CZ286979B6 - Capsule encapsulating cells producing viral particles, process of its preparation and pharmaceutical preparation for gene therapy - Google Patents
Capsule encapsulating cells producing viral particles, process of its preparation and pharmaceutical preparation for gene therapy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ286979B6 CZ286979B6 CZ19974195A CZ419597A CZ286979B6 CZ 286979 B6 CZ286979 B6 CZ 286979B6 CZ 19974195 A CZ19974195 A CZ 19974195A CZ 419597 A CZ419597 A CZ 419597A CZ 286979 B6 CZ286979 B6 CZ 286979B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- capsule
- sulphate
- genes
- vector
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 239000002775 capsule Substances 0.000 title claims description 85
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 39
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 193
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 59
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 44
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 claims description 40
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 38
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 32
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 32
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 claims description 29
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 20
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 20
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 16
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 16
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 16
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 13
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 10
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 claims description 10
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 9
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 7
- 108010020076 Cytochrome P-450 CYP2B1 Proteins 0.000 claims description 6
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 5
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims description 5
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims description 5
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 claims description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 4
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 claims 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 3
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 claims 2
- 229960002796 polystyrene sulfonate Drugs 0.000 claims 2
- 239000011970 polystyrene sulfonate Substances 0.000 claims 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims 1
- PZAGQUOSOTUKEC-UHFFFAOYSA-N acetic acid;sulfuric acid Chemical compound CC(O)=O.OS(O)(=O)=O PZAGQUOSOTUKEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- YBCVMFKXIKNREZ-UHFFFAOYSA-N acoh acetic acid Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O YBCVMFKXIKNREZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 13
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 108010021066 nicotinamide riboside kinase Proteins 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 6
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 4
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- SMEGJBVQLJJKKX-HOTMZDKISA-N [(2R,3S,4S,5R,6R)-5-acetyloxy-3,4,6-trihydroxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O1)O)OC(=O)C)O)O SMEGJBVQLJJKKX-HOTMZDKISA-N 0.000 description 3
- 229940081735 acetylcellulose Drugs 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 125000001174 sulfone group Chemical group 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108050004290 Cecropin Proteins 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 2
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 101710087237 Whey acidic protein Proteins 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- -1 ie their size Substances 0.000 description 2
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 description 2
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- OVHQWOXKMOVDJP-UHFFFAOYSA-N melitin Chemical compound OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(O)C(OC=2C=C3C(C(C(OC4C(C(O)C(O)C(COC5C(C(O)C(O)C(CO)O5)O)O4)O)=C(C=4C=CC(O)=CC=4)O3)=O)=C(O)C=2)OC(C)C1O OVHQWOXKMOVDJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101000929495 Homo sapiens Adenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108700023471 alginate-polylysine-alginate Proteins 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 102000043395 human ADA Human genes 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- DYUWTXWIYMHBQS-UHFFFAOYSA-N n-prop-2-enylprop-2-en-1-amine Chemical compound C=CCNCC=C DYUWTXWIYMHBQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007514 neuronal growth Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5005—Wall or coating material
- A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
- A61K9/5026—Organic macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyvinyl pyrrolidone, poly(meth)acrylates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5005—Wall or coating material
- A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
- A61K9/5036—Polysaccharides, e.g. gums, alginate; Cyclodextrin
- A61K9/5042—Cellulose; Cellulose derivatives, e.g. phthalate or acetate succinate esters of hydroxypropyl methylcellulose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Oblast techniky
Základem genové terapie je dodání terapeuticky výhodného genu do cílových buněk. Má-li se stát genová terapie rutinním postupem, je nanejvýše důležité vyvinout systémy, které budou schopny účinně dodávat terapeutické geny in vivo cílovým buňkám.
Dosavadní stav techniky
Virové vektory, zejména retrovirové vektory, jsou v genové terapii nejobvyklejším prostředníkem (Morgan a Anderson, 1993). Nejběžnější způsob genové terapie využívá přístup ex vivo, kdy buňky odebrané pacientovi jsou in vitro geneticky modifikovány a poté vráceny pacientovi. Tento postup je těžkopádný, drahý a jeho použití je limitováno použitím špičkových technologií. Navíc je tento způsob použitelný pouze pro buňky, které je možno lehce izolovat, kultivovat a reimplantovat (Gůnzburg a spol., 1995). Ačkoliv dodání terapeutických genů in vivo by nabízela mnoho výhod, je tento postup v současné době problematický a neefektivní. Hlavním problémem je malá účinnost genového přenosu, a je proto nutno použít opakovaného dodání virového vektoru. Opakovaná aplikace vektoru je však nejen pracná, ale pravděpodobně i neúspěšná, vzhledem k imunitní odpovědi na virové částice.
Jeden ze způsobů, kterými by bylo možno tyto potíže překonat, je přímá implantace buněk, které produkují virové částice. Implantace buněk, produkujících virové částice, obsahující genom virového vektoru in šitu blízko cílového orgánu nebo cílových buněk by také umožnila přímé působení virového vektoru na tyto cílové buňky nebo orgány.
Navíc, je-li použitý virový vektor vektorem retroviru, je tento přístup výhodný proto, že ve srovnání s použitím opakovaných dávek zvyšuje naději, že vektor bude přítomen v době, kdy cílová buňka prochází stadiem replikace, čímž se zvýší pravděpodobnost infekce. Dále, plynulé uvolňování virových částic v menších množstvích by mohlo příznivě ovlivnit možnost úniku virových částic imunitní odpovědi hostitele.
Má-li být dodání virového vektoru účinné,buňky produkující virové partikule musí být schopné přežít dlouhou dobu po implantaci a virové částice musí být po tuto dobu produkovány a uvolňovány z buněk. Nedojde-li k významné imunitní odpovědi, na příklad po implantaci do mozku, jsou tyto buňky schopny přežívat dlouhou dobu (Culver a spol., 1992; Ram a spol., 1993). K dosažení úspěšné implantace do jiných částí těla je však nutno produkční buňky chránit před reakcí imunitního systému.
Dlouhodobá účinnost tohoto postupu tedy závisí na (1) ochraně buněk před hostitelským imunitním systémem, který za normálních okolností eliminuje buňky, produkující virové částice, a to zejména tehdy, pocházejí-li buňky, produkující virové částice, zjiného živočišného druhu, což je pro tyto buňky obvyklý případ, a(2) prodloužené době přežití buněk in šitu, která bývá nutná pro jejich vaskularizaci.
Do jisté míry se ukázalo úspěšné zapouzdření buněk do propustných struktur, průchodných pro některé biologicky aktivní molekuly, ale zároveň chránících buňky,, produkující tyto látky, před imunitní odpovědí hostitele (přehled viz Chang, 1995). Byly již zapouzdřeny buňky, které byly geneticky modifikovány tak, aby produkovaly lidský růstový hormon (hGH) (Tai a Sun, 1993) nebo sekretovanou formu lidské adenosin deaminázy (Hughes a spol., 1994). V obou studiích byly buňky zapouzdřeny do poly-L-lyzin-alginátové mikrokapsule a ukázalo se, že v kultuře
-1 CZ 286979 B6 přežívají dlouhou dobu. Tyto buňky byly po dlouhou dobu schopny vylučovat enzym nebo hormon. Dále (Tai a Sun, 1993) prokázali, že po transplantaci těchto mikrokapsulí do myší byly tyto buňky schopny života 1 rok a po tuto dobu pokračovaly v produkci hGH, což dokazuje schopnost mikrokapsule chránit transfektovanou buňku před zničením hostitelským imunitním systémem.
Bylo rovněž publikováno zapouzdření buněk s použitím jiných materiálů. Geneticky byly modifikovány ledvinové buňky mladých křečků tak, aby produkovaly nervový růstový faktor, byly zapouzdřeny do chloridu polyakrylonitrilu nebo polyakrylovinylchloridu a implantovány do krysího mozku. Zapouzdřené buňky přežívaly nejméně 6 měsíců a pokračovaly v produkci NGF (Win a spol., 1994; Deglon a spol., 1995).
Hepatocyty byly úspěšně zapouzdřeny do polyelektrolytického komplexu síranu celulózy a polydimetyl diallylaminia (Stange a spol., 1993). Více než 90% zapouzdřených hepatocytů rostoucích v monovrstvě, byly metabolicky aktivnější. Tím nechceme tvrdit, že kapsule, vytvořené síranem celulózy a polydimetyldiallylamoniem, mohou podporovat růst buněk jiných typů, nebo umožňovat průchod virových částic těmito kapsulemi.
Postup přípravy kapsulí ze síranu celulóz}', použitých v předkládaném vynálezu, byl podrobně popsán v DE 40 21 050 AI. Rovněž syntéza síranu celulózy je popsána v tomto patentu. Postupy k celkové charakterizaci kapsulí se rozsáhle zabývá H. Dautzengerg a spol., Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., 21 (3), 399-405 (1993). Jiné kapsule, používající síran celulózy, jsou popsány v GB 2 135 954. Vlastnosti celulózových kapsulí, t.j. jejich velikost, velikost pórů, síla stěny a mechanické vlastnosti, závisející na několika faktorech, jako na příklad na fyzikálních podmínkách, za kterých byly kapsule připraveny, viskozita srážecí lázně, její iontová síla, teplota, rychlost přidávání suspenze buněk nebo síranu celulózy, složení síranu celulózy a další parametry jsou popsány Dautzengergovou skupinou.
