KR19990028491A

KR19990028491A - 바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화 세포

Info

Publication number: KR19990028491A
Application number: KR1019970709807A
Authority: KR
Inventors: 로버트 미샤엘 잘러; 발터 하. 귄즈부룩; 브리안 잘몬스
Original assignee: 피터 울프; 버베리안 노딕 리서치 인스티튜트 에이/에스; 메나케 게오르크; 게에스에프 포르슝스젠트룸 퓌르 움벨트 운트 게준드하이트게엠베하
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1996-06-24
Publication date: 1999-04-15
Also published as: PT835137E; IL122119A; JP2008101011A; EP0835137B1; CZ419597A3; HK1010139A1; IL122119A0; WO1997001357A1; KR100484883B1; ATE309000T1; SI0835137T1; JP4848348B2; ES2253754T3; NO321427B1; EP0835137A1; CA2222559A1; CN1187095C; AU708273B2; NO975813D0; PL185338B1

Abstract

본 발명은 바이러스성 입자, 특히 치료 유전자를 운반하는 바이러스성 벡터의 게놈을 함유하는 레트로바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화 세포, 이러한 캡슐화 세포의 제조방법은 물론 질병 치료를 위한 상기 캡슐화 세포의 용도에 관한 것이다.

Description

바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화 세포

표적세포에 치료효과가 있는 유전자의 공급은 유전자 치료의 개념에 필수적이다. 유전자 치료가 일상적인 과정이 되는 경우, 표적세포에 치료유전자를 효과적으로 생체내에 공급하는 시스템의 개발이 가장 중요하다.

바이러스성 벡타 및 특히 레트로바이러스성 벡터는 유전자 치료에 가장 통상적으로 사용되는 공급매개체이다 (Morgan and Anderson, 1993). 최근에 인정된 유전자 치료 프로토콜의 대부분은 환자로부터 세포를 제거하고 유전학적으로 시험관내 변형시킨 다음 환자에게 재삽입시키는 생체외 방법을 채용하고 있다. 이 방법은 복잡하고, 비용이 들며 또한 기술적으로 진보된 시설로 한정되어 있다. 또한 이러한 유형의 방법은 용이하게 분리하여 배양하고 재이식할 수 있는 세포로 한정되어 있다 (Gunzburg 등, 1995). 치료 유전자의 생체내 공급은 많은 이점을 제공하지만 현재의 제형에서 이러한 방법은 비효율적이고 문제가 있다. 주요한 문제점은 유전자 전이의 낮은 효율성 때문에 바이러스성 벡터를 여러번 적용시킬 필요성이 있다는 것이다. 벡터 공급을 여러번 해야함은 까다로울 뿐만아니라 바이러스성 입자에 대하여 면역반응 때문에 비성공적일 가능성이 있다.

이러한 문제를 해결할 수 있는 한가지 가능한 방법은 바이러스성 입자를 생산하는 세포를 직접 이식시키는 것이다. 표적 기관 또는 세포 다음의 위치에서 바이러스성 벡터의 게놈을 함유하는 바이러스성 입자를 생산하는 세포의 이식은 또한 표적세포/기관에 바이러스성 벡터을 직접적용시키는 것이다.

그외에, 사용된 바이러스성 벡터 바이러스가 레트로바이러스성 벡터 바이러스인 경우, 이러한 방법은 여러번 단일 고투여량 적용시보다 이점이 있다. 그 이유는 표적세포가 복제를 수행할 때에 벡터 바이러스가 존재할 가능성이 존재하고 따라서 표적 세포를 감염시킬 가능성이 증가하기 때문이다. 더욱이 바이러스성 벡터의 낮지만 계속적인 분리는 바이러스성 입자에 대한 숙주 면역반응을 피하는데 유리할 수 있다.

바이러스성 벡터의 효과적인 공급을 위해서, 바이러스성 벡터를 생산하는 세포는 이식후 장기간 생존할 수 있어야 하며 또한 바이러스성 입자는 이 기간중에 생성되어 세포로부터 분리되어야 한다. 예를들어 이식후 현저한 면역반응이 없는 경우, 이들 세포는 장기간에 걸쳐 생존해 있어야 한다 (Culver 등, 1992; Ram 등, 1993). 그러나 체내의 다른 부위에서 성공적인 이식을 수행하기 위해서는 생산자 세포는 면역 시스템으로부터 보호되어야 한다.

따라서 장기간 이러한 방법의 유효성은 (1) 특히 바이러스성 입자를 생산하는 세포가 통상적으로 이런 세포의 경우와 상이한 종으로부터 유래한 경우, 통상 바이러스성 입자를 생산하는 세포를 제거하는 숙주 면역시스템으로부터 세포의 보호, 및 (2) 혈관신생을 필요로 할 수 있는 연장된 기간동안 그위치에서 세포의 살아있음에 좌우된다.

특정의 생물학적 활성 분자를 분리시키지만 이들 분자를 생산하는 세포를 숙주 면역시스템으로부터 보호하는 침투가능한 구조에서 세포의 캡슐화는 약간의 성공을 거두었다 (참고 Chang, 1995). 인간 성장호르몬(hGH) (Tai and Sun, 1993) 또는 분비형태의 인간 아데노신 데아미나제(Hughes등, 1994)를 생산하기 위해 유전학적으로 변형된 세포는 캡슐화되어 왔다. 이들 두가지 연구에서 세포는 폴리-L-라이신-알기네이트 마이크로캡슐로 캡슐화되었으며 또한 세포는 배양물에서 장기간 살아있는 것으로 나타났다. 이것은 효소 또는 호르몬의 장기간 생산에 의해 달성되었다. 또한 마이스(mice)에 마이크로캡슐의 이식시 세포는 1년간 살아있었으며, hGH의 생산을 계속하는 것으로 나타났다 (Tai and Sun, 1993). 이것은 캡슐이 숙주면역시스템에 의한 파괴로부터 트랜스팩트화 세포를 보호한다는 것을 입증한다.

다른 물질을 사용하는 세포 캡슐화도 또한 보고되었다. 신경 성장 인자를 생산하기 위해 유전적으로 변형된 어린 햄스터 신장 세포는 폴리아크릴로니트릴/비닐클로라이드로 캡슐화시켜 래트 뇌에 이식하였다. 캡슐화된 세포는 적어도 6개월 생존하였으며 또한 NGF 의 생산을 계속하였다 (Winn 등, 1994; Deglon 등, 1995).

그외에, 간세포는 셀룰로스 설페이트 및 폴리디메틸디알릴 암모늄의 고분자 전해질 복합물로 성공적으로 캡슐화하였다 (Stange 등, 1993). 캡슐화된 간세포의 90% 이상은 그의 생존성을 유지하였으며 또한 단층으로 성장한 간세포와 달리 캡슐화된 세포는 증가된 대사활성을 보여주었다. 여기에서는 셀룰로스 설페이트/폴리디메틸디알릴암모늄 캡슐이 다른 성장 유형의 세포, 예를들어 바이러스성 입자를 생산하는 세포를 뒷받침하거나 이러한 캡슐로부터 바이러스성 입자를 방출시킬 수 있다는 것은 제안되어 있지 않다.

본 발명에서 사용된 셀룰로스 설페이트 캡슐의 제조는 DE 40 21 050 A₁호에 상세하게 기술되어 있다. 또한 셀룰로스 설페이트의 합성은 이 특허출원에서 기술되어 있다. 셀룰로스 설페이트 캡슐의 포괄적인 특징화 방법은 문헌[H. Dautzenberg 등, Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., 21(3), 399-405(1993)]에서 광범위하게 다루고 있다. 다른 셀룰로스 설페이트 캡슐은 GB 2 135 954호에 기술되어 있다. 셀룰로스 캡슐의 특성, 즉 크기, 벽두께 및 기계적 특성은 여러 가지 인자 예를들어 캡슐 제조시의 물리적 환경, 침전욕의 점도, 그 이온강도, 온도, 세포/셀룰로스 설페이트 현탁액의 첨가속도, 셀룰로스 설페이트의 조성은 물론 Dautzenberg 그룹에 기술된 다른 파라미터에 따라 좌우된다.

이식된 세포로부터 바이러스성 입자의 계속적인 생산이 고분자 전해질 복합물에서 세포의 캡슐화에 의해 달성될 수 있다는 놀라운 사실이 밝혀졌다. 이러한 캡슐의 구공은, 바이러스를 비활성화시키는 것으로 알려진(Welsh 등, 1975, Cornetta등, 1990), 항체 및 보체를 캡슐에 진입시키는데 충분한 크기를 갖지만, 본 발명자들은 거대한 면역 또는 염증반응 또는 이식된 캡슐의 부근에서 괴사증에 대한 증거가 없음을 밝혀냈다. 그외에 놀랍게도 본 발명에 따른 캡슐이 숙주내에서 잘 접목되어 빠르게 혈관화된다는 것도 밝혔다. 따라서 본 발명에 따른 캡슐화된 세포는 생체내에서 치료 유전자를 운반하는 바이러스성 벡터를 장기간 공급시킨다.

본 발명은 바이러스성 입자, 특히 치료 유전자를 운반하는 레트로바이러스성 벡터의 게놈을 함유하는 레트로바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화 세포, 이러한 캡슐화 세포의 제조방법은 물론 유전자, 특히 치료유전자를 표적기관/세포(target organs/cells)에 공급하기 위한 상기 캡슐화 세포의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 특히 다음을 단독으로 또는 결합형태로 포함한다:

세포 함유 코어부 및 상기 코어부를 둘러싸는 다공성 캡슐벽을 포함하는 바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화된 세포, 여기서 상기 다공성 캡슐벽은 상기 바이러스성 입자에 침투가능함;

상기 다공성 캡슐벽이 대-전하 고분자 전해질로부터 형성된 고분자 전해질 복합물로 이루어진 상술한 캡슐화 세포;

상기 다공성 캡슐 벽이 설페이트 그룹-함유 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체 또는 설포네이트 그룹-함유 합성폴리머 및 4급 암모늄 그룹을 가진 폴리머로부터 형성된 고분자 전해질 복합물로 이루어진 상술한 캡슐화 세포;

상기 설페이트 그룹-함유 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체가 셀룰로스 설페이트, 셀룰로스 아세테이트 설페이트, 카르복시메틸셀룰로스 설페이트, 덱스트란 설페이트 또는 스타치 설페이트이고, 또한 설포네이트 그룹-함유 합성 폴리머가 폴리스티렌 설포네이트인 상술한 캡슐화 세포;

4급 암모늄 그룹을 가진 폴리머가 폴리디메틸디알릴암모늄 또는 폴리비닐벤질-트리메틸암모늄인 상술한 캡슐화 세포;

다공성 세포벽이 셀룰로스 설페이트 및 폴리디메틸디알릴 암모늄으로부터 형성된 복합물로 이루어진 상술한 캡슐화 세포;

직경 0.01 내지 5 mm, 바람직하게는 0.1 내지 1 mm인 마이크로캡슐 형태를 갖는 상술한 캡슐화 세포;

상기 캡슐이 구공을 함유하는 캡슐표면에 의해 둘러싸인 캡슐벽의 내부를 형성하는 스폰지상 셀룰로스 설페이트 매트릭스로 이루어지며, 이때 상기 스폰지상 매트릭스는 세포로 충진되는 상술한 캡슐화 세포;

다공성 캡슐벽의 표면 구공크기가 80 내지 150 nm, 바람직하게는 100 내지 120 nm인 상술한 캡슐화 세포;

캡슐화 세포에 의해 생산된 바이러스성 입자가 레트로바이러스성 벡터의 게놈을 함유하는 레트로바이러스성 입자인 상술한 세포;

레트로바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화 세포가 표현 벡터로 트랜스팩트화된 팩키지 세포라인이고, 상기 표현 벡터는 상기 레트로바이러스성 벡터 구조물에 의해 운반된 하나 이상의 코딩서열의 표적세포에서의 상기 표현을 지시감염시킬 수 있는 레트로바이러스성 벡터 구조물을 운반하며, 상기 패키지 세포 라인은 레트로바이러스성 벡터 구조물을 패키지화시키는데 필요한 단백질을 코딩하는 유전자를 운반하는 적어도 하나의 표현벡터가 잠재하는 상술한 캡슐화 세포;

상기 코딩서열의 적어도 하나가 마커 유전자, 치료유전자, 항바이러스성 유전자, 항종양 유전자 및 시토킨 유전자로부터 선택된 이형의 펩티드를 코딩하는 상술한 캡슐화 유전자;

상기 마커 유전자가 β-가락토시다제, 네오마이신, 알콜 디하이드로게나제, 푸로마이신, 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 히그로마이신 및 분비된 알카리성 포스파타제 같은 단백질을 코딩하는 마커 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택되며, 또한 상기 치료유전자는 헤퍼스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus) 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 구아닌 포스포리보실 트랜스페라제(gpt), 시토크롬 P 450 같은 단백질을 코딩하는 유전자, 및 SDI 같은 세포 사이클 조절유전자, p53 같은 단백질을 코딩하는 종양억제 유전자 또는 멜리틴, 세크로핀 또는 시토킨 예를들어 IL-2 같은 단백질을 코딩하는 항증식 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 상술한 캡슐화 세포;

패키지세포라인이 psi-2, psi-crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 및 GP+envAM-12로부터 선택된 상술한 캡슐화 세포;

패키지 세로라인으로 트랜스팩트화된 표현벡터가 pBAG, pLXSN, p125LX, pLX2B1, 또는 pc3/2B1 또는 그의 유도체인 상술한 캡슐화 세포;

고분자 전해질의 수용액에 바이러스성 입자를 생산하는 세포를 현탁시킨 다음, 예비 성형된 입자 형태의 현탁액을 대-전하 고분자 전해질의 수용액을 함유하는 침전욕에 주입시킴을 포함하는 상술한 캡슐화 세포의 제조방법;

상기 입자 형성이 스프레이에 의해 일어나는 상술한 방법;

상기 세포가 설페이트 그룹-함유 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체 또는 설포네이트 그룹-함유 합성폴리머의 수용액중에 현탁되는 상술한 방법;

상기 설페이트 그룹-함유 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체가 셀룰로스 설페이트, 셀룰로스 아세테이트 설페이트, 카르복시메틸셀룰로스 설페이트, 덱스트란 설페이트 또는 스타치 설페이트이고, 또한 상기 설포네이트 그룹-함유 합성 폴리머가 폴리스티렌 설포네이트인 상술한 방법;

상기 침전욕이 4급암모늄 그룹을 가진 폴리머의 수용액을 함유하는 상술한 방법;

상기 4급 암모늄 그룹을 가진 폴리머가 폴리디메틸디알릴암모늄 또는 폴리비닐벤질-트리메틸암모늄인 상술한 방법;

상기 세포가 소듐 셀룰로스 설페이트의 수용액중에 현탁된 다음 폴리디메틸디알릴암모늄 클로라이드의 수용액을 함유하는 침전욕중에 주입되는 상술한 방법;

상기 수성 셀룰로스 설페이트 수용액이 완충 식염중 0.5 내지 50%, 바람직하게는 2 내지 5% 소듐 셀룰로스 설페이트 및 2 내지 10%, 바람직하게는 5% 태아 송아지 혈청으로 이루어진 상술한 방법;

상기 침전욕중의 수용액이 완충식염중 0.5 내지 50%, 바람직하게는 2 내지 10%, 또는 더욱 바람직하게는 3% 폴리디메틸디알릴암모늄 클로라이드로 이루어진 상술한 방법;

상술한 방법에 의해 제조죈 상기 어느 하나의 캡슐화 세포;

다음 단계 a) 및 b)를 포함하는 표적기관/세포에 유전자를 공급하기 위한 상기 어느 하나의 캡슐화 세포의 용도:

a) 캡슐화 세포를 적절한 배지에 배양시키는 단계, 및

b) 캡슐화 세포를 인간을 포함한 살아있는 동물체내에 이식시키는 단계;

상기 표적기관/세포가 유선 또는 췌장인 상술한 용도; 및

표적기관/세포가 동맥을 둘러싸는 부드러운 근육세포 및 다른 세포 유형인 상술한 용도.

