godzina i nie więcej niż dni,) kapsułki zawierające komórki mogą być chirurgicznie implantowane do różnych obszarów ciała zarówno bezpośrednio, jak i poprzez iniekcję przy użyciu strzykawki.

Cząsteczki wirusa produkowane przez otoczone kapsułką komórki, zgodnie z wynalazkiem, mogą opierać się na każdym wirusie użytecznym w terapii genowej, w tym nieograni14

185 338 czająco na adenowirusach, wirusach związanych z adenowirusami, wirusach herpes czy retrowirusach (Giinzburg and Salmons, 1995).

W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, komórkami otoczonymi kapsułkami jest linia komórek pakujących produkujących cząstki retrowirusa zawierające genom konstruktu wektora retrowirusowego przenoszącego geny markerowe i/lub terapeutyczne.

Systemy wektora retrowirusowego składają się z dwóch komponent:

1) Wektora ekspresji (wektor plazmidowy) przenoszącego konstrukt wektora retrowirusowego, który jest zmodyfikowanym retrowirusem, w którym geny kodujące białka zostały zastąpione przez geny terapeutyczne, opcjonalnie zawierające geny markerowe w celu przeniesienia do komórki docelowej. Jako, że zastąpienie genów kodujących białka wirusowe efektywnie uszkadza wirusa, to musi być to naprawione przez drugą komponentę systemu, która dostarcza brakujące białka wirusa do zmodyfikowanego retrowirusa.

Drugą komponentą jest:

2) Linia komórkowa, która produkuje duże ilości białek wirusowych, chociaż brakuje jej możliwości produkowania wirusa zdolnego do replikacji. Ta linia komórek znana jest jako linia komórek pakujących i zawiera linię komórek transfekowanych plazmidem przenoszącym geny, umożliwiające opakowanie zmodyfikowanego genomu retrowirusa. Te plazmidy kierują syntezą niezbędnych białek wirusowych, wymaganych dla produkcji wirusa.

Aby otrzymać opakowany wektor retrowirusa, wektor plazmidowy transfekowany jest do linii komórek pakujących. W tych warunkach zmodyfikowany genom retrowirusowy zawierający wprowadzone geny terapeutyczne i opcjonalne geny markerowe jest transkrybowany z wektora plazmidowego i tak otrzymany, zmodyfikowany genom retrowirusa pakowany jest do cząsteczek retrowirusa. Komórka zainfekowana taką wirusową cząsteczką nie może produkować cząsteczek wirusa, gdyż nie ma w nich żadnych białek wirusowych. Jednak jest obecny konstrukt wektora retrowirusowego przenoszący geny terapeutyczne i markerowe, i geny te mogą ulegać ekspresji w zainfekowanych komórkach.

Publikacje WO 94/29437, WO 89/11539 i WO 96/07748 opisują różne rodzaje systemów wektora retrowirusowego użyteczne dla celów niniejszego wynalazku.

Cząsteczki wirusa produkowane przez otoczone kapsułkami komórki, według wynalazku, mogą być tak skonstruowane, że zawierają genom wektora wirusowego przenoszącego geny kodujące geny markerowe i/lub geny terapeutyczne.

Geny markerowe lub terapeutyczne przenoszone przez wektor wirusowy mogą być, na przykład, genami które kodują takie białka, jak β-galaktozydaza, neomycyna, dehydrogenaza alkoholowa, puromycyna, transferaza fosforybozylowa hipoksantyny (HPRT), higromycyna i wydzielana fosfataza alkaliczna lub geny terapeutyczne, które kodują takie białka, jak kinaza tymidynowa wirusa opryszczki (Herpes Simplex) deaminaza cytozynowa, transferaza fosforybozylowa guanozyny (gpt), cytochrom P 450, geny regulujące cykl komórkowy takie jak SDl, geny supresorów nowotworów, które kodują białka takie jak p53, geny antyproliferacyjne, które kodująbiałka takie jak melityna, cykropina, lub cytokiny, takie, jak lL-2.

W szczególnym przykładzie wykonania, wynalazek dotyczy użycia otoczonych kapsułką komórek, zgodnie z wynalazkiem, w leczeniu nowotworów.

Wiele złośliwych nowotworów nie poddaje się dobrze chemioterapii. Antyrakowe leki używane w leczeniu nowotworów są w większości przypadków stosowane układowo i w związku z tym rozprzestrzeniają się w całym ciele pacjenta. Stosowanie wysokich dawek układowych takich leków, wymagane w leczeniu raka, często związane jest z dotkliwymi efektami ubocznymi u pacjenta. Jedna ze strategii, dzięki której problemy wysokiego układowego stężenia leków anty-rakowych mogłyby być pokonane, polega na bezpośrednim podaniu lub aktywacji leku bezpośrednio do, lub w pobliżu danego nowotworu. Mogłoby to być osiągnięte dzięki implantacji otoczonych kapsułkami komórek, zgodnie z wynalazkiem, produkujących cząsteczki wirusa zawierające genom zaprojektowanego wirusa, szczególnie wektora retrowirusowego, przenoszącego geny kodujące leki antyrakowe, na przykład, enzym aktywujący, mogący przekształcić prolek w czynnik cytotoksyczny, zarówno w komórkach nowotworu albo w ich pobliżu.

185 338

Zgodnie z jednym przykładem wykonania wynalazku, dostarczane są otoczone kapsułkami komórki produkujące cząsteczki retrowirusa, zawierające genom wektora retro wirusowego, przenoszącego enzymy istotne dla nowotworu, takie jak cytochrom P450 lub geny samobójcze, takie jak, ale nieograniczająco, dla kinazy tymidynowej, które przekształcają nietoksyczne leki na jeden lub więcej toksycznych metabolitów. Takie otoczone kapsułkami komórki, zgodnie z wynalazkiem, mogą być zastosowane w leczeniu raka poprzez implantację kapsułek do, lub w pobliżu nowotworu, na przykład, nowotworu trzustki lub gruczołu sutkowego.

Dodatkowe cele mogą być uzyskane poprzez zastosowanie specyficznych elementów regulacyjnych i promotorów komórek docelowych w celu kierowania ekspresją genów terapeutycznych związanych ze specyficznym typem komórki.

Takie specyficzne elementy regulacyjne i promotory komórek docelowych zawierają, na przykład, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki, w tym elementy regulacyjne i promotory dla anhydrazy węglowej iI i (β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla gruczołów sutkowych obejmujące kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV nadające reaktywność na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoły sutkowe. Inne promotory zawierają, na przykład, promotory CD4, CD34, IL-2. Wymienione elementy regulacyjne i promotory regulują korzystnie ekspresję wymienionego wektora retrowirusowego.

Promotory indukcyjne, takie jak promotory indukowane naświetlaniem, na przykład, promotor cząsteczki-1 międzykomórkowej adhezji (ICAM-1), promotor receptora dla epidermalnego czynnika wzrostu i promotor czynnika nekrozy nowotworu mogą być również zastosowane.

