RU2688383C2 - Способ синтеза белка в культуре бактериальных клеток - Google Patents
Способ синтеза белка в культуре бактериальных клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2688383C2 RU2688383C2 RU2017124374A RU2017124374A RU2688383C2 RU 2688383 C2 RU2688383 C2 RU 2688383C2 RU 2017124374 A RU2017124374 A RU 2017124374A RU 2017124374 A RU2017124374 A RU 2017124374A RU 2688383 C2 RU2688383 C2 RU 2688383C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- range
- polymer
- polymers
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 54
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 229920002518 Polyallylamine hydrochloride Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 5
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 4
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims abstract description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 4
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 8
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 claims description 5
- 229940006186 sodium polystyrene sulfonate Drugs 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 19
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000707 layer-by-layer assembly Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 abstract 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 abstract 1
- JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N azane;7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonic acid Chemical compound N.OS(=O)(=O)C1=CC=C(F)C2=NON=C12 JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 abstract 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000589614 Pseudomonas stutzeri Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004666 bacterial spore Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу синтеза белка в культурах бактериальных клеток. Способ включает модификацию поверхности клеток методом послойной адсорбции противоположно заряжённых полимеров и последующее термостатирование культуры клеток. Культуру клеток используют в количествах 10– 10КОЕ/мл. Перед нанесением и после нанесения полимеров клетки промывают растворами с ионной силой в диапазоне 0–0,155 моль/л. В качестве положительно заряженного полимера используют полилизин, протамин сульфат, полиаллиламин гидрохлорид, полиэтиленимин, полидиаллилдиметиламмоний хлорид или хитозан. В качестве отрицательно заряженного полимера используют альгинат, гиалуроновую кислоту, полиакриловую кислоту, полистиролсульфонат натрия, полимолочную кислоту, полиглутаминовую кислоту или сульфат целлюлозы. Концентрации полимеров выбирают в диапазоне 0,1 мг/мл – 10 мг/мл. Клетки инкубируют в растворе полимеров в течение 4–15 мин. В случае использования центрифугирования реакционный объем смеси выбирают в диапазоне 0,5 мл – 1 л и центрифугируют в диапазоне 700–10000 g в течение 30 с – 5 мин. В случае фильтрования реакционный объем смеси выбирают в диапазоне 1 л – 50 л и используют фильтрующие материалы с размером пор не менее 0,45 мкм. Изобретение позволяет увеличить количество синтезируемого белка в различных видах культур бактериальных клеток без снижения выживаемости клеток. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выращиванию бактерий на питательной среде с целью увеличения количества белковых компонентов в клеточных культурах.
Известен способ промышленного культивирования штаммов E.coli, полученных на основе штамма bl21(de3), несущего ген t7 rna полимеразы под контролем lacuv5 промотора, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения (см. патент на изобретение RU 2473683, МПК C12N 1/21). Способ предусматривает выращивание инокулята на основе штамма BL21(DE3) E.coli, несущего ген Т7 RNA полимеразы под контролем lacUV5 промотора, до середины логарифмической фазы роста на питательной среде с использованием в качестве источника углерода глюкозы в концентрации 10 г/л при температуре 38°С, перемешивании 200 об/мин в течение 3 ч, засев ферментера инокулятом с посевной дозой 10%, культивирование микроорганизмов при 38°С, концентрации растворенного кислорода 80% при максимальной скорости перемешивания 1200 об/мин, максимальном уровне аэрации 1 объем воздуха/мин: 1,2 объема культуральной жидкости, рН 7,00; окончание ферментации на 12-13 ч культивирования; осаждение клеток штамма-продуцента E.coli. Вначале культивирования добавляют 50%-ный (мас. %) раствор глюкозы, в середине логарифмической фазы роста производят порционную добавку 80%-го (мас. %) раствора глицерина и с конца логарифмической фазы роста культуры осуществляют дробные добавки 25%-ного (мас. %) раствора лактозы. После культивирования содержащую рекомбинантные целевые белки в виде нерастворимых тел включения биомассу осаждают. Изобретение позволяет повысить выход биомассы и целевого белка с единицы объема культуральной среды.
Наиболее близким к заявляемому является способ увеличения производства белка (см. заявку на изобретение WO 8606410, МПК С12Р 21/02). Способ обеспечивает увеличение количества получаемого белка путем культивирования кишечной палочки, имеющей выраженный вектор, который содержит структурный ген белка. Способ включает в себя выращивание кишечной палочки на среде, содержащей источник ионов железа, марганца или их смеси, и источник азота природного происхождения для увеличения количества белка свободного от метионина, соответствующего поступательному стартовому ко дону ATG. Где этот белок, свободный от метионинового остатка, может быть получен в увеличенном количестве и соответствует инициирующему кодону ATG.