본 발명의 목적은 캡슐로부터 세포에 의해 생성된 바이러스성 입자를 분리시킴과 동시에 숙주에 이식후 현저한 숙주 면역 또는 염증 반응을 유발하지 않는 바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 바이러스성 입자를 생산하는 이런 캡슐화 세포의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 숙주내의 바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화 세포의 이식에 의해 표적기관/세포에 유전자, 특히 치료 유전자를 공급하는 방법을 제공하며, 따라서 표적 기관내에 또는 표적 세포 근처에 바이러스성 입자의 계속적인 생산 및 분리를 제공한다.

본 발명에 따르면, 캡슐로부터 세포에 의해 생성된 바이러스성 입자를 분리시킴과 동시에 숙주에 이식후 현저한 숙주 면역 또는 염증 반응을 유발하지 않는 바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화 세포가 제공된다.

본 발명에 따른 캡슐화 세포는 고분자 전해질 (예: 설페이트 그룹-함유 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체 또는 설포네이트 그룹-함유 합성폴리머로부터 선택된)의 수용액에 바이러스성 입자를 생산하는 세포를 현탁시킨 다음, 예비 성형된 입자 형태의 현탁액을 대-전하 고분자 전해질(예를들어 4급암모늄 그룹을 가진 폴리머)의 수용액을 함유하는 침전욕에 주입시킴으로써 제조할 수 있다.

설페이트 그룹-함유 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체는 셀룰로스 설페이트, 셀룰로스 아세테이트 설페이트, 카르복시메틸셀룰로스 설페이트, 덱스트란 설페이트 또는 스타치 설페이트를 염 형태, 특히 소듐염 형태로 포함한다. 상기 설포네이트 그룹-함유 합성 폴리머는 폴리스티렌 설포네이트염, 바람직하게는 소듐염일 수 있다.

4급 암모늄 그룹을 가진 폴리머는 폴리디메틸디알릴암모늄 또는 폴리비닐벤질-트리메틸암모늄을 그의 염형태, 바람직하게는 클로라이드 염형태로 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서 바이러스성 입자를 생산하는 세포는 셀룰로스 설페이트 및 폴리디메틸디알릴-암모늄으로부터 형성된 복합물로 이루어진 복합체로 캡슐화한다.

이러한 캡슐은 임으로 완충제중에 0.5 내지 50%, 바람직하게는 2 내지 5% 소듐 셀룰로스 설페이트 및 5% 태아 송아지 혈청을 함유하는 용액중에 바이러스성 입자를 생산하는 세포를 현탁시켜 제조하는 것이 바람직하다. 이어서 이 현탁액은 임의로 완충제중에 0.5 내지 50%, 바람직하게는 2 내지 10%, 또는 더욱 바람직하게는 3% 폴리디메틸디알릴암모늄 클로라이드를 함유하는 침전욕중에 교반하면서 분산시스템 (예: 에어-제트 시스템 또는 피에조 전기 시스템)으로 적하한다. 캡슐 형성은 밀리세컨드 이내에 일어나며 또한 세포를 함유하는 캡슐은 침전욕중에 30초 내지 5분간 유지시킨 다음 세척한다. 이 방법의 신속성은 세포가 전체 공정중에 과도하게 스트레스되지 않는다는 것을 입증한다 (Stange 등, 1993).

본 발명에 따른 캡슐은 0.01 내지 5 mm의 가변성 직경을 갖지만, 바람직하게는 0.1 내지 1 mm이다. 따라서 캡슐은 가변적인 수의 세포를 함유하도록 만들 수 있다. 본 발명에 따른 캡슐화 공정을 이용하면 바이러스성 입자를 생산하는 최고 10¹⁰까지, 그러나 바람직하게는 10⁵-10⁷세포가 고분자 전해질 복합물로 캡슐화한다.

셀룰로스 설페이트 및 폴리디메틸디알릴 암모늄으로 구성된 캡슐은 우수한 기계적 특성을 가지며 일정한 크기 및 구공크기로 제조할 수 있다.

캡슐의 구공크기는 80 내지 150nm, 바람직하게는 100 내지 120nm이다.

캡슐화 세포는 습도, 온도 및 CO₂농도의 표준조건에서 정상세포 배지(이의 성질은 캡슐화 세포에 따라 좌우된다)로 배양할 수 있다. 이 배양기간중에 캡슐로부터 바이러스성입자를 세포배지로 생산하는 것은 RT-PCR 기술을 사용하거나 또는 표적세포에 세포 불함유 (0.45㎛ 여과된) 상등액의 전이에 의해 입증할 수 있으며 그후 바이러스성 입자중에 함유된 바이러스성 벡터 구조물에 의해 운반된 유전자로 엔코딩된 마커 단백질의 활성 평가에 의해 바이러스 감염을 확인할 수 있다. 바이러스성 벡터의 의해 운반된 유전자로 엔코딩된 마커 유전자가 표적세포상의 특정한 화합물에 내성을 부여하는 유전자인 경우, 시스템에 의해 생산된 바이러스의 적정량을 확인할 수 있다.

적절한 배양기간 후 (통상 적어도 1 시간 및 30일을 초과하지 않음), 세포 함유 캡슐은 외과적으로 직접 이식하거나 주사기를 사용하여 몸의 여러 부분에 주사하여 이식할 수 있다.

본 발명에 따른 캡슐화 세포에 의해 생산된 바이러스성 입자는 한정된 것은 아니지만 아데노바이러스, 아데노바이러스 관련 바이러스, 포진 바이러스 또는 레트로바이러스를 포함한 유전자 치료에 유용한 모든 바이러스를 기본으로 할 수 있다 (참조 : Gunzburg and Salmons, 1995).

본 발명의 바람직한 실시태양에서 캡슐화 세포는 마커 및/또는 치료유전자를 운반하는 레트로바이러스성 벡터구조물의 게놈을 함유하는 레트로바이러스성 입자를 생산하는 패키지 세포라인이다.

레트로바이러스성 벡터 시스템은 다음 두가지 성분으로 구성되어 있다:

1) 바이러스성 단백질을 엔코딩하는 유전자가 표적세포에 이송될 마커유전자를 임의로 포함한 치료유전자에 의해 대체되는 변형 레트로바이러스인 레트로바이러스성 구조물을 운반하는 표현벡터 (백터 플라스미드). 바이러스성 단백질을 엔코딩하는 유전자의 대체는 바이러스를 효과적으로 무기력화시키기 때문에 착오바이러스성 단백질을 변형 레트로바이러스에 제공하는 시스템에서 제 2 성분으로 보호되어야 한다.