Przykład 1: Lipofekcja PA317 przez pBAG i izolacja opornych komórek G418

Amfotropowe komórki pakujące PA317 pochodne linii NIH3T3 (Miller and Buttimore, 1986) były hodowane w medium Dulbecco modyfikowanym przez Eagle (DMEM), zawierającym 10% surowicę z cielęcego płodu. Komórki zostały umieszczone w 10 cm płytkach hodowlanych z gęstością 3x10 ’ jeden dzień przed lipofekcją i następnie zostały lipofekowane 2 fig wektora pBAG (Price i wsp., 1987), przenoszącego wektor retrowirusa opartego na MLV (wirus białaczki myszy), przy użyciu zestawu lipofektaminy z GIBCO/BRL, zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki zostały następnie rozrzedzone w stosunku 1:10 i hodowane w typowym środowisku zawierającym dodatkowo 400 pg/ml G418 (GIBCO/BRL). Po 14 dniach oporne kolonie G418 zostały połączone.

Przykład 2: Otaczanie komórek mikrokapsułkami

10⁷ komórek zostało zawieszonych w 1 ml roztworu buforowanej soli, zawierającej 2-5% siarczanu celulozy sodu i 5% płodowej surowicy cielęcej, następnie zawiesina została wkroplona przy użyciu systemu dozującego (air-jet system) do płynu intubacyjnego do precypitacji zawierającego 2-3% polidimetylodiallil amoniowy w buforowane ‘soli. Formowanie kapsułek pojawiło się w ciągu milisekund, po czym nastąpiło dalsze tworzenie się wewnętrznej, bardziej porowatej warstwy dla mechanicznego zabezpieczenia, zawierającej przede wszystkim siarczan celulozy. Kapsułki zawierające komórki były trzymane w płynie inkubacyjnym do precypitacji w czasie od 30 sekund do 5 minut, po czym były płukane w DMEM (Stange i wsp.. 1993). Partie uzyskane według różnych parametrów, jak opisano wyżej, to znaczy stężenie siarczanu celulozy sodu, przepływ w systemie air-jet oraz czas trwania inkubacji wykorzystane zostały do celów badawczych. Reprezentatywne przykłady warunków są następujące: 2,5% siarczan celulozy sodu, 2% polidimetylodiallil amoniowy i 1 minuta inkubacji, lub 1,5% siarczan celulozy sodu, 2% polidimetylodiallil amoniowy i 0,5 minuty inkubacji, lub 3% siarczan celulozy sodu, 3% polidimetylodiallil amoniowy i 2 minuty inkubacji. Dokładne warunki zostały wyznaczone biorąc również pod uwagę dokładne rozmiary pożądanych kapsułek, grubość ściany kapsułki jak i inne parametry.

185 338

Przykład 3: Implantacja mikrokapsułek do gruczołu sutkowego myszy

Mikrokapsułki umieszczone zostały w gruczołach sutkowych 2-miesięcznej samicy myszy BALB/c poprzez zabieg chirurgiczny typu „key hole”, a miejsce wprowadzenia zamknięto szwem. Do każdego operowanego miejsca wprowadzono do 6 kapsułek o średnicy od 0,5 do mm.

Badania in vitro uwalniania wirusa z mikrokapsułek, struktura mikrokapsułek i wpływ implantacji kapsułek na immunokompetentne myszy zostały przeprowadzone przy zastosowaniu następujących testów:

A) Aktywność β-galaktozydazy

Wykrycie zainfekowanych komórek przez barwienie histochemiczne przeprowadzono, jak opisano to wcześniej (Cepko, 1989). Komórki, kapsułki lub skrawki tkankowe płukane były oziębionym PBS i następnie utrwalane 2% roztworem paraformaldehydu w czasie od 20 minut do 24 godzin, zależnie od grubości próbki. Po intensywnym płukaniu w PBS, komórki, kapsułki lub skrawki tkanek były inkubowane w roztworze zawierającym substrat X-gal (20 mM K₃FeCN6, 20 mM K4FeCN6x3H₂O, 2 mM MgCL i 1mg/ml X-gal) przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37°C.

B) Infekcja

4x104 komórek docelowych umieszczonych zostało w 6-dołkowych płytkach hodowlanych 6 godzin przed infekcją. Kapsułki zawierające komórki produkujące wirusa umieszczone zostały na komórkach i do medium dodano polibren (8 pg/ml). Cztery godziny później medium zostało zmienione w celu usunięcia resztek polibrenu. Pięć dni później część dołków została zabarwiona na aktywność β-galaktozydazy, jak opisano wyżej, inne były trypsynizowane w większych płytkach do hodowli tkankowych i hodowane w medium zawierającym 400 pg/ml G418. 16 dni później zostały wykryte oporne kolonie G418.

C) Analiza RT-PCR

Cząsteczki wirusa z 5 ml supematantu medium hodowlanego zostały osadzone w wyniku ultrawirowania (240,000xg, 1 godzina, 4°C). Osad został ponownie zawieszony w buforze lizującym (1% Triton-100, 0,5% dezoksycholan sodu, 0,1% dodecylosiarczan sodu, PBS) i RNA zossaio WA^y-e^-Sl^r^ałh^o^watne w fenolu, po czym nastąpiła precypiiacja w damom jtak opisano wcześniej (Salmons i wsp., 1986). RNA było następnie odwrotnie transkrybowane do DNA, przy użyciu zestawu Ready-To-Go T-primed first-strand (Pharmacia). Amplifikacja techniką PCR została przeprowadzona przy użyciu primerów ulokowanych we fragmentach env i R BAG wektora LTR pochodnego z MLV (fig. 2A). Amplifikacja techniką PCR została przeprowadzona w 100 pl mieszanin reakcyjnych, zawierających 500 mM KC1, 10 mM TrisHCl (pH 8,3), 1,5 mM MgC2, 0,01% (w/v) żelatynę i 100 pM każdego dNTP, 40 pM każdego primera i 2,5 jednostki polimerazy Taq (Perkin Elmer). Reakcje przeprowadzano w urządzeniu do PCR, Perkin Elmer Cetus Ther-ma cycler 9600 w następujących warunkach: 1 minuta w 94°C, 2 minuty w 53°C i 3 minuty w 72°C, przez 35 cykli. Produkty PCR zostały rozdzielone na 0,8% żelu agarozowym i następnie przeniesione do membran sondy Zeta (BIORAD) i hybrydyzowane, jak opisano wcześniej (Indraccolo i wsp., 1995), ze znakowanym 3²P 612bp fragmentem PCR genomu MLV, utworzonego przy użyciu takich samych primerów i pBAG jak wzorzec. Sekwencje specyficzne dla MLV były wizualizowane przy zastosowaniu systemu phosphoimaging BAS 1000.

D) Analiza PCR

Genomowe DNA (1 pg) było amplifikowane techniką PCR przy użyciu jednego primera zlokalizowanego w pozostałej env sekwencji wektora BAG i drugiego primera w obszarze polyoma plazmidu poza sekwencją wektora retrowirusowego. (fig. 3B). Reakcja PCR została przeprowadzona, jak opisano to wyżej, przy zastosowaniu następujących warunków reakcji: 1 minuta w 94°C, 2 minuty w 50°C i 3 minuty w 68°C, przez 35 cykli. Produkt reakcji PCR był hybrydyzowany ze znakowanym 3²P 1,5kb Xbal fragmentem dNa z pBAG, który jest specyficzny dla sekwencji polyoma.