Překvapivé bylo zjištění, že nepřetržitou produkci virových částic z implantovaných buněk lze dosáhnout zapouzdřením buněk do polyelektrolytového komplexu. Ačkoliv póry těchto kapsulí jsou dostatečně velké, aby umožnily průchod protilátek a komplementu, o kterých je známo, že inaktivují virus (Welsh a spol., 1975, Cometta a spol., 1990), nenalezli jsme viditelné důkazy imunitní nebo zánětlivé odpovědi v okolí implantovaných kapsulí. Překvapivé bylo navíc zjištění, že kapsule, připravené podle předloženého vynálezu, dobře v hostiteli přirůstají a jsou rychle vaskularizovány. Zapouzdřené buňky, připravené podle předloženého vynálezu, tedy dovolují in vivo dlouhodobé dodávání virového vektoru, nesoucího terapeutické geny.
Podstata vynálezu
Vynález se týká následujících bodů nebo jejich kombinací:
Zapouzdřených buněk, produkujících virové částice, sestávajících z vnitřku, obsahujícího buňky; a porézní stěny kapsule, která obklopuje buňky a umožňuje průchod příslušným virovým částicím;
zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, kdy porézní stěna této kapsule je tvořena polyelektrolytovým komplexem, obsahujícím opačně nabité polyelektrolyty;
zapouzdřených buněk, jak shora uvedené, kdy porézní stěna této kapsule je tvořena polyelektrolytovým komplexem z polysacharidů nebo polysacharidových derivátů, obsahujících síranovou skupinu, nebo syntetických polymerů, obsahujících sulfonové skupiny, a polymerů, obsahujících kvartemí amoniové skupiny;
-2CZ 286979 B6 zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, kdy polysacharid nebo derivát polysacharidu, obsahující síranovou skupinu, je síran celulóza, síran acetylcelulózy, síran karboxymetylcelulózy, síran dextranu nebo síran škrobu, a syntetický polymer, obsahující sulfonovou skupinu, je sulfopolystyren;
zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, kdy polymer, obsahující kvartemí amoniovou skupinu, je polydimetyldiallylamonium nebo polyvinylbenzentrimetylamonium;
zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, kdy stěna porézní kapsule se skládá z komplexu, tvořeného síranem celulózy a polydimetyldiallylamonia;
zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, majících tvar mikrokapsule o průměru mezi 0,01 a 1 mm;
zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, kdy vnitřní stěna kapsule sestává z houbovitého skeletu, tvořeného síranem celulózy a je obklopena vnějším porézním povrchem; uvedený houbovitý skelet je naplněn buňkami;
zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, s velikostí pórů ve stěně porézní kapsule mezi 80 a 150 nm, lépe mezi 100-120nm;
zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, kdy virové částice, produkované zapouzdřenými buňkami, jsou částice retrovirů, obsahující genom retrovirového vektoru;
zapouzdřených buněk, jak shora uvedeno, kdy zapouzdřenými buňkami, produkujícími retrovirové částice, je buněčná linie, obsahující pomocný virus [termín „buňka (nebo buněčná linie), obsahující pomocný virus“ je použit na tomto místě a v celé přihlášce místo anglického „packaging cell“, (packaging cell line“); výstižný krátký český termín nebyl dosud vytvořen; význam termínuje vysvětlen v přihlášce na str. 12 řádek 1], transfektovaná expresním vektorem, tento expresní vektor, obsahující konstrukt retrovirového vektoru, schopný infekce a řízení exprese jedné nebo více kódovaných sekvencí, obsažených v tomto konstruktu vektoru v cílových buňkách; zmíněná buněčná linie, obsahující pomocný virus, nese alespoň jeden expresní vektor, obsahující geny, kódující bílkoviny, nutné ke sbalení retrovirového konstruktu;
zapouzdřené buňky, jak shora uvedeno, ve kterých jedna ze zmíněných sekvencí kóduje heterologní peptidy, vybrané ze značkovaných genů, terapeutických genů,protinádorových genů nebo cytokininových genů;
zapouzdřené buňky, jak shora uvedeno, v nichž je uvedený značkový gen vybrán ze skupiny značkových genů, kódujících bílkoviny, jako β-galaktosidázu, neomycin, alkohol dehydrogenázu, puromycin, hypoxantin fosforibosyltransferázu, (HPRT) . hygromycin, vylučované alkalické fosfatázy, a zmíněný terapeutický gen je vybrán z genů, které kódují bílkoviny, jako jsou Herpes simplex virus tymidin kináza, cytosin deamináza, guanin fosforibosyltransferáza (gpt), cytochrom P 450 a cyklické regulační geny, jako SDI, nádory potlačující geny, které kódují bílkoviny, jako p53 nebo antiproliferační geny, které kódují bílkoviny jako melittin, cecropin nebo cytokininy, jako IL-2;
zapouzdřené buňky, jak shora uvedeno, kdy buněčná linie, obsahující pomocný virus, je vybrána z psi—2, psi-ciypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 a GP+envAM-12;
zapouzdřené buňky, jak shora uvedeno, u nichž je expresní vektor transfektovaný do buněčné linie, obsahující pomocný virus, jako je pBAG, pLXSN, pl25LX, pLX2Bl nebo pc3/2Bl nebo jejich deriváty;
-3CZ 286979 B6 postup přípravy zapouzdřených buněk sestává v suspendování buněk, produkujících virové částice,ve vodném roztoku polyelektrolytu, poté je nově vzniklá suspenze ve formě částic vnesena do srážecí lázně, obsahující vodný roztok opačně nabitého polyelektrolytu;
postup uvedený shora, při kterém se částice tvoří rozprášením;
postup uvedený shora, při kterém se buňky suspendují ve vodném roztoku polysacharidu, nebo derivátu polysacharidu, obsahujícího síranové skupiny, nebo roztoku syntetického polymeru, obsahujícího sulfonové skupiny;
postup uvedený shora, kdy použité polysacharidy, nebo polysacharidové deriváty, obsahující síranové skupiny, jsou vybrány ze síranu celulózy, síranu acetylcelulózy, síranu karboxymetylcelulózy, síranu dextran nebo síranu škrobu, a syntetický polymer, obsahující sulfoskupinu, je sulfopolystyren postup uvedený shora, kdy srážecí lázeň obsahuje vodný roztok polymeru, majícího kvartémí amoniové skupiny;
postup uvedený shora, kdy polymerem, obsahujícím kvartémí amoniové skupiny, je polydimetyldiallylamonium nebo polyvinylbenzyltrimetylamonium;
postup uvedený shora, kdy buňky jsou suspendovány ve vodném roztoku sodné soli síranu celulózy a jsou vnášeny do srážecí lázně, obsahující vodný roztok chloridu polydimetyldiallylamonia;
metoda uvedená shora, kdy vodný roztok síranu celulózy obsahuje 0,5-50 % sodné soli síranu celulózy a 2-10 %, přednostně 5 % fetálního telecího séra v pufrovaném fyziologickém roztoku;
metoda uvedená shora, kdy vodný roztok srážecí lázně obsahuje 0,5-50 %, lépe 2-5 %, ještě lépe 3 % chloridu polydimetyldiallylamonia v pufrovaném fyziologickém roztoku;
jakékoliv zapouzdřené buňky, připravené kterýmkoli ze shora uvedených postupů;
použití zapouzdřených buněk, jak je shora uvedeno, pro dodání genů do cílových orgánů nebo buněk, sestávající z:
a) růstu zapouzdřených buněk ve vhodném médiu, a
b) implantace zapouzdřených buněk do živého zvířecího těla, včetně těla lidského;
použití, jak je shora uvedeno, do cílových orgánů nebo buněk savčích žláz nebo pankreatu; a použití, jak je shora uvedeno, do cílových orgánů nebo buněk hladkého svalstva a jiných typů buněk, obklopujících arterie.
Předmětem předkládaného vynálezu je získání zapouzdřených buněk, umožňujících uvolnění virových částic, produkovaných těmito buňkami zkapsulí, a které po implantaci kapsulí nevzbudí významnou imunitní nebo zánětlivou reakci hostitelského organismu.
Dalším předmětem vynálezu je uvedení postupu přípravy těchto zapouzdřených buněk, produkujících virové částice.
Předmětem tohoto vynálezu je také metoda pro dodání genů, zvláště genů terapeutických, cílovým orgánům nebo buňkám implantací zapouzdřených buněk, produkujících virové částice,
-4CZ 286979 B6 do hostitelského organismu a tedy zajištění stálé produkce a uvolňování virových částic v cílových orgánech nebo v blízkosti cílových buněk.
Podle předloženého vynálezu zapouzdřené buňky produkují a umožňují uvolnit virové částice, které byly buňkami produkovány, z kapsulí, a současně nevyvolají významnou imunitní reakci nebo zánět v hostitelském organismu.
Zapouzdřené buňky podle tohoto vynálezu mohou být připraveny suspendováním buněk, produkujících virové částice, ve vodném roztoku polyelektrolytu (např. podle výběru polysacharidy, nebo deriváty polysacharidů, obsahující síranové skupiny nebo syntetické polymery, obsahující sulfonové skupiny) a dále vnesením suspenze, obsahující vzniklé částice, do srážecí lázně, obsahující vodný roztok opačně nabitého polyelektrolytu (jakým je např. polymer, obsahující kvartémí amoniové skupiny).
Polysacharidy nebo deriváty polysacharidů, obsahující síranové skupiny, včetně síranu celulózy, síranu acetylcelulózy, síranu karboxymetylcelulózy, síranu dextranu nebo síranu škrobu ve formě solí, zejména sodných. Syntetickým polymerem, obsahujícím sulfo-skupiny, může být sůl sulfopolystyrenu, lépe jeho sodná sůl.