제 2 성분은 다음과 같다:

2) 다량의 바이러스성 단백질을 생산하나, 복제 경쟁 바이러스를 생산할 수 있는 능력이 부족한 세포라인. 이 세포라인은 패키지세포라인으로 알려져 있으며 변형 레트로바이러스성 게놈을 패키지화시킬 수 있는 유전자를 운반하는 플라스미드로 트랜스팩트화된 세포라인으로 구성되어 있다. 이들 플라스미드는 비리온(virion) 생산에 필요한 바이러스성 단백질의 합성을 가능하게 한다.

패키지화된 레트로바이러스성 벡터를 생산하기 위해서 벡터플라스미드는 패키지 세포라인으로 트랜스팩트화된다. 이러한 조건하에 치료 및 임의의 마커 유전자를 포함한 변형 레트로바이러스성 게놈은 벡터 플라스미드로부터 전사되며 또한 수득된 변형 레트로바이러스성 게놈은 레트로바이러스성 입자로 패키지화된다. 이러한 바이러스성 입자로 감염된 세포는 바이러스성 단백질이 이들 세포중에 존재하지 않기 때문에 바이러스성 입자를 생산할 수 없다. 그러나 치료 및 마커 유전자를 운반하는 레트로바이러스성 벡터 구조물이 존재하며 또한 이들은 감염된 세포로 표현될 수 있다.

WO 94/29437호, WO 89/11539호 및 WO 96/07748호는 본 발명의 목적에 유용한 상이한 유형의 레트로바이러스성 벡터 시스템을 개시하고 있다.

본 발명에 따른 캡슐화 세포에 의해 생산된 바이러스성 입자는 마커 및/또는 치료 유전자를 엔코딩하는 유전자를 운반하는 바이러스성 벡터의 게놈을 함유하도록 구성할 수 있다.

바이러스성 벡터에 의해 운반된 마커 또는 치료 유전자는 예를들어 β-가락토시다제, 네오마이신, 알콜 디하이드로게나제, 푸로마이신, 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 히그로마이신 및 분비된 알카리성 포스파타제 같은 단백질을 코딩하는 마커 유전자, 또는 헤퍼스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 구아닌 포스포리보실 트랜스페라제(gpt), 시토크롬 P 450 같은 단백질을 코딩하는 치료 유전자, SDI 같은 세포 사이클 조절유전자, p53 같은 단백질을 코딩하는 종양억제 유전자, 또는 멜리틴, 세크로핀 또는 시토킨 에를들어 IL-2 같은 단백질을 코딩하는 항증식 유전자일 수 있다.

구체적인 실시태양에서 본 발명은 종양 치료에 있어 본 발명에 따른 캡슐화 세포의 용도에 관한 것이다.

많은 악성종양은 화학요법에 잘 반응하지 않는다. 종양을 치료하는데 사용되는 항암제는 대분분의 경우에 전신계로 적용되며 따라서 환자의 전체 신체에 퍼진다. 암치료에 요구되는 이러한 약제의 높은 전신계 투여용량은 흔히 환자의 불쾌한 부작용과 결부되어 있다. 항암제의 높은 전신계 투여농도에서의 이러한 문제점을 피할 수 있는 한가지 방안은 종양의 내부에 또는 근처에 직접적으로 약제를 활성화시키거나 직접 적용시키는 것이다. 이것은 종양세포내에 또는 부근 세포내에서, 예를들어 전구약물질을 세포독성제로 전환시킬 수 있는 활성화 효소인, 항암제를 엔코딩하는 유전자를 운반하는, 강화바이러스의 게놈을 함유하는 바이러스성 입자, 특히 레트로바이러스성 벡터를 생산하는 본 발명의 엔캡슐화 세포의 이식에 의해 달성할 수 있다.

본 발명의 한 실시태양에서 한정되는 것은 아니지만 비독성 약제를 하나 이상의 독성 대사물로 전환시키는 티미딘 키나제 같은 자살 유전자 또는 시토크롬 P450 같은 종양관련 효소를 운반하는 레트로바이러스성 벡터의 게놈을 함유하는 레트로바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화 세포가 제공된다. 본 발명의 이러한 캡슐화 세포는 종양, 예를들어 췌장 또는 유선내의 종양 내부에 또는 근처에 캡슐을 이식시켜 암 치료에 사용할 수 있다.

추가적인 표적화(targeting)는 특정의 세포유형에 결합된 치료유전자의 표현의 지시를 위한 표적세포 특이성 조절요소 및 프로모터의 사용에 의해 얻을 수 있다.

이러한 표적세포 특이성 조절인자 및 프로모터는 예를들어 탄산 안하이드라제Ⅱ 및 β-글루코키나제 조절 요소 및 프로모터를 포함한 췌장 특이성조절 요소 및 프로모터; 임뮤노글로빈 및 MMTV 임파구 특이성 요소 및 프로모터를 포함한 임파구 특이성 조절요소 및 프로모터; 훼이 애시딕 프로테인(WAP), 마우스 유방종양 바이러스(MMTV), β-락토글로빈 및 카제인 특이성 조절요소 및 프로모터를 포함한 유방 특이성 조절요소 및 프로모터; 및 글루코코르티코이드 호르몬에 반응성을 부여하거나 유선에 표현을 지시하는 MMTV 특이성 조절요소 및 프로모터를 포함한다. 다른 프로모터는 예를들어 CD4, CD34, 및 IL2 프로모터를 포함한다. 상기 조절 요소 및 프로모터는 바람직하게는 상기 레트로바이러스성 벡터의 표현을 조절한다.

방사형 유도 프로모터 같은 유도 프로모터, 예를들어 세포간 접착분자-1(ICAM-1)프로모터, 표피성장인자 수용체(EGFR) 프로모터 및 종양 췌장 인자 (TNF) 프로모터도 또한 사용될 수 있다.

다음 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 예시하지만, 본 발명을 제한하는 것으로 해석해서는 않된다.

<실시예 1>

pBAG로 PA317의 리포팩션화 및 G418 내성세포의 분리

양성 NIH3T3 기본 PA317 패키지 세포 (Miller and Buttimore, 1986)은 10% 태아 송아지 혈청을 함유하는 둘베코 모디파이드 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에 배양하였다. 세포를 리포팩션화전 하루에 3×10⁵세포의 밀도로 10cm 조직배양 접시에 발아시킨 다음 생산자 지시에 따라 GIBCO/BRL로부터 리포펙타민을 사용하여 MLV(Mouse Leukemia Virus) 기본 레트로벡터를 운반하는 2㎍의 pBAG 벡터로 리포팩트화하였다. 이어서 세포를 1 : 10으로 희석하고 400㎍/㎖ G418(GIBCO/BRL)을 추가로 함유하는 통상의 배지에 배양하였다. 14일후 G418 내성세포의 콜로니를 혼주(pool)하였다.

<실시예 2>

마이크로엔캡슐화

10⁷세포를 2-5% 소듐셀룰로스 설페이트 및 5% 태아 송아지 혈청을 함유하는 1ml의 완충식염 용액중에 현탁시키고 현탁액을 완충식염수중에 2-3% 폴리디메틸-디알릴암모늄을 함유하는 침전욕중에 분산시스템(에어-제트 시스템)을 사용하여 적하하였다. 캡슐 형성이 밀리세컨드 이내에 일어난 다음 실질적으로 셀룰로스 설페이트로 구성된 기계적 지지체용 내부, 더욱 다공성의, 층을 구성시켰다. 세포를 함유하는 캡슐을 침전욕중에 30초 내지 5분간 유지시킨 다음 DMEM으로 세척하였다(Stange 등, 1993). 상술한 바와같이 상이한 파라미터, 즉 소듐 셀룰로스 설페이트의 농도, 에어 제트 시스템의 플로우 및 침전욕중의 시간으로 얻어진 배치를 생물학적 연구를 위해 사용하였다. 조건의 대표적인 실시예는 예를들면 2.5% 소듐셀룰로스 설페이트, 2% 폴리디메틸-디알릴암모늄, 및 침전욕에서 1분, 또는 1.5% 소듐셀룰로스 설페이트, 2% 폴리디메틸-디알릴암모늄, 및 침전욕에서 0.5분, 또는 3% 소듐셀룰로스 설페이트, 3% 폴리디메틸-디알릴암모늄, 및 침전욕에서 2분이다. 정확한 파라미터는 원하는 캡슐의 정확한 사이즈, 캡슐의 두께 및 다른 파라미터를 고려하여 선택한다.

