UA65525C2 - Capsules containing encapsulated cells, method for their preparation - Google Patents

Description

Даний винахід відноситься до інкапсульованих клітин, що продукують вірусні частки, зокрема, ретровірусні частки, що містять геном ретровірусного вектору, що несуть терапевтичні гени; до способів отримання таких інкапсульованих клітин; а також до використання вказаних інкапсульованих клітин для доставки генів, зокрема, терапевтичних генів до органів/клітин-мішеней.

Передумови створення винаходу

Доставка терапевтично цінних генів до клітин-мішень є основним принципом генної терапії. Для того, щоб генна терапія стала звичайною процедурою, дуже важливо розробити такі системи, які забезпечували б ефективну іп мімо-доствку терапевтичних генів до клітин-мішень.

Вірусні вектори, зокрема, вектори на основі ретровірусів, являються засобами, що найбільш часто використовуються для переносу генів у генній терапії (Могдап та Апаєгзоп, 1993). В основі більшості апробованих схем генної терапії лежить ех мімо-метод, який заключається в тому, що у пацієнта удаляють відповідні клітини, ці клітини генетично модифікують іп міо, а потім знову вводять пацієнту. Цей метод являється працевмісним та досить вартісним, а також обмежений технологічними складностями. Крім того, можливості цього методу обмежені конкретними клітинами, які повинні бути легко виділені, культивовані, та знову імплантовані (ип2риго та ін., 1995). Хоча іп мімо-доставка терапевтичних генів має багато переваг, однак, у тій формі, в якій її здійснюють в цьому методі вона являється неефективною та проблематичною.

Основною проблемою, пов'язаною з низькою ефективністю переносу генів в данному методі, являється необхідність багаторазового введення вірусного вектору. Така необхідність здійснення множини циклів доставки вектору робить цей метод не тільки працевмісним, але також, очевидно, і неефективним із-за імунної відповіді, що продукується проти вірусних часток.

Одним з шляхів вирішення проблеми являється безпосередня імплантація клітин, що продукують вірусні частки. Імплантація клітин, що продукують вірусні частки та містять геном вірусного вектору, іп умо поблизу органу-мішені або клітин-мішеней, дозволила б також доставляти вірусний вектор безпосередньо до клітин/органів-мішеней.

Крім того, у випадку, коли вірусом, що використовується для вірусного вектору, являється ретровірус, цей метод являється більш ефективним, ніж метод введення більшості одноразових високих доз, оскільки в даному випадку, існує вірогідність того, що векторний вірус буде присутній при реплікації клітин-мішеней, що підвищує його шанс інфікувати ці клітини-мішені. До того ж, вивільнення більш низьких рівней вірусних часток, але більш довготривале, може бути переважливим, оскільки воно дозволяє уникнути імунної відповіді проти цих вірусних часток.

Для ефективної доставки вірусних векторів, клітини, що продукують вірусні частки, мають бути життєздатними на протязі довгого періоду часу після їх імплантації хазяїну, і в цей період часу мають продукуватися та вивільнятися з клітин вірусні частки. У відсутності значної імунної відповіді, наприклад, після імплантації у головний мозок, ці клітини можуть зберігати життєздатність на протязі довгого періоду часу (Симег та ін., 1992, Ват та ін., 1993). Однак, для успішного здійснення імплантації в інші ділянки організму, клітини-продуценти мають бути спочатку захищені від імунної відповіді.

Таким чином, довготривала ефективність цього методу залежить від (1) захищеності клітин від імунної системи хазяїна, яка звичайно елімінує клітини, що продукують вірусні частки, особливо, якщо ці клітини походять з різних видів, як це звичайно має місце у випадку таких клітин; та (2) життєздатності клітин іп мімо на протязі тривалого періоду часу, яке може знадобитися для васкуляризації.

Інкапсуляція клітин у проникних структурах, які допускають вивільнення деяких біологічно активних молекул, але які, в той же час, захищають клітини, що продукують ці молекули, від імунної системи хазяїна, мала певний успіх (див. огляд Спапо, 1995). Були інкапсульовані клітини, піддані генетичній модифікації для продукування гормону росту людини (ПОН) (Таї та йип, 1993) або секретованої форми аденозиндеамінази людини (Нипде5 та ін., 1994). В обидвах цих дослідженнях, клітини були інкапсульовані в полі-І -лізин- альгінатні мікрокапсули, та було показано, що ці клітини залишаються життєздатними на протязі довгого періоду часу в культурі. Таким чином було здійснено довге продукування ферменту або гормону. Крім того, було показано (Таї та б!йип, 1993), що після трансплантації мікрокапсул мишам, клітини залишаються життєздатними на протязі 1 року та продовжують продукувати ПОН, щ освідчить про те, що капсули захищають трансфекування клітини від дестркуції імунної системи хазяїна.

Сповіщалось також про проведення інкапсуляції клітин з використанням інших матеріалів. Клітини нирки детища хом'яка, модифіковані так, щоб вони продукували фактор росту нервової тканини, були інкапсульовані в поліакрилонітрид/ввінілхлорид та імплантовані в головний мозок пацюка. Інкапсульовані клітини зберігали життєздатність на протязі, принаймні, 6 місяців, та продовжували продукувати Ма (М/іпп та ін., 1994; Оеєедіоп та ін., 1995).

Крім того, гепатоцити були успішно інкапсульовані в поліелектролітний комплекс сульфату целюлози та полідиметилдиаліламонію (бЗіапде та ін., 1993). Більш 9095 інкапсульованих гепатоцитів зберігали свою життєздатність, та у протилежність гепатоцитам, культивованим у вигляді моношару, інкапсульовані клітини виявляли підвищену метаболічну активність. Однак, в цій роботі не було висловлено яких-небудь пропозицій відносно того, що капсули з сульфату целюлози/полідиметилдиаліламонію здатні забезпечувати ріст клітин іншого типу, таких, як клітини, що продукують вірусні частки, або забезпечувати вихід вірусних часток з цих капсул.

Отримання капсул з сульфату целюлози, що використовуються в даному винаході, було детально описано в роботі ОЕ 40 21 050 А1. В цій патентній заявці був також описаний синтез сульфату целюлози. Методи для повної характеризації капсул з сульфату целюлози були розроблені Н.ЮОашлгепбего та ін. (Віотаї, Ай. СеПев 5

ІтторБ. Віоїесн., 21 (3), 399-405 (1993)). Інші капсули з сульфату целюлози були описані в патенті 282 135 954.

Властивості целюлозних капсул, тобто розмір пор, товщина стінки та механічні властивості, залежать від декількох факторів, наприклад, таких, як фізичні умови, при яких були отримані ці капсули; в'язкість осаджуючої бані; її йонна сила; температура; швидкість додавання суспензії клітин/сульфату целюлози; та структура сульфату целюлози; а також від інших параметрів, що описані групою ОСашлгепрега.

Несподівано було виявлено, що тривале продукування вірусних часток з імплантованих клітин може бути досягнено шляхом інкапсуляції клітин в поліелектролітному комплексі. Хоча пори таких капсул являються досить великими та здатні пропускати всередину капсул антитіла та комплемент, які як відомо, інактивують віруси (М/єїЇсп та ін., 1975, Согпецйа та ін., 1990), однак, яких-небудь значних імунних або запальних реакцій, або некрозу в області імплантації капсул не спостерігалось. Крім того, несподівано було виявлено, що капсули даного винаходу добре імплантуються хазяїну та швидко васкуляризуються. Тому інкапсульовані клітини даного винаходу забезпечують пролонговану доставку вірусних векторів, що несуть терапевтичні гени іп мімо.