F) Mikroskopia elektronowa

Preparaty do analizy w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM) i transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM) były płukane w PBS (pH 7,35) i wstępnie utrwalane

185 338 w 1% glutaraldehydzie w PBS przez 15 minut, a następnie utrwalane w 2% OsO4 przez 15 minut. Próbki były odwadniane w serii etanoli i następnie dzielone na dwie grupy: a) Próbki dla SEM były suszone w punkcie krytycznym ciekłego CO2 i napylane 1-3 nm platyną (Emscope SC 500; Ashford, England). Napylone skrawki były analizowane w 10 kV polu emisji skaningowego mikroskopu elektronowego (Joel JSM-6300F, Tokyo, Japan), z napięciem przyspieszającym 5-10 kV w systemie wtórnym, b) Próbki TEM zostały zatopione w Eponie. Ultracienkie skrawki były dwukrotnie barwione octanem uranylu i cytrynianem ołowiu, i oglądane w transmisyjnym mikroskopie elektronowym Zeiss EM-10C (Oberkochen, Germany).

Wyniki

Badania in vitro uwalniania wirusa z mikrokapsułek:

Zabarwienie komórek w mikrokapsułkach uzyskanych w przykładzie 2 z substratu X-gal, jak opisano w powyższym teście na aktywność (β-galaktozydazy, dla ujawnienia, że wykazują one ekspresję genu (β-galaktozydazy, kodowanego przez pBAG (fig. 1), jak to robią komórki produkujące wektor, nie otoczone kapsułką (nie pokazano).

W celu wykazania, że cząsteczki wirusa są uwalniane przez komórki w mikrokapsułkach do medium hodowli komórkowej, po różnych okresach czasu trwania hodowli zostało wypreparowane RNA z osadzonych wirionów pochodzących z supernatantów kapsułek. To RNA było analizowane przy pomocy reakcji RT-PCR, przy użyciu primerów komplementarnych do rejonów wirusowych env i R, jak to opisano wyżej, w rozdziale Analiza RT-PCR. Specyficzny dla MLV, wytworzony przy użyciu PCR fragment spodziewanej wielkości (612 bp) był obserwowany w mikrokapsularnym medium hodowlanym przez okres co najmniej 6 tygodni (fig. 2B, prążki 1-4), po czym analizę przerywano. Obecność tego fragmentu nie wynikała z kontaminacji DNA, gdyż wstępne potraktowanie wirusowego RNA przez RNA-zę przed reakcją RT-PCR nie spowodowało żadnego efektu (fig. 2C, 1-4). Produkcja i uwalnianie zainfekowanego wirusa z kapsułek może być zweryfikowane przez ich wspólną hodowlę z komórkami docelowymi, jak to opisano wyżej w rozdziale Infekcja, na przykład, komórkami NIH3T3 (Jainchill i wsp., l969) lub CRFK (Clandell i wsp .,1973). Po 4 dniach wspólnej hodowli, komórki docelowe, jak i pokryte kapsułami komórki pakujące były barwione na aktywność (β-galaktozydazy, jak to opisano powyżej. Pozostałe komórki docelowe zostały wyselekcjonowane do badania oporności względem G418. Wiele ze wspólnie hodowanych komórek NIH3T3 i CRFK wykazywało ekspresję genu β-gal. (fig. 3A).

Aby potwierdzić, że komórki docelowe nabyły gen (3-gal w wyniku infekcji, komórki docelowe były testowane przy użyciu reakcji PCR. Linia komórek pakujących BAG oparta jest na linii komórkowej pA317 (Miller i Buttimore, 1986) i przenosi gen kinazy tymidynowej Herpes Simplex Virus (HSV-TK), którego produkt powoduje konwersję gancyklowiru (GCV) w lek cytotoksyczny. Komórki docelowe NIH3T3 lub CFRK normalnie nie posiadają tego genu. W eksperymencie, w którym zademonstrowano, że wspólnie hodowane komórki docelowe NIH3T3 i CFRK wykazujące ekspresję β-gal, były oporne na GCV, co wskazuje, że nie nastąpiło uwolnienie komórek produkujących BAG, genomowy DNA został wyekstrahowany z komórek docelowych i zanalizowany na obecność sekwencji plazmidu poza wektorem, przy zastosowaniu reakcji PCR (Analiza pCr jak wyżej). Takie sekwencje są obecne w komórkach pakujących jako, że wektor BAG był lipofekowany do tych komórek w formie plazmidowego pBAG. Wirus produkowany przez komórki pakujące nie przenosi jednak tych sekwencji plazmidowych i stąd nie powinien być obecny w zainfekowanych komórkach docelowych. Figura 3B pokazuje, że żadne takie sekwencje plazmidowe, związane z infekcją tych komórek przez wektor BAG nie były wykryte.

Struktura mikrokapsułek

Przygotowano skrawki mikrokapsułek i ich struktura była analizowana w mikroskopie elektronowym. Wewnętrzna część kapsułki zawiera gąbczastą osłonę wypełnioną komórkami (fig. 4). Skaningowa mikroskopia elektronowa powierzchni mikrokapsułek ujawniła obecność porów, na tyle dużych, aby umożliwić przejście cząsteczek wektora retrowirusowego poza kapsułki, co unaocznia biały pasek, reprezentujący przeciętną średnicę cząsteczki wirusa (fig. 4).

185 338

Stabilność in vivo u immunokompetentnej myszy

W celu wyznaczenia stabilności mikrokapsułek in vivo i sprawdzenia, czy mikrokapsułki lub produkowane przez nie wirusy wywołują znaczącą odpowiedź odpornościową, mikrokapsułki zostały zaimplantowane do gruczołu sutkowego 2-miesięcznych samic myszy BALB/c. Myszy zostały uśmiercone w różnym czasie po implantacji, aby zbadać zarówno tempo zanikania mikrokapsułek jak i produkcję zainfekowanego wirusa. Zaimplantowane mikrokapsułki były wyraźnie widoczne, będąc zagłębione w tkance tłuszczowej sutka przez co najmniej 6 tygodni po implantacji. (fig. 5A). Co ciekawe, unaczynienie pojawiło się w pobliżu mikrokapsułek u wszystkich analizowanych zwierząt (fig. 5A), przypuszczalnie jako wynik produkcji czynników angiogenezy lub czynników wzrostu przez komórki pakujące.

Analiza skrawków, obejmujących mikrokapsułki i otaczającą tkankę sutka, potwierdziła, że naczynia krwionośne można było znaleźć w bezpośrednim sąsiedztwie kapsułek (fig. 5B). Skrawki te ujawniły również warstwę tkanki łącznej umiejscowionej między mikrokapsułką a tkanką sutka. Nie stwierdzono znaczącej odpowiedzi zapalnej lub odpornościowej skierowanej przeciwko mikrokapsułkom lub komórkom produkującym wirusa w nich zawartego.

W celu wykazania, że cząsteczki zainfekowanego wektora retrowirusowego były uwalniane z kapsułek i zainfekowały otaczającąje tkankę sutka, część skrawków była analizowana na ekspresję β-gal przez barwienie X-gal. Komórki wykazujące ekspresję genu β-gal były wyraźnie widoczne na zewnątrz mikrokapsułek (fig.SC).

Przykład 4

Ten przykład opisuje sposób skonstruowania wektora retrowirusowego, kierującego ekspresją, który zawiera gen dla szczurzego cytochromu P450 2B1, służącego do wewnątrznowotworowej infekcji.