Polymery, obsahující kvartémí amoniové skupiny, mohou být polydimetyldiallylamonium nebo polyvinylbenzyltrimetylamonium ve formě solí, lépe jako chloridy.
V přednostním provedení vynálezu jsou buňky, produkující virové částice, zapouzdřeny v komplexu, sestávajícím z komplexu, tvořeného síranem celulózy a polydimetyldiallylamonia.
Tyto kapsule jsou přednostně připraveny suspendováním buněk, produkujících virové částice, v roztoku, obsahujícím 0,5-50 %, lépe 2-5 %, síranu celulózy a 5 % fetálního hovězího séra ve zvoleném pufru. Suspenze je potom vnášena po kapkách dávkovacím zařízením (např. rozstřikováním vzduchem pomocí trysky nebo piezoelektrickým systémem) za stálého míchání do srážecí lázně, obsahující 0,5-50%, lépe 2-10%, nebo nejlépe 3% chloridu polydimetyldiallylamonia ve zvoleném pufru. Tvorba kapsulí trvá milisekundy a kapsule, obsahující buňky, jsou ponechány ve srážecí lázni 30 sekund až 5 minut a poté jsou promyty. Rychlost metody zaručuje, že buňky nejsou vystaveny během postupu škodlivému stresu. (Stange a spol., 1993).
Kapsule, připravené podle vynálezu, mají průměry v rozmezí mezi 0,01 a 5 mm, lépe mezi 0,1 a 1 mm. V závislosti na velikosti mohou být kapsule připraveny tak, aby obsahovaly různé množství buněk. S použitím postupu podle vynálezu je možno zapouzdřením do polyelektrolytového komplexu připravit kapsule, obsahující až 1010, lépe ΙΟ5—107 buněk, produkujících virové částice.
Kapsule, vytvořené síranem celulózy a polydimetyldiallylamoniem, mají výborné mechanické vlastnosti a mohou být připraveny v jednotné velikosti a s jednotnou velikostí pórů.
Velikost pórů kapsulí je mezi 80 a 150 nm, lépe mezi 100 a 120 nm.
Zapouzdřené buňky mohou být kultivovány v normálním buněčném médiu (jehož složení závisí na druhu zapouzdřených buněk) za standardních podmínek vlhkosti, teploty a koncentrace CO2. Po dobu kultivace je možno dokázat, že dochází k uvolňování virových částic z kapsulí do kultivačního média použitím buď RT-PCR technologií, nebo přenosem bezbuněčného (0,45 pm filtrace) supematantu do cílových buněk a následným důkazem virové infekce stanovením aktivity značkových bílkovin, kódovaných geny konstruktu virového vektoru, obsaženého ve virových částicích. Je-li značkový gen, obsažený ve virovém vektoru, genem nesoucím
-5CZ 286979 B6 specifickou rezistenci k nějaké látce v cílových buňkách, je možno titr viru, produkovaného systémem, stanovit také tímto způsobem.
Po vhodné době kultivace (normálně na kratší než 1 hodina a delší než 30 dní) mohou být kapsule, obsahující buňky, chirurgicky implantovány, a to buď přímo, nebo injekčně s použitím injekční stříkačky do různých částí těla.
Podle tohoto vynálezu mohou být virové částice, produkované zapouzdřenými buňkami, jakéhokoli druhu, vhodného pro genovou terapii, zahrnujíce v to, ale neomezujíce se pouze na, adenoviry, viry sdružené s adenoviry, herpetické viry nebo retroviry; přehled viz Gůnzburg a Salmons, 1995.
V přednostním provedení vynálezu jsou zapouzdřené buňky buněčná linie, obsahující pomocný virus, produkující retrovirové částice, které obsahují ve svém genomu konstrukt retrovirového vektoru, nesoucí markerový a terapeutický gen.
Systémy retrovirového vektoru se skládají ze dvou částí:
1) expresní vektor (plazmidový vektor) nesoucí retrovirový vektorový konstrukt, který je modifikovaným retrovirem, u něhož byly geny kódující virové bílkoviny nahrazeny terapeutickými geny a podle rozhodnutí i zvoleným značkovým genem za účelem jejich přenosu do cílové buňky. Protože záměna genů, kódujících virové bílkoviny, virus značně poškozuje, je nutno jej ochránit druhou složkou systému, která zajistí syntézu chybějících virových bílkovin.
Druhá složka je:
2) buněčná linie, produkující velké množství virových bílkovin, která ale neprodukuje replikace schopný virus. Tato buněčná linie se nazývá buněčná linie, obsahující pomocný virus, a je to buněčná linie, která byla transfektována plazmidy, nesoucími geny, umožňující sbalení modifikovaného retrovirového genomu do virové částice. Tyto plazmidy řídí syntézu virových bílkovin, nutných pro produkci virionů.
K získání sbaleného retrovirálního vektoru je vektorový plazmid transfektován do buněčné linie, obsahující pomocný virus. Za těchto podmínek je modifikovaný retrovirový genom, obsahující vložený terapeutický gen a zvolený značkový gen, přepsán z vektorového plazmidu a výsledný modifikovaný retrovirový genom je sbalen do retrovirové částice. Buňka, infikovaná takovou virovou částicí, není schopna vytvářet virové částice, protože žádné virové bílkoviny nejsou v těchto buňkách obsaženy. Avšak retrovirový konstrukt, nesoucí terapeutický a značkový gen, je přítomen a může být v infikovaných buňkách exprimován.
WO 94/29437, WO89/11539 a WO96/07748 popisují různé typy systémů retrovirových vektorů, použitelných k účelům tohoto předloženého vynálezu
Virové částice, produkované zapouzdřenými buňkami podle tohoto vynálezu, mohou být navrženy tak, aby obsahovaly genom virového vektoru, nesoucího geny kódující značku a/nebo terapeutické geny.
Značkové nebo terapeutické geny, nesené virovým vektorem, mohou být např. geny kódující bílkoviny, jako β-galaktosidázu, neomycin, alkoholdehydrogenázu, puromycin, hypoxantin fosforibosyl transferázu (HPRT), hygromycin a vylučovanou alkalickou fosfatázu, nebo terapeutické geny, kódující bílkoviny, jako je virová Herpes Simplex tymidin kináza, cytosin deamináza, guanin fosforibosyltransferáza (get), cytochrom P 450, regulační geny buněčného
-6CZ 286979 B6 cyklu, jako je SDI, geny potlačující nádory, kódující bílkoviny, jako je p53, antiproliferační geny, které kódují bílkoviny, jako je melitin, cecropin nebo cytokininy jako IL-2.
Ve zvláštním spojení se použití vynálezu týká užití zapouzdřených buněk, připravených podle 5 vynálezu, k léčení nádorů.
Mnoho maligních nádorů nereaguje dobře na chemoterapii. Protirakovinná léčiva, používaná v léčení nádorů, jsou v mnoha případech používána systematicky a jsou tedy rozšiřována do celého organismu pacienta. Soustavná podávání vysokých dávek takových léčiv, vyžadovaná 10 k léčení rakoviny, jsou často doprovázena pro pacienta nepříjemnými vedlejšími efekty. Jedna ze strategií, které by mohly obejít tyto problémy vysokých systematických koncentrací, je přímá aplikace nebo aktivace léčiva v blízkém okolí nádoru. Toho může být dosaženo podle tohoto vynálezu implantací zapouzdřených buněk, produkujících virové částice, obsahující genom plánovitě pozměněného viru, zvláště retroviru, nesoucího gen, kódující léčivo proti rakovině, 15 např. aktivační enzym, schopný převést prekurzor léčiva na cytotoxickou látku, buď přímo v nádorových buňkách, nebo v buňkách v jejich blízkém okolí.
V jednom z použití tohoto vynálezu zapouzdřené buňky skýtají možnost produkce retrovirových částic, obsahujících genom retrovirového vektoru nesoucí enzymy, významné pro nádorovou 20 tkáň, jako jsou cytochrom P 450, nebo sebevražedné geny, jako jsou, ale ne pouze, tymidin kináza, která přeměňuje netoxická léčiva na jeden nebo několik toxických metabolitů. Takové zapouzdřené buňky podle tohoto vynálezu mohou být využity k léčbě rakovin implantací těchto kapsulí do / nebo blízko nádorů, např. nádorů pankreatu nebo mléčných žláz.
Dalšího cíleného působení může být dosaženo použitím specifických regulačních prvků a promotorů v cílových buňkách, jimiž lze dosáhnout řízení exprese připojených terapeutických genů ve specifických typech buněk.
Tyto specifické regulační prvky a promotory cílových buněk zahrnují např. specifické 30 pankreatické regulační prvky a promotory, počítajíce do nich regulační elementy a promotory anhydrázy kyseliny, uhličité II a β-glukokinázy; lymfocytámí specifické regulační prvky a promotory, zahrnující lymfocytámí specifické regulační prvky a promotory imunoglobulinu a MMTV;, specifické regulační prvky a promotory mléčných žláz, počítajíce do nich Whey Acidic Protein (WAP) a virus myších mléčných žláz (MMTV) Mouše Mammary Tumor Virus, 35 specifické regulační prvky a promotory β-laktoglobulinu a kaseinu a specifické regulační prvky a promotory MMTV, udělující citlivost na glukokortikoidní hormony nebo řídící expresi v mléčných žlázách. Jiné promotory zahrnuje například promotory CD4, CD34 a IL2. Uvedené regulační prvky a promotory regulují přednostní expresi zmíněných retrovirových vektorů.