Однако существенным недостатком данных способов является использование геномодифицированных организмов для увеличения количества синтезируемого белка на селективных питательных средах.
Техническая проблема настоящего изобретения заключается в разработке способа синтеза белка без внедрения генетических векторов, обеспечивая расширение арсенала способов синтеза белка в биотехнологии.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в увеличении количества синтезируемого белка в различных видах культур бактериальных клеток за счет покрытия поверхности бактериальных клеток полимерными слоями и последующим выращиванием клеток на питательной среде.
Технический результат достигается тем, что в способе синтеза белка в культуре бактериальных клеток, включающем выращивание клеток на питательной среде, согласно решению, на поверхность выращенных клеток наносят положительно заряженный слой полимера путем инкубирования в растворе положительно заряженного полимера, центрифугируют или фильтруют, промывают, затем на поверхность клеток наносят отрицательно заряженный слой полимера путем инкубирования в растворе отрицательно заряженного полимера, центрифугируют или фильтруют, промывают; нанесение слоев повторяют до получения необходимого их количества и заданного размера клеточных агрегатов; после чего клетки, покрытые полимерными слоями, помещают на питательную среду, выращивают и отделяют полученный продукт, при этом культуру используют в количествах 106-1020 кое/мл, клетки промывают перед нанесением полимеров и после их нанесения растворами с ионной силой в диапазоне 0-0.155 моль/л, концентрации полимеров выбирают в диапазоне 0.1 мг/мл-10 мг/мл, клетки инкубируют в растворе полимеров в течение 4-15 минут.
В качестве положительно заряженного полиэлеткролита используют полилизин, или протамин сульфат или полиаллиламин гидрохлорид или полиэтиленимин или полидиаллилдиметиламмоний хлорид или хитозан.
В качестве отрицательно заряженного полимера используют альгинат или гиалуроновую кислоту или полиакриловую кислоту или полистиролсульфонат натрия или полимолочную кислоту, или полиглутаминовую кислоту или сульфат целлюлозы.
Оптимальную температуру для покрытия выбирают в диапазоне от 2 до 46°С.
В случае использования центрифугирования реакционный объем смеси выбирают в диапазоне 0.5 мл - 1 л и центрифугируют в диапазоне 700-10000g в течение 30 сек - 5 минут, в случае использования метода фильтрования, выбирают в диапазоне 1 л - 50 л и используют фильтрующие материалы с размером пор не менее 0.45 микрон.
Размер клеточных агрегатов варьируют от 5 до 200 микрон. Изобретение поясняется чертежами
На фиг. 1 - представлена относительная интенсивность зеленого флуоресцирующего белка в клетках, покрытых полимерными оболочками и контрольных клетках (E.coli Тор 10) при наблюдении на конфокальном микроскопе: а) флуоресценция контрольных клеток, которая находятся на уровне 40-50 относительных единиц, б) флуоресценция клеток с увеличенным содержанием, которая достигает значения в 255 относительных единиц.
На фиг. 2 и фиг. 3 - представлены образцы клеток с увеличенным содержанием белка (наиболее яркие при увеличенном размере) и контрольных клеток.
На фиг. 4 - представлено спектрофотометрическое измерение флуоресценции популяции покрытых полимерными оболочками и контрольных клеток в питательной среде. Значения флуоресценции белка покрытых клеток составляли 103027±11659 в стационарной фазе роста, значения флуоресценции белка контрольных клеток 51492±2980, т.е. увеличение содержания белка составляло порядка 2 раз. Измерения проводились с целью дополнительного подтверждения увеличения количества синтезируемого белка в клетках с модифицированным покрытием, по сравнению с контрольными клетками.
Способ представляет собой процедуру нанесения полимерных слоев на поверхность клеток с целью увеличения количества синтезируемых белковых компонентов клеток. Способ включает в себя модификацию поверхности клеток методом послойной адсорбции противоположно заряженных полимеров и последующим термостатированием культуры до температуры оптимальной для роста. Нанесение слоев продолжается до достижения заданных технологических параметров, в частности, количества синтезируемого белка, количества и заданного размера клеточных агрегатов. Необходимо отметить, что нанесение большего числа слоев приводит к увеличению содержания белка в клетках, но в тоже время увеличивает продолжительность и трудоемкость проведения операций.