Короткий опис винаходу

Даний винахід, іпіег аіїа, включає (окремо або в комбінації): продукуючі вірусні частки клітини, що заключені в капсулу, яка складається з ядра, що містить клітини, та пористої стінки, яка оточує це ядро; причому вказана пориста стінка капсули є проникливою для вказаних вірусних часток; вищевказані клітини, що поміщені в капсулу, пориста стінка якої складається з поліелектролітного комплексу, утвореного протилежно зарядженими поліелектролітами; вищевказані клітини, що заключені в капсули, пориста стінка яких складається з поліелектролітного комплексу, утвореного з полісахаридів, що містять сульфонатну групу, або похідних полісахариду, або з синтетичних полімерів, що містять сульфонатну групу, та полімерів з четвертинно-амонієвими групами; вищевказані клітини, що заключені в капсули, де полісахаридами, що містять сульфатну групу, або похідним полісахарида є сульфат целюлози, ацетосульфат целюлози, сульфат карбоксиметилцелюлози, сульфат декстрану, або сульфат крохмалю; а синтетичним полімером, що містить сульфонову групу, є сульфонат полістиролу; вищевказані клітини, що заключені в капсули, в яких полімером з четвертинно-аммонієвими групами є поліметидіаліламоній або полівінілбензил-триметиламоній; вищевказані клітини, що заключені в капсули, в яких пориста стінка капсули складається з комплексу, утвореного з сульфату целюлози та полідиметилдіаліламонію; вищевказані клітини, що заключені в капсули, які мають форму мікрокапсул з діаметром 0,01-5мм; а переважно, 0,1-їмм; вищевказані клітини, що заключені в капсулу, яка складається з матриці на основі губчатої сульфатної целюлози, яка утворює внутрішню частину капсули, оточену поверхнею стінки капсули, що містить пори; причому вказана губчата матриця заповнена клітинами; вищевказані клітини, що заключені в капсули, де пориста стінка капсули має розмір пор від 80 до 15Онм, а переважно від 100 до 120нм; вищевказані інкапсульовані клітини, що продукують вірусні частки, де вказаними вірусними частками є ретровірусні частки, які містять геном ретровірусного вектору; вищевказані інкапсульовані клітини, що продукують ретровірусні частини, де вказані інкапсульовані клітини представляють собою пакувальну клітинну лінію, що трансфекується експресійним вектором, що несе ретровірусну векторну конструкцію, яка здатна інфікувати та регулювати експресію у клітинах-мішенях однієї або декількох кодуючих послідовностей, що присутні у вказаній ретровірусній конструкції; причому, вказана пакувальна клітинна лінія включає, принаймні, один експресійний вектор, що несе гени, що кодують білки, необхідні для упаковки ретровірусної векторної конструкції; вищевказані інкапсульовані клітини, де, принаймні, одну з вказаних послідовностей, що кодує гетерологічні пептиди, вибирають з маркерних генів, терапевтичних генів, противірусних генів, протипухлинних генів та генів, що кодують цитокіни; вищевказані інкапсульовані клітини, де вказаний маркерний ген вибирають з групи, що включає маркерні гени, які кодують такі білки, як р-галактозидаза, неоміцин, алкогольдегідрогеназа, пуроміцин, гіпоксантинфосфорибозилтрансфераза (НРРТ), гігроміцин, та секретуюча лужна фосфатаза; а вказаний терапевтичний ген вибирають з генів, які кодують такі білки, як тимідинкіназа вірусу простого герпесу, цитозиндеаміназа, гуанінфосфорибозилтрансфераза (др), цитохром Р4і50, генів, що регулюють клітинний цикл, таких, як 50; пухлинно-супресорних генів, які кодують такі білки, як р53, або антипроліферативних генів, які кодують такі білки, як мелітин, цекропін, або цитокіни, такі як 11-12; вищевказані інкапсульовані клітини, де лінію клітин з дефектом упаковки вибирають з рвзі-2, рві-сгурі, рвї-

АМ, ОР--Е-86, РАЗ17, та СР -непУАМ-12; вищевказані інкапсульовані клітини, де експресійним вектором, трансфікованим в пакувальну клітинну лінію, є рвАс, рі Х5М, р125ІХ, рі-Ха2ВІ, або ре3/28В1, або їх похідні; спосіб отримання вищевказаних інкапсульованих клітин, який заключається в тому, що клітини, продукуючі вірусні частки, суспендують у водному розчині поліелектроліту, а потім суспензію у формі попередньо сформованих часток вводять в осаджаючу баню, що містить водний розчин протилежно заряженого поліелектроліту; вищевказаний спосіб, в якому утворення частин проходить шляхом розпилення; вищевказаний спосіб, в якому клітини суспендують у водному розчині полісахариду, що містить сульфатну групу, або його похідну, або синтетичного полімеру, що містить сульфонатну групу; вищевказаний спосіб, де полісахарид, що містить сульфатну групу, або похідну полісахариду вибирають з сульфату целюлози, ацетосульфату целюлози, сульфату карбоксиметилцелюлози, сульфату декстрану або сульфату крохмалю; а синтетичним полімером, що містить сульфонатну групу, є полістиролсульфонат; вищевказаний спосіб, де осаджуюча баня містить водний розчин полімеру з четвертинно-амонієвими групами; вищевказаний спосіб, де полімером з четвертинно-амонієвими групами є поліметилдіаліл- або полівінілбензилтриметиламоній; вищевказаний спосіб, в якому клітини суспендують у водному розчині сульфату натрій-вмісної целюлози, та отриману суспензію вводять в осаджуючу баню, що містить водний розчин хлориду полідиметилдіаліламонію; вищевказаний спосіб, де водний розчин сульфату целюлози складається з 0,5-5095, а переважно 2-59 сульфату натрій-вмісної целюлози, та з 2-1095, переважно 595 фетальної телячої сироватки в забуференому фізіологічному розчині; вищевказаний спосіб, де водний розчин в осаджуючій бані складається з 0,5-5095, переважно 2-1095, а більш переважно 395 хлориду полідиметилдіаліламонію в забуфероному розчині; вищевказані інкапсульовані клітини, отримані вищеописаним способом; використання вищевказаних інкапсульованих клітин для доставки генів до органів/клітин-мішеней, що передбачає: а) культивування інкапсульованих клітин у підходящому середовищі; та б) імплантацію інкапсульованих клітин в живий організм тварини, включаючи людину; використання, що описане вище, де органом-мішенню/клітинами-мішенями є молочна залоза або підшлункова залоза; та використання, описане вище, де органом-мішенню/клітинами-мішенями є клітини гладких м'яз та клітини інших типів, що обмежують артерії.

Цілі даного винаходу

Ціллю даного винаходу є отримання інкапсульованих клітин, що продукують вірусні частки, причому вказані капсули дозволяють вивільнятися вірусним часткам, що продукуються клітинами, не викликаючи, при цьому, значної імунної або запальної відповіді хазяїна після їх імплантації цьому хазяїну.

Іншою ціллю даного винаходу є спосіб отримання вказаних інкапсульованих клітин, продукуючих вірусні частки.

Ще однією ціллю даного винаходу є розробка способу доставки генів, а зокрема, терапевтичних генів, до органу-мішені/клітинам-мішеням шляхом імплантації вказаних інкапсульованих клітин, продукуючих вірусні частки хазяїну; та, тим самим, способа тривалого продукування та вивільнення вірусних часток в органах- мішенях або поблизу клітин-мішеней.

Опис винаходу

У відповідності з даним винаходом, клітини, продукуючі вірусні частки, заключають в капсули, які здатні вивільняти вірусні частки, які продукуються клітинами, не викликаючи, при цьому, значної імунної або запальної відповіді хазяїна після їх імплантації цьому хазяїну.

Інкапсульовані клітини даного винаходу можуть бути отримані шляхом суспендування клітин, які продукують вірусні частки, у водному розчині поліелектроліту (наприклад, вибраного з полісахаридів, що містять сульфатну групу, або їх похідних, та синтетичних полімерів, що містять сульфонатну групу), з по слідуючим введенням суспензії, отриманої у вигляді попередньо зформованих часток, в осаджуючу баню, що містить водний розчин протилежно заряженого поліелектроліту (наприклад, полімеру з четвертинно- амонієвими групами).

Полісахаридами, що містять сульфатну групу, або їх похідними є сульфатна целюлоза, ацетат сульфатної целюлози, сульфатна карбоксиметилцелюлоза, сульфат декстрану, або сульфат крохмалю у формі солі, а зокрема, натрієвої солі. Синтетичним полімером, що містить сульфонатну групу, може бути полістиролсульфонатна сіль, а переважно, натрієва сіль.

Полімерами, що мають четвертинно-амонієві групи, Є полідиметилдіаліламоній або полівінілбензилтриметиламоній у формі їх солі, переважно хлориду.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу, клітини, продукуючі вірусні частки, інкапсульовані в комплекс, утворений з сульфатної целюлози та полідиметилдіаліламонію.

Вказані капсули отримують переважно шляхом суспендування клітин, що продукують вірусні частки, у розчині, що містить 0,5-5095, переважно 2-590 натрій-сульфатної целюлози, та 595 фетальної телячої сироватки, необов'язково у буфері. Потім цю суспензію за допомогою дозуючого пристрою (наприклад, повітряного ежектру або п'єзоелектричної системи) вводять, розмішуючи при цьому, в осаджуючу баню, що містить 0,5-5095, переважно 2-1095, а найбільш переважно біля 395 хлориду полідиметилдіаліламонію, необов'язково в буфері. Утворення капсул проходить за міллісекунди, та клітино-вмісні капсули витримують в осджуючіїй бані на протязі часу від 30 секунд до 5 хвилин, а потім промивають. Швидкість цього методу дає гарантію того, що інкапсульовані клітини не будуть піддаватися досить великому стресу під час всієї процедури (Зіапде та ін., 1993).

Капсули даного винаходу мають діаметр, що варірує від 0,01 до 5мм, а переважно від 0,1 до 1їмм. При цьому, можуть бути виготовлені капсули, що містять різні кількості клітин. З використанням способу інкапсулювання даного винаходу, в поліелектролітний комплекс може бути інкапсульовано до 1079, а переважно 105-107 клітин, продукуючих вірусні частки.

