JPH11508768A - ウイルス粒子産生カプセル化細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウイルス、特に治療用遺伝子を有するウイルスベクターのゲノムを含有するレトロウイルス粒子を産生するカプセル化細胞、このようなカブセル化細胞の製造法、および疾病治療のための、このようなカプセル化細胞の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルス粒子産生カプセル化細胞 本発明は、ウイルス粒子（特に、治療用遺伝子を保持するレトロウイルスベク ターのゲノムを含有するレトロウイルス粒子）を産生するカプセル化細胞、その ようなカプセル化細胞の製造法、および標的器官／細胞へ遺伝子（特に治療用遺 伝子）を輸送するためのそのようなカプセル化細胞の使用に関する。 背景 標的細胞へ治療上有益な遺伝子を輸送することは、遺伝子治療の概念の中心的 課題である。遺伝子治療が常套的な方法となるためには、治療用遺伝子を標的細 胞へ有効にインビボで輸送させる系を開発することが最も重要である。 ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子治療に最も一般的 に使用されている輸送ビークルである(ＭorganおよびＡnderson，1993)。現在承 認されている遺伝子治療プロトコールのほとんどは、細胞を患者から取り出し、 インビトロで遺伝的に修飾し、ついでその患者へ再導入するという、エクスビボ （ex vivo）アプローチを採用している。この方法は手間および経費がかかり、 技術的に進歩した施設に制限されてしまう。さらに、この種のアプローチは、単 離、 用遺伝子のインビボ輸送には多くの利点があるが、このアプローチは現在のその 形態では、非効率的で問題が多い。遺伝子導入効率が低いことによる大きな問題 は、ウイルスベクターを複数回適用しなければならないことである。複数回のベ クター輸送を要することは、面倒であるばかりでなく、そのウイルス粒子に対す る免疫応答により不成功となる可能性がある。 これらの問題を回避すると考えられる１つの方法は、ウイルス粒子を産生する 細胞を直接移植することによるものである。ウイルスベクターのゲノムを含有す るウイルス粒子を産生する細胞を標的器官または細胞の隣にインシトウで移植す れば、標的細胞／器官へのウイルスベクターの直接的な適用が可能となるであろ う。 さらに、使用するウイルスベクターウイルスがレトロウイルスベクターウイル スの場合には、そのようなアプローチの方が、高用量の一回量を複数回適用する より有利である。なぜなら、標的細胞が複製される時点でベクターウイルスが存 在している可能性、およびそれによりそれが標的細胞に感染できる可能性が高く なるからである。さらに、ウイルス粒子の放出がより低いが連続的であることは 、ウイルス粒子に対する宿主の免疫応答から逃れるのに有利かもしれない。 ウイルスベクターの有効な輸送のためには、ウイルス粒子産生細胞は、移植後 に宿主中で長期間生存可能でなければならず、ウイルス粒子が、この期間中に産 生され、該細胞から放出されなければならない。有意な免疫応答の非存在下では (例えば、脳内移植後)、これらの細胞は長期にわたり生存可能である(Ｃulver ら，1992; Ｒamら，1993)。しかしながら、他の身体部位で移植を成功させるた めには、免疫系からプロデューサー細胞を防御しなければならない。 したがって、このアプローチの長期的な有効性は、（１）宿主免疫系からの該 細胞の防御(そのような細胞で通常見られるように、特に、ウイルス粒子を産生 する細胞が、異なる種からのものである場合には、該免疫系は通常、該ウイルス 粒子産生細胞を排除する)、および（２）血管新生に必要となりうる長期間のイ ンシトウでの該細胞の生存に依存する。 ある生物活性分子を放出させるがこれらの分子を産生する細胞を宿主免疫系か ら防御する透過性構造体中に細胞をカプセル化することが、いくつか成功してい る(再検討のためには、Ｃhang，1995を参照されたし)。ヒト成長ホルモン(hＧＨ )（ＴaiおよびＳun,1993）または分泌型ヒトアデノシンデアミナーゼ（Ｈughes ら，1994）を産生するよう遺伝的に修飾された細胞がカプセル化されている。