Способ увеличения синтеза белка в культурах бактериальных клеток заключается в следующем.
Выращенную культуру в количестве 10-10 кое/мл промывают растворами с ионной силой в диапазоне 0-0.155 моль/л. Для инкапсуляции бактерий, основанной на электростатическом взаимодействии поверхности клетки с полимером, используют пары противоположно заряженных полимеров. В качестве положительно заряженных полиэлеткролитов используют полилизин, или протамин сульфат, или полиаллиламин гидрохлорид, или полиэтиленимин, или полидиаллилдиметиламмоний хлорид или хитозан.
А в качестве отрицательно заряженных полимеров используют альгинат или гиалуроновую кислоту или полиакриловую кислоту или полистиролсульфонат натрия или полимолочную кислоту, или полиглутаминовую кислоту или сульфат целлюлозы. Полимеры растворяют в деионизованной воде в диапазоне концентраций 0.1 мг/мл-10 мг/мл и при необходимости доводят до оптимального значения рН для бактериальной культуры. Раствор положительно заряженного полимера добавляют к приготовленной культуре в объемном соотношении 1:1, где реакционный объем находится в интервале 0.5 мл - 1 л (в случае центрифугирования) и инкубируют в течение 4-15 минут в диапазоне температур 2-46°С. Инкубированный образец центрифугируют в диапазоне 900-10000g в течение 30 сек - 5 минут. Данный способ может быть также осуществлен методом фильтрования, реакционный объем которого находится в диапазоне 1 л - 50 л, и где используют фильтрующие материалы с размером пор не менее 0.45 микрон.
Затем к полученному раствору добавляют отрицательно заряженный полимер в объемном соотношении 1:1 и инкубируют в течение 4-15 минут и промывают. Отличие промывки в случае отрицательного полимера заключается лишь в разнице для скорости и времени центрифугирования, которые используются в заданных диапазонах (900-10000 g в течение 30 сек - 5 минут), данный шаг также возможно заменить методом фильтрации. Эту процедуру повторяют до достижения желаемого числа слоев. Полученную биомассу помещают на питательную среду при оптимальной температуре для роста. Размер клеточных агрегатов, полученных в ходе данного способа, с увеличенным содержанием белков может варьироваться от 5 до 200 микрон. Выживаемость культуры подтверждают с использованием методов конфокальной микроскопии и спектрофотометрических измерений.
Примеры практической реализации способа. Пример 1.
Приготовление полимеров.
Для данного примера инкапсуляции использовали пары противоположно заряженных полимеров полиэтиленимин и полистиролсульфонат натрия, которые разбавляют в деионизованной воде в конечной концентрации 2.5 мг/мл. Полученные растворы помещают в ультразвуковую ванну на 15 мин. В дальнейшем полимеры титруют до значения рН=7.
Инкапсуляция.
Изначально, раствор полиэтиленимина добавляют к промытым клеткам, в количестве 1012 кое/мл в объемном соотношении 1:1 (реакционной объем смеси 2 мл) и инкубируют в течение 5 минут при комнатной температуре (25°С). После чего клетки центрифугируют при 700 g в течение 2 мин. Осажденную на поверхности культуру промывают 2 раза в растворе хлорида натрия (0.155 моль/л) и ресуспензируют клетки в объеме раствора путем промывки. После покрытия первым полимером, клетки инкубируют в растворе полистиролсульфоната натрия в объемном соотношении 1:1, используя те же условия. Промывку производят аналогичным образом кроме времени и силы центрифугирования, которые были 3 мин и 1500 g соответственно для формирования достаточно плотного слоя клеток. Эту процедуру повторяют до достижения 6 слоев. Пример 2.
Приготовление полимеров.
В данном примере использовали пары противоположно заряженных полимеров полиаллиламин гидрохлорид и полиакриловая кислота, которые разбавляют в деионизованной воде в конечной концентрации 10 мг/мл. Полученные растворы помещают в ультразвуковую ванну на 15 мин. В дальнейшем полимеры титруют до значения рН=7.
Инкапсуляция.