Mohou být rovněž použity radiačně induktivní promotory, například promotor intracelulámí adhezivní molekuly-1 (ICAM-1), promotor epidermálního růstového faktoru (EGFR) nebo promotor nádorového nekrózního faktoru (TNF).
Následující příklady dále ilustrují tento vynález, avšak není je možno chápat jako příklady 45 vynález omezující.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Lipofekce PA317 pomocí pBAG a izolace rezistentních buněk G418:
Amfotropické buňky NIH3T3, založené na buňkách P317, obsahujících pomocný virus (Miller a Bultimore, 1986), byly kultivovány na Dubesccem modifikovaném médiu podle Eagle (DMEM), obsahujícím 10 % fetálního telecího séra. Buňky byly naočkovány do 10 cm misek na tkáňové kultuiy v hustotě 3x105 jeden den před lipofekcí a byly lipofektovány 2 pg vektoru pBAG (Price a spol., 1987), nesoucím retrovirální vektor MLV (virus myší leukemie), s použitím komerční lipofektaminové sady činidel od GIBCO/BRL podle návodu výrobce. Buňky byly poté zředěny jedna ku deseti a kultivovány v obvyklém médiu, obsahujícím navíc 400 pg/ml G418 (GIBCO/BRL). Po 14 dnech byly kolonie, obsahující G418 rezistentní buňky, spojeny.
Příklad 2
Mikrozapouzdření:
107 buněk bylo suspendováno v 1 ml pufrovaného fyziologického roztoku, obsahujícího 2-5 % sodné soli síranu celulózy a 5 % fetálního telecího séra a vzniklá suspenze byla po kapkách pomocí dávkovacího systému (rozstřikováním vzduchem pomocí trysky) vnášena do srážecí lázně, obsahující 2-3 % polydimetyldiallylamonia v pufrovaném fyziologickém roztoku. Tvorba mikrokapsulí, probíhající v milisekundách, byla následována tvorbou porézní, pro mechanickou odolnost důležité, vnitřní vrstvy, v zásadě složené ze síranu celulózy. Kapsule, obsahující buňky, byly ponechány ve srážecí lázni 30 sekund až 5 minut a potom promyty DMEM (Stange a spol., 1993). Jednotlivé preparáty, získané za různých podmínek, t.j. různé koncentrace síranu celulózy, různého průtoku tryskou dávkovacího systému a časem, po který byly kapsule ponechány ve srážecí lázni, byly použity k biologickým studiím. Reprezentativní příklady podmínek jsou například: 2,5 % sodné soli síranu celulózy, 2 % polydimetyldiallylamonia a 1 minuta ve srážecí lázni, nebo 1,5% sodné soli síranu celulózy, 2% polydimetyldiallylamonia a 0,5 minuty ve srážecí lázni, nebo 3 % sodné soli síranu celulózy a 3 % polydimetyldiallylamonia a 2 minuty ve srážecí lázni. Přesné podmínky byly voleny s ohledem na přesnou velikost žádaných kapsulí, sílu stěny kapsule a jiné vlastnosti.
Příklad 3
Implantace mikrokapsulí do mléčných žláz myší:
Mikrokapsule byly chirurgicky vloženy do mléčných žláz 2 měsíce starých samic BALB/c myší metodou „klíčové dírky“ a otvor byl uzavřen jedním stehem. Až 6 kapsulí o průměru 0,5-2 mm bylo umístěno do každého operačního místa.
Uvolnění virových částic ve studiích in vitro, struktura mikrokapsulí a vliv implantace kapsulí do imunokompetentních myší byly studovány následujícími metodami:
-8CZ 286979 B6
A) β-galaktosidázová aktivita
Provedení histochemického barvení, použitého pro detekci v infikovaných buňkách, bylo uvedeno již dříve (Čepko, 1989). Buňky, kapsule nebo tkáňové řezy byly promyty chladným PBS a fixovány 2 % paraformaldehydem 20 minut-24 hodin, podle tloušťky vzorku. Po extenzivním promytí PBS byly buňky, kapsule nebo tkáňové řezy inkubovány v roztoku, obsahujícím substrát X-gal (20 mM KjFeCNž, 20 mM K4FeCN6.3H2O, 2 mM MgCl2 a 1 mg/ml X-gal) nejméně 2 hodiny při 37 °C.
B) Infekce
4x104 cílových buněk bylo vyseto do 6-ti jamkových misek na tkáňové kultury 6 hodin před infekcí. Kapsule, obsahující virus produkující buňky, byly umístěny na buňky a k médiu byl přidán polybren (8 pg/ml). Čtyři hodiny později bylo médium vyměněno, aby se odstranil zbývající polybren. Po pěti dnech byly některé jamky obarveny testem na β-galaktosidázovou aktivitu, jak shora uvedeno, jiné byly trypsinizovány do větších tkáňových misek a kultivovány v médiu, obsahujícím 400 pg/ml G418. Po 16 dnech byly detekovány G418 rezistentní kolonie.
C) RT-PCR analýza
Virové částice z 5 ml supematantu kultivačního média byly paletovány na ultracentrifuze (240 OOOxg, 1 hodinu, 4 °C). Pelety byly suspendovány v lyžujícím pufru (1 % Triton 100, 0,5 % desoxycholátu, 0,1 % dodecylsíranu sodného, PBS) a RNK byla extrahována fenolem s následným srážením etanolem, jak bylo dříve popsáno (Salmons a spol., 1986). RNK byla reverzně přepsána do DNK s použitím soupravy: Read-To-Go T-primed first strand kit (Pharmacia). PCR amplifikace byla provedena s použitím primerů, umístěných uvnitř env a R MLV, pozměněného BAG vektorem LTR (Obr. 2A). PCR amplifikace byla provedena v 100 μΐ reakční směsi, sestávající z 500 mM Kel, 10 mM Tris-HCl (pH=8,3) 1,5 mM MgCl2, 0,01 % (W/v) želatiny a 100 μΐ každého dNTB, 40 pM každého primeru a 2,5 jednotek Tag polymerázy (Perkin Elmer). Reakce byla prováděna v cykleru Perkin Elmer Cetus Therma Cycler 9600 za těchto podmínek: 1 min. při 94 °C, 2 min. při 53 °C, 3 min. při 72 °C, celkový počet cyklů byl 35. Produkty PCR byly rozděleny na 0,8 % agarózovém gelu a potom přeneseny na Zeta probe membrány (BIORAD) a hybridizovány, jak popsáno (Indaccolo a spol., 1995), s 32P-značeným 612 PCR fragmentem genomu MLV, získaného se stejnými primeiy a pBAG jako templátem. MLV specifická sekvence byla zviditelněna s použitím Fuji phosphoimaging systém (BAS 1000).
D) PCR analýza
Genomová DNK (1 pg) byla amplifikována metodou PCR s použitím jednoho primeru, umístěného ve zbytkové části env sekvence vektoru BAG a druhého primeru v polyomové části plazmidu mimo sekvenci retrovirového vektoru (Obr. 3B). PCR reakce byly provedeny, jak shora popsáno, za použití těchto reakčních podmínek: 1.min. při 94 °C, 2.min. při 50 °C, 3.min. při 68 °C, celkový počet cyklů byl 35. Produkt PCR byl hybridizován s j2P-značeným fragmentem 1,5 kb Xbal DNK ze pBAG, specifickým pro sekvence polyomu.
E) Elektronová mikroskopie
Vzorky pro skenovací elektronovou mikroskopii (SEM) a transmisní elektronovou mikroskopii (TEM) byly promyty PBS (pH 7,3) a předfixovány 1% glutaraldehydem po dobu 15 minut a potom 15 minut fixovány 2% OsO4. Vzorky byly odvodněny roztoky etanolu se stoupající koncentrací a rozděleny do dvou skupin. A) vzorky pro SEM byly sušeny metodou kritického
-9CZ 286979 B6 bodu CO2, a pokoveny 3 nm platiny (Emscope SC 500Ashford, England). Pokovené vzorky byly hodnoceny v lOkV emisním skenujícím mikroskopu (Jeol JSM-6300F; Tokyo, Japan), s urychlujícím napětím 5-10 kV v sekundárním modu, b) Vzorky pro TEM byly zality do Eponu. Ultratenké řezy byly dvojitě barveny octanem uranylu a citrátem olovnatým, a hodnoceny na transmisním elektronovém mikroskopu Zeis EM-10C )Oberkochem, Germany).
Výsledky
Uvolňování viru z mikrokapsulí - studie in vitro:
Barvení mikrokapsulí, získaných podle postupu, uvedeného v příkladu 2, se substrátem X-gal, jak je popsáno v testu na β-galaktosidázu kódovanou pBAG (Obr. 1), stejně jako nezapouzdřené vektor produkující buňky (není ukázáno).
Uvolňování virových částic do kultivačního média z buněk v mikrokapsulích bylo prokázáno tak, že z peletovaných virionů, získaných ze supematantu kapsulí, byla v různých časových intervalech kultivace připravena RNK. Tato RNK byla analyzována RT-PCR technikou s použitím doplňkových primerů k env a R oblastem virového genomu, jak je popsáno v odstavci RT-PCR analýza. Vznik fragmentu o předpokládané délce (612 bp), specifického pro MLV, generovaného PCR metodou z kultivačního média mikrokapsulí, byl pozorován nejméně 6 týdnů (Obr. 2B, řádky 1—4), kdy bylo stanovení přerušeno. Tento fragment nevznikl vlivem znečistění DNK, protože po působení ribonukleázy na virovou RNK před RT-PCR nedalo pozitivní výsledky. (Obr. 2C; 1-4).