<실시예 3>

마우스의 유선내에 마이크로캡슐의 이식

마이크로캡슐을 "키이 홀(key hole)"수술에 의해 암컷 2개월된 BALB/c 마우스의 유선에 삽입하고 주입부위를 1 봉합으로 밀폐하였다. 직경 0.5-2mm의 캡슐을 6개까지 각 수술 부위에 삽입하였다.

마이크로캡슐로부터 바이러스 분리에 대한 시험관내 연구, 마이크로캡슐의 효과 및 면역경쟁 마우스내로 캡슐이식의 효과는 다음 시험법을 사용하여 조사하였다.

A) β-갈락토시다제 활성

조직화학적 오염법에 의한 감염된 세포의 탐색은 전술한 바와같이 수행하였다 (Cepko, 1989). 세포, 캡슐 또는 조직단면은 냉각된 PBS로 세척한 다음 샘플의 두께에 따라 2% 파라포름알데히드 용액으로 20분-24시간 고정시켰다. PBS로 광범위한 세척후 세포 캡슐 또는 조직 단면을 37℃에서 적어도 2 시간동안 기질 X-gal (20mM K₃FeCN₆, 20mM K₄FeCN₆.3H₂O, 2mM MgCl₂및 1mg/ml X-gal)을 함유하는 용액중에 접종하였다.

B) 감염

4×10⁴표적세포를 감염전 6시간 6-웰 조직 배양 플레이트에 혼주하였다. 바이러스 생산 세포를 함유하는 캡슐을 세포의 상부에 놓고 폴리브렌 (8㎍/㎖)을 배지에 첨가하였다. 4시간 후 배지를 교환하여 잔류 폴리브렌을 제거하였다. 5일후 일부 웰은 상술한 β-갈락토시다제 활성으로 오염되었고 다른 웰은 더 큰 조직배양접시에 트립신화된 다음 400㎍/㎖ G418을 함유하는 배지에 배양하였다. 16일후 G418 내성 콜로니를 탐색하였다.

C) RT-PCR 분석

5ml의 캡슐 배지 상등액으로부터 바이러스성 입자는 초원심분리(240,000×g, 1시간, 4℃)에 의해 펠렛화하였다. 펠렛을 용해완충제(1% 트리톤 100, 0.5% 소듐 데속시콜레이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트, PBS)로 재현탁시키고 RNA를 전술한 바와같이 페놀 추출후 에탄올 침전에 의해 추출하였다(Salmons등, 1986). 이어서 RNA를 레이디-투-고우 T-프라임드 퍼스트-스트란드 키트(Pharmacia)를 사용하여 DNA로 가역전사하였다. PCR증식은 MLV 유래 BAG 벡터 LTR의 R 및 엔벨로프내에 위치한 프라이머를 사용하여 수행하였다(제 2A도). PCR증식은 500mM KCl, 10mM 트리스-HCl(pH8.3), 1.5mM MgCl₂, 0.01%(w/w)젤라틴 및 100μM의 각 dNTP, 40pM의 각 프라이머 및 2.5유닛 Taq 폴리머라제(Perkin Elmer)로 구성된 100㎕ 반응혼합물중에서 수행하였다. 반응은 다음 조건하에 퍼킨 엘머 세터스 터마 사이클러 9600에서 수행하였다: 94℃에서 1분, 53℃에서 2분 및 72℃에서 3분 35사이클. PCR 생성물은 0.8% 아가로스 겔상에 분리시킨 다음 제타 탐침 막(BIORAD)로 전사하고 전술한 바와같이(Indraccolo 등, 1995) 템플레이트와 동일한 프라이머 및 pBAG를 사용하여 생산된 MLV게놈의³²P-라벨된 612bp PCR 프라그먼트로 교잡시켰다. MLV특이성 서열은 후지 포스포이미징 시스템(BAS 1000)을 사용하여 관찰하였다.

D) PCR 분석

게놈 DNA (1㎍)는 레트로바이러스 벡터 서열의 외측 플라스미드의 폴리오마 영역에서 제2의 프라이머 및 BAG 벡터의 잔류 엔벨로프 서열내애 위치한 하나의 프라이머를 사용하여 PCR로 증식하였다 (제 3B도). PCR반응은 다음 반응 조건하에 상술한 바와같이 수행하였다: 94℃에서 1분, 50℃에서 2분 및 68℃에서 3분 35사이클. PCR 생성물은 폴리오마 서열에 특이적인 pBAG로부터³²P-라벨된 1.5kb×bal DNA 프라그먼트로 교잡시켰다.

F) 전자 현미경

전자현미경 (SEM) 및 투과전자현미경 (TEM) 검사용 시편을 PBS (pH 7.35)중에 헹구고 2% OsO₄중에 15분간 후고정전 15분동안 PBS의 1% 글루타르알데히드중에 예비고착시켰다. 샘플을 등급을 매긴 계열의 에탄올로 탈수하고 두개의 그룹으로 나누었다. a) SEM 샘플은 CO₂를 사용하여 임계-점- 건조시킨 다음 1-3 nm플라티늄으로 코팅하였다 (Emscope SC 500; Ashford, 영국). 코팅된 시편은 두 번째 모드에서 5-10kV의 가속전압으로 10kV 전계방출 주사전자 현미경(Jeol JSM-6300F; 도쿄, 일본)으로 검사하였다. b) TEM 샘플은 Epon으로 삽입하였다. 울트라틴 단면은 우란닐아세테이트 및 리드 시트레이트로 이중 오염시키고 Zeiss EM-10C(Oberkochen, 독일) 투과전자 현미경으로 관찰하였다.

결과

마이크로캡슐로부터 바이러스분리의 시험관내 조사:

β-갈락토시다제 활성에 대한 상기 실험에서 기술된 바와같은 기질 X-gal로 실시예 2에서 얻은 마이크로캡슐중의 세포에서의 오염은 마이크로캡슐이 캡슐화되지 않은 벡터 생산 세포에서 처럼 (도시되지 않음) pBAG로 엔코딩된 β-갈락토시다제를 표현하는(제 1 도) 것으로 나타났다.

바이러스성 입자가 마이크로캡슐중의 세포로부 세포배지내로 박리된다는 것을 입증하기 위해 RNA는 베양물에서 다양한 시간 경과 후 캡슐상등액으로부터 수득한 펠렛화된 비리온으로부터 제조하였다. 이 RNA는 상기 RT-PCR 분석에서 설명한 바와같이 바이러스성 엔벨로프 및 R 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하였다. 예상된 사이즈(612bp)의 MLV 특이성, PCR 생산, 프라그먼트는 적어도 6주간 마이크로캡슐 배지에서 관찰하였으며(제 2B도 레인 1-4), 이 지점에서 분석을 중단하였다. 이 프라그먼트는 RT-PCR전에 RNase로 바이러스성 RNA의 전처리가 신호를 생기게 하지 않기 때문에 DNA를 오염시키는 원인이 되지 않는다 (제 2C도, 1-4).