Изначально, раствор полиаллиламин гидрохлорида добавляют к промытым клеткам, в количестве 1020 кое/мл в объемном соотношении 1:1 (реакционной объем смеси 500 мл) и инкубируют в течение 15 минут при температуре 46°С. После чего клетки центрифугируют при 6000 g в течение 5 мин. Осажденную на поверхности культуру промывают 2 раза в растворе хлорида натрия (0.0775 моль/л) и ресуспензируют клетки в объеме раствора путем промывки. После покрытия первым полимером, клетки инкубируют в растворе полиакриловой кислоты в объемном соотношении 1:1, используя те же условия. Промывку производят аналогичным образом кроме времени и силы центрифугирования, которые были 5 мин и 10000 g соответственно для формирования достаточно плотного слоя клеток. Эту процедуру повторяют до достижения 4 слоев. Пример 3.
Приготовление полимеров.
Для данного примера использовали пары противоположно заряженных полимеров хитозан и полиглутаминовая кислота, которые разбавляют в деионизованной воде в конечной концентрации 0,1 мг/мл. Полученные растворы помещают в ультразвуковую ванну на 15 мин. В дальнейшем полимеры титруют до значения рН=7.
Инкапсуляция.
Изначально, раствор хитозана добавляют к промытым клеткам, в количестве 106 кое/мл в объемном соотношении 1:1 (реакционной объем смеси 1 мл) и инкубируют в течение 10 минут при температуре (2°С). После чего клетки центрифугируют при 2000 g в течение 4 мин. Осажденную на поверхности культуру промывают 2 раза в деионизованной воде и ресуспензируют клетки в объеме раствора путем промывки. После покрытия первым полимером, клетки инкубируют в растворе полиглутаминовой кислоты в объемном соотношении 1:1, используя те же условия. Промывку производят аналогичным образом кроме времени и силы центрифугирования, которые были 6 мин и 4000 g соответственно для формирования достаточно плотного слоя клеток. Эту процедуру повторяют до достижения 8 слоев.
Пример 4.
Приготовление полимеров.
В данном примере использовали пары противоположно заряженных полимеров полилизин и полимолочной кислоты, которые разбавляют в деионизованной воде в конечной концентрации 3 мг/мл. Полученные растворы помещают в ультразвуковую ванну на 15 мин. В дальнейшем полимеры титруют до значения рН=7.
Инкапсуляция.
Изначально, раствор полилизина добавляют к промытым клеткам, в количестве 1010 кое/мл в объемном соотношении 1:1 (реакционной объем смеси 1 л) и инкубируют в течение 10 минут при температуре (15°С). Культуру промывают методом фильтрования в растворе хлорида натрия (0.03975 моль/л) и ресуспензируют клетки в объеме раствора путем промывки. После покрытия первым полимером, клетки инкубируют в растворе полимолочной кислоты в объемном соотношении 1:1, используя те же условия. Промывку производят аналогичным образом с использованием фильтрующего материала с размером пор 0.45 микрон. Эту процедуру повторяют до достижения 10 слоев.
Увеличение количества синтезируемого белка.
Приготовление культуры.
В качестве примера увеличения количества синтезируемого белка была выбрана культура Escherichia coli top 10 как модельный организм поведения бактериальных клеток. Из этого следует, что данный способ может быть применен к другим штаммам бактериальных клеток (Neidhardt F.С, Ingraham J.L., Schaechter M. Physiology of the bacterial cell: a molecular approach. - Sunderland: Sinauer, 1990. - T. 20, Ankeny R.A., Leonelli S. What's so special about model organisms? //Studies in History and Philosophy of Science Part A. - 2011. - T. 42. - №. 2. - C. 313-323.;
http://study.com/academy/lesson/escherichia-coli-e-coli-as-a-model-organism-or-host-cell.html; https://www.emlab.com/s/sampling/env-report-03-2010.html; Lee P.S., Lee K.H. Escherichia coli-a model system that benefits from and contributes to the evolution of proteomics //Biotechnology and bioengineering. - 2003. - T. 84. - №. 7. - C. 801-814.), Культура была преобразована с pRSET-emGFP плазмидом путем электропорации с использованием стандартных протоколов. Необходимо отметить, что введение плазмида pRSET-emGFP использовалось лишь для проверки данной гипотезы. Данную культуру культивировали на питательном бульоне (объем 100 мл, Nutrient Broth №2) с добавлением ампициллина с концентрацией 100 мг/мл. Эта смесь была помещена на роторный шейкер для выращивания около 3 часов при температуре 37°С до достижения оптической плотности равной 0.2. В дальнейшем, 50 мл полученной культуры концентрировали методом центрифугирования при 5000 g в течение 6 мин. Затем бактериальную культуру промывали от остатков питательной среды в 0.09% раствора хлорида натрия 3 раза и центрифугировали при 3000 g в течение 3 мин.