Produkce a uvolnění infekčního viru z kapsulí mohlo být ověřeno společnou kultivací s cílovými buňkami, jak je shora popsáno, v testech na infekčnost, např. s buňkami NIH3T3 (Janchill a spol., 1969) nebo CRFK (Crandell a spol., 1973). Po 4 dnech společné kultivace alikvoty cílových buněk stejně jako zapouzdřené buňky, obsahující pomocný virus, byly barveny na βgalaktosidázovou aktivitu způsobem shora uvedeným. Zbylé cílové buňky byly selektovány na rezistenci proti G418. Mnoho buněk NIH3T3 a CRFK společně kultivovaných NIH3T3 a CRFK prokázalo expresi genu β-gal (Obr. 3A).
Aby bylo možno potvrdit, že cílové buňky získaly β-gel infekci, byly cílové buňky testovány metodou PCR. BAG produkující buněčné linie, obsahující pomocný virus, jsou založeny na buněčné linii PA317 (Miller a Buttimore, 1986) a nesou gen tymidin kinázy viru Herpes simplex (HSV-TK), působením které je převáděn prekurzor genclovir na cytotoxický prostředek. Cílové buňky NIH3T3 nebo CRTK běžně tento gen nemají. Pokusně může být demonstrováno, že společně kultivované cílové buňky NIH3T3 nebo CRTK, které jsou schopny exprimovat β-gal, jsou rezistentní k GCV, což znamená, že nedošlo k úniku buněk, produkujících BAG, genomová DNK byla extrahována z cílových buněk, analyzována na přítomnost plazmidové sekvence mimo vektor metodou PCR. Tyto sekvence jsou přítomny v buněčných liniích, obsahujících pomocný virus, poněvadž vektor BAG byl lipofektován do těchto buněk ve formě plazmidu pBAG. Virus produkovaný buňkami, obsahujícími pomocný virus, nemá tyto plazmidové sekvence, takže by neměly být přítomny ani v cílových infikovaných buňkách. Obr. 3B ukazuje, že takové plazmidové sekvence nebyly detekovatelné, v souhlase s infekcí těchto buněk vektorem BAG. Struktura mikrokapsulí:
Byly připraveny řezy mikrokapsulí a jejich struktura byla analyzována elektronovou mikroskopií. Vnitřek mikrokapsulí tvoří houbovitá matrice, naplněná buňkami (Obr. 4). Skenující elektronová mikroskopie ukázala, že na povrchu mikrokapsulí jsou otvory dostatečně velké, aby umožnily průchod vektorům retrovirových částic z mikrokapsulí, bílá úsečka na obr. 4 odpovídá svou velikostí průměrnému průměru retrovirových částic (Obr. 4).
-10CZ 286979 B6
Stabilita in vivo u imunokompetentních myší.
Ke stanovení stability mikrokapsulí a zjištění, zda-li mikrokapsule nebo virus, který je jimi produkován, způsobuje pozorovatelnou imunitní odpověď, byly mikrokapsule implantovány do mléčných žláz 2 měsíce starých myších samic BALB/c. Myši byly po různých dobách implantace utraceny a byl sledován vzhled mikrokapsulí a produkce infekčního viru. Implantované mikrokapsule byly jasně viditelné, obalené polštářky tuku mléčných žláz nejméně 6 týdnů po implantaci (Obr. 5B). K vaskularizaci došlo v okolí mikrokapsulí u všech analyzovaných zvířat (Obr. 5A), pravděpodobně jako výsledek produkce angiogenického nebo růstového faktoru buňkami, obsahujícími pomocný virus.
Řezy mikrokapsulí a je obklopující tkáně mléčných žláz potvrdily, že je možno nalézt cévy v bezprostřední blízkosti kapsulí (Obr. 5B). Tyto řezy také ukázaly vrstvu spojovací tkáně mezi mikrokapsulemi a tkání mléčných žláz. Nebyla pozorována viditelná známka větší zánětlivé nebo imunitní reakce na mikrokapsule, nebo virus produkující buňky, v nich obsažené.
Na důkaz toho, že infekční retrovirové vektory byly uvolněny z kapsulí a infikovaly je obklopující tkáň mléčných žláz, byly některé řezy analyzovány na expresi β-gal barvením Xgal. Buňky, exprimující β-gal, byly jasně viditelné mimo mikrokapsule (Obr. 5C).
Příklad 4
Tento příklad popisuje konstrukci retrovirového expresního vektoru, obsahujícího gen krysího cytochromu P450 2B1, pro intratumorální infekci.
Expresní vektor pLX2Bl, viz obr. 6, byl konstruován ligací fragmentů, získaných zplazmidu pLX125 a pSWl (Kedzie a spol. 1991). Plazmid pLX125 byl linearizován Hpal a výsledné zarovnané konce byly defosforylovány telecí střevní fosfatázou. DNK byla separována na 1% agarózovém gelu, vyříznuta a získána podle komerčního postupu QiaQuick (Qiagen). Po srážení etanolem byla DNK resuspendována ve vodě.
Klonovací vektor pSWl po štěpení Smál a HincII poskytl dva zarovnané konce. Štěpená směs byla rozdělena na 1% agarózovém gelu. Kratší fragment (1,5 kb), obsahující krysí cytochrom P450 2B1 (Fuji-Kuriyama a spol., 1982), byl vyříznut a eluován podle Qiaquick DNK extrakčního protokolu, sražen etanolem a resuspendován ve vodě.
7,6 fMolů pLX125 a 24 fMolů Smal/HundlI-fragmentu ze pSWl bylo smícháno a ligováno po 3 dny při 12 °C pomocí T-4 ligázy (Boehringer). Ligáza byla inaktivována při teplotě 65 °C 10 min. a DNK sražena 10 objemy butanolu. Sražená DNK byla resuspendována ve vodě a metodou elektroporace zavedena do DHlOB-bakterií (Gibco). Kolonie, které byly rezistentní vůči ampicilinu, byly vybrány, byla z nich připravena DNK, která byla štěpena SspBI/SalI, BamHI/SspBI, Pvul a BamHI. Výsledný správný plazmid byl označen pLX2Bl.
Lipofekce
Jeden den před lipofekcí bylo 3xl05 retrovirových buněk, obsahujících pomocný virus PA317 (Miller a Buttimore, 1986), vyseto na 6 cm Petriho nebo tkáňové kultivační misky. V den infekce byl smíchán 1 pg pLX2Bl se 100 μΐ média prostého séra. Paralelně 15 μΐ Lipofectaminu (Gibco BRL) bylo smícháno s 100 μΐ média prostého séra. Roztok obsahující plazmid byl přidán k lipofektaminové směsi a inkubován 45 min. Po 35 minutách byly buňky promyty jednou 2 ml média, neobsahujícího sérum. 800 μΐ média neobsahujícího sérum bylo přidáno k lipofectaminové směsi a výsledný 1 ml reakční směsi byl přidán k připraveným buňkám. Po 6
-11CZ 286979 B6 hodinách byl přidán 1 ml Dulbeccem modifikovaného Eaglova média, obsahujícího 10% FCS. Příštího dne byly buňky trypsinizovány, zředěny 1:10 a vysety na 100 mm misku. Po 24 hodinách bylo médium vyměněno za médium, obsahující analog neomycinu G418. Jednotlivé populace buněčných klonů byly izolovány a analyzovány na expresi cytochromu P450.
Zapouzdření
Buňky, produkující retrovirový vektor a obsahující pomocný virus, byly získány a zapouzdřeny postupem, popsaným shora v příkladu 2.
Implantace
Získané kapsule byly chirurgicky implantovány postupem „klíčové dirky“ blízko nebo přímo do transplantovaných nebo spontánních nádorů myší BALB/c nebo GR. Asi 6 kapsulí o průměru 1 mm bylo vloženo do každého z operačních míst. Operační pole bylo uzavřeno jedním stehem. Myši byl potom místně vystaveny působení cyklofosfamidu nebo ifosfamidu přímou intratumorální infekční aplikací 100 μΐ 20 mg/ml nebo systémové koncentraci 130 mg CPA/kg váhy, aplikované i.p. a 40-60 mg IFO/kg váhy rovněž i.p. aplikované, a to maximálně po dobu 10 týdnů. Po tuto dobu byl denně monitorován makroskopický vzhled nádoru. Potom byly myši utraceny, tkáň, obsahující vložené kapsule a nádor, byla vyňata a byly připraveny histologické řezy pro světelný a elektronový mikroskop. Tyto řezy jasně ukázaly dobré vhojení kapsulí a vaskularizaci, nebyla pozorována přítomnost lymfocytů, která by indikovala buněčnou imunitní reakci. V těchto řezech nebyla pozorována přítomnost odumřelých buněk nebo nekrózy uvnitř kapsulí. Nádor naopak nekrotické změny vykazoval a makroskopicky bylo jasně patrné zmenšení jeho velikosti během pokusu.
Příklad 5
Tento příklad popisuje konstrukci stálé buněčné linie, přirozeně exprimující cytochrom P450 2B1.
Expresní vektor pc3/2Bl byl konstruován ligací fragmentů, získaných zplazmidu pcDNA3 (Invitrogen) a pSW (Kedzie a spol., 1991).
Plazmid pcDNA3 byl štěpen Xhol/Xbal a vzniklé kohezní konce fragmentů defosforylovány telecí střevní fosfatázou. Řetězec vektorové DNK byl izolován a čištěn na 1% agarózovém gelu, DNK byla vyříznuta a extrahována podle Qiaquick postupu (Qiagen). Po srážení etanolem byla DNK resuspendována ve vodě.