캡슐로부터 감염 바이러스의 생산 및 분리는 표적세포, 예를들어 NIH3T3(Jainchill등, 1969) 또는 CRFK (Crandell 등, 1973) 세포로 상기 실험 감염에서 기술된 바와같이 공 배양에 의해 입증할 수 있다. 4일간 공배양한 후 표적세포는 물론 캡슐화 패키지 세포의 정제수가 상술한 바와같이 β-갈락토시다제를 오염하였다. 나머지 표적세포는 G418 내성을 위해 선택하였다. 많은 공배양된 NIH3T3 및 CRFK 세포는 β-gal 유전자를 표현하는 것으로 나타날 수 있다 (제 3A 도).

표적세포가 감염에 의해 β-gal 유전자를 획득했다는 것을 확인하기 위하여, 표적세포는 PCR로 시험하였다. BAG 생산 팩키지 세포라인은 PA317셀 라인을 기본으로 하며 (Miller and Buttimore, 1986) 또한 헤퍼스 심플렉스 바이러스 (HSV-TK)의 티미딘 키나제 유전자를 운반하며, 이의 생성물은 프로드럭을 세포독성 약제으로 전환한다. 표적 NIH3T3 또는 CFRK 세포는 보통 이 유전자를 운반하지 않는다. 한 실험에서는 BAG 생산 세포의 이탈이 발생하지 않았음을 나타내는 GCV에 β-gal 표현 공배양된 NIH3T3 및 CFRK 표적세포가 내성이 있었다는 것을 입증할 수 있었으며, 게놈성 DNA는 표적세포로부터 추출하고 PCR(상기 PCR분석)에 의해 벡터의 외측 플라스미드의 존재를 분석하였다. 이들 서열은 BAG 벡터가 플라스미드 pBAG 형태로 이들 세포내로 리포팩트화되기 때문에 팩키지 세포에 존재한다. 그러나 패키지 세포로부터 생산된 바이러스는 이들 플라스미드를 생산하지 않으며 따라서 표적 감염세포에 존재하지 않아야 한다. 제 3B 도는 이러한 플라스미드 서열이 BAG 벡터로 이들 세포의 감염에 적합하게 탐색할 수 있었다는 것을 보여준다.

마이크로캡슐의 구조

마이크로캡슐의 단면을 제조하고 그의 구조를 전자현미경으로 분석하였다. 캡슐의 내부는 세포로 채워진 스폰지상 매트릭스로 구성되어 있다(제 4 도). 마이크로캡슐의 표면의 주사전자 현미경 검사는 백색 기둥이 레트로바이러스 입자의 평균직경을 나타내기 때문에 캡슐중의 레트로바이러스 벡터입자를 통과시키는데 충분한 구공의 존재를 나타낸다.(제 4 도).

면역경쟁 마우스에서 생체내 안정성:

마이크로캡슐의 생체내 안정성을 조사하고 또한 마이크로캡슐 또는 이들이 생산하는 바이러스가 대량의 면역반응을 유발시키는지 여부를 조사하기 위해서, 마이트로캡슐을 암컷 2개월된 BALB/c 마우스의 유선내에 이식시켰다. 마우스는 이식후 여러번 치사시켜 마우스의 치사성을 평가하고 또한 감염 바이러스가 생산되는지 여부를 평가하였다. 이식된 마이크로캡슐은 이식후 적어도 6개월간 유방의 지방패드내에 분명하게 삽입할 수 있었다(제 5A 도). 흥미롭게는 혈관신생은, 추측컨대 패키지 세포에 의해 맥관유래 또는 성장인자의 생산 결과로서, 분석된 모든 동물의 마이크로캡슐 부근에서 발생하였다.

마이크로캡슐 및 주변의 유방조직을 통한 절단면은 혈액용기가 캡슐의 중간부근에서 발견될 수 있다는 것을 확인해주었다 (제 5 B도). 이들 단면은 또한 마이크로캡슐과 유방조직 사이에 위치한 결합조직의 층을 나타냈다. 여기에 이들이 함유하는 것보다 마이크로캡슐 또는 바이러스 생산 세포에 대하여 상당한 염증 및 면역반응의 증거는 없었다.

감염 레트로바이러스 벡터입자가 캡슐로부터 분리되고 주변 유방조직을 감염시켰다는 것을 입증하기 위하여 단면의 일부는 X-gal 오염법에 의한 β-gal의 표현을 분석하였다. β-gal 유전자를 표현하는 세포는 마이크로캡슐의 외측에서 분명히 관찰할 수 있었다 (제 5C 도).

<실시예 4>

이 실시예는 래트 시토크롬 P450 3B1용 유전자를 함유하는 내종양 감염을 위한 레트로바이러스 표현벡터의 구조를 기술한다.

제 6 도에 도시된 표현벡터 pLX2B1은 플라스미드 pLX125 및 pSW1으로부터 얻은 프라그먼트의 결착에 의해 구성되었다 (Kedzie 등, 1991). 플라스미드 pLX125는 Hpal로 선형화하고 수득된 무딘 말단부는 송아지 장의 포스페이타제를 사용하여 탈인산화하였다. DNA는 1% 아가로스겔상의 분리, Qiaquick 프로토콜을 사용하는 절제 및 제조에 의해 정제하였다. 에탄올 침전후 DNA는 수중에 재현탁하였다. 크로닝벡터 pSW1은 Smal 및 Hincll 로 분해시켜 두 개의 무딘 말단의 프라그먼트를 수득하였다. 분해혼합물은 1% 아가로스겔상에 분리하였다. 래트 시토크롬 P450 2B1 cDNA (Fuji-Kuriyama 등, 1982)를 함유하는 가장 짧은 프라그먼트 (1.5kb)는 Qiaquick DNA 추출 프로토콜을 사용하여 절제 및 용출시키고 에탄올을 수중에 침전 및 재현탁하였다.

pLX125 7.6fMol 및 pSW1의 Smal/Hindll-프라그먼트 24fMol을 함께 혼합하고 T4-리가제(Boehringer)를 사용하여 12℃에서 3일간 결착시켰다. 리가제는 65℃에서 10분간 비활성화시키고 DNA 부탄올은 10배 용적의 부탄올로 침전시켰다. 침전된 DNA는 수중에 재현탁시키고 DH10B-박테리아(Gibco)로 일렉트로포레이트(electroporate)하였다. 암피실린 내성 콜로니를 선택하고 DNA를 제작하고 시험을 SspB1/Sall, BamH1/SspB1, Pvul 및 BamH1으로 분해하였다. 최종 수정 플라스미드는 pLX2B1으로 지정하였다.

리포팩션

리포펙션 1일전 3×10⁵레트로바이러스 팩키지 세포 PA317 (Miller 및 Buttimore, 1986)를 6cm 페트리 또는 배양접시로 혼주하였다. 감염 1일에 2㎍의 pLX2B1은 100㎕ 혈청 유리 매체로 혼합하였다. 마찬가지로 15㎕의 리포펙타민(Gibco BRL)은 100㎕ 혈청 유리 매체와 혼합하였다. 플라스미드 함유 용액은 리포펙타민-혼합물에 첨가하고 45분간 접종하였다. 35분후 세포를 2ml 혈청 유리 매체로 한 번 세척하였다. 800㎕의 혈청 유리 매체를 리포펙션-혼합물에 첨가하고 수득된 1ml을 생산된 세포상에 놓았다. 6시간후 10% FCS를 함유하는 1ml Dulbecco 모디파이드 이글스 배지를 첨가하였다. 다음날 세포를 트립신화하고 1:10 희석하고 100ml 접시에 혼주하였다. 24시간후 배지를 네오마이신 유사체 G418을 함유하는 배지로 대체하였다. 단일 세포크론 또는 세포 집단을 분리하고 시토크롬 P450의 표현을 위해 분석하였다.