Wektor pLX2B1, pokazany na fig. 6, skonstruowany został przez ligację fragmentów, uzyskanych z plazmidu pLX125 i pSW1 (Kodzie i wsp., 1991). Plazmid pLX125 zlinearyzowany został za pomocą Hpal i uzyskane tępe końce zostały zdefosforylozowane przy użyciu cielęcej fosfatazy jelitowej. DNA zostało oczyszczone przez rozdzielenie na 1% żelu agarozowym, wycięte i spreparowane przy zastosowaniu protokołu Qiaquick (Qiagen). Po precypitacji w etanolu DNA zostało ponownie zawieszone w wodzie. Wektor pSWl do klonowania był cięty za pomocą Smali i Hincll, aby otrzymać dwa tępo zakończone fragmenty. Mieszanina trawiąca została rozdzielona na 1%o żelu agarozowym. Krótszy fragment (1,5 kb), zawierający cDNA szczurzego cytochromu P450 2B1 (Fuji-Kuriyama i wsp., 1982), został wycięty i wyeluowany przy wykorzystaniu protokołu ekstrakcji DNA Qiaquick, sprecypitowany w etanolu i ponownie zawieszony w wodzie.

7,6 fMoli wektora pLX125 i 24 fMoli fragmentu wektora pSW1, ciętego przez Smal/Hindll, były razem wymieszane i ligowane przez 3 dni w 12°C przy użyciu ligazy T4 (Boehringer). Ligaza była inaktywowana w 65°C przez 10 minut, po czym DNA było precypitowane w butanolu, w 10-krotnej objętości butanolu. Sprecypitowane DNA zostało ponownie zawieszone w wodzie i elektroporowane do bakterii DH10B (Gibco). Wyselekcjonowano kolonie oporne na ampicylinę, DNA zostało wypreparowane i w celach testowych trawione za pomocą SspBI/SalL Bam/Hl/SsBL Pvul i BamHI. Ostateczny prawidłowy plazmid został oznaczony jako pLX2B1

Lipofekcja

Jeden dzień przed lipofekcją 3x10⁵ retrowirusowych komórek pakujących PA317 (Miller i Buttimore, 1986) zostało umieszczonych w 6 cm szalkach Petriego lub płytkach hodowlanych. W dniu infekcji 2 pg pazmidu pLX2Bl zostało wymieszane ze 100 pl medium bez surowicy. Jednocześnie 15 pl Lipofectaminy (Gibco BRL) zostało zmieszane ze 100 fil medium bez surowicy. Roztwór zawierający plazmid został dodany do mieszaniny Lipofectaminy i był inkubowany przez 45 minut. Po 35 minutach komórki zostały jeden raz wypłukane w 2 ml medium bez surowicy. 800 pl medium bez surowicy zostało dodane do mieszaniny lipofekcyjnej i otrzymany 1 ml podany został na przygotowane komórki. Po 6 godzinach dodano medium Eagles modyfikowane przez Dulbecco, zawierające 10% FCS. Następnego dnia komórki były trypsynizowane i rozrzedzone w stosunku 1:10, i umieszczone w 100 mm płytkach. Po 24 godzinach medium zostało zastąpione innym medium, zawierającym analog

185 338 neomycyny G418. Klony pojedynczych komórek lub populacji komórek zostały wyizolowane i przebadane na ekspresję genu cytochromu P450.

Otaczanie komórek kapsułkami

Uzyskane komórki pakujące produkujące wektor retrowirusowy są otaczane kapsułkami, jak to opisano wyżej w przykładzie 2.

Implantacja

Uzyskane kapsułki są wprowadzane poprzez zabieg chirurgiczny typu „key hole” w pobliżu, lub do transplantowanych lub spontanicznych nowotworów myszy BALB/c lub Gr. Około 6 kapsułek o średnicy 1 mm wprowadzanych jest do każdego operowanego miejsca. Operowane miejsce jest zamykane 1 szwem. Następnie myszom podaje się lokalnie cyklofosfamid lub izofosfamid, poprzez bezpośrednią iniekcję do nowotworu 100 pl roztworu 200 mg/ml lub układowe stężenia 130 mg CPA/kg wagi ciała dootrzewnowo, i 40-60 mg IFO/kg wagi ciała dootrzewnowo, przez maksymalny okres 10 tygodni. W tym czasie rozmiary nowotworu i jego makroskopowy wygląd są codziennie analizowane. Następnie myszy są uśmiercane, tkanka zawierająca kapsułki i nowotwór są usuwane i przygotowywane są skrawki histologiczne dla mikroskopii świetlnej i elektronowej. Skrawki te wyraźnie pokazały dobre wszczepienie kapsułek, unaczynienie i brak limfocytów, które wskazywałyby na komórkową odpowiedź odpornościową. Skrawki te nie ujawniły również śladów śmierci komórek czy nekrozy we wnętrzu kapsułki. Natomiast nowotwór wykazał nekrozę i wyraźne makroskopowo zmniejszenie wielkości w okresie testowym.

Przykład 5

Przykład ten opisuje konstrukcję linii stabilnych komórek, które wykazują ekspresję genu szczurzego cytochromu P450 2B1.

Wektor pc.3/2Bl, kierujący ekspresją, skonstruowany został przez ligację fragmentów uzyskanych z plazmidu pcDNA3 (Invitrogen) i pSW1 (Kedzie i wsp., 1991).

Plazmid pcDNA3 był cięty przez Xhol/Xbal i uzyskane fragmenty o lepkich końcach zostały zdefosforylowane przy użyciu cielęcej fosfatazy jelitowej. DNA fragmentu szkieletowego (backbone) zostało oczyszczone przez rozdzielenie na 1% żelu agarozowym, wycięte i spreparowane przy zastosowaniu protokołu Qiaquick (Qiagen). Po precypitacji w etanolu DNA zostało ponownie zawieszone w wodzie.

Wektor do klonowania pSW1 był cięty przez Xhol i Xbal tak, aby otrzymać dwa fragmenty. Mieszanina trawiąca była rozdzielana na 1% żelu agarozowym.

Najkrótszy fragment (1,5 kb), zawierający cDNA szczurzego cytochromu P450 2B1 (Fuji-Kuriyama i wsp., 1982) został wycięty i wyeluowany przy zastosowaniu protokołu ekstrakcji DNA Qiaqiuck, a następnie precypitowany w etanolu i ponownie rozpuszczony w wodzie.8,3 fMoli szkieletowego fragmentu (backbone) pcDNA3 i 24,8 fMoli ciętego przez Xhol/Xbal fragmentu pSW1 zostały razem zmieszane i ligowane przez 1 dzień w 12°C przy użyciu ligazy T4 (Boehringer). Ligaza była inaktywowana w 65°C przez 10 minut i DNA było precypitowane w 10-ciokrotnej objętości butanolu. Sprecypitowane DNA było ponownie zawieszone w wodzie i elektroporowane do bakterii DH10B (Gibco). Wyselekcjonowano oporne na ampicylinę kolonie, DNA wypreparowano i cięto przy pomocy EcoRl, BamHI, EcoRV i Xhol. Finalny prawidłowy plazmid został oznaczony jako pc3/2Bl.

Lipofekcja

Przed dniem infekcji, 3xl0⁵ komórek NIH3T3 zostało umieszczonych w 35 mm płytkach. W dniu infekcji 2 pg plazmidu pc3/2B1 zostały zmieszane z 100 pl medium bez surowicy. Jednocześnie 15 pl Lipofectaminy zostało zmieszane ze 100 pl medium bez surowicy. Roztwór zawierający plazmidy dodany został do mieszaniny Lipofectaminy i był inkubowany przez 45 minut. Po 35 minutach komórki zostały raz przepłukane w 2 ml medium bez surowicy. 800 pl medium bez surowicy zostało dodane do mieszaniny lipofekcyjnej i otrzymany 1 ml został podany na przygotowane komórki. Po 6 godzinach dodany został 1 ml dMEm (Glutamax) z 10%o FCS. Następnego dnia komórki były trypsynizowane i 10-ciokrotnie rozrzedzone, oraz umieszczone w 100 mm płytkach. Po 24 godzinach medium zostało zastąpione medium z neomycyną. Po 14 dniach oporne na neomycynę klony były izolowane i testowane na obecność i aktywność wektora.