Klonovací vektor pSWl byl štěpen Xhola Xbal na dva fragmenty. Štěpená směs byla rozdělena na 1% agarózovém gelu. Nejkratší fragment (1,5 kb), obsahující krysí cytochrom P 450 2B1 cDNK (Fuji-Kuriyama a spol., 1982), byl vyříznut, eluován extrakčním postupem Qiaquick DNK, sražen etanolem a resuspendován ve vodě.
8,3 fMolů hlavního řetězce pcDNA3 a 24,8 fMolů Xhol/Xbal-fragmentu p SW1 bylo smícháno a ligováno 1 den při 12 °C T4-ligázou (Boehringer). Ligáza byla inaktivována při 65 °C 10 min. a DNK byla srážena 10 násobným nadbytkem butanolu. Sražená DNK byla resuspendována ve vodě a metodou elektroevaporace zavedena do bakterií DHlOb (Gibco). Vybrány byly kolonie rezistentní k ampicilinu, z nich byla připravena DNK a zkušebně štěpena EcoRI, BamHI, EcoRV a Xhol. Výsledný správný plazmid byl označen pc3/2Bl.
-12CZ 286979 B6
Lipofekce den před infekcí bylo vyseto 3x105 buněk na 35 mm misky. V den infekce byly smíseny 2 pg pc3/2Bl se 100 μΐ média neobsahujícího sérum. Roztok obsahující plazmid byl přidán k lipofektaminové směsi a inkubován 45 minut. Po 35 minutách byly buňky jednou promyty 2 ml média neobsahujícího sérum. 800 μΐ média neobsahujícího sérum bylo přidáno k lipofekční směsi a výsledný 1 ml směsi byl přidán nalitím na připravené buňky. Po 6 hodinách byl přidán 1 ml DMEM (Glutamax) s 10 % FCS. Příští den byly buňky trypsinizovány, desetkrát zředěny a vysety na 100 mm misku. Po 24 hodinách bylo médium vyměněno za neomycinové médium. Po 14 dnech neomycin rezistentní klony byly izolovány a testovány na přítomnost a aktivitu vektoru.
Kapsule, obsahující tyto buňky, byly připraveny podle příkladu 2 a implantovány do myší blízko nádorů. Po působení cyclofosfamidem nebo ifosfamidem byla účinnost působení hodnocena shora popsaným způsobem.
Obrázky
Obr. 1: Histologické barvení zapouzdřených PA317 buněk stabilně transfektovaných pBAG jako důkaz exprese β-galaktosidázy.
Obr. 2: Analýza RT-PCR virových částic uvolněných z kapsulí. (2B; vzorky 1-4; médium odebráno po 2, 3, 5 a 6 týdnech kultivace kapsulí). Kultivační médium buněk nezapouzdřených, produkujících virus BAG, bylo použito jako pozitivní kontrola (vzorek 5) a médium z netransfektovaných PA317 jako negativní kontrola (vzorek 6). Negativní odpovědi byly získány u vzorků štěpených RNázou před provedením RT-PCR analýzy, což je důkazem, že amplifikované pásy pocházejí z virové RNK (2C; vzorky 1-4). Virová RNK, připravená z nezapouzdřených buněk, produkujících virus BAG, bez štěpení ribonukleázou, byla použita při reakci RT-PCR jako pozitivní kontrola (vzorek 7)·
Obr. 3: Společná kultivace zapouzdřených buněk, produkujících virus a buněk NIH3T3.
(A) Cílové buňky byly vysety s nízkou hustotou jeden den před přidáním kapsulí s buňkami, obsahujícími pomocný virus a produkujícími retrovirový vektor. Buňky a kapsule byly několik dní později histologicky barveny na průkaz β-galaktosidázové aktivity.
(B) Za účelem ověření, že cílové buňky, exprimující β-galaktosidázu, vznikly infekcí spíše než únikem viru z produkčních buněk, byla z buněk extrahována genomová DNK a byla analyzována metodou PCR.
Obr. 4: Snímek skenovacího elektronového mikroskopu, ukazující povrch částice (mikrokapsule), na kterém jsou při vysokém zvětšení (x 75 000) patrné porézní struktury. Bílá úsečka, reprezentující 100 nm (průměr částice retrovinu), je důkazem, že tyto struktury mohou býti póry, kterými je virus z kapsule uvolňován.
Obr. 5: Histologická analýza kapsule, implantované do mléčné žlázy myši. (A) (B) řez kapsulí, implantované do myší mléčné žlázy po čtyřech týdnech na světelném mikroskopu (133 x zvětšeno).
(C) Infekce buněk myší mléčné žlázy po implantaci kapsulí, obsahujících buňky PA317, produkující vektor BAG.
-13CZ 286979 B6
Obr. 6: Struktura expresního vektoru pLX2Bl, obsahující gen pro krysí cytochrom P450 2B1, který je kontrolován po konverzi promotoru promotorem U3-MMTV.
Lineární odkazy:
Čepko, C. (1989). Liniová analýza nervového systému obratlovců genovým transferem, zprostředkovaným retrovirem. Meth. Neurosci. 1,367-392.
Chang, P. L. (1995). Neautologní somatická genová terapie. Somatická genová terapie. P. L. Chang, ed (CRC press, Boča Raton) pp. 203-223.
Cometta, K., Moen, R. C., Culver, K., Morgan, R. A., Mclachlin, J. R., Sturm, S., Selegue, J., London, W., Blaese, R. M., and Anderson, W. F. (1990). Amfotropický retrovirus myší leukemie není akutním patogenem primátů. Hum. Gene Ther.l,15-30.
Crandelll, R. A., Fabricant, C. G., a Nelson-Rees, W. A. (1973). Vývoj charakterizace a virová citlivost liščích (Felis catus) ledvinových buněčných linií (CRFK) In vitro 9,176-185.
Culver, K. W., Ram, Z., Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfíeld, E. H., a Baese, R. M. (1992) Genový transfer in vivo pomocí buněk, produkujících retrovirový vektor, k léčení experimentálních mozkových nádorů. Science 256,1550-1552.
Deglon, N., Zum, A., Baetge, E., a Aebischer, P. (1995) Vývoj genové terapie pro léčení neurodegenerativních chorob; Parkinsonovy nemoci, Alzheimerovy choroby a terapie amyotropické laterální sklerózy; intratekální transplantace neurotropinsekretujících buněk, zapouzdřených v polymeru. Gene Ther.2,563.
Fuji-Kuryama, Y., Mizukami, Y., Kawajiri, K., Sogawa, K., a Muramutsu, M.: Primární struktura cytochromu P-450; Kódující nukleotidová sekvence cDNK cytochromu P-450 z krysích jater, indukovatelného fenobarbitálem, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1982 May; 79:2793-97.
Gunzburg, W. H., Saller, R., a Salmons, B. (1995). Retrovirové vektory řízené k předdefinovaným buněčným typům pro genovou terapii. Biologicals 23,5-12.
Gunzburg, W. H., a Salmons, B. (1995) Návrh virového vektoru pro genovou terapii. Molecular Medicine Today, 1,410-417.
Hughes, M., Vassilakos, A., Andrews, D. W., Hortelano, G., Belmont, J. W., a Chang, P. L. (1994) Dodání sekretované adenozin deaminázy mikrokapsulemi - nový přístup k somatické genové terapii. Hum. Gene Ther.4,1445-1455.
Indraccolo, S., Gunzburg, W. H., Leib-Mosch, C., Erfle, V., a Salmons, B. (1995) Identifikace tří lidských sekvencí s virovými specifickými primery superantigenů. Mammalian Genome 6,339-344.
Jainchill, J. L., Andeson, S. A., a Torado, G. J. (1969) Myší sarkomové a leukemické viry: stanovení s použitím klonových linií stykem-inhibovaných myších buněk. J. Virol.4,549-553.
Kedzie, J. L., balfour, C. A., Wscobar, G. Y., Grimm, S. W., He, Y. A., Pepperl, D. J, Reagan, J. W. Stevens, J. C., Halpert, J. H.: Molekulární základ unikátní varianty cytochromu P45011B1. J. Biol. Chem. 1991 Nov 25 263, (33) 22515-21.
-14CZ 286979 B6
Miller, A. D. a Buttimore, C. (1986). Změna buněčné linie, obsahující virus, znemožňující rekombinaci, vedoucí k produkci pomocného viru. Mol. Cell. Biol.6,2895-2902.
Morgan, R. A. a Anderson, W. F. (1993). Lidská genová terapie. Ann. Rev. Biochem.62,191217.
Price, J., Turner, D. a Čepko, C. (1987) Liniová analýza nervového systému obratlovců pomocí retrovirem zprostředkovaného genového transferu. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84,156-160.
Ram, Z., Culver, K. W., Walbridge, S., Blaese, R. M. a Oldfield, E. H. (1993). Retrovirem zprostředkovaný transfer in sítu při léčení mozkových nádorů krys. Cancer Res.5,83-88.
Salmons, B., Knedlitschek, G., Kennedy, N., Groner, B. a Ponta, H. (1986). Endogenní lokus Mtv-8 viru nádorů myších mléčných žláz obsahuje obálkový (env) gen. Virus Res.4,377-389.