こ れらのいずれの研究においても、細胞はポリ−Ｌ−リシン−アルギナートマイク ロカプセル中にカプセル化されており、その細胞は培養中で長期間生存すること が示された。これは、その酵素またはホルモンの長期にわたる産生を伴った。さ らに、このマイクロカプセルをマウスに移植したところ、その細胞は１年間生存 し続け、hＧＨを産生し続けることが示されており(ＴaiおよびＳun，1993)、こ のことは、このカプセルが宿主免疫系による破壊から該トランスフェクション化 細胞を防御 することを示すものである。 他の物質を使用することによる細胞のカプセル化も報告されている。遺伝的に 神経成長因子を産生するよう修飾された乳児ハムスター腎細胞が、ポリアクリロ ニトリル／塩化ビニル中にカプセル化されており、ラット脳内に移植されている 。このカプセル化細胞は、少なくとも６ヵ月間生存し、ＮＧＦを産生し続けた( Ｗinnら，1994; Ｄeglonら，1995)。 さらに、硫酸セルロースとポリジメチルジアリルアンモニウムとの高分子電解 質複合体中に肝細胞をカプセル化することが成功している(Ｓtangeら，1993)。 このカプセル化肝細胞の90％以上が生存能を維持し、このカプセル化細胞は、単 層として成長させた肝細胞に対して、代謝活性の増加を示した。この文献には、 硫酸セルロース／ポリジメチルジアリルアンモニウムカプセルが、他の型の細胞 （例えば、ウイルス粒子を産生する細胞）の成長を維持することについても、ウ イルス粒子を該カプセルから放出させることについても示唆されていない。 本発明で用いる硫酸セルロースカプセルの製造は、ＤＥ40 21 050 Ａ1に十分 に記載されている。また、硫酸セルロースの合成も、この特許出願に記載されて いる。硫酸セルロースカプセルの包括的な特徴づけのための方法は、Ｈ．Ｄautz enbergら，Ｂiomat.Ａrt.Ｃells ＆ Ｉmmob.Ｂiotech.,21(3),399-405(1993)に 詳細に記載されている。他の硫酸セルロースカプセルは、ＧＢ2 135 954に記載 されている。セルロースカプセルの特性、すなわちサイズ、孔径、壁厚および機 械的特性は、例えば、カプセル製造時の物理的環境、沈殿浴の粘度、そのイオン 強度、温度、細胞／硫酸セルロース懸濁液の添加速度、硫酸セルロースの組成お よびＤautzenbergらに記載されている他のパラメーターなどのいくつかの要因に 左右される。 驚くべきことに、移植細胞からのウイルス粒子の連続的産生は、高分子電解質 複合体中へ該細胞をカプセル化することにより達成できることが見出された。そ のようなカプセルの孔は、ウイルスを不活性化することが知られている抗体およ び補体（Ｗelshら，1975，Ｃornettaら，1990）が該カプセル中へ侵入するのに 十分な大きさであるが、本発明者らは、移植されたカプセル付近での有意な免疫 または炎症反応または壊死の証拠を何ら見出していない。さらに、驚くべきこと に、 本発明のカプセルは、宿主中にうまく移植され、急速に血管新生されるようにな ることが見出された。したがって、本発明のカプセル化細胞は、治療用遺伝子を 保持するウイルスベクターの長期にわたるインビボでの輸送を可能とするもので ある。 発明の概要 本発明は、とりわけ、以下のものを単独または組み合わせて含んでなる： 細胞を含有するコアと該コアを包囲する多孔性カプセル壁とを含んでなる、ウ イルス粒子を産生するカプセル化細胞であって、該多孔性カプセル壁が該ウイル ス粒子を透過しうることを特徴とするカプセル化細胞； 該多孔性カプセル壁が、対荷電高分子電解質（counter-charged polyelectro- lytes）から形成される高分子電解質複合体よりなる、前記カプセル化細胞； 該多孔性カプセル壁が、硫酸基含有多糖もしくは多糖誘導体またはスルホナー ト基含有合成ポリマーおよび第四級アンモニウム基を有するポリマーとから形成 される高分子電解質複合体よりなる、前記カプセル化細胞； 該硫酸基含有多糖もしくは多糖誘導体が硫酸セルロース、酢酸硫酸セルロース 、カルボキシメチルセルロース硫酸、デキストラン硫酸またはデンプン硫酸であ り、該スルホナート基含有合成ポリマーがポリスチレンスルホナートである、前 記カプセル化細胞； 第四級アンモニウム基を有するポリマーが、ポリジメチルジアリルアンモニウ ムまたはポリビニルベンジルートリメチルアンモニウムである、前記カプセル化 細胞； 該多孔性カプセル壁が、硫酸セルロースおよびポリジメチルジアリルアンモニ ウムから形成される複合体よりなる、前記カプセル化細胞； 0.01〜５mm、好ましくは0.1〜１mmの直径を有するマイクロカプセルの形態を 有する、前記カプセル化細胞； 該カプセルが、孔を含有するカプセル表面に包囲される該カプセル壁の内部を 形成する海綿状硫酸セルロースマトリックスよりなり、該海綿状マトリックスが 細胞で満たされている、前記のいずれかのカプセル化細胞； 該多孔性カプセル壁の表面孔径が、80〜150nm、好ましくは100〜120nmである 、前記カプセル化細胞； 該カプセル化細胞により産生されるウイルス粒子が、レトロウイルスベクター のゲノムを含有するレトロウイルス粒子である、前記カプセル化細胞； レトロウイルス粒子を産生するカプセル化細胞が、発現ベクターでトランスフ ェクションされたパッケージング細胞系であり、該発現ベクターが、レトロウイ ルスベクターコンストラクトを保持し、該レトロウイルスベクターコンストラク トが、標的細胞に感染し該標的細胞中で該レトロウイルスベクターコンストラク トに保持された１以上のコード配列の発現を指令する能力を有し、該パッケージ ング細胞系が、該レトロウイルスベクターコンストラクトがパッケージングされ るのに必要なタンパク質をコードする遺伝子を保持する少なくとも１つの発現ベ クターを含む、前記カプセル化細胞； 該コード配列の少なくとも１つが、マーカー遺伝子、治療用遺伝子、抗ウイル ス遺伝子、抗腫瘍遺伝子およびサイトカイン遺伝子から選ばれる異種ペプチドを コードする、前記カプセル化細胞； 該マーカー遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン、アルコールデヒ ドロゲナーゼ、ピューロマイシン、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェ ラーゼ(ＨＰＲＴ)、ハイグロマイシンおよび分泌アルカリホスファターゼなどの タンパク質をコードするマーカー遺伝子よりなる群から選ばれ、該治療用遺伝子 が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)、シトクロムＰ450などのタンパク質を コードする遺伝子、ＳＤＩなどの細胞周期調節遺伝子、p53などのタンパク質を コードする癌抑制遺伝子、メリチン、セクロピンまたはサイトカイン（例えば、 ＩＬ-2）などのタンパク質をコードする抗増殖遺伝子から選ばれる、前記カプセ ル化細胞； 該パッケージング細胞系が、psi-2、psi-crypt、psi-ＡＭ、ＧＰ+Ｅ-86、ＰＡ 317およびＧＰ+envＡＭ-12から選ばれる、前記カプセル化細胞； 該パッケージング細胞系にトランスフェクションされた発現ベクターが、pＢ ＡＧ、pＬＸＳＮ、p125ＬＸ、pＬＸ2Ｂ1またはpc3/2Ｂ1またはそれらの誘導体で ある、 前記カプセル化細胞； ウイルス粒子を産生する細胞を高分子電解質の水溶液に懸濁し、ついで前形成 粒子形態の該懸濁液を、対荷電高分子電解質の水溶液を含有する沈殿浴中に導入 することを含んでなる、前記カプセル化細胞の製造法； 該粒子形成が噴霧により生じる、前記製造法； 該細胞を、硫酸基含有多糖もしくは多糖誘導体またはスルホナート基含有合成 ポリマーの水溶液に懸濁する、前記製造法； 該硫酸基含有多糖もしくは多糖誘導体が、硫酸セルロース、酢酸硫酸セルロー ス、カルボキシメチルセルロース硫酸、デキストラン硫酸またはデンプン硫酸か ら選択され、該スルホナート基含有合成ポリマーがポリスチレンスルホナートで ある、前記製造法； 該沈殿浴が、第四級アンモニウム基を有するポリマーの水溶液を含有する、前 記製造法； 第四級アンモニウム基を有するポリマーが、ポリジメチルジアリルアンモニウ ムまたはポリビニルベンジル−トリメチルアンモニウムである、前記製造法； 該細胞を、硫酸セルロースナトリウムの水溶液に懸濁し、ポリジメチルジアリ ルアンモニウムクロリドの水溶液を含有する沈殿浴中に導入する、前記製造法； 該硫酸セルロース水溶液が、緩衝食塩水中の0.5〜50％、好ましくは２〜５％ の硫酸セルロースナトリウムおよび２〜10％、好ましくは５％のウシ胎児血清よ りなる、前記製造法； 該沈殿浴中の水溶液が、緩衝食塩水中の0.5〜50％、好ましくは２〜10％、よ り好ましくは３％のポリジメチルジアリルアンモニウムクロリドよりなる、前記 製造法； 前記製造法により製造される、前記のいずれかに記載のカプセル化細胞； 標的器官／細胞へ遺伝子を輸送するための、前記のいずれかに記載のカプセル 化細胞の使用であって、 a）適当な培地中で該カプセル化細胞を培養し、そして b）生きた動物（ヒトを含む）の体内へ該カプセル化細胞を移植することを含 んでなる使用； 該標的器官／細胞が乳腺または膵臓である、前記使用；および 該標的器官／細胞が、動脈を包囲する平滑筋細胞および他の型の細胞である、 前記使用。 発明の目的 ウイルス粒子を産生するカプセル化細胞であって、宿主に移植された後で、該 細胞により産生されたウイルス粒子を該カプセルから放出させ、かつ、有意な宿 主の免疫または炎症応答を惹起しないカプセル化細胞を提供することが本発明の 目的である。 ウイルス粒子を産生するそのようなカプセル化細胞の製造法を提供することが 、本発明のさらに別の目的である。 本発明のさらに別の目的は、ウイルス粒子を産生するそのようなカプセル化細 胞を宿主に移植し、それにより標的器官または標的細胞付近でウイルス粒子の連 続的な産生および放出を引き起こさせることにより、標的器官／細胞へ遺伝子（ 特に治療用遺伝子）を輸送する方法を提供することである。 本発明 本発明によれば、ウイルス粒子を産生するカプセル化細胞であって、宿主に移 植された後で、該細胞により産生されたウイルス粒子を該カプセルから放出させ 、かつ、有意な宿主の免疫または炎症応答を惹起しないカプセル化細胞が提供さ れる。 本発明のカプセル化細胞は、ウイルス粒子を産生する細胞を高分子電解質（例 えば、硫酸基含有多糖もしくは多糖誘導体またはスルホナート基含有合成ポリマ ーから選ばれる）の水溶液に懸濁し、ついで前形成粒子形態の該懸濁液を、対荷 電高分子電解質（例えば、第四級アンモニウム基を有するポリマー）の水溶液を 含有する沈殿浴中に導入することにより製造することができる。 硫酸基含有多糖もしくは多糖誘導体としては、塩、特にナトリウム塩の形態の 、硫酸セルロース、酢酸硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロース硫酸、デ キストラン硫酸、デンプン硫酸などが挙げられる。該スルホナート基含有合成ポ リ マーは、ポリスチレンスルホナート塩（好ましくは、ナトリウム塩）であっても よい。 第四級アンモニウム基を有するポリマーとしては、塩、好ましくは塩化物塩の 形態の、ポリジメチルジアリルアンモニウム、ポリビニルベンジル−トリメチル アンモニウムなどが挙げられる。 本発明の好ましい実施態様では、ウイルス粒子を産生する細胞を、硫酸セルロ ースおよびポリジメチルジアリル−アンモニウムから形成される複合体よりなる 複合体中にカプセル化する。 そのようなカプセルは、好ましくは、ウイルス粒子を産生する細胞を、0.5〜5 0％、好ましくは２〜５％の硫酸セルロースナトリウムおよび５％のウシ胎児血 清を含有する（所望により緩衝液中）溶液に懸濁することにより製造する。つい でこの懸濁液を、攪拌しながら、0.5〜50％、好ましくは２〜10％、最も好まし くは約３％のポリジメチル−ジアリルアンモニウムクロリドを含有する（所望に より緩衝液中）沈殿浴中へ分注系（例えば、エアジェット系または圧電系）によ り滴下する。カプセルの形成は数ミリ秒以内で生じ、該細胞含有カプセルを、沈 殿浴中で30秒〜５分間維持し、ついで洗浄する。この方法の迅速性は、該細胞が 、全操作の間に過度にストレスを受けないことを保証する(Ｓtangeら，1993)。 本発明のカプセルは、0.01〜５mm、好ましくは0.1〜１mmの種々の直径を有す る。そのため、種々の細胞数を含有するカプセルを、製造することができる。本 発明のカプセル化方法を用いると、10¹⁰個まで、好ましくは10⁵〜10⁷個のウイル ス粒子産生細胞を、高分子電解質複合体中にカプセル化することができる。 硫酸セルロースおよびポリジメチルジアリルアンモニウムよりなるカプセルは 、優れた機械的特性を有し、一定のサイズおよび孔径に製造することができる。 