185 338

Kapsułki zawierające te komórki były produkowane, jak opisano w przykładzie 2, i implantowane do myszy w pobliżu nowotworu. Po leczeniu cyklofosfamidem lub izofosfamidem oceniano skuteczność leczenia jak to opisano powyżej.

Przedmiot wynalazku uwidoczniony został w przykładach wykonania na rysunku, na którym:

Figura 1 przedstawia barwienie histologiczne komórek PA317 pokrytych kapsułkami, stabilnie transfekowanych przez pBAG w celu zademonstrowania ekspresji genu β-galaktozydazy.

Figura 2 przedstawia analizę RT-PCR cząsteczek wirusa uwalnianych z kapsułek (2B; prążki 1-4: medium pobrane po 2, 3, 5 i 6 tygodniach hodowli). Medium z hodowli komórkowej komórek nie pokrytych kapsułami, produkujących wirus BAG zostało zastosowane jako kontrola pozytywna (prążek 5), medium z hodowli nietransfekowanych komórek PA317 (prążek 6) - jako kontrola negatywna. Nie obserwowano żadnego sygnału, gdy próbki wirusa były trawione przez RNA-zę przed przeprowadzeniem analizy RT-PCR, w celu upewnienia się, że zamplifikowany prążek pochodził z wirusowego RNA (2C; prążki 1-4), a wirusowe RNA wypreparowane z komórek produkujących wirus BAG, nie pokrytych kapsułkami, bez zastosowania RNA-zy, zostało użyte jako pozytywna kontrola w reakcji RT-PCR (prążek 7)

Figura 3 przedstawia wspólną hodowlę komórek pokrytych kapsułkami, produkującymi wirus, z komórkami NIH3T3.

(A) Komórki docelowe zostały umieszczone w dużym rozrzedzeniu, jeden dzień przed dodaniem komórek pakujących produkujących wektor retrowirusa i pokrytych kapsułkami. Zarówno komórki jak i kapsułki były barwione histologicznie na aktywność β-galaktozydazy kilkanaście dni później.

(B) W celu zweryfikowania, czy komórki docelowe wykazujące ekspresję genu β-galaktozydazy w A) pochodziły z infekcji, czy raczej z wycieku komórek produkujących wirusa, genomowe DNA zostało wyekstrahowane z komórek i przeprowadzono analizę PCR.

Figura 4 przedstawia obraz ze skaningowego mikroskopu elektronowego pokazujący powierzchnię kapsułki, w której podobne do porów struktury są wykrywalne przy dużym powiększeniu (x 75.000). Biały pasek reprezentuje 100 nm (średnica cząsteczki retrowirusa), wskazując, że te struktury mogą reprezentować pory, przez które wirus uwalniany jest z kapsułki.

Figura 5 przedstawia histologiczną analizę kapsułek implantowanych do gruczołu sutkowego myszy.

(A) Wygląd mikrokapsułek i unaczynienie w ich pobliżu w różnym czasie po implantacji (1-6 tygodni).

(B) Skrawek dla mikroskopii świetlnej, pokazujący przekrój przez kapsułkę po implantacji do gruczołu sutkowego myszy po czterech tygodniach (powiększenie x 133).

(C) Infekcja komórek sutkowych myszy po implantacji komórek PA317 produkujących wektor BAG i zawierających kapsułki.

Figura 6 przedstawia strukturę wektora pLX2Bl wykazującego ekspresję, zawierającego gen dla szczurzego cytochromu P450 2B1, który będzie kontrolowany przez promotor U3-MMTY po konwersji promotora.

185 338

Publikacje:

Cepko, C. (1989). Lineage analysis in the vertebrate nervous system by retrovirusmediated gene transfer. Meth. Neurosci. 1, 367-392.

Chang, P.L. (1995). Nonautologous somatic gene therapy. In Somatic Gene Therapy.

P.L. Chang, ed. (CRC Press, Boca Raton) str. 203-223.

Cometta, K., Moen, R.C., Culver, K., Morgan, R.A., Melachlin, J.R., Sturm, S., Selegue, J., London, W., Blaese, R.M., and Anderson, W.F. (1990) Amphotropic murine leukemia retrovirus is not an acute pathogen for primates. Hum. Gene Ther. 1, 15-30.

Crandelll, R.A., Fabricant, C.G., and Nelson-Rees, W.A. (1973). Development, characterization, and virus susceptibility of a feline (Felis catus) renal cell line (CRFK). In vitro 9, 176-185.

Culver, K.W, Ram, Z, Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfieid, E.H., and Baese, R.M. (1992). In vivo gene transfer with retroviral vector producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science 256, 1550-1552.

Deglon, N., Zum, A., Baetge, E., and Aebischer, P. (1995) Development of gene therapy for the treatment of neurodegenerative diseases; Parkinson disease, Alzheimer disease and amyotrophic lateral sclerosis therapy; połymer encapsulated neurotrophic-secreting cell intrathecal transplantation. Gene Ther. 2, 563.

Fuji-Kuryama, Y., Mizukami, Y., Kawajiri, K, Sogawa, K. and Muramutsu, M.:

Primary structure of a cytochrome P-450: Coding nucleotides sequence of phenobarbitalinducible cytochrome P-450 cDNA from rat liver. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982 May; 79: 2793-97

Gunzburg, W.H., Saller, R., and Salmons, B. (1995). Retroviral vectors directed to predefined cell types for gene therapy. Biologicals 23, 5-12.

Gunzburg, W.H. and Salmons, B. (1995) Virus vector design in gene therapy. Molecular Medicine Today, 1,410-417.

Hughes, M., Yassilakos, A., Andrews D.W., Hortelano, G., Belmont, J.W., and Chang, P.L. (1994). Delivery of a secretable adenosine deaminase through microcapsules a novel approach to somatic gene therapy. Hum. Gene Ther. 5, 1445-1455.

Indraccolo, S., Gunzburg, W.H., Leib-Mosch, C., Erfle, V., and Salmons, B. (1995). Identification of three human sequences with viral superantigen-specific primers. Mammalian Genome 6, 339-344.

Jainchill, J.L., Andeson, S.A., and Todaro, G.J. (1969). Murine sarcoma and leukaemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells. J. Virol. 4, 549-553.

Kedzie, KM; Balfour, CA; Escobar, GY; Grimm, SW; He, YA; Pepperl, DJ; Regan, JW; Stevens, JC; Halpert, JR: Molecular basis for a functionally unique cytochrome P450II81 variant, J. Biol. Chem. 1991 Nov 25; 266(33): 22515-21

Miller, A.D., and Buttimore, C. (1986). Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol. Celi. Biol. 6, 2895-2902.

Morgan, R.A., and Andersen, W.F. (1993). Human gene therapy. Ann. Rev. Bio-chem. 62, 191-217.

Price, J., Turner, D., and Cepko, C. (1987). Lineage analysis in the vertebrate nervous system by retrovirus-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 156-160.