Stange, J., Mitzner, S., Dautzenberg, H., Ramlow, W., Knippel, M., Steiner, M., Ernst, B., Schmidt, R. a Klinkmann, H. (1993) Prodloužená biochemická a morfologická stabilita zapouzdřených jatemích buněk - nová metoda. Art. Cells & Immob. Biotech. 21,343-352.
Tai, I. T. a Sun, A. M. (1993) Mikrozapouzdření rekombinantních buněk: nový dodávající systém pro genovou terapii. FASEB J. 7,1061-1069.
Welsh, R. M., Cooper, N. R., Jensen, F. C. a Oldstone, Μ. B. A. (1975). Lidské sérum lyžuje nádorové RNK viry. Nátuře 257,612-614.
Winn, S. R., Hammang, J. P., Emerich, D., F., Lee, A., Palmiter, R. D. and Baetge, E. E. (1994). V polymeru zapouzdřené buňky, geneticky modifikované tak, aby produkovaly lidský nervový růst, podporují přežívání axotomizovaných septálních cholinergických neuronů. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91,2324-2328.
Claims (29)
1. Kapsule zapouzdřující buňky, produkující virové částice, vyznačující se tím, že obsahuje porézní stěnu kapsule, která má póry takové velikosti, že umožňuje uvolnění v podstatě všech virových částic, produkovaných zapouzdřenými buňkami.
2. Kapsule podle nároku 1, vyznačující se tím, že porézní stěna kapsule obsahuje polyelektrolytový komplex, tvořený opačně nabitými polyelektrolyty.
3. Kapsule podle nároků laž2, vyznačující se tím, že porézní stěna kapsule obsahuje polyelektrolytový komplex, tvořený polysacharidy nebo deriváty polysacharidů, obsahujícími sulfátové skupiny, nebo syntetickými polymery, obsahujícími sulfonátové skupiny a polymery s kvartémími amoniovými skupinami.
4. Kapsule podle nároku 3, vyznačující se tím, že polysacharidy nebo deriváty polysacharidů, obsahující sulfátové skupiny, jsou vybrány zjednoho nebo několika prvků ze skupiny, obsahující sulfát celulózy, acetátsulfát celulózy, sulfát karboxymethylcelulózy, sulfát dextranu nebo sulfát škrobu, a syntetickým polymerem, obsahujícím sulfonátové skupiny, je polystyren-sulfonát.
-15CZ 286979 B6
5. Kapsule podle nároku 3, vyznačující se tím, že polymerem s kvartémími amoniovými skupinami je polydimetyldiallylamonium nebo polyvinylbenzyltrimetylamonium.
6. Kapsule podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že porézní stěna kapsule obsahuje komplex, tvořený sulfátem celulózy a polydimetyldiallylamoniem.
7. Kapsule podle nároků laž 6, vyznačující se tím, že jsou ve formě mikrokapsulí o průměru 0,01 mm až 5 mm, výhodně 0,1 mm až 1 mm.
8. Kapsule podle nároků laž7, vyznačující se tím, že uvedená kapsule obsahuje houbovitou síť-matrix ze sulfátu celulózy, tvořící vnitřek kapsule, obklopenou stěnou kapsule, ve které jsou póry, přičemž uvedená houbovitá síť je naplněná buňkami.
9. Kapsule podle nároků laž8, vyznačující se tím, že velikost pórů v povrchu porézní stěny kapsule je 80 nm až 150 nm, výhodně 100 nm až 120 nm.
10. Kapsule podle kteréhokoliv z nároků laž9, vyznačující se tím, že virovou částicí, produkovanou zapouzdřenými buňkami, je retrovirová částice, která obsahuje genom retrovirového vektoru.
11. Kapsule podle nároku 10, vyznačující se tím, že zapouzdřenými buňkami, produkujícími retrovirové částice, je sbalovací pakážovací buněčná linie, obsahující pomocný virus, transfektovaná expresním vektorem, kterýžto expresní vektor nese retrovirový vektorový konstrukt schopný infikovat a řídit expresi jedné nebo několika kódujících sekvencí, které obsahuje, v cílových buňkách, přičemž uvedená sbalovací buněčná linie, obsahuje pomocný virus, který obsahuje alespoň jeden expresní vektor nesoucí geny, kódující bílkoviny, nutné pro sbalení genomu uvedeného retrovirového vektorového konstruktu.
12. Kapsule podle nároku 11, vyznačující se tím, že nejméně jedna z uvedených kódujících sekvencí kóduje heterologní peptidy, vybrané ze značkových genů, terapeutických genů, antivirových genů, protinádorových genů, a cytokinových genů.
13. Kapsule podle nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že retrovirový vektor je replikačně defektní.
14. Kapsule podle nároku 13, vyznačující se tím, že retrovirový vektor obsahuje úsek 5’LTR, který má strukturu U3-R-U5, jednu nebo několik sekvencí, vybraných z kódujících nebo nekódujících sekvencí, a úsek 3’LTR, který obsahuje částečně nebo úplně odstraněný úsek U3, po kterém následují úseky R a U5, přičemž úsek U3 je nahrazen sekvencí polylinkeru a regulačním prvkem nebo promotorem.
15. Kapsule podle kteréhokoliv z předchozích nároků 10 až 14, vyznačující se tím, že retrovirový expresní vektor je vektor obsahující krysí gen pro cytochrom p450 2B1.
16. Způsob přípravy kapsule podle nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že se buňky produkující virové částice suspendují ve vodném roztoku polyelektrolytu a suspenze ve formě přeformovaných částic se vnese do srážecí lázně, obsahující vodný roztok opačně nabitého polyelektrolytu.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že částice se vytvářejí rozprášením.
-16CZ 286979 B6
18. Způsob podle nároku 16 nebo 17, vy z n a č uj í c í se t í m , že se buňky suspendují ve vodném roztoku polysacharidu nebo derivátu polysacharidu, obsahujícího sulfátové skupiny, nebo syntetického polymeru, obsahujícího sulfonátové skupiny.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že se použije polysacharid nebo derivát polysacharidu, obsahující sulfátové skupiny, vybraný zjednoho nebo několika prvků skupiny, obsahující sulfát celulózy, acaetátsulfát celulózy, sulfát karboxymetylcelulózy, sulfát dextranu a sulfát škrobu, a jako syntetický polymer, obsahující sulfonátové skupiny, se použije polystyren-sulfonát.
20. Způsob podle nároků 16ažl7, vyznačující se tím, že srážecí lázeň obsahuje vodný roztok polymeru s kvartémími amoniovými skupinami.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že jako polymer s kvartémími amoniovými skupinami se použije polydimetyldiallylamonium nebo polyvinylbenzyltrimethylamonium.
22. Způsob podle nároků 16 až 17, vyznačující se tím, že buňky se suspendují ve vodném roztoku sodné soli sulfátu celulózy a vnesou se do srážecí lázně, obsahující vodný roztok chloridu polydimetyldiallylamonia.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že se použije vodný roztok sulfátu celulózy, obsahující 0,5 až 50 % , výhodně 2 až 5 %, sodné solisulfátu celulózy a 2 až 10 %, výhodně 5 %, fetálního telecího séra v pufrovaném fyziologickém roztoku.
24. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že se ve srážecí lázni použije vodný roztok, obsahující 0,5 až 50%, výhodně 2 až 10%, a ještě výhodněji 3 %, chloridu polydimetyldiallylamonia v pufrovaném fyziologickém roztoku.
25. Kapsule podle nároků 1 až 15 pro použití v genové terapii a/nebo v léčení rakoviny a nádorových onemocnění.
26. Použití kapsule podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 15 pro přípravu farmaceutického přípravku.
27. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje kapsule podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 15.
28. Farmaceutický přípravek podle nároku 27, vyznačující se tím, že má formu vhodnou pro injekci a/nebo implantaci do cílového orgánu/buněk a/nebo do sousedství daného cílového orgánu/buněk.