Капсули, що складаються з сульфатної целюлози та полідиметилдіаліламонію мають прекрасні механічні властивості та можуть бути виготовлені в різних розмірах та з різним розміром пор.

Розмір пор складає від 80 до 150нм, а переважно від 100 до 120нм.

Інкапсульовані клітини можуть бути культивовані в нормальному середовищі для культивування клітин (природа якої залежить від конкретно інкапсульованих клітин) при стандартних умовах вологості, температури та концентрації СО». Вивільнення вірусних часток з капсул в культуральне середовище в процесі культивування може бути продемонстровано або з використанням АТ-РСВ-технології (завдяки полімеразної ланцюгової реакції з зворотною транскриптазою), або шляхом переносу безклітинного супернатанту (відфільтрованого через 0,45мкм-фільтр) до клітин-мішеней з послідуючим виявленням вірусної інфекції за допомогою аналізу на активність маркерних білків, що кодуються генами, які несуть вірусну векторну конструкцію, що міститься у вірусній частці. Якщо маркерний ген, присутній у вірусному векторі, є геном, що несе стійкість до специфічної сполуки на клітині-мішені, то може бути встановлений титр вірусу, що продукується цією системою.

Після відповідного періоду культивування (звичайно, не менш і години та не більш 30 днів), капсули що містять клітини, можуть бути хірургічно імплантовані або безпосередньо, або шляхом ін'єкції з використанням шприцу в різних ділянках організму.

Вірусні частки, що продукуються інкапсульованими клітинами даного винаходу, можуть бути отримані на основі будь-якого вірусу, що використовується для генної терапії, включаючи, але не обмежуючись ними, аденовіруси, аденоасоційовані віруси, віруси герпесу або ретровіруси; див., наприклад, огляд Сипабіїгд та

ЗаІтопв, 1995.

В переважному варіанті здійснення даного винаходу, інкапсульованими клітинами є пакувальні клітинні лінії, продукуючі ретровірусні частки, що містять геном ретровірусної векторної конструкції, що несе маркерні та/або терапевтичні гени.

Ретровірусні векторні системи складаються з двох компонентів: 1) першим компонентом є експресійний вектор (плазмідний вектор), що несе ретровірусну векторну конструкцію, що представляє собою модифікований ретровірус, в якому гени, кодуючі вірусні білки, були замінені терапевтичними генами, включаючи, але необов'язково, маркерні гени, призначені для перенесення до клітин-мішеней. Оскільки заміна генів, кодуючих вірусні білки, приводить до значного пошкодження вірусу, то він повинен бути "врятований" за допомогою другого компоненту даної системи, який забезпечує захист модифікованого ретровірусу від можливого його пошкодження із-за втрати вірусних білків; 2) другим компонентом є лінія клітин, яка продукує велику кількість вірусних білків, але яка, при цьому, не здатна продукувати компетентний у відношенні реплікації вірус. Ця клітинна лінія відома як пакувальна клітинна лінія та представляє собою клітинну лінію, трансфіковану плазмідами, що несуть гени, які дозволяють здійснювати упаковку модифікованого ретровірусного геному. Ці плазміди регулюють синтез потрібних вірусних білків, необхідних для продукування віріону.

Для генерування упакованого ретровірусного вектору, векторну плазміду трансфікують в пакувальну клітинну лінію. В цих умовах, модифікований ретровірусний геном, що включає вбудовані терапевтичні та необов'язково маркерні гени, транскрибуються з векторною плазмідою, та генерований в результаті цього модифікований ретровірусний геном упаковується в ретровірусні частки. Клітина, інфікована такою вірусною часткою, не може продукувати вірусні частки, оскільки в цих клітинах відсутні вірусні білки. Однак, в інфікованих клітинах присутня ретровірусна векторна конструкція, що несе терапевтичні та маркерні гени, та ця конструкція може експресуватися в даних клітинах. в МмО94/29437, МО 89/11539 та УУО 96/07748 описані різні типи ретровірусних векторних систем, які можуть бути використані в цілях даного винаходу.

Вірусні частки, продуковані інкапсульованими клітинами даного винаходу, можуть бути сконструйовані так, що вони будуть містити геном вірусного вектору, що несе маркерні та/або терапевтичні гени.

Прикладами маркерних або терапевтичних генів, присутніх у вірусному векторі, можуть служити гени, які кодують такі білки, як рД-галактозидаза, неоміцин, алкогольдепдрогеназа, піроміцин, гіпоксантинфосфорибозилтрансфераза (НРАТ), гігроміцин та секретована лужна фосфатаза; або терапевтичні гени, які кодують такі білки, як тимідинкіназа вірусу простого герпесу, цитозиндеаміназа, гуанінфосфорибозилтрансфераза (де), цитохром РА5О, гени, регулюючі клітинний цикл, такі, як 501, пухлинно-супресуючі гени, які кодують такі білки, як р53, антипроліферативні гени, які кодують такі білки, як мелітин, цекропін, або цитокіни, такі, як ІІ -2.

В одному з конкретних своїх варіантах, даний винахід відноситься до використання інкапсульованих клітин даного винаходу для лікування пухлинних захворювань.

Багато злоякісних пухлин не дуже добре піддаються хіміотерапії. Протипухлинні лікарські засоби, що використовуються для лікування пухлин, застосовуються, у більшості випадків, системно, а тому розсіюються по всьому організму пацієнта. Використання високих системних доз таких лікарських засобів, що необхідні для протиракової терапії, часто супроводжуються небажаними для пацієнта бічними ефектами. Одним з засобів, завдяки якому можуть бути вирішені проблеми, пов'язані з високою системною концентрацією протиракових лікарських засобів, є безпосереднє введення лікарського засобу в пухлину, або активація цього лікарського засобу безпосередньо поблизу пухлини. Це може бути досягнено шляхом імплантації інкапсульованих клітин даного винаходу, продукуючих вірусні частки, що містять геном сконструйованого вірусу, а зокрема, ретровірусного вектору, що несе ген, кодуючий протираковий лікарський засіб, наприклад, активуючий фермент, здатний перетворювати пролікарську сполуку в цитоксичний агент або в пухлинних клітинах, або поблизу пухлинних клітин.

В одному з варіантів даного винаходу отримують інкапсульовані клітини, продукуючі ретровірусні частки, що містять геном ретровірусного вектору, що несе гени пухлинно-релевантних ферментів, таких, як цитохром

Р4і50, або "гени-самовбийці", включаючи гени тимідинкінази (але не обмежуючись ними), яка перетворює нетоксичні пролікарські засоби в один або декілька токсичних метаболітів. Вказані інкапсульовані клітини даного винаходу можуть бути використані для лікування раку шляхом імплантації капсул в пухлини або поблизу пухлин, наприклад, пухлин в підшлунковій залозі або у молочній залозі.

Додатково забезпечення направленої доставки може бути досягнено шляхом використання регуляторних елементів та промоторів, специфічних до даних клітин-мішеней, для регуляції експресії зціплених терапевтичних генів в конкретних типах клітин.

Такими регуляторними елементами та промоторами, специфічними для клітин-мішеней, є, наприклад, регуляторні елементи та промотори, специфічні для підшлункової залози, наприклад, такі, як регуляторні елементи та промотори гену вугольної ангідрази Ії та р-глюкогинази; лімфоцит-специфічні регуляторні елементи та промотори, включаючи імуноглобулін-специфічні регуляторні елементи та промотори, та лімфоцит-специфічні регулюторні елементи та промотори вірусу пухлини молочних залоз миші (ММТУ); регуляторні елементи та промотор, специфічні ля молочних залоз, включаючи УМАВ (білок молочної сироватки)-, ММТМ-, р-лактоглобулін- та казеін-специфічні регуляторні елементи та промотори, а також

ММТМ-специфічні регуляторні елементи та промотори, що несуть сприйнятливість до глюкокортикоіїдних гормонів, та регулюючі експресію в молочних залозах. Прикладами інших промоторів с промотори СО4, СОЗ34 та 1/2. Вказані регуляторні елементи та промотори регулюють, переважно, експресію вищеописаного ретровірусного вектору.

Можуть бути також використані індукуючі промотори, такі, як промотори, що індукуються випроміненням, наприклад, промотор фактору міжклітинної адгезії-1 (ІСАМ-1), промотор рецептору епідермального фактору росту (ЕСЕВ), та промотор фактору некрозу пухлин (ТМЕ).

Нижчеслідуючі приклади ілюструють даний винахід, однак, вони не повинні роздивлятися як деяке обмеження об'єму винаходу.

Приклад 1

Ліпофекція РАЗ17 вектором рвАс та виділення резистентних клітин 418

Амфотропні МІНЗТЗ основні пакувальні клітини РАЗ 17 (МіШег 5 Вийцітог, 1986) культивували в модифікованій по способу Дульбекко середовищі Ігла (ОМЕМ), що містить 1095 фетальну сироватку теляти.