該カプセルの孔径は、80〜150nm、好ましくは100〜120nmである。 該カプセル化細胞は、通常の細胞培養培地（その種類はカプセル化細胞による ）中にて、湿度、温度およびＣＯ₂濃度の標準的な条件で培養することができる 。この培養期間中に該カプセルから細胞培養培地中へのウイルス粒子の産生を確 認するには、ＲＴ-ＰＣＲ法、または標的細胞への無細胞（0.45μｍで濾過した もの）上清の導入、ついで、該ウイルス粒子内に含有されたウイルスベクターコ ンストラ クトに保持された遺伝子にコードされるマーカータンパク質の活性に関するアッ セイによりウイルス感染を確認することにより行なうことができる。ウイルスベ クターに保持されたマーカー遺伝子が、特定の化合物に対する耐性を標的細胞に 付与する遺伝子であれば、該系により産生されたウイルスの力価を確認すること ができる。 培養中で適当な時間が経過した後(通常、１時間以上、30日未満)、該細胞含有 カプセルを、種々の身体領域中へ直接的にまたはシリンジを用いて注入すること により、外科的に移植することができる。 本発明のカプセル化細胞により産生されるウイルス粒子は、遺伝子治療に有用 な任意のウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウ イルスまたはレトロウイルスなどであるが、これらに限定されるものではない） 1995を参照されたし)。 本発明の好ましい実施態様では、該カプセル化細胞は、マーカーおよび／また は治療用遺伝子を保持するレトロウイルスベクターコンストラクトのゲノムを含 有するレトロウイルス粒子を産生するパッケージング細胞系である。 レトロウイルスベクター系は、以下の２つの成分よりなる。 １）ウイルスタンパク質をコードする遺伝子が標的細胞に導入すべき治療用遺 伝子（所望によりマーカー遺伝子を含む）で置換されている、修飾されたレトロ ウイルスであるレトロウイルスベクターコンストラクトを保持する発現ベクター (ベクタープラスミド)。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の置換は、該ウ イルスを有効に欠損させるため、それは、該修飾レトロウイルスに該欠損ウイル スタンパク質を付与する該系の第２成分によりレスキューされる必要がある。 第２成分は、 ２）大量のウイルスタンパク質を産生するが、自己増殖性（replication comp etent）ウイルス産生能を欠く細胞系である。この細胞系は、パッケージング細 胞系として公知であり、該修飾レトロウイルスゲノムのパッケージングを可能に する遺伝子を保持するプラスミドでトランスフェクションされた細胞系よりなる 。これらのプラスミドは、ビリオン産生に要する必須ウイルスタンパク質の 合成を指令する。 このパッケージングされたレトロウイルスベクターを得るためには、該ベクタ ープラスミドをパッケージング細胞系にトランスフェクションする。これらの条 件下で、挿入された治療用遺伝子および所望によりマーカー遺伝子を含む修飾さ れたレトロウイルスゲノムが該ベクタープラスミドから転写され、得られた修飾 レトロウイルスゲノムが該レトロウイルス粒子中にパッケージングされる。その ようなウイルス粒子が感染した細胞中にはウイルスタンパク質が存在しないため 、該細胞はウイルス粒子を産生できない。しかしながら、該感染細胞においては 、該治療用遺伝子およびマーカー遺伝子を保持するレトロウイルスベクターコン ストラクトが存在し、これらが発現されうる。 ＷＯ94/29437、ＷＯ89/11539およびＷＯ96/07748は、本発明の目的に有用な種 々の型のレトロウイルスベクター系を記載している。 本発明のカプセル化細胞により産生されるウイルス粒子は、マーカーおよび／ または治療用遺伝子をコードする遺伝子を保持するウイルスベクターのゲノムを 含有するよう構築されうる。 