엔캡슐화

수득된 패키지 세포를 생산하는 레트로바이러스성 벡터는 상기 실시예 2에서 기술되어 있다.

이식

수득된 캡슐을 BALB/c 또는 GR마우스의 이식 또는 자발 종양내에 또는 부근에 "키이 홀(key hole)"수술에 의해 삽입하였다. 직경 1mm의 캡슐 약 6개를 각 수술부위에 삽입하였다. 수술부위는 1 봉합부로 밀폐하였다. 이어서 최대 10주까지 130mg CPA/kg 복강내 체중 및 40-60mg IFO/kg 복강내 체중의 전신계 농도 또는 20mg/m중 100㎕ 를 지접 종양내의 주사에 의해 국부적으로 사이클로포스파미드 또는 이포스파미드로 처리하였다. 이 기간중에 종양사이즈 및 현미경적 외관을 매일 조사하였다. 이어서 마우스를 치사시키고 삽입된 캡슐 및 종양을 함유하는 조직을 제거하고 일광 및 전자 현미경 검사용 조직학적 단면을 제조하였다. 이들 단면은 캡슐의 양호한 접목, 혈관신생, 및 세포면역반응을 나타내는 임파구의 존재 증거가 없음을 분명히 보여준다. 이들 단면은 또한 캡슐내에 세포 사멸 또는 괴사의 흔적이 없음을 보여준다. 반면, 종양은 괴사를 나타냈고 또한 육안적으로 여기에는 시험기간동안 사이즈의 분명한 감소가 있었다.

<실시예 5>

이 실시예는 래트 시토크롬 P450 2B1을 조직적으로 표현하는 안정한 세포라인의 구성을 기술한다.

표현벡터 pc3/2B1은 플라스미드 pcDNA3(Invitrigen) 및 pSW1(Kedzie등, 1991)로부터 수득한 프라그먼트의 결착에 의해 구성하였다.

플라스미드 pcDNA3은 Xhol/Bal로 분해시키고 수득된 딱딱한 말단의 프라그먼트는 송아지 장의 포스포타제를 사용하여 탈인산화시켰다. 벡터 골격의 DNA는 1% 아가로스 겔상의 분리, Qiaquick 프로토콜(Qiagen)을 사용하는 절제 및 제조에 의해 정제하였다. 에탄올 침전후 DNA는 수중에 재현탁하였다.

크로닝벡터 pSW1은 Xhol 및 Xbal로 분해시켜 두 개의 프라그먼트를 수득하였다. 분해혼합물은 1% 아가로스겔상에 분리하였다. 래트 시토크롬 P450 2B1 cDNA (Fuji-Kuriyama 등, 1982)를 함유하는 가장 짧은 프라그먼트 (1.5kb)는 Qiaquick DNA 추출 프로토콜을 사용하여 절제 및 용출시키고, 에탄올을 수중에 침전 및 재현탁시켰다.

pcDNA3 골격 8.3fMol 및 pSW1의 Xhol/Xbal-프라그먼트 24.8fMol을 함께 혼합하고 T4-리가제(Boehringer)를 사용하여 12℃에서 1일간 결착시켰다. 리가제는 65℃에서 10분간 비활성화시키고 DNA 부탄올은 10배 용적의 부탄올로 침전시켰다. 침전된 DNA는 수중에 재현탁시키고 DH10B-박테리아(Gibco)로 일렉트로포레이트(electroporate)하였다. 암피실린 내성 콜로니를 선택하고 DNA를 제작하고 시험을 EcoR1, BamH1, EcoRV 및 Xhol로 분해하였다. 최종 수정 플라스미드는 pc3/2B1으로 지정하였다.

리포팩션

리포팩션 1일전 3×10⁵NIH3T3 세포를 35mm 접시로 혼주하였다. 감염 1일에 2㎍의 pc3/2B1은 100㎕ 혈청 유리 매체로 혼합하였다. 마찬가지로 15㎕의 리포펙타민을 100㎕ 혈청 유리 매체와 혼합하였다. 플라스미드 함유 용액을 리포펙타민-혼합물에 첨가하고 45분간 접종하였다. 35분후 세포를 2ml 혈청 유리 매체로 한 번 세척하였다. 800㎕의 혈청 유리 매체를 리포팩션-혼합물에 첨가하고 수득된 1ml을 생산된 세포상에 놓았다. 6시간후 10% FCS를 함유하는 1ml DMEM (Glutamax)를 첨가하였다. 다음날 세포를 트립신화하고 팩터 10으로 희석하고 100ml 접시에 혼주하였다. 24시간후 배지를 네오마이신 매체로 대체하였다. 14일후 네오마이신 내성 클론을 분리하고 벡터의 존재 및 활성을 시험하였다.

이들 세포를 함유하는 캡슐은 실시예 2에 기술된 바와같이 생산하고 종양부위의 부근의 마우스에 이식하였다. 사이클로포스파미드 또는 이포스파

미드로 처리한 후 치료의 효능을 상술한 바와같이 평가하였다.

도면

제 1 도 : β-갈락토시다제 표현을 입증하기 위해 pBAG로 안정하게 트랜스팩화된 캡슐화 PA317 세포의 조직적 오염도.

제 2 도 : 캡슐에 의해 분리된 바이러스성 입자의 RT-PCR 분석도. (2B; 레인 1-4: 캡슐의 2, 3, 5 및 6주후 취한 배지). 캡슐화되지 않은 BAG바이러스 생산 세포로부터의 세포 배지는 양성대조군(레인5)로서 사용하였고 트랜스팩트화되지 않은 PA317로부터의 배지는 음성대조군(레인 6)으로 사용하였다. 증식된 밴드가 바이러스성 RNA로부터 유도되었음을 입증하기 위해 RT-PCR분석을 수행하기 전에 바이러스성 샘플을 RNase로 분해하였을 때 흔적은 관찰되지 않았다(2C; 레인 1-4). RNase 처리없이 캡슐화되지 않은 BAG 바이러스 생산 세포로부터 제조된 바이러스성 RNA는 RT-PCR 반응에서 양성 대조군으로 사용하였다 (레인 7).

제 3 도 : NIH3T3 세포로 캡슐화된 바이러스 생산 세포의 공배양.

(A) 표적세포는 레트로바이러스성 벡터 생산 팩키지 세포를 함유하는 캡슐을 첨가하기 하루전에 저밀도에서 혼주하였다. 세포 및 캡슐을 여러날 후에 β-갈락토시다제 활성을 조직적으로 오염시켰다.

(B) A에서 β-갈락토시다제 표현 표적세포가 바이러스 생산 세포의 이탈로부터가 아닌 감염으로부터 유도되었음을 입증하기 위해서 게놈 DNA는 세포로부터 추출하고 PCR분석을 수행하였다.

제 4 도 : 구공상 구조가 고배율(×75000)에서 탐지가능하게 되는 캡슐의 표면을 보여주는 주사 전자 현미경사진. 백색 기둥은 100mm (레트로바이러스성 입자의 직경)을 나타내며, 이는 이들 구조가 구공을 나타내며 이 구공을 통하여 바이러스가 캡슐로부터 분리됨을 나타낸다.

제 5 도 : (A) 마우스의 유선에 이식된 캡슐의 조직학적 분석. (B) 4주간 마우스 유선으로 이식후 캡슐을 통한 담면의 일광현미경사진 (133배 확대).

(C) BAG 벡터 생산 PA317 세포를 함유하는 캡슐의 이식후 마우스 유방세포의 감염.