Потім, за один день до ліпофекції, клітини засівали в 10-сантиметрові чашки Петрі при щільності 3х105, після чого, ці клітини піддавали липофекції 2 мікрограмами вектору рвАа (Рігесе та ін., 1987), що несе МІ М (вірус лейкозу мишей), на основі ретровірусного вектору, з використанням ліпофектамінового набору від

СІВСО/ВВЇ, у відповідності з інструкціями виробника. Потім, клітини розводили 1:10 та культивували у звичайному середовищі, що містить додатково 40Омкг/мл (3418 (СІВСО/ВАІ). Через 14 днів колонії резистентних клітин 1418 об'єднували.

Приклад 2

Мікроінкапсулювання 107 клітин суспендували в їмл забуферованого фізіологічного розчину, що містить 2,595-ний натрій- вмісний сульфат целюлози, та 596-ну фетальну сироватку теляти, а потім отриману суспензію вводили за допомогою дозуючої системи (ежекторної системи) в баню для осадження, що містить 2-З395-ний полідиметилаліламоній в забуфероному фізіологічному розчині. Утворення капсули проходило за міллісекунди з послідуючим формуванням внутрішнього, більш пористого шару для механічної підтримки, що складається, в основному, з сульфату целюлози. Капсули, що містять клітини, витримували у бані для осадження на протязі часу від 30 секунд до 5 хвилин, а потім промивали у середовищі ОМЕМ (5їаподе та ін., 1993). Для біологічних досліджень були використані партії, отримані з різними параметрами, описані вище, тобто такими як концентрація натрій-вмісного сульфату целюлози, поток в ежекторній системі, та час перебування у бані для осадження. Прикладами характерних умов є слідуючі умови: 2,595 натрій-вмісний сульфат целюлози, 295 полідиметилаліламоній, та 1 хвилина перебування у бані для осадження; або 1,595 натрій-вмісний сульфат целюлози, 295 полідиметилаліламоній, та 0,5 хвилин перебування у бані для осадження; або 3905 натрій-вмісний сульфат целюлози, З95о-ний полідиметилаліламонш, та 2 хвилини перебування у бані для осадження. Точні параметри були вибрані також з урахуванням точного розміру капсул, які треба отримати, товщини стінок капсул, а також інших властивостей.

Приклад З

Імплантація мікрокапсул в молочній залозі миші

Мікрокапсули вводили в молочні залози двомісячних самок мишей ВАЇ В/с шляхом операції по типу "ключ- замок", та вхідний отвір закривали одним швом. В кожну ділянку операції було введено до 6 капсул діаметром 0,5-2мм.

В іп міго-дослідженнях вірусу, що вивільнюється з мікрокапсул, структуру мікрокапсул та вплив імплантації капсули в імунокомпетентну мишу, досліджували з використанням слідуючих тест-методів:

А) р-галактозидна активність.

Виявлення інфікованих клітин шляхом гістохімічного фарбування здійснювали, як описано раніше (Серко, 1989). Зрізи клітин, капсул або тканини промивали охолодженим РВ5, а потім фіксували 295 параформальдегідним розчином на протязі 20 хвилин-24 години у відповідності з товщиною зразка. Після інтенсивної промивки фосфатно-буферним розчином, зрізи клітин, капсул або тканини були інкубовані в розчині, що містить субстрат Х-да! (20мМ КзБеСМе, 20мМ К.РеСМе ЗНгО, 2 мММасСі» та мг/мл Х-оаї), принаймні, на протязі 2 годин при 3770.

В) Інфікування 4х107 клітин-мішеней засівали в б-лункові планшети для культивування тканини за 6 годин до інфікування.

Капсули, що містять вірус-продукуючі клітини, поміщали поверх клітин-мішеней, та до середовища додавали полібрен (Змкг/мл). Через чотири години середовище заміняли для видалення залишкового полібрену. Через днів деякі лунки були пофарбовані завдяки р-галактозидазної активності, як описано вище, а інші лунки були трипсинізовані в більші чашки для культивування тканини, та культивували в середовищі, що містить 40Омкг/мл 418. (418-резистентні колонії були виявлені через 16 днів.

С) АТ-РСВ-аналіз

Вірусні частки від Ббмл супернатанту культурального середовища капсул осаджували шляхом ультрацентрифугування (240000х4д, 1 годину, 4"С). Утворений осад ресуспендували у буфері для лізису (195

Тритон 100, 0,595 дезоксихолат натрію, 0,196 додецилсульфат натрію, РВ5), та РНК екстрагували фенолом з послідуючим осадженням етанолом, як описано раніше (ЗаІтопзв та ін., 1986). Потім, РНК піддавали зворотній транскрипції в ДНК з використанням готового до вживання набору з Т-праймованою одноланцюговою послідовністю (НАєаду-То-сСо Т-ріїтей Пгві-зїапа КИ Ріпагтасіа). РОСВ-ампліфікацію здійснювали з використанням праймерів, локалізованих в епм та А з МІ М похідного ВАС; -вектору І ТА (фіг.2А). РСВ- ампліфікацію здійснювали в 100 мікролітрах реакційної суміші, що містить 5200мММ КСІ, 10мМ Трис-НСЇІ (рн 8,3), 1,5мМ Мас», 0,0195 (мас/об.) желатину, а також 100мМ кожного аМТР, 40пМ кожного праймеру, та 2,5 одиниць полімерази Тад (Режкіп ЕІтеїг). Реакції проводили в термолунках 9600 (Реїкіп ЕІтег Сей5 Тпепта сусієг) при слідуючих умовах: 1 хвилина при 94"С, 2 хвилини при 53"С та 3 хвилини при 72"С за 35 циклів. РОВ-продукти виділяли на 0,895 агарозному гелі, а потім переносили на 7еїа зондові мембрани (ВІОВАОБ), та гібридизували, як описано раніше (Іпагассоїйо та ін., 1995), з З2Р-міченим РСОВ-фрагментом (612п.0.) геному МІ М, генерованого з використанням тих же праймерів та рвда в якості матриць. МІ М-специфічні послідовності візуалізували з використанням фосфовізуалізованої системи Еції (ВАЗ 1000). о) РОВ-аналіз

Геномну ДНК (мкг) ампліфікували за допомогою РСА з використанням одного праймеру, розташованого всередині залишкових послідовностей епм вектору ВАС, та іншого праймеру в поліомній області плазміди, розташованій за межами ретровірусних векторних послідовностей (Фіг.38). РСОВ-реакції проводили, як описано вище, з використанням слідуючих умов: їхв. при 94"С, 2хв. пр 50"С та 3 хв. при 68"С за 35 циклів. РСВ- продукт гібридузували з З"Р-міченим ХраІ-ДНК-фрагментом 1,5Ко вектору рВАС, який є специфічним до поліомних послідовностей.

Р) Електронна мікроскопія

Зразки для оцінки скануючої електронної мікроскопії (ЗЕМ) та трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ) промивали в РВ5 (рн-7,35), а потім фіксували в 195 глутаральдегіді в РВ5 на протязі 15 хвилин, після чого фіксували в 295 0504 на протязі 15 хвилин. Зразки дегідратували в ступінчатому градієнті етанолу, а потім розділяли на дві групи: а) 5ЕМ-зразки осушували при критичній температурі з використанням СО» та покривали платиновим шаром 1-Знм (Ете5соре 50 500; Авійога, Епдіапа). Покриті зразки оцінювали в емісійному скануючому електронному мікроскопі при 10кВ (уео! У5М-6З300Е; Токіо, Японія) з прискорюючою напругою 5-10КкВ у другому режимі; Б) ТЕМ-зразки занурювали в Ероп. Зверхтонкі зрізи два рази фарбували уранілацетатом та цитратом свинцю, та просліжували у просвічуючому електронному мікроскопі 7еів5 Ет-10С (Обеїкоснпеп, Німеччина).

Результати

Іп міго-дослідженнях вірусу, що вивільнюється з мікрокапсул

Фарбування клітин в мікрокапсул, отриманих в Прикладі 2, субстратом Х-даї, описаному у вищевказаному тесті на р-галактозидазну активність, виявило, що інкапсульовані клітини експресують ген р-галактозидази, що кодується вектором рвдАа (Ффіг.1), також як і неінкапсульовані клітини, продукуючі вектор (не показані).

Для ілюстрації того, що вірусні частки вивільнюються з клітин в мікрокапсули в культуральне клітинне середовище, РНК отримували з осаджених віріонів, зібраних з супернатантів капсул після різних періодів часу культивування. Цю РНК аналізували шляхом полімеразної ланцюгової реакції із зворотною транскриптазою (АТ-РСТ) з використанням праймерів, комплементарних вірусу епм та області А, описаній у вищевказаному

АТ-РСВ-аналізі. МІ М-специфічний РОВ-генерований фрагмент потрібного розміру (612п.0.) досліджували в культуральному середовищі мікрокапсул, принаймні, на протязі 6 тижнів (Фіг.2В, шляхи 1-4), причому, в цей період часу аналізи переривали. Цей фрагмент не є наслідком контамінації ДНК, оскільки попередня обробка вірусної РНК РНКазою перед полімеразною ланцюговою реакцією з зворотною транскриптазою не переводила до появи сигналу (Фіг.2В, 1-4).