Подготовленные клетки после процедуры нанесения (см. Пример 1) были помещены в объеме 4 мкл на предметное стекло, содержащее питательную агарную среду, и накрыты покровным стеклом. Для наблюдения был использован конфокальный микроскоп Leica TCS SP8X, оснащенный боксом с возможностью нагрева до 37°С. Образец был помещен в камеру, где термостатировался до заданной температуры в течение всего времени эксперимента с использованием 100х увеличивающего объектива (НСХ PL АРО 100х/1.44 OIL) (фиг. 1-4). Предварительные эксперименты с использованием других культур P.stutzeri, S. aureus, В. subtilis и различных штаммов E.coli также показали положительный эффект использования данного способа с целью увеличения количества синтезируемого белка.
Заявляемое изобретение может быть осуществлено не только в вариантах, которые представлены в настоящем описании для иллюстрации, а в различных комбинациях параметров, которые ограничиваются только формулой в настоящем изобретении.
Кроме того, следует понимать, что различные признаки, аспекты и функциональные возможности, описанные в одном или нескольких отдельных примерах, не ограничены в отношении их применимости к различным вариантам осуществления данного биотехнологического процесса, и вместо этого могут применяться, отдельно или в различных комбинациях, к одному или нескольким способам реализации изобретения.
Необходимо отметить, что возможность нанесения полимеров на поверхность бактериальных клеток была показана в следующих работах: см. WO 200845806, МПК A61K-009/48; A61K-035/00; A61K-035/12; B01J-013/22 и др., см. Franz В. et al. Layer by Layer Nano Encapsulation of Microbes: Controlled Cell Surface Modification and Investigation of Substrate Uptake in Bacteria //Macromolecular bioscience. - 2010. - T. 10. - №. 2. - C. 164-172., см. см. Balkundi S.S. et al. Encapsulation of bacterial spores in nanoorganized polyelectrolyte shells //Langmuir. - 2009. - T. 25. - №. 24. - C. 14011-14016, однако, данные методы не использовались для увеличения количества синтезируемого белка и эффектов, аналогичных предложенному в патенте, не наблюдалось.
Данный способ позволяет расширить арсенал средств для синтезирования белка и может быть также применен в сочетании с методами генной инженерии.
Claims (2)
1. Способ синтеза белка в культуре бактериальных клеток, включающий выращивание клеток на питательной среде, отличающийся тем, что на поверхность выращенных клеток наносят положительно заряженный слой полимера путем инкубирования в растворе положительно заряженного полимера, центрифугируют или фильтруют, промывают, затем на поверхность клеток наносят отрицательно заряженный слой полимера путем инкубирования в растворе отрицательно заряженного полимера, центрифугируют или фильтруют, промывают; нанесение слоев повторяют до получения необходимого их количества и заданного размера клеточных агрегатов; после чего клетки, покрытые полимерными слоями, помещают на питательную среду, выращивают и отделяют полученный продукт, при этом культуру используют в количествах 106 - 1020 КОЕ/мл, клетки промывают перед нанесением полимеров и после их нанесения растворами с ионной силой в диапазоне 0–0,155 моль/л, в качестве положительно заряженного полимера используют полилизин или протамин сульфат, или полиаллиламин гидрохлорид, или полиэтиленимин, или полидиаллилдиметиламмоний хлорид, или хитозан, в качестве отрицательно заряженного полимера используют альгинат или гиалуроновую кислоту, или полиакриловую кислоту, или полистиролсульфонат натрия, или полимолочную кислоту, или полиглутаминовую кислоту, или сульфат целлюлозы, концентрации полимеров выбирают в диапазоне 0,1 мг/мл – 10 мг/мл, клетки инкубируют в растворе полимеров в течение 4–15 мин, в случае использования центрифугирования реакционный объем смеси выбирают в диапазоне 0,5 мл – 1 л и центрифугируют в диапазоне 700–10000 g в течение 30 с – 5 мин, в случае использования метода фильтрования – выбирают в диапазоне 1 л – 50 л и используют фильтрующие материалы с размером пор не менее 0,45 мкм.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что оптимальную температуру для покрытия и инкубирования выбирают в диапазоне от 2 до 46°C.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017124374A RU2688383C2 (ru) | 2017-07-10 | 2017-07-10 | Способ синтеза белка в культуре бактериальных клеток |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017124374A RU2688383C2 (ru) | 2017-07-10 | 2017-07-10 | Способ синтеза белка в культуре бактериальных клеток |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017124374A3 RU2017124374A3 (ru) | 2019-01-11 |