該ウイルスベクターにより保持されるマーカーまたは治療用遺伝子は、例えば 、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピュー ロマイシン、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＰＲＴ)、ハ イグロマイシン、分泌アルカリホスファターゼなどのタンパク質をコードする遺 伝子、または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ 、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)、シトクロムＰ450などのタ ンパク質をコードする治療用遺伝子、ＳＤＩなどの細胞周期調節遺伝子、p53な どのタンパク質をコードする癌抑制遺伝子、またはメリチン、セクロピンまたは サイトカイン（例えば、ＩＬ-2）などのタンパク質をコードする抗増殖遺伝子で あってもよい。 特定の実施態様では、本発明は、腫瘍の治療における本発明のカプセル化細胞 の使用に関する。 悪性腫瘍の多くは、化学療法に十分に反応しない。腫瘍の治療に使用される抗 癌薬は、ほとんどの場合、全身適用されるため、その患者の全身に広がってしま う。癌治療に必要なそのような薬物の高い全身用量は、患者にとって望ましくな い副作用を引き起こすことが多い。抗癌薬の高い全身濃度に関するこれらの問題 を避けうる１つの戦略は、腫瘍中またはその付近へ該薬物を直接適用するか又は そこで該薬物を直接活性化することによるものである。これは、抗癌薬（例えば 、プロドラッグを細胞傷害性剤に変換しうる活性化酵素）をコードする遺伝子を 保持する操作されたウイルス（特に、レトロウイルス）ベクターのゲノムを含有 するウイルス粒子を産生する本発明のカプセル化細胞を、腫瘍細胞中またはその 付近の細胞中へ移植することにより達成することが可能である。 本発明の１つの実施態様では、腫瘍関連酵素（例えば、シトクロムＰ450）の 遺伝子、または無毒性薬を１以上の毒性代謝物に変換するチミジンキナーゼなど （これらに限定されるものではない）の自殺遺伝子を保持するレトロウイルスベ クターのゲノムを含有するレトロウイルス粒子を産生するカプセル化細胞が提供 される。本発明のそのようなカプセル化細胞は、腫瘍（例えば、膵臓または乳腺 中の腫瘍）内またはその付近へ該カプセルを移植することにより、癌の治療に使 用することができる。 結合した治療用遺伝子の発現を特定の細胞型へ方向づけるための標的細胞特異 的調節要素およびプロモーターを使用することにより、迫加的な標的化を得るこ とができる。 そのような標的細胞特異的調節要素およびプロモーターには、例えば、カルボ ニックアンヒドラーゼIIおよびβ−グルコキナーゼ調節要素およびプロモーター などの膵臓特異的調節要素およびプロモーター、免疫グロブリンおよびＭＭＴＶ リンパ球特異的調節要素およびプロモーターなどのリンパ球特異的調節要素およ びプロモーター、乳漿酸性タンパク質(Ｗhey Ａcidic Ｐrotein(ＷＡＰ))、マウ ス乳癌ウイルス(ＭＭＴＶ)、β−ラクトグロブリンおよびカゼイン特異的調節要 素およびプロモーターなどの乳房特異的調節要素およびプロモーター、およびグ ルココルチコイドホルモンに対する応答性を付与したりあるいは発現を乳腺に方 向づけるＭＭＴＶ特異的調節要素およびプロモーターが含まれる。他のプロモー ターには、例えば、ＣＤ4、ＣＤ34およびＩＬ2プロモーターが含まれる。前記調 節要素およびプロモーターは、好ましくは、前記レトロウイルスベクターの発現 を調節 する。 誘導性プロモーター、例えば、放射能誘導性プロモーター、例えば、細胞間接 着分子−１（ＩＣＡＭ-1）プロモーター、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）プロ モーター、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）プロモーターも使用することができる 。 以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明することとするが、これらの実 施例は本発明を限定するものではない。 実施例１ pＢＡＧによるＰＡ317のリポフェクションおよびＧ418耐性細胞の単離 両種指向性(amphotropic)ＮＩＨ3Ｔ3に基づくＰＡ317パッケージング細胞(Ｍi llerおよびＢuttimore，1986)を、10％ウシ胎児血清を含有するダルベッコの改 変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。