Продукування та вивільнення інфекційного вірусу з капсул може бути підтверджено шляхом їх сумісного культивування (описаного вище в тесті на їх інфікування) з клітинами-мішенями, такими як, наприклад, МІТЗТЗ (Чаїпспі! та ін., 1969) або САЕК (Сгапавеї! та ін., 1973). Через 4 дні після сумісного культивування, аліквоту клітин-мішеней, а також інкапсульованих клітин з дефектом упаковки фарбували для проведення аналізу на р- галактозидазну активність, як описано вище. Клітини-мішені, що залишилися, були відібрані на резистентність до (1418. Було показано, що багато сумісно культивованих клітин МІНЗТЗ та СВЕК експресують ген р-даї (Фіг.ЗА).

Для підтвердження того, що клітини-мішені можуть придбати ген р-да! шляхом інфікування, ці клітини- мішені аналізували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, ВАС-продукуюча пакувальна клітинна лінія основана на клітинній лінії РАЗ17 (МіПег 5 Вицітоге, 1986), та несе ген тимідинкінази вірусу простого герпесу (НБУ-ТК), продукт якого перетворює сполуку проліків ганцикловір в цитотоксичну лікарський засіб. Клітини мішені МІНЗТЗ та СЕВК звичайно не несуть цього гену. В експерименті, який проводили для того, щоб продемонструвати, р-даІ-експресуючі сумісно культивовані клітини-мішені МІТЗТЗ та СЕАК є резистентним до

СС, що вказує на відсутність витоку ВАС-продукуючих клітин, геномну ДНК екстрагували з клітин-мішеней та аналізували за допомогою РСА-аналізу (описаного вище) на присутність плазмдних послідовностей за межами вектору. Ці послідовності були присутні у пакувальних клітинах, оскільки вектор ВАС був ліпофікований у ці клітини у формі плазмідного вектору ВА. Однак, вірус, продукований з клітин з дефектом упаковки, не несе цих плазмідних послідовностей, а тому вони не повинні бути присутні в інфікованих клітинах-мішенях. На фіг.З3В показано, що плазмідні послідовності не були виявлені, що вказує на інфікування цих клітин вектором ВА.

Структура мікрокапсул

Були отримані зрізи мікрокапсул, а їх структура було проаналізовано за допомогою електронної мікроскопії. Внутрішню частину капсули, що складається з губчатоподібної матриці, заповняли клітинами (Фіг.4). Аналіз поверхні мікрокапсул, проведений за допомогою скануючої електронної мікроскопії, виявив присутність пор, які є достатньо великими, що дозволяє ретровірусним векторним частинкам вивільнятися з капсул, що підтверджує біла смуга на зображенні поверхні капсули (Фіг. 4), яка представляє середній діаметр ретровірусної частки.

Іп мімо-стабільність в імунокомпетентних мишах

Для оцінки іп мімо-стабільності мікрокапсул, та для того, щоб визначати чи мікрокапсули продукують чи вірус високу імунну відповідь, ці мікрокапсули імплантували в молочні залози двомісячних самок мишей

ВАЇ В/с. Мишей умертвляли у різні інтервали часу після імплантації для кількісної оцінки присутніх мікрокапсул та для того, щоб визначити чи продукується інфікційний вірус. Як можна явно бачити, імплантовані мікрокапсули були поміщені всередину жирного шару молочних залоз, принаймні, на протязі 6 тижнів після імплантації (Фіг.5А). Цікаво відмітити, що васкуляризація поблизу мікрокапсул проходила у всіх тварин, яких аналізували, (Фіг.5А), що, можливо, є результатом продукування факторів ангіогенезу або факторів росту пакувальними клітинами.

Зрізи, приготовлені з мікрокапсул, та тканеве обрамлення молочної залози підтверджують, що кровеносні судини можуть знаходитися у безпосередній близькості від капсул (Фіг.58). За допомогою цих зрізів було також виявлено присутність шару сполучної тканини, розташованого між мікрокапсулами та тканиною молочної залози. Ці зрізи не виявляли високої протизапальної або імунної відповіді, направленої проти мікрокапсул або вірусо-продукуючих клітин, які містяться у цих мікрокапсулах.

Для ілюстрації того, що інфекційні ретровірусні векторні частки вивільняються з капсул та інфікують навколишню тканину молочної залози, деякі зрізи були проаналізовані на експресію р-даї шляхом Х-даї- фарбування. Клітини, експресуючі ген р-галактозидази, були добре помітні за межами мікрокапсул (див.

Фіг.50).

Приклад 4

У даному прикладі описано конструювання ретровірусного експресуючого вектору для внуфішньопухлинної інфекції, який містить ген для цитохрому пацюка РА50 281.

Вектор експресії рі Х2ВІ, показаний на Фіг.б, конструювали шляхом лігування фрагментів, отриманих від плазміди рі Х125 та ром (Кеаліє та ін., 1991). Плазміду рі Х125 лінеризували ферментом Нраї, та отримані тупі кінці дефосфорилювали з використанням фосфатази кишечнику теляти. ДНК очищали шляхом розділення на 195 агарозному гелі, а потім вирізали, та виділяли у відповідності зі схемою Оіадціск (Оіадеп). Після осадження етанолом, ДНК ресуспендували у воді. Клонуючий вектор рОУМІ гідролізували ферментами бтаї та

Ніпсії з отриманням двох затуплених по кінцям фрагментів. Суміш для гідролізу розділяли на 195 агарозному гелі. Найкоротший фрагмент (1,5КБ), що містить КДНК цитохрому Р450 181 пацюка (Рц)і-Киїуата та ін., 1982), вирізали та елюювали у відповідності з процедурою екстрагування ДНК (Оіадціак), а потім осаджували етанолом, та ресуспендували у воді. 7, 6 фМолей рі Х125 та 24 фМолей Зта//НіпсіІ-фрагменту змішували та лігували на протязі З днів при 1270 з використанням ТА4-лігази (Воепйгіпдег). Лігазу шактивували при температурі 65" С на протязі 10 хвилин, а потім ДНК осаджували 10-кратним об'ємом бутанолу. Осаджену ДНК ресуспендували у воді та піддавали електропорації в ОНТООВ-бактерію (Сірсо). Колонії, резистентні до ампіциліну, відбирали, а потім отриману

ДНК гідролізували ферментами 552рві/ЗаїІ, ВаіпНІ/558І, РмшІ та Ватні. Кінцеву правильно зконструйовану плазміну позначали рі ХаВ 1.

Ліпофекція

За один день до ліпофекції, 3х107 ретровірусних клітинних ліній з дефектами упаковки РАЗ17 (Міїег 8

Вийітоге, 1986) засівали у б-сантиметрові чашки Петрі або планшети ля культивування. Через один день після інфікування, 2 мікрограми рі Х2ВІ змішували з 100 мікролітрами без сироваткового середовища.

Одночасно, 15мкл ліпофектаміну (СІВСО, ВА) змішували з 100 мікролітрами безсироваткового середовища.

Розчин, що містить плазміду. змішували з ліпофектаміном та інкубували 45 хвилин. Через 35 хвилин клітини один раз промивали 2 мілілітрами безсироваткового середовища. 800мкл безсироваткованого середовища наносили на отримані клітини. Через 6 годин додавали мл модифіковане за способом Дульбекко середовище

Ігла, що містить 1090 фетальну сироватку теляти. На слідуючий день клітини трипсинізували та розводили у відношенні 1:10, а потім засівали в 10 мілілітрові чашки. Через 24 години середовища заміняли на середовище, що містить аналог неоміцину (418. Одиничні клітинні клони або клітинні популяції виділяли та аналізували на експресію цитохрому РА50.

Інкапсулювання

Отримані пакувальні клітинні лінії, продукуючі ретровірусний вектор, інкапсували, як описано вище, у

Прикладі 2

Імплантація

Отримані капсули вводили хірургічно по типу "ключ-замок" біля, або у трансплантовані, або у спонтанно утворені пухлини мишей ВАЇ В/с або СВ. У кожну ділянку операції було введено 6 капсул діаметром в 1їмм. Цю ділянку операції закривали одним швом. Потім мишей обробляли циклофосфамідом або іфосфамідом за допомогою місцевого введення шляхом безпосередньої внутрішньопухлинної ін'єкції 100мкл - 20мг/мл або системних концентрацій 130мг СРА/кг маси тіла (внутрішньочеревинно), та 40-60мг ІРО/кг маси тіла (внутрішньочеревинно) на протязі максимального періоду часу 10 тижнів. На протязі цього періоду часу кожний день просліджували розмір пухлини аж до її візуального виявлення. Після цього періоду часу мишей умертвляли, а тканину, що містить введені капсули та пухлину, удаляли та отримували гістологічні зрізи для оптичної та електронної мікроскопії. Ці зрізи явно показували досить добре приживлення капсул, васкуляризацію, а також, не виявляли наявність лімфоцитів, що вказують на клітинну імунну відповідь. Ці зрізи також не показували яких-небудь ознак загибелі клітин або некрозу клітин всередині капсули. У протилежність цьому, пухлини виявляли некроз та явне візуальне зниження своїх розмірів під час періоду досліджень.