| RU2017124374A RU2017124374A (ru) | 2019-01-11 |
| RU2688383C2 true RU2688383C2 (ru) | 2019-05-21 |
Family
ID=65013823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017124374A RU2688383C2 (ru) | 2017-07-10 | 2017-07-10 | Способ синтеза белка в культуре бактериальных клеток |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2688383C2 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2187301C2 (ru) * | 1995-06-27 | 2002-08-20 | Бавариан Нордик А/С | Капсула для клеток, продуцирующих вирусные частицы, способ ее получения и использования |
| WO2008045806A2 (en) * | 2006-10-06 | 2008-04-17 | Microislet, Inc. | Multilayered polyelectrolyte-based capsules for cell encapsulation and delivery of therapeutic compositions |
| WO2012101167A1 (en) * | 2011-01-25 | 2012-08-02 | Austrianova Singapore Pte Ltd. | Protection of microbial cells from acidic degradation |
-
2017
- 2017-07-10 RU RU2017124374A patent/RU2688383C2/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2187301C2 (ru) * | 1995-06-27 | 2002-08-20 | Бавариан Нордик А/С | Капсула для клеток, продуцирующих вирусные частицы, способ ее получения и использования |
| WO2008045806A2 (en) * | 2006-10-06 | 2008-04-17 | Microislet, Inc. | Multilayered polyelectrolyte-based capsules for cell encapsulation and delivery of therapeutic compositions |
| WO2012101167A1 (en) * | 2011-01-25 | 2012-08-02 | Austrianova Singapore Pte Ltd. | Protection of microbial cells from acidic degradation |
Non-Patent Citations (6)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017124374A3 (ru) | 2019-01-11 |
| RU2017124374A (ru) | 2019-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106119322B (zh) | 一种提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 | |
| Reshmy et al. | Bacterial nanocellulose: engineering, production, and applications | |
| Das et al. | Fabrication of living soft matter by symbiotic growth of unicellular microorganisms | |
| Zamalloa et al. | Ionic effects on microalgae harvest via microalgae-fungi co-pelletization | |
| Hertzberg et al. | Studies of alginate-immobilized marine microalgae | |
| Homburg et al. | Entrapment and growth of Chlamydomonas reinhardtii in biocompatible silica hydrogels | |
| Van Boekel | Phaeocystis colony mucus components and the importance of calcium ions for colony stability | |
| Han et al. | Precipitation of calcite induced by Synechocystis sp. PCC6803 | |
| Zywicka et al. | The effect of different agitation modes on bacterial cellulose synthesis by Gluconacetobacter xylinus strains | |
| Nasri et al. | The use of the immobilization of whole living cells to increase stability of recombinant plasmids in Escherichia coli | |
| RU2688383C2 (ru) | Способ синтеза белка в культуре бактериальных клеток | |
| RU2500811C1 (ru) | Рекомбинантный штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент фосфолипазы с | |
| Kumaran et al. | Effective biomass harvesting of marine diatom Chaetoceros muelleri by chitosan-induced flocculation, preservation of biomass, and recycling of culture medium for aquaculture feed application | |
| Beike et al. | Axenic bryophyte in vitro cultivation. | |
| Cassaignon et al. | From living light to living materials | |
| RU2681281C1 (ru) | Штамм бактерии Komagataeibacter hansenii - продуцент бактериальной целлюлозы | |
| WO2019131505A1 (ja) | 糸状菌細胞に対するタンパク質導入法およびその成果物 | |
| Singh et al. | Distribution of live and dead cells in pellets of an actinomycete Amycolatopsis balhimycina and its correlation with balhimycin productivity | |
| Zelinskiy et al. | Substrates for cell cultivation based on thermosensitive imidazole copolymers | |
| CN111518824B (zh) | 一种提高外源核酸转化效率的方法 | |
| RU2085212C1 (ru) | Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для ра, рск и рдск | |
| RU2707118C1 (ru) | Способ повышения продуктивности бактерий escherichia coli | |
| Helianti | APPLICATION OF RECOMBINANT TRIACYLGLYCEROL LIPASE AND CARBOXYLESTERASE ENZYMES FROM Bacillus velezensis STRAIN S3 FOR POLYESTER SURFACE MODIFICATION | |
| JP2022517524A (ja) | 微生物培養のための三次元基質 | |
| RU2614118C1 (ru) | Применение штамма Anabaena sp. PCC 7120 для получения наночастиц серебра |