제 6 도 : 프로모터 전환후 U3-MMTV 프로모터에 의해 조절되는 래트 시토크롬 P450 2B1을 위한 유전자를 함유하는 표현 벡터pLX2B1의 구조.

참고문헌:

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Claims

세포 함유 코어부 및 상기 코어부를 둘러싸는 다공성 캡슐벽을 포함하며, 상기 다공성 캡슐벽은 상기 바이러스성 입자에 침투할 수 있음을 특징으로 하는 바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화된 세포.
제 1 항에 있어서, 상기 다공성 캡슐벽이 대-전하 고분자 전해질로부터 형성된 고분자 전해질 복합물로 이루어진 캡슐화 세포.
제 1 또는 2 항에 있어서, 상기 다공성 캡슐 벽이 설페이트 그룹-함유 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체 또는 설포네이트 그룹-함유 합성폴리머 및 4급 암모늄 그룹을 가진 폴리머로부터 형성된 고분자 전해질 복합물로 이루어진 캡슐화 세포.
제 3 항에 있어서, 상기 설페이트 그룹-함유 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체가 셀룰로스 설페이트, 셀룰로스 아세테이트 설페이트, 카르복시메틸셀룰로스 설페이트, 덱스트란 설페이트 또는 스타치 설페이트이고, 또한 상기 설포네이트 그룹-함유 합성 폴리머가 폴리스티렌 설포네이트인 캡슐화 세포.
제 3 항에 있어서, 4급 암모늄 그룹을 가진 상기 폴리머가 폴리디메틸디알릴암모늄 또는 폴리비닐벤질-트리메틸암모늄인 캡슐화 세포.
제 1 항 내지 5 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 세포벽이 셀룰로스 설페이트 및 폴리디메틸디알릴 암모늄으로부터 형성된 복합물로 이루어진 캡슐화 세포.
제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에 있어서, 직경 0.01 내지 5 mm, 바람직하게는 0.1 내지 1 mm인 마이크로캡슐 형태를 갖는 캡슐화 세포.
제 1 항 내지 7 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 캡슐이 구공을 함유하는 캡슐표면에 의해 둘러싸인 캡슐벽의 내부를 형성하는 스폰지상 셀룰로스 설페이트 매트릭스로 이루어지며, 이때 상기 스폰지상 매트릭스는 세포로 충진되는 캡슐화 세포.
제 1 항 내지 8 항중 어느 한 항에 있어서, 다공성 캡슐벽의 표면 구공크기가 80 내지 150 nm, 바람직하게는 100 내지 120 nm인 캡슐화 세포.
제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항에 있어서, 캡슐화 세포에 의해 생산된 바이러스성 입자가 레트로바이러스성 벡터의 게놈을 함유하는 레트로바이러스성 입자인 캡슐화 세포.
제 10 항에 있어서, 레트로바이러스성 입자를 생산하는 캡슐화 세포가 표현 벡터로 트랜스팩트된 팩키지 세포라인이고, 상기 표현 벡터는 상기 레트로바이러스성 벡터 구조물에 의해 운반된 하나 이상의 코딩서열의 표적세포내의 상기 표현을 지시감염시킬 수 있는 레트로바이러스성 벡터 구조물을 운반하며, 상기 패키지 세포 라인은 레트로바이러스성 벡터 구조물이 패키지화되는데 필요한 단백질을 코딩하는 유전자를 운반하는 적어도 하나의 표현벡터가 잠재하는 캡슐화 세포.
제 11 항에 있어서, 상기 코딩서열의 적어도 하나가 마커 유전자, 치료유전자, 항바이러스성 유전자, 항종양 유전자 및 세포독성 유전자로부터 선택된 이형의 펩티드를 코딩하는 캡슐화 세포.
제 12 항에 있어서, 상기 마커 유전자가 β-가락토시다제, 네오마이신, 알콜 디하이드로게나제, 푸로마이신, 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 히그로마이신 및 분비된 알카리성 포스파타제 같은 단백질을 코딩하는 마커 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택되며, 또한 상기 치료유전자는 헤퍼스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 구아닌 포스포리보실 트랜스페라제(gpt), 시토크롬 P 450 같은 단백질을 코딩하는 유전자, 및 SDI 같은 세포 사이클 조절유전자, p53 같은 단백질을 코딩하는 종양억제 유전자, 또는 멜리틴, 세크로핀 또는 시토킨 예를들어 IL-2 같은 단백질을 코딩하는 항증식 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 캡슐화 유전자.
제 11 항에 있어서, 패키지 세포라인이 psi-2, psi-crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 및 GP+envAM-12로부터 선택된 캡슐화 세포.
제 11 항에 있어서, 상기 표현벡터가 pBAG, pLXSN, p125LX, pLX2B1, 또는 pc3/2B1 또는 그의 유도체인 캡슐화 세포.
고분자 전해질의 수용액에 바이러스성 입자를 생산하는 세포를 현탁시킨 다음, 예비 성형된 입자 형태의 현탁액을 대-전하 고분자 전해질의 수용액을 함유하는 침전욕에 주입시킴을 포함하는 제 1 항 내지 15 항중 어느 하나에 따른 캡슐화 세포의 제조방법.
제 16 항에 있어서, 상기 입자 형성이 스프레이에 의해 일어나는 방법.
제 17 항 또는 18 항에 있어서, 상기 세포가 설페이트 그룹-함유 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체, 또는 설포네이트 그룹-함유 합성폴리머의 수용액중에 현탁되는 방법;
제 18 항에 있어서, 상기 설페이트 그룹-함유 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체가 셀룰로스 설페이트, 셀룰로스 아세테이트 설페이트, 카르복시메틸셀룰로스 설페이트, 덱스트란 설페이트 또는 스타치 설페이트이고, 또한 상기 설포네이트 그룹-함유 합성 폴리머가 폴리스티렌 설포네이트인 방법.
제 16 항 또는 17 항에 있어서, 상기 침전욕이 4급암모늄 그룹을 가진 폴리머의 수용액을 함유하는 방법.
제 20 항에 있어서, 4급 암모늄 그룹을 가진 상기 폴리머가 폴리디메틸디알릴암모늄 또는 폴리비닐벤질-트리메틸암모늄인 방법.
제 16 항 또는 17항에 있어서, 상기 세포가 소듐 셀룰로스 설페이트의 수용액중에 현탁된 다음 폴리디메틸디알릴암모늄 크로라이드의 수용액을 함유하는 침전욕중에 주입되는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 수성 셀룰로스 설페이트 수용액이 완충 식염중 0.5 내지 50%, 바람직하게는 2 내지 5% 소듐 셀룰로스 설페이트 및 2 내지 10%, 바람직하게는 5% 태아 송아지 혈청으로 이루어진 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 침전욕중의 수용액이 완충식염중 0.5 내지 50%, 바람직하게는 2 내지 10%, 또는 더욱 바람직하게는 3% 폴리디메틸디알릴암모늄 클로라이드로 이루어진 방법.
제 16 항 내지 24 항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 제 1 항 내지 15 항중 어느 한 항에 따른 캡슐화 세포.
다음 단계 a) 및 b)를 포함하는 표적기관/세포에 유전자를 공급하기 위한 제 1 항 내지 15 항중 어느 한 항에 따른 캡슐화 세포의 용도:

a) 캡슐화 세포를 적절한 배지에 배양시키는 단계; 및

b) 캡슐화 세포를 인간을 포함한 살아있는 동물체내에 이식시키는 단계.
제 26 항에 있어서, 상기 표적기관/세포가 유선 또는 췌장인 용도.
제 26 항에 있어서, 표적기관/세포가 동맥을 둘러싸는 부드러운 근육세포인 용도.