Приклад 5

В цьому прикладі описана конструкція стабільної клітиннної лінії, яка експресує цитохром пацюка Р450 2В1 конститутивно.

Вектор експресії ре3з/281 конструювали шляхом лігування фрагментів, отриманих від плазміди рсоОМмАЗ (Іпмігодеп) та реуміІ (Кеаліє та ін., 1991).

Плазміду рсОМАЗ гідролізували ферментами Хпої/ХраІ, та отримані липкі кінці фрагментів дедефосфосфолювали з використанням фосфатази кишечнику теляти. ДНК-каркас вектору очищали шляхом виділення на 195 агарозному гелі, вирізали та отримували у відповідності зі схемою Оіадціск (Оцідеп). Після осадження етанол ом ДНК ресуспендували у воді.

Клонуючий вектор роУМІ гідролізували ферментами Хпої! та Хвраї з отриманням двох фрагментів. Гідролізну суміш виділяли на 195 агарозному гелі. Найбільш короткий фрагмент (1,5КБ), що містить КДНК цитохрому пацюка Р450 281 (Рці-Кипуата та ін., 1982), вирізали, елюювали у відповідності зі схемою екстракції ДНК (Оіадніск), осаджували етанолом та ресуспендували у воді. 8,3 фМолей каркасу рсОМАЗ та 24,8 фМолей Хпої/Хра! фрагменту ром змішували та лігували на протязі одного дня при 12"С з використанням Т4-лігази (Воепгіпдег). Лігазу інактивували на протязі 10 хвилин при 65"С та ДНК осаджували 10-кратним об'ємом бутанолу. Осаджену ДНК ресуспендували у воді та піддавали електропорації у ОНІОВ-бактерію (Сірсо). Колонії, резистентні до ампіциліну, відбирали та після аналізу отриману ДНК гідролізували ферментами ЕсоВі, Ватні, ЕсоВМ та Хпої. Кінцеву правильно сконструйовану плазміду позначали ре3/281.

Ліпофекція

За один день до інфікування З3х10? клітин МІНЗТЗ засівали у 35-міліметрові чашки. У день інфікування 2мкг ре3/281 змішували з 100 мікролітрами безсироваткового середовища. Розчин, що містить плазміду, додавали до суміші ліпофектаміну та інкубували на протязі 45 хвилин. Через 35 хвилин клітини один раз промивали 2 мілілітрами безсироваткового середовища. До суміші для ліпофекції додавали З0О0мкл безсироваткового середовища, та 1їмл отриманого розчину речовини наносили на клітини. Через 6 годин додавали їмл ОМЕМ (Сішатах), що містить 1095 фетальну сироватку теляти. На слідуючий день клітини трипсинузували, 10-кратно розводили та засівали на 10-міліметрові чашки. Через 24 години середовище заміняли на середовище, що містить неоміцин. Через 14 днів клони, резистентні до неоміцину, виділяли та аналізували на присутність вектору та його активність.

Капсули, що містять ці клітини, були продуковані, як описано у Прикладі 2, та імплантовані в мишей у місце біля пухлини. Після обробки циклофосфамідом або іфосфамідом ефективність обробки оцінювали, як описано вище.

Опис креслень

Фіг1 Гістологічне фарбування інкапсульованих клітин РАЗ17, стабільно трансфікованих вектором рвАс для ілюстрації експреси р-галактозидази.

Фіг2. АВТ-РСВ-аналіз вірусних часток, що вивільняються капсулами (28; шляхи 1-4: середовище, взяте після 2-, 3-. 5- та б--ижневого культивування капсул). Культуральне середовище від неінкапсульованих ВАС- вірус-продукуючих клітин була використана в якості позитивного контролю (шлях 5), а середовище від нетрансфікованих клітин РАЗ17 була використана у якості негативного контролю (шлях 6). У випадку, коли вірусні зразки піддавали гідролізу РНКазою перед здійсненням АТ-РСВ-аналізу, то ніяких сигналів не спостерігалось, що свідчить про те, що ампліфікована смуга походить від вірусної РНК (2С; шляхи 1-4).

Вірусна РНК, отримана від неінкапсульованих ВАС-вірус-продукованих клітин, без обробки РНКазою, була використана в ВТ-РСВ-реакції у якості позитивного контролю (шлях 7).

Фіг.3. Культивування інкапсульованих вірус-продукуючих клітин разом з клітинами МІНЗТЗ. (А) Клітини-мішені засівали з низькою щільністю за один день до того, як були добавлені капсули, що містять пакувальні клітини, продукуючі ретровірусний вектор. Через декілька днів клітини та капсули піддавали гістолологічному фарбуванню для проведення аналізу на р-галактозидазну активність. (В) Для підтвердження того, що клітини-мішені, експресуючі р-галактозидазу, були отримані в результаті інфікування, а не завдяки витоку вірус-продукуючих клітин, геномну ДНК екстрагували з клітин та проводили РСВ-аналіз.

Фіг4. Скануюча електронна мікроскопія показала поверхню капсули, в якій пориста структура стає виявленою лише при великому збільшенні (х75000). Біла смуга означає 100нм (діаметр ретровірусної частки), що показує на те, ці структури можуть представляти собою пори, через які вірус вивільнюється з капсули.

Фіг.5. Гістологічний аналіз капсул, імплантованих в молочну залозу миші (А), (В) оптична мікроскопія поперечного перерізу капсули на протязі 4 тижнів після імплантації в молочну залозу миші (збільшення х133), (С) шфікування клітин молочної залози миші після імплантації капсул, що містять ВАСі-вектор-продукуючі клітини РАЗ17.

Фіг.б6. Структура експресійного вектору рі ХаВІ, що містить ген, який кодує цитохром Р450 281 пацюка, та який знаходиться під контролем промотору 0З-ММТ після конверсії промотору.

Посилання:

Серко, С. (1989). І Іпеаде апаїувів іп Ше мепебгайе пегуоиз зувіет бу геїгомігпи5-теадіагеа депе (гапвіег. Мей.

Меиговзсі. 1,367-392.

Спапо, Р.Г. (1995). Мопашоіодоиз зотаїййс депе Шегару. п ботаїййс Сепе Тпегару. Р. Спапод, єд. (САС

Ргезв, Воса Наюп) рр.203-223.

Соптейа, К., Моєп, А.С., Сиімег, К., Могдап, В.А., Меїасніїп, У.А., 5іШгт, 5., ЗеІедпне, ., Гопаоп, М/., Віаєзе,

А.М., апа Ападегзоп, МУ.Р. (1990) АтрПпоїгоріс тигіпе Іеикетіа гейоміги5 із пої ап асшще рашодеп ог ріітацев.

Нит. Сепе Тег, 1, 15-30.

Стапаеє!й, А.А., Раріісапі, С.б., апа Меізоп-Неевз, М.А. (1973). ЮОемеіортепі, сНагасіегігайоп, апа міги5 зизсерійбіїйу ої а Геїїпе (Ееїїв сайв) гепаї сеї! Іїпе (САЕК). Іп міїго 9,176-185.

Симег, К.МУ., Ват, 2., УМаПргідде, 5., ІвПії, Н., Оіапейа, Е.Н., апа Ваєзе, В.М. (1992). Іп мімо депе ігапегег мій геїгоміга! месіог ргодисег сеїІ5 юг ігеаїтепі ої ехрепітепіаї! бгаїп штогв. Зсієпсе 256,1550-1552.

Оедіоп, М.. ит, А., Ваєїщде, Е., апа Аерізспег, Р. (1995) Оемеіюортепі ої депе (Пегару ог Пе ігеайтепі ої пеигодедепегаїййме аізеазев; РаїКіпзоп аізеазе, АІ2пеїтег дізеазе апа атуоїгорпіс Іасега! 5сіеговів (Пегару; роїутег епсарзшайей пепигоїгорпіс-зесгеїйіпод сеї! іпігашйесаї! (гапзріапіайоп. Сепе ТНег. 2,563.

Еці-Кигуата, У., Мігикаті, У., Камаїї, К, Зодама, К. апа Мигатиїзи, М.: Ріітагу зігписішге ої а суїоспготе рР-450: Содіпуд писієоїідез зедиєпсе ої рпепобагбіїа!-іпаисіріє суюспготе Р-450 СсОМА пот гаї Іїмег, Ргос. Маї).