Ram, Z., Culver, K.W., Walbridge, S., Blaese, R.M., and Oldfield, E.H. (1993). In situ retroviral-mediated gene transfer for the treatment of brain tumors in rats. Can-cerRes. 53, 83-88.

Salmons, B., Knedlitschek, G., Kennedy, N., Groner, B., and Ponta, H. (1986). The endogenous mouse mammary tumour virus locus Mtv-8 contains a defective envelope gene. Virus Res. 4,377-389.

Stange, J., Mitzner, S., Dautzenberg, H., Ramlow, W., Knippel, M., Steiner, M., Ernst B.,

Schmidt, R., and Klinkmann, H. (1993). Prolonged biochemical and morphological stability of encapsulated liver cells - a new method. Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech. 21,343-352.

Tai, I.T., and Sun, A.M. (1993). Microencapsulation of recombinant cells: a new delivery system for gene therapy. FASEB J. 7, 1061-1069.

185 338

Welsh, R.M., Cooper, N.R., Jensen, F.C., and Oldstone, M.B.A. (1975). Humań serum lyses RNA tumour viruses. Nature 257, 612-614.

Winn, S.R., Hammang, J.P., Emerich, D.F., Lee, A., Palmiter, R.D., and Baetge, E.E. (1994). Polymer encapsulated cells genetically modified to secrete human nerve growth promote the survival of axotomized septal cholinergic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2324-2328.

^kenv

U3 R

RNA

R U5

O-Gal_SV40pr. neo ori wirusowy

6463rrts 7075nts cDNA

3'GGGCACATAGGTTATTTGGGAG5

B

612 bp

i i

612 bp —......>·

FIG. 2

185 338

FIG. 3A

185 338 zintegrowane BAG po infekcji ^z\y ·χϊϊ$£ί5$ί:

rv/

a) 5TGTTGCTTCTATGCGGACCA 3

b) 5'CCGCGCTTATTAGCCTGTTA 3' en

FIG. 3B

185 338

Powierzchnia mikrokapsuły

x10000 x37000 x75000

FIG.4

185 338

tygodnie 5 tygodni 6 tygodni

185 338

FIG. 5B

185 338

FIG. 5C

185 338 spLUll

...Sspl

Ascl

PshAI \ SexAI ·. SspBI BstXI

Sali

FIG. 6

185 338

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (71)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kapsułka otaczająca linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, znamienna tym, że zawiera półprzepuszczalną błonę z farmaceutycznie dopuszczalnego polimeru tworzącego porowatą ściankę mającą wielkość porów pozwalającą na uwalnianie zasadniczo wszystkich cząsteczek retrowirusa produkowanych przez tę linię komórkową.
2. 2. Kapsułka według zastrz. 1, znamienna tym, że porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks polielektrolitu utworzony z polielektrolitów o przeciwnych ładunkach.
3. 3. Kapsułka według zastrz. 2, znamienna tym, że porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks polielektrolitu złożony z polisacharydów zawierających grupy siarczanowe lub pochodnych polisacharydów lub polimerów syntetycznych zawierających grupy sulfonianowe i polimerów z czwartorzędowymi grupami amoniowymi.
4. 4. Kapsułka według zastrz. 3, znamienna tym, że polisacharydy zawierające grupy siarczanowe lub pochodne polisacharydów wybrane są z siarczanu celulozy, siarczanu octanu celulozy, siarczanu karboksymetylocelulozy, siarczanu dekstranu lub siarczanu skrobi, a polimer syntetyczny zawierający grupę sulfonianowąjest sulfonianem polistyrenu.
5. 5. Kapsułka według zastrz. 3, znamienna tym, że polimerem z czwartorzędowymi grupami amoniowymi jest polidimetylodiallil amoniowy lub poliwinylobenzylotrimetyl amoniowy.
6. 6. Kapsułka według zastrz. 1, znamienna tym, że porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks złożony z siarczanu celulozy i polidimetylodiallilu amoniowego.
7. 7. Kapsułka według zastrz. 1, znamienna tym, że ma postać mikrokapsułek o średnicy w zakresie od 0,01 do 5 mm, a korzystnie od 0,1 do 1 mm.
8. 8. Kapsułka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera gąbczastą osłonkę tworzącą wnętrze kapsułki otoczoną przez ściankę kapsułki zawierającą pory, przy czym gąbczasta osłonka wypełniona jest komórkami.
9. 9. Kapsułka według zastrz. 1, znamienna tym, że wielkość powierzchniowych porów porowatej ścianki kapsułki wynosi od 80 do 150 nm, a korzystnie od 100 do 120 nm.
10. 10. Kapsułka według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka retrowirusa produkowana przez linię komórek pakujących zawiera genom wirusa retrowirusowego.
11. 11. Kapsułka według zastrz. 10, znamienna tym, że otoczona kapsułką linia komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa jest transfekowana wektorem ekspresyjnym, przy czym wektor ekspresyjny niesie konstrukt wektora retrowirusowego zdolny do zakażania i sterowania ekspresją w komórkach docelowych jednej lub więcej sekwencji kodujących niesionych przez ten konstrukt wektora retrowirusowego, a linia komórek pakujących przenosi co najmniej jeden wektor ekspresyjny niosący geny kodujące białka wymagane do pakowania konstruktu wektora retrowirusowego.
12. 12. Kapsułka według zastrz. 11, znamienna tym, że co najmniej jedna z sekwencji kodujących koduje heterologiczne peptydy wybrane z genów markerowych, genów terapeutycznych, genów antywirusowych, genów antynowotworowych i genów cytokin.
13. 13. Kapsułka według zastrz. 12, znamienna tym, że gen markerowy wybrany jest z grupy złożonej z genów markerowych, które kodują takie białka jak β-galaktozydaza, neomycyna, dehydrogenaza alkoholowa, puromycyna, transferaza fosforybozylowa hipoksantyny