29. Farmaceutický přípravek podle nároku 28, vyznačující se tím, že cílový orgán/buňky je rakovinná tkáň nebojsou to buňky hladkého svalstva, obklopující arterie.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK74095 | 1995-06-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ419597A3 CZ419597A3 (cs) | 1998-03-18 |
| CZ286979B6 true CZ286979B6 (en) | 2000-08-16 |
Family
ID=8097001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19974195A CZ286979B6 (en) | 1995-06-27 | 1996-06-24 | Capsule encapsulating cells producing viral particles, process of its preparation and pharmaceutical preparation for gene therapy |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6776985B1 (cs) |
| EP (1) | EP0835137B1 (cs) |
| JP (2) | JP4119952B2 (cs) |
| KR (1) | KR100484883B1 (cs) |
| CN (1) | CN1187095C (cs) |
| AT (1) | ATE309000T1 (cs) |
| AU (1) | AU708273B2 (cs) |
| CA (1) | CA2222559A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ286979B6 (cs) |
| DE (1) | DE69633180D1 (cs) |
| DK (1) | DK0835137T3 (cs) |
| ES (1) | ES2253754T3 (cs) |
| IL (1) | IL122119A (cs) |
| NO (1) | NO321427B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ312671A (cs) |
| PL (1) | PL185338B1 (cs) |
| PT (1) | PT835137E (cs) |
| RU (1) | RU2187301C2 (cs) |
| SI (1) | SI0835137T1 (cs) |
| UA (1) | UA65525C2 (cs) |
| WO (1) | WO1997001357A1 (cs) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3908274B2 (ja) | 1995-03-09 | 2007-04-25 | ゲーエスエフ−フォルシュンクスツェントラム・フュア・ウムベルト・ウント・ゲズントハイト・ゲーエムベーハー | 遺伝子治療用の抗菌ペプチドをコードする治療用遺伝子を有するベクター |
| JP4119952B2 (ja) | 1995-06-27 | 2008-07-16 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | ウイルス粒子産生カプセル化細胞 |
| US6540995B1 (en) | 1996-03-27 | 2003-04-01 | Bavarian Nordic Research Institute Gmbh | Encapsulated cells producing cytochrome P450 |
| ATE309383T1 (de) | 1996-03-27 | 2005-11-15 | Bavarian Nordic As | Verkapselte zellen expremierend cytochrome p450 für die aktivierung einer medikamentenvorstufe |
| EP0994680A1 (en) | 1998-05-05 | 2000-04-26 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Toothbrush comprising a brush member having a bristle field and an interdental bristle field |
| US9845344B2 (en) | 2004-03-30 | 2017-12-19 | Hoba Therapeutics Aps | Therapeutic use of a growth factor, NsG33 |
| WO2006116789A2 (en) | 2005-05-03 | 2006-11-09 | Veterinärmedizinische Universität Wien | Permeable capsules |
| CA2708959C (en) | 2007-12-20 | 2017-01-31 | Ethicon, Incorporated | Encapsulated kidney tissue |
| KR101250925B1 (ko) * | 2011-10-28 | 2013-04-04 | 한화케미칼 주식회사 | 캡슐 세포용 구조체 |
| GB201408233D0 (en) | 2014-05-09 | 2014-06-25 | Austrianova Singapore Pte Ltd | Use of polyanionic composition |
| CN108291208A (zh) * | 2015-11-24 | 2018-07-17 | 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 | 用于产生逆转录病毒的稳定细胞系 |
| DE102016122317A1 (de) * | 2015-11-24 | 2017-05-24 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Transientes transfektionsverfahren für retrovirale produktion |
| AU2017269371B2 (en) | 2016-05-25 | 2021-08-05 | Lonza Houston Inc. | Methods for isolating adeno-associated virus using a polydiallyldialkylammonium salt |
| RU2688383C2 (ru) * | 2017-07-10 | 2019-05-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского" | Способ синтеза белка в культуре бактериальных клеток |
| EP4340820A2 (en) * | 2021-05-21 | 2024-03-27 | Bionaut Labs Ltd. | Systems and methods for microbot-mediated therapeutic delivery |
| CN115820683B (zh) * | 2022-09-28 | 2024-04-05 | 西南大学 | 家蚕Cyp9a20基因及其应用 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4391909A (en) * | 1979-03-28 | 1983-07-05 | Damon Corporation | Microcapsules containing viable tissue cells |
| DD160393A3 (de) * | 1980-11-14 | 1983-07-27 | Horst Dautzenberg | Mikrokapseln und verfahren zu ihrer herstellung |
| US4686098A (en) * | 1984-05-14 | 1987-08-11 | Merck & Co., Inc. | Encapsulated mouse cells transformed with avian retrovirus-bovine growth hormone DNA, and a method of administering BGH in vivo |
| US4680174A (en) * | 1984-05-24 | 1987-07-14 | Damon Biotech, Inc. | Induction of immune response by immunization with encapsulated antigen-producing cells |
| EP0199362A3 (en) * | 1985-04-26 | 1987-10-07 | Massachusetts Institute Of Technology | System and apparatus for delayed and pulsed release of biologically active substances |
| CA1310924C (en) * | 1986-04-24 | 1992-12-01 | Francis P. Mccormick | Infective drug delivery system |
| AU631554B2 (en) | 1988-05-17 | 1992-12-03 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Retroviral vector |
| US5328470A (en) * | 1989-03-31 | 1994-07-12 | The Regents Of The University Of Michigan | Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor |
| DE4021050A1 (de) * | 1990-06-29 | 1992-01-02 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zur herstellung von mikrokapseln |
| CA2051288C (en) * | 1990-09-14 | 2002-02-05 | Robert L. Martuza | Viral targeted destruction of neoplastic cells |
| WO1992010564A1 (en) * | 1990-12-13 | 1992-06-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce | Sustained and continuous production of high titers of recombinant viral vectors and transduced target cells for use in gene therapy |
| WO1994029437A1 (en) | 1993-06-07 | 1994-12-22 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | Highly-efficient, self-inactivating, recombination-free, u3-free retroviral vectors |
| US5688773A (en) | 1994-08-17 | 1997-11-18 | The General Hospital Corporation | Method of selectively destroying neoplastic cells |
| CA2198210C (en) | 1994-09-02 | 2006-07-11 | Walter Henry Gunzburg | Non self-inactivating, expression targeted retroviral vectors |
| JP4119952B2 (ja) | 1995-06-27 | 2008-07-16 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | ウイルス粒子産生カプセル化細胞 |
| DK0848757T3 (da) | 1995-09-06 | 2002-07-01 | Austrian Nordic Biotherapeutic | Anvendelse af WAP eller MMTV regulatoriske sekvenser for målrettet ekspression af sammenkædede heterologe gener i humane mammae celler, inklusiv humane mammae carcinoma celler |
| ATE309383T1 (de) | 1996-03-27 | 2005-11-15 | Bavarian Nordic As | Verkapselte zellen expremierend cytochrome p450 für die aktivierung einer medikamentenvorstufe |
-
1996
- 1996-06-24 JP JP50416597A patent/JP4119952B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-24 PL PL96324289A patent/PL185338B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-06-24 DK DK96923905T patent/DK0835137T3/da active
- 1996-06-24 CN CNB961950501A patent/CN1187095C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-24 IL IL12211996A patent/IL122119A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-06-24 KR KR1019970709807A patent/KR100484883B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-24 RU RU98101362/13A patent/RU2187301C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-06-24 CZ CZ19974195A patent/CZ286979B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-06-24 CA CA002222559A patent/CA2222559A1/en not_active Abandoned
- 1996-06-24 ES ES96923905T patent/ES2253754T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-24 WO PCT/EP1996/002748 patent/WO1997001357A1/en active IP Right Grant
- 1996-06-24 AT AT96923905T patent/ATE309000T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-24 UA UA97126354A patent/UA65525C2/uk unknown
- 1996-06-24 NZ NZ312671A patent/NZ312671A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-06-24 EP EP96923905A patent/EP0835137B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-24 PT PT96923905T patent/PT835137E/pt unknown
- 1996-06-24 AU AU64154/96A patent/AU708273B2/en not_active Expired
- 1996-06-24 SI SI9630729T patent/SI0835137T1/sl unknown
- 1996-06-24 DE DE69633180T patent/DE69633180D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-12-10 NO NO19975813A patent/NO321427B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-12-23 US US08/996,460 patent/US6776985B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-11-21 JP JP2007301109A patent/JP4848348B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE309000T1 (de) | 2005-11-15 |
| NZ312671A (en) | 1999-10-28 |
| HK1010139A1 (en) | 1999-06-17 |
| EP0835137B1 (en) | 2005-11-09 |
| NO321427B1 (no) | 2006-05-08 |
| JPH11508768A (ja) | 1999-08-03 |
| AU6415496A (en) | 1997-01-30 |
| JP4119952B2 (ja) | 2008-07-16 |
| RU2187301C2 (ru) | 2002-08-20 |
| NO975813D0 (no) | 1997-12-10 |
| WO1997001357A1 (en) | 1997-01-16 |
| PT835137E (pt) | 2004-12-31 |
| US6776985B1 (en) | 2004-08-17 |
| AU708273B2 (en) | 1999-07-29 |
| CN1187095C (zh) | 2005-02-02 |
| CN1189104A (zh) | 1998-07-29 |
| CZ419597A3 (cs) | 1998-03-18 |
| IL122119A0 (en) | 1998-04-05 |
| ES2253754T3 (es) | 2006-06-01 |
| KR19990028491A (ko) | 1999-04-15 |
| KR100484883B1 (ko) | 2005-09-02 |
| NO975813L (no) | 1998-02-23 |
| UA65525C2 (en) | 2004-04-15 |
| PL185338B1 (pl) | 2003-04-30 |
| DK0835137T3 (da) | 2006-03-06 |
| DE69633180D1 (de) | 2004-09-23 |
| EP0835137A1 (en) | 1998-04-15 |
| JP4848348B2 (ja) | 2011-12-28 |
| CA2222559A1 (en) | 1997-01-16 |
| JP2008101011A (ja) | 2008-05-01 |
| IL122119A (en) | 2004-06-01 |
| PL324289A1 (en) | 1998-05-11 |
| SI0835137T1 (sl) | 2006-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4848348B2 (ja) | ウイルス粒子産生カプセル化細胞 | |
| US6027721A (en) | Device and method for encapsulated gene therapy | |
| RU2185821C2 (ru) | Трансдуцирующие цитохром р450 ретровирусные векторы | |
| EP0848757B1 (en) | The use of the wap of mmtv regulatory sequences for targeted expression of linked heterologous genes in human mammary cells, including human mammary carcinoma cells | |
| HK1010139B (en) | Encapsulated cells producing viral particles | |
| US6540995B1 (en) | Encapsulated cells producing cytochrome P450 | |
| JP2004337176A (ja) | 中枢神経系への遺伝子導入のための方法 | |
| US7074398B1 (en) | Retroviral vectors carrying senescent cell derived inhibitors 1 (SDI-1)or antisense SDI-1 nucleotide sequences | |
| D’INHIBITEURS et al. | ANTISENSE SDI-1 NUCLEOTIDE SEQUENCES | |
| WO1996029423A1 (en) | Compositions and methods for inducing infection by retroviral vectors outside of their host range |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20110624 |