Асад. 5сі. ОБА, 1982 Мау; 79:2793-97

Сиипгриго, М.Н., Заїйег, В., апа ЗаІтопв, В. (1995). Веїгоміга! месіогз аїгесієд ю ргеадеїїпеа сеї! туре5 г депе

Шегару. Віоіодісаіє 23,5-12.

Сиипгриго, М.Н. апа ЗаІтопв, В. (1995) Мігиз месіог девідп іп депе Іпегару. МоІесцаг Меадісіпе Тодау, 1,410- 417.

Ниднез, М., Маззіаков, А., Апагем ЮОЛМУ., Нопеїапо, с, ВеіІтопі, 9УЛМ., апа Спапа, Р.Г. (1994). Оєїмеуу оба зестейаріє адепозіпе деатіпазе Іпгоцойп тісгосарзціе5 а помеє! арргоасі ю зотаїййс депе Шегару. Нит. Сепе

Тнег. 5,1445-1455.

Іпагассої!о, 5., бип2риго, М.Н., І еір-Мозсп, См Епіє, М., апа ЗаІтопв, В. (1995). Ідепійісайноп ої їпгее питап зедпепсев мій міга! зирегапіїдеп-гресійс ргітег5. Маттаїап Сепоте 6,339-344.

Уаїпеній, У.Г, Апдезоп, 5.А., апаТодаго, Сх.9. (1969). Мигіпе загсота апа ІеоКаєтіа мігизев: аззау ивіпу сіопаї

ІЇпев ої сопіасі-іппірней тоизе сеїІ5. у). Міго!. 4,549-553.

Кеагіє, КМ; Ваїоиг, СА; Езсобаг, СУ; Сгітт, ЗМУ; Не, ХА; Рерре!, у; Ведап, УМ; іемепв, УС; НаїІреїї, ОВ:

Моїесшіаг базі ог а псійопану ипідне суюснготе Р4АБОЇІВІ1 мапапі, 9. Віої. Снет. 1991 Мом25; 266(33): 22515-

МіШег, А.О., апа Вийітоге, С. (1986). Недевідп ої геїгомігиє расКадіпа сеї! Іпез юю амоїй гесотбіпайоп Ієадіпд юю Пеїрег мігиз ргодисійоп. Мої. СеїІ. Вісі. б6,2895-2902.

Могоап, В.А., апа Апаегзоп, МУР. (1993). Нитап депе Шегару. Апп. Неу. Віоспет. 62,191-217.

Ріїсе, 9., Тигпег, О., апа Серко, С (1987). І іпеаде апаїузів іп Ше мепебргаге пегусиз 5зузієт Бу геїгомігив- теадіайей депе ігапвіег. Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА 84,156-160.

Ват, 2., Сиімег, К.МУ., УМаІргпдде, 5., Віаезе, В.М., апа Оіайеїйа, Е.Н. (1993). Іп віш геїгомігаІ-тедіаїєд депе іапвіег гог (пе ігеаїтепі ої бгаїп Штогвз іп гаїв. Сапсег Нев. 53, 83-88.

ЗаІтопв5, В., Кпеаййвспек, С., Кеппейу, М.. (агопег, В., апа Ропіа, Н. (1986). Тиє епдодепои5 тоизе таттагу ШшШтоиг мігив (осив Мім-8 сопіаїп5 а аеїесіїме епмеІоре депе. Мігиз Вев. 4, 377-389.

Зіапде, 9., Мії2гпег, 5., Оацігепрего, Н., Натіом, МУ., Кпірре!ї, М., Бієїпег, Ме, Етві В., 5сптіаї, В., апа

КіпКтапп, Н. (1993). Ргоіопдей Біоспетіса! апа тогрпоіодіса! віаріїну ої епсарзшагеа Іїмег сеїїв - а пе теїнод.

Віотаї. Аг. СеїЇв 5 Ітторб. Віоїесні. 21, 343-352.

Таї, І.Т., апа Бийп, А.М. (1993). Місгоепсарзшайоп ої гесотрбіпапі сеїІв: а пеж деїмегу зувієт юг депе Шегару.

ЕАБЕВ У. 7,1061-1069.

МуєЇзи, А.М., Соорег, М.А., Уепвеп, Е.С., апа Оійвіюопе, М.В.А. (1975). Нитап зегпит Іузе5 АМА Штоиг мігизез. Майшге 257, 612-614.

МУіпп, 5.8., Наттапо, 9.Р., Етепсп, О.Р., ее, А., Раїтісгег, А.О., апа Ваєе, Е.Е. (1994). Роїутег епсарзшагеа сеї депеїйїсану тоаїййеа ю зестеге питап пегле доми ргоотоїе Ше зигуїма! ої ахоїтігеа зеріаї! споїїпегдіс пеигопв. Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА 91,2324-2328.

Нв с. й и ни дви з Й і шу : щої , за ке В і: киш ен с ех, Що : сон ові ВУ і в я; я Й

ШИ йно Й

Фіг.1

8-Саї БУ4Орг. песо огі вед -

А КО я 3 ВІ вірусна РНК ру 1 б463пбв 70751065 фест ненні 0 «ДНК с- що -Ба "СТЕСТССАЄССТСТАЄТТТТЗ" З'ЄСССАСАТАССТТАТТТОССАСВ

В ! 612 Бр» ей «й ! 12 3 4 5 6 бі2Бри У ! !

І

12.3 4 76 ї і

Фіг. 2 ож ' Ка: 1. - . и ок І шк я - Ним зн й т шк ВХ злу хна у ей й НД. чай і

Нюх В.

Коко о и ву й " НН с В, . келих ве код ою Кук я хв А х й Ме .

Шу ПЕН п, 4

ОН 5 З, а х «ке НІ Ин кое ви и й фан Меде Бе зі КЗ . шия и М хво БЕ НОВ нн хокею ЩІ Я о си

Не «теккн я ЕК телів рн, ХЕ ЛУК не ж я я пе ми ' рок Кк Те х. поши ; я ть й : (Кв р Кк и ди о Й ВИН НН вв ОО годин шо в и ОО удача ще сок і В Ан шию ет В Щі од у й пе, фік З чНЯ й пк ре Дтя у.

СК, сне кор ви пої З; Км з х Ку КУН миши о що нм ЗИМИ ох лука пан ши о НН С, кор НН с в В си п КА о о ж ел ее и, си о с, а Ка Верх з А и Ву ід с я Коня Ах я сек ЗК ще А Кн, я нн ей сво сне фея п пак рвав по 5 а

КУМ нету в Ей о он мае

Ши в А

ЕМ Ас дня он о Нв АН АВМ

Фіг. ЗА інтегрований ВАС після інфікування

Хра І, 298 ям, и Хра І, 7316 ща з» рас 23кь й Хра І, 8823 ій

Ха І, 88658 я) Б'ТСТТССТІСТАТССССАССА З" ь) Б'ЄСССССТТАТТАССОСТСТТА З пе дике ук 2 бук ж. п : Кри ре кто ВИНИ

Би й Вау ННЯ

Ос

Й г. ШО х Ден я бод т Ж на пк нн аа, панни 3.3КЬ пн Бур код вето г. но ок Мт. и Кк ОВ ни зокре

КИ тку ОВ МИ - рот МАВ

Фіг. зв нереииятнукякя всиррк ДУ ча гу е зек у ср зів з-д ух ня ака ниві ТИНИ Зх з подо сло дет схов Фея («иа би й «Ех ду

А, сія, ет й, ше рі ик НЯ ВЕНАХ,

ВЕ фо ни Фе. кр ЕК с ШИК а мен Ко НИЙ ЧИ пе: шко А ж век в а й оо я ВА пт ко аа пис -- ши ДТ зт Уву Б. ей сексу ми в.

Кн ман фу ШК ШШН. ка во Не мк ик с ит, таж ох й Я М КУКИ й ях р сх

ЕЕ вожй соя пев та ТК Ше щ пеня МАО МУ КИ х 10000 х 37000 х 15000 би. Я т, ії Ши Май пило - чари

Ви они Б "АН ЩІ ; ЗЕ Вя о я !