    185 338 (HPRT), higromycyna i wydzielana fosfataza alkaliczna, a gen terapeutyczny wybrany jest z genów, które kodują białka takie jak kinaza tymidynowa wirusa opryszczki (Herpes Simplex), deaminaza cytozynowa, transferaza fosforybozylowa guanozyny (gpt), cytochrom P 450, geny regulujące cykl komórkowy takie jak SDI, geny supresorów nowotworów, które kodują białka takie jak p53, geny antyproliferacyjne, które kodują białka takie jak melityna, cykropina lub cytokiny takie jak IL-2.
14. 14. Kapsułka według zastrz. 11, znamienna tym, że linia komórek pakujących wybrana jest z psi-2, psi-crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 i GP+envAM-12.
15. 15. Kapsułka według zastrz. 11, znamienna tym, że wektor retrowirusowy jest defektywny pod względem replikacji.
16. 16. Kapsułka według zastrz. 15, znamienna tym, że wektor retrowirusowy zawiera region 5' LTR o budowie U3-R-U5, jedną lub więcej sekwencji wybranych z sekwencji kodujących i niekodujących, i region 3' LTR zawierający całkowicie lub częściowo wydeletowany region U3, przy czym ten wydeletowany region U3 zastąpiony jest przez sekwencję polilinkera i element regulatorowy lub promotor, po którym następuje region R i U5.
17. 17. Kapsułka według zastrz. 11, znamienna tym, że wektorem ekspresyjnym jest pBAG, pLXSN, pl25LX, pLX2Bl lub pc3/2Bl lub jego pochodne.
18. 18. Sposób otrzymywania kapsułki otaczającej linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, znamienny tym, że komórki pakujące zawiesza się w roztworze wodnym polielektrolitu, po czym zawiesinę w postaci wstępnie formowanych cząsteczek wprowadza się do kąpieli strąceniowej zawierającej roztwór wodny polielektrolitu o przeciwnym ładunku.
19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że tworzenie cząsteczek przeprowadza się przez natryskiwanie.
20. 20. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że komórki zawiesza się w roztworze wodnym polisacharydu zawierającego grupy siarczanowe lub pochodnej polisacharydu, lub polimeru syntetycznego zawierającego grupę sulfonianowi.
21. 21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że polisacharyd zawierający grupę siarczanową lub pochodną polisacharydu wybiera się z siarczanu celulozy, siarczanu octanu celulozy, siarczanu karboksymetylocelulozy, siarczanu dekstranu lub siarczanu skrobi, a polimer syntetyczny zawierający grupę sulfonianowąjest sulfonianem polistyrenu.
22. 22. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że stosuje się kąpiel strąceniową, która zawiera roztwór wodny polimeru z czwartorzędowymi grupami amoniowymi.
23. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako polimer z czwartorzędowymi grupami amoniowymi stosuje się polidimetylodiallil amoniowy lub poliwinylobenzylotrimetyl amoniowy.
24. 24. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że komórki zawiesza się w roztworze wodnym siarczanu celulozy sodu i wprowadza się do kąpieli strąceniowej zawierającej roztwór wodny chlorku polidimetylodiallilu amoniowego.
25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że stosuje się roztwór wodny siarczanu celulozy, który złożony jest z 0,5-50%, a korzystnie z 2-5% siarczanu celulozy sodu oraz z 2-10%, a korzystnie z 5% płodowej surowicy cielęcej w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.
26. 26. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że stosuje się roztwór wodny w kąpieli strąceniowej, który złożony jest z 0,5-50%, korzystnie z 2-10%, a najkorzystniej z 3% chlorku polidimetylodiallilu amoniowego w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.
27. 27. Kapsułka otaczająca linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa i zawierająca półprzepuszczalną błonę z farmaceutycznie dopuszczalnego polimeru tworzącego porowatą ściankę mającą wielkość porów pozwalającą na uwalnianie zasadniczo wszystkich cząsteczek retrowirusa produkowanych przez tę linię komórkową, do zastosowania w leczeniu choroby nowotworowej lub związanej z nią innej choroby lub zaburzenia.
28. 28. Kapsułka według zastrz. 27, znamienna tym, że otoczone nią komórki przeznaczone są do wstrzykiwania i/lub implantowania do docelowych narządów/komórek i/lub w pobliżu tych docelowych narządów/komórek.

    185 338
29. 29. Kapsułka według zastrz. 28, znamienna tym, że docelowe narządy/komórki są tkanką nowotworową.
30. 30. Kapsułka według zastrz. 28 albo 29, znamienna tym, że docelowymi narządami/komórkami są gruczoł mleczny, trzustka lub mięśnie gładkie otaczające tętnice.
31. 31. Zastosowanie kapsułki otaczającej linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa i zawierającej półprzepuszczalną błonę z farmaceutycznie dopuszczalnego polimeru tworzącego porowatą ściankę mającą wielkość porów pozwalającą na uwalnianie zasadniczo wszystkich cząsteczek retrowirusa produkowanych przez tę linię komórkową, do wytwarzania leku do leczenia choroby nowotworowej lub związanej z nią innej choroby lub zaburzenia.
32. 32. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że otoczone kapsułką komórki przeznaczone są do wstrzykiwania i/lub implantowania do docelowych narządów/komórek i/lub w pobliżu tych docelowych narządów/komórek.
33. 33. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że docelowe narządy/komórki są tkanką nowotworową.
34. 34. Zastosowanie według zastrz. 32 albo 33, znamienne tym, że docelowymi narządami/komórkami są gruczoł mleczny, trzustka lub mięśnie gładkie otaczające tętnice.
35. 35. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej obejmujący mieszanie składnika aktywnego z fizjologicznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub rozcieńczalnikiem, znamienny tym, że jako składnik aktywny stosuje się kapsułkę otaczającą linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa zawierającą półprzepuszczalną błonę z farmaceutycznie dopuszczalnego polimeru tworzącego porowatą ściankę mającą wielkość porów pozwalającą na uwalnianie zasadniczo wszystkich cząsteczek retrowirusa produkowanych przez tę linię komórkową.
36. 36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, której porowata ścianka zawiera kompleks polielektrolitu utworzony z polielektrolitów o przeciwnych ładunkach.
37. 37. Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, której porowata ścianka zawiera kompleks polielektrolitu złożony z polisacharydów zawierających grupy siarczanowe lub pochodnych polisacharydów lub polimerów syntetycznych zawierających grupy sulfonianowe i polimerów z czwartorzędowymi grupami amoniowymi.
38. 38. Sposób według zastrz. 37, znamienny tym, że polisacharydy zawierające grupy siarczanowe lub pochodne polisacharydów wybiera się z siarczanu celulozy, siarczanu octanu celulozy, siarczanu karboksymetylocelulozy, siarczanu dekstranu lub siarczanu skrobi, a polimer syntetyczny zawierający grupę sulfonianowąjest sulfonianem polistyrenu.
39. 39. Sposób według zastrz. 37, znamienny tym, że jako polimer z czwartorzędowymi grupami amoniowymi stosuje się polidimetylodiallil amoniowy lub poliwinylobenzylotrimetyl amoniowy.
40. 40. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, której porowata ścianka zawiera kompleks złożony z siarczanu celulozy i polidimetylodiallilu amoniowego.
41. 41. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, mającą postać mikrokapsułek o średnicy w zakresie od 0,01 do 5 mm, a korzystnie od 0,1 do 1 mm.
42. 42. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, która zawiera gąbczastą osłonkę tworzącą wnętrze kapsułki otoczoną przez ściankę kapsułki zawierającą pory, przy czym gąbczasta osłonka wypełniona jest komórkami.
43. 43. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, której wielkość powierzchniowych porów porowatej ścianki wynosi od 80 do 150 nm, a korzystnie od 100 do 120 nm.
44. 44. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, w której cząsteczka retrowirusa produkowana przez linię komórek pakujących zawiera genom wirusa retrowirusowego.
45. 45. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, w której otoczona linia komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa jest transfekowana wektorem ekspresyjnym, przy czym wektor ekspresyjny niesie konstrukt wektora retrowiru185 338 sowego zdolny do zakażania i sterowania ekspresją w komórkach docelowych jednej lub więcej sekwencji kodujących niesionych przez ten konstrukt wektora retrowirusowego, a linia komórek pakujących przenosi co najmniej jeden wektor ekspresyjny niosący geny kodujące białka wymagane do pakowania konstruktu wektora retrowirusowego.
46. 46. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, w której co najmniej jedna z sekwencji kodujących koduje heterologiczne peptydy wybrane z genów markerowych, genów terapeutycznych, genów antywirusowych, genów antynowotworowych i genów cytokin.
47. 47. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że gen markerowy wybiera się z grupy złożonej z genów markerowych, które kodują takie białka jak β-galaktozydaza, neomycyna, dehydrogenaza alkoholowa, puromycyna, transferaza fosforybozylowa hipoksantyny (HPRT), higromycyna i wydzielana fosfataza alkaliczna, a gen terapeutyczny wybiera się z genów, które kodują białka takie jak kinaza tymidynowa wirusa opryszczki (Herpes Simplex) deaminaza cytozynowa, transferaza fosforybozylowa guanozyny (gpt), cytochrom P 450, geny regulujące cykl komórkowy takie jak SDI, geny supresorów nowotworów, które kodują białka takie jak p53, geny antyproliferacyjne, które kodują białka takie jak melityna, cykropina lub cytokiny takie jak IL-2.
48. 48. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że linię komórek pakujących wybiera się z psi-2, psi-crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 i GP+envAM-12.
49. 49. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, w której wektor retrowirusowy jest defektywny pod względem replikacji.
50. 50. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, w której wektor retrowirusowy zawiera region 5' LTR o budowie U3-R-U5, jedną lub więcej sekwencji wybranych z sekwencji kodujących i niekodujących, i region 3' LTR zawierający całkowicie lub częściowo wydeletowany region U3, przy czym ten wydeletowany region U3 zastąpiony jest przez sekwencję polilinkera i element regulatorowy lub promotor, po którym następuje region R i U5.
51. 51. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że stosuje się kapsułkę, w której wektorem ekspresyjnym jest pBAG, pLXSN, pl25LX, pLX2Bl lub pc3/2Bl lub jego pochodne.
52. 52. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca składnik aktywny i fizjologicznie dopuszczalny nośnik i/lub rozcieńczalnik, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera kapsułkę otaczającą linię komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa, która zawiera półprzepuszczalną błonę z farmaceutycznie dopuszczalnego polimeru tworzącego porowatą ściankę mającą wielkość porów pozwalającą na uwalnianie zasadniczo wszystkich cząsteczek retrowirusa produkowanych przez tę linię komórkową.
53. 53. Kompozycja według zastrz. 52, znamienna tym, że porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks polielektrolitu utworzony z polielektrolitów o przeciwnych ładunkach.
54. 54. Kompozycja według zastrz. 53, znamienna tym, że porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks polielektrolitu złożony z polisacharydów zawierających grupy siarczanowe lub pochodnych polisacharydów lub polimerów syntetycznych zawierających grupy sulfonianowe i polimerów z czwartorzędowymi grupami amoniowymi.
55. 55. Kompozycja według zastrz. 54, znamienna tym, że polisacharydy zawierające grupy siarczanowe lub pochodne polisacharydów wybrane są z siarczanu celulozy, siarczanu octanu celulozy, siarczanu karboksymetylocelulozy, siarczanu dekstranu lub siarczanu skrobi, a polimer syntetyczny zawierający grupę sulfonianowąjest sulfonianem polistyrenu.
56. 56. Kompozycja według zastrz. 54, znamienna tym, że polimerem z czwartorzędowymi grupami amoniowymi jest polidimetylodiallil amoniowy lub poliwinylobenzylotrimetyl amoniowy.
57. 57. Kompozycja według zastrz. 52, znamienna tym, że porowata ścianka kapsułki zawiera kompleks złożony z siarczanu celulozy i polidimetylodiallilu amoniowego.
58. 58. Kompozycja według zastrz. 52, znamienna tym, że kapsułka ma postać mikrokapsułek o średnicy w zakresie od 0,01 do 5 mm, a korzystnie od 0,1 do 1 mm.

    185 338
59. 59. Kompozycja według zastrz. 52, znamienna tym, że kapsułka zawiera gąbczastą osłonkę tworzącą wnętrze kapsułki otoczoną przez ściankę kapsułki zawierającą pory, przy czym gąbczasta osłonka wypełniona jest komórkami.
60. 60. Kompozycja według zastrz. 52, znamienna tym, że wielkość powierzchniowych porów porowatej ścianki kapsułki wynosi od 80 do 150 nm, a korzystnie od 100 do 120 nm.
61. 61. Kompozycja według zastrz. 52, znamienna tym, że cząsteczka retrowirusa produkowana przez linię komórek pakujących zawiera genom wirusa retrowirusowego.
62. 62. Kompozycja według zastrz. 61, znamienna tym, że otoczona kapsułką linia komórek pakujących produkujących cząsteczki retrowirusa jest transfekowana wektorem ekspresyjnym, przy czym wektor ekspresyjny niesie konstrukt wektora retrowirusowego zdolny do zakażania i sterowania ekspresją w komórkach docelowych jednej lub więcej sekwencji kodujących niesionych przez ten konstrukt wektora retrowirusowego, a linia komórek pakujących przenosi co najmniej jeden wektor ekspresyjny niosący geny kodujące białka wymagane do pakowania konstruktu wektora retrowirusowego.
63. 63. Kompozycja według zastrz. 62, znamienna tym, że co najmniej jedna z sekwencji kodujących koduje heterologiczne peptydy wybrane z genów markerowych, genów terapeutycznych, genów antywirusowych, genów antynowotworowych i genów cytokin.
64. 64. Kompozycja według zastrz. 63, znamienna tym, że gen markerowy wybrany jest z grupy złożonej z genów markerowych, które kodują takie białka jak β-galaktozydaza, neomycyna, dehydrogenaza alkoholowa, puromycyna, transferaza fosforybozylowa hipoksantyny (HPRT), higromycyna i wydzielana fosfataza alkaliczna, a gen terapeutyczny wybrany jest z genów, które kodują białka takie jak kinaza tymidynowa wirusa opryszczki (Herpes Simplex), deaminaza cytozynowa, transferaza fosforybozylowa guanozyny (gpt), czochrom P 450, geny regulujące cykl komórkowy takie jak SDI, geny supresorów nowotworów, które kodują białka takie jak p53, geny antyproliferacyjne, które kodują białka takie jak melityna, cykropina lub cytokiny takie jak IL-2.
65. 65. Kompozycja według zastrz. 62, znamienna tym, że linia komórek pakujących wybrana jest z psi-2, psi-crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 i GP+envAM-12.
66. 66. Kompozycja według zastrz. 62, znamienna tym, że wektor retrowirusowy jest defektywny pod względem replikacji.
67. 67. Kompozycja według zastrz. 66, znamienna tym, że wektor retrowirusowy zawiera region 5' LTR o budowie U3-R-U5, jedną lub więcej sekwencji wybranych z sekwencji kodujących i niekodujących, i region 3' LTR zawierający całkowicie lub częściowo wydeletowany region U3, przy czym ten wydeletowany region U3 zastąpiony jest przez sekwencję polilinkera i element regulatorowy lub promotor, po którym następuje region R i U5.
68. 68. Kompozycja według zastrz. 62, znamienna tym, że wektorem ekspresyjnym jest pBAG, pLXSN, pl25LX, pLX2B1 lub pc3/2B1 lub jego pochodne.
69. 69. Kompozycja według zastrz. 52, znamienna tym, że ma postać odpowiednią do wstrzyknięcia i/lub implantacji do docelowych narządów/komórek i/lub w pobliżu tych narządów/komórek.
70. 70. Kompozycja według zastrz. 69, znamienna tym, że docelowe narządy/komórki są tkanką nowotworową.
71. 71. Kompozycja według zastrz. 69 albo 70, znamienna tym, że docelowymi narządami/komórkami są gruczoł mleczny, trzustka lub mięśnie gładkie otaczające tętnice.