Ще : ши ин он 7 на 4 Косюк Еш "ай ще : ех е ша Шни чи т ша б ох 1 вжлень З тижня З тижня ни шо м К ри - Р Що й ! ОВ, СИ м Боян, й

Зі а МЕ Ана тож |, З у їх жу ох я сі І зікой рт ке ми

Фи и й ОМ ати ди оре рт и Я ве Ь З оби чи

ЕД от и иа у

Ся Пн Я кн ик п а у У КУ

Кв ик: ВУ ! о ке в й ех дива ДК жав сов" ря: во Ж г с жк уж ще. ЕДокров'яна судиня ще Ж Ин ох жи й о й як ВА ут а фах ж свій ТК ад и. - сполучна тка о З "КИ І я тканина ть ЕК вра по я т х а КО ИШя ре ох аву Кене их ' , дк ЗАМ оди екв, ДИКУ пре ПОД тв мит Кия ми І АВ р ий тю СВК НК че ах пев и а ' ГУК г ж й МИЩННМ капсула ія ей бк М нини щі

Н а о у се і. од вх ие х ль 4

Бо ин й Же кою В фа СКУ жит іх г за, Хр де ке я аж м ие а и МН У

Пи ре Ве 8 «г зайти

А о я у М у ре нн а: МИ ИН і ейк китаю ско рей ц ий щі водо ши і нн ИН реле но а к ще оз жня хи Й Й ми Ді ди у ий р о Я і я 2 а ! лій до дет

А: : дя , Збільшення 320х

Фіг. 58 сере куєидинтит умо пд тя

АК «ЗАД п У кА НОЯ ну Ко А АН

Тео ие МК ОМ кін А Ки Два

Та пре ач ера а З

Бо ді ди а у Акне лу. в і. Р НД і т ся й пом пек реа дао сн Е кв уа кита юр А В ин у НЕТ не вано да па а І

А, ее п кот тв яки КО и и а в ОДА кю ож

Кожне а оо Аа Ух еру А и ОНИ дум МОНА в суті: же пра ре ле о ЛВ я сь і т в В . ри Я жав СО уза Мити ; -Ї7 пух, З ау яю так и ба о уд шніх, М ач русь «Й схе Ар Ди сдкя са їде тий Уран ЗЕ КН й о дак у ка и

ПРИ ря в НАУКИ ен І М ІМЕНА ве ЗА ОК БАС пи не Тех ман рин : ЩО ши г:

Не : Й г. Й ня й -

ЯК : . - ху ти бе. 7 . т: й ня - т ще

НЕБА А Я, , . в: АННУ : нг що пз ав ЗИ НН і

Мак и : кана аа п Я и ще і ть ши ши ин :.: . Н

САНИ пи ч . Й ри мови и ни М шк - щк о на мн ОО ап» г, ши - пн А А ОН ННЯ для а о на и ІН. хз

КН В и Б РУКА ННЯ аж зе ше

Я тА зн нива АВ ТЕН ца ЕК сн яв в о от я не дея ні у АК чу й Км пе М иа вн о, У я

Я я ак с І- - Кк ах во мин генія ря вермут ПАБ ово СА й ши . тд А я аама их - . ит Ак п п в НА ЕВ я ми нн нь ОВЕН нич , ОТ ни ех

ОК ТО еоо г

ВАДИ дить тоюино «Аді КАТІВ АВ В

Фіг. 50

М. «ВврІДЛІ

Ї вк у;

Вр! | ще туугоп й пммту (|! апр Вер . ж . 100 ріХ2в81 пою

РВКогі 5ТЛВ.

Ав

А вхо Мо-Мибхм/Мо РЕВА

ВЗ песо лою тп дай х/ убогі "мо; вуаоре РА5О цитохроме, 5 -, ЗехАї ху о, ВеРВІ вах в. вай о Фіг, б

Claims (26)

1. Капсула, що містить інкапсульовані клітини, які продукують вірусні частки, причому вказана капсула містить пористу стінку, яка має пори такого розміру, що дозволяють вихід більшої частини вірусних часток, що продукуються вказаними клітинами.

2. Капсула за п. 1, де вказана пориста стінка капсули містить поліелектролітний комплекс, утворений з протилежно заряджених електролітів.

3. Капсула за п. 1 або 2, де вказана пориста стінка капсули містить поліелектролітний комплекс, утворений з полісахаридів, що містять сульфатну групу, або їх похідних, або з синтетичних полімерів, що містять сульфонатну групу, та полімерів з четвертинно-амонієвими групами.

4. Капсула за п. 3, де полісахариди, що містять сульфатну групу, або їх похідні вибирають з одного або більше елементів групи, що складається з сульфату целюлози, ацетосульфату целюлози, сульфату карбоксиметилцелюлози, сульфату декстрану або сульфату крохмалю, а синтетичним полімером, що містить сульфонатну групу, є полістиролсульфонат.

5. Капсула за п. 3, де полімером з четвертинно-амонієвими групами є полідиметилдіаліламоній або полівінілбензитриметиламоній.

6. Капсула за будь-яким з пп. 1-5, де пориста стінка капсули містить поліелектролітний комплекс, утворений з сульфату целюлози та полідиметилдіаліламонію.

7. Капсула за будь-яким з пп. 1-6, що має форму мікрокапсули з діаметром між 0,01 та 5 мм, переважно між 0,1 та 1 мм.

8. Капсула за будь-яким з пп. 1-7, де вказана капсула містить губчату матрицю на основі сульфату целюлози, що утворює внутрішню частину стінки капсули, обмежену поверхнею стінки капсули, що містить пори, причому, вказана губчата матриця заповнена клітинами.

9. Капсула за будь-яким з пп. 1-8, де розмір поверхневих пор пористої стінки капсули складає між 80 та 150 нм, переважно між 100 та 120 нм.

10. Капсула за будь-яким з пп. 1-9, де вірусні частки, продуковані інкапсульованими клітинами, являють собою ретровірусні частки, що містять геном ретровірусного вектора.

11. Капсула за п. 10, де інкапсульовані клітини, продукуючі ретровірусні частки, являють собою пакувальну клітинну лінію, трансфіковану експресуючим вектором, що несе ретровірусну векторну конструкцію, здатну інфікувати та регулювати експресію в клітинах-мішенях однієї або декількох кодуючих послідовностей, присутніх в указаній ретровірусній конструкції причому, вказана пакувальна клітинна лінія включає, принаймні, один експресуючий вектор, що несе гени, що кодують білки, необхідні для упаковки геному вказаної ретровірусної конструкції.

12. Капсула за п. 11, де, принаймні, одна з вказаних кодуючих послідовностей кодує гетерологічні пептиди, та де вказані кодуючі послідовності вибирають з маркерних генів, терапевтичних генів, антивірусних генів, протипухлинних генів та генів, кодуючих цитокіни.

13. Капсула згідно з будь-яким з пп. 10-12, де ретровірусний вектор є реплікаційно дефектним.

14. Капсула згідно з п. 13, де ретровірусний вектор містить 5-ЇТА ділянку структури Ш3-А-О5, одну або більше послідовностей, вибраних серед кодуючих або некодуючих послідовностей, та 3-ЇТЕ ділянку, яка містить повністю або частково делетовану З ділянку, де вказана делетована З ділянка є заміщеною полілінксерною послідовністю та регуляторним елементом або промотором, з наступними В та И5 ділянками.

15. Капсула згідно з будь-яким з пп. 10-14, де ретровірусний вектор експресії є рі Х2В1, одержаний як описано у прикладі 4.

16. Спосіб одержання капсули згідно з будь-яким з пп. 1-15, що включає суспендування клітин, продукуючих вірусні частки, у водному розчині поліелектроліту, після чого суспензію, одержану у формі попередньо сформованих часток, вводять в осаджуючу баню, що містить водний розчин протилежно зарядженого поліелектроліту.

17. Спосіб за п. 16, де утворення часток проходить шляхом розпилення.

18. Спосіб за п. 16 або 17, де клітини суспендують у водному розчині полісахариду, що містить сульфатну групу, або його похідного, або синтетичного полімеру, що містить сульфонатну групу.

19. Спосіб за п. 18, де полісахарид, що містить сульфатну групу, або його похідне, вибирають з одного або більше елементів групи, яка складається з сульфату целюлози, ацетосульфату целюлози, сульфату карбоксиметилцелюлози, сульфату декстрану або сульфату крохмалю, а синтетичним полімером, що містить сульфонатну групу, є полістиролсульфонат.

20. Спосіб за п. 16 або 17, де осаджуюча баня містить водний розчин полімеру з четвертинно-амонієвими групами.

21. Спосіб за п. 20, де полімером з четвертинно-амонієвими групами є полідиметилдіаліламоній або полівінілбензилтриметиламоній.

22. Спосіб за п. 16 або 17, де клітини суспендують у водному розчині сульфату натрійвмісної целюлози, та вводять в осаджуючу баню, що містить водний розчин хлориду полідиметилдіаліламонію.

23. Спосіб за п. 22, де водний розчин сульфатної целюлози складається з 0,5-50 95, переважно 2-595 сульфату натрійвмісної целюлози та 2-1095, переважно 595 фетальної телячої сироватки в фосфатному забуференому фізіологічному розчині.

24. Спосіб за п. 22, де водний розчин в осаджуючій бані складається з 0,5-5095, переважно 2-1095, більш переважно 395 хлориду полідиметилдіаліламонію в фосфатному забуференому фізіологічному розчині.

25. Капсула згідно з будь-яким з пп. 1-15, одержана способом згідно з будь-яким з пп. 16-24.

26. Капсула згідно з будь-яким з пп. 1-15 або 25 для використання у генній терапії та/або для лікування раку або будь-якого подібного захворювання або розладу.