該細胞を、リポフェクションの１日 前に３×10⁵細胞の密度で10cm組織培養皿にまき、ついで、ＧＩＢＣＯ/ＢＲＬか らのリポフェクタミンキットを製造業者の指示に従い使用して、ＭＬＶ（マウス 白血病ウイルス）に基づくレトロウイルスベクターを保持する２μgのpＢＡＧベ クター（Ｐriceら,1987）でリポフェクションした。ついで、該細胞を１：10希 釈し、さらに400μg/ml Ｇ418（ＧＩＢＣＯ/ＢＲＬ）を含有する通常の培地中で 培養した。14日後に、Ｇ418耐性細胞のコロニーをプールした。 実施例２ マイクロカプセル化 ２〜５％硫酸セルロースナトリウムおよび５％ウシ胎児血清を含有する１mlの 緩衝食塩水溶液に10⁷個の細胞を懸濁し、緩衝食塩水中に２〜３％ポリジメチル −ジアリルアンモニウムを含有する沈殿浴中に、該懸濁液を分注系（エアジェッ ト系）を用いて滴下した。カプセル形成は数ミリ秒以内に生じ、ついで硫酸セル ロースより実質的になる機械的支持のための内部のより多孔性の層がさらに構築 された。細胞を含有する該カプセルを沈殿浴中で30秒〜５分間維持し、ついでＤ ＭＥＭ中で洗浄した(Ｓtangeら,1993)。前記のとおり種々のパラメーター(すな わち、硫酸セルロースナトリウムの濃度、エアジェット系の流れ、および沈殿 浴中での時間)に対して得られたバッチを、生物学的研究に使用した。代表的な 条件は、例えば、2.5％硫酸セルロースナトリウム、２％ポリジメチル−ジアリ ルアンモニウムおよび沈殿浴中で１分、あるいは1.5％硫酸セルロースナトリウ ム、２％ポリジメチル−ジアリルアンモニウムおよび沈殿浴中で0.5分、あるい は3％硫酸セルロースナトリウム、３％ポリジメチル−ジアリルアンモニウムお よび沈殿浴中で２分である。正確なパラメーターは、所望のカプセルの正確なサ イズ、カプセル壁の厚さおよび他の特性も考慮して選ばれる。 実施例３ マウスの乳腺中へのマイクロカプセルの移植 ２月齢の雌ＢＡＬＢ/cマウスの乳腺中に、「鍵穴(key hole)」手術により、該マ イクロカプセルを挿入し、該侵入部位を１縫合で閉じた。直径0.5〜２mmの６個 以下のカプセルを各手術部位に挿入した。 該マイクロカプセルからのウイルス放出のインビトロ研究、該マイクロカプセ ルの構造、および免疫適格マウス（immunocompetent mouse）中への該カプセル 移植の効果を、以下の試験方法を用いて調べた。 Ａ）β−ガラクトシダーゼ活性 組織化学的染色による感染細胞の検出を、既に概説されているとおりに(Ｃepk o，1989)行なった。該細胞、カプセルまたは組織切片を、冷却ＰＢＳで洗浄し、 ついで２％パラホルムアルデヒド溶液で、該サンプルの厚さに応じて20分〜24時 間固定した。ＰＢＳで徹底的に洗浄した後、該細胞、カプセルまたは組織切片を 、基質Ｘ-gal（20mＭ Ｋ₃ＦeＣＮ₆、20mＭ Ｋ₄ＦeＣＮ₆-3Ｈ₂Ｏ、２mＭ ＭgＣl₂ および１mg/ml Ｘ-gal）を含有する溶液中、37℃で少なくとも２時間インキュベ ートした。 Ｂ）感染 感染の６時間前に、４×10⁴個の標的細胞を６ウェル組織培養プレート中にま いた。ウイルス産生細胞を含有するカプセルを該細胞上に載せ、ポリブレン（８ μg/ml）を該培地に加えた。４時間後、該培地を交換して、残留ポリブレンを除 去した。５日後、いくつかのウェルを、前記のとおりβ−ガラクトシダーゼ活性 に関して染色し、残りのものは、より大きな組織培養皿中にトリプシン処理し、 400 μg/ｍl Ｇ418を含有する培地中で培養した。16日後、Ｇ418耐性コロニーを検出 した。 Ｃ）ＲＴ-ＰＣＲ分析 ５mlのカプセル培養培地上清からウイルス粒子を、超遠心（240,000×g、１時 間、４℃）によりペレット化した。該ペレットを、溶解緩衝液（１％Ｔriton100 、0.5％デスオキシコール酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、ＰＢＳ ）に再懸濁し、フェノール抽出によりＲＮＡ抽出し、ついでエタノール沈殿させ た[既に記載されているとおりに行なった(Ｓalmonsら，1986)]。ついで、レディ ツーゴー・Ｔプライムド第１鎖キット（Ｒeady-Ｔo-Ｇo Ｔ-primed first-stran d kit)（Ｐharmacia）を用いて、該ＲＮＡをＤＮＡに逆転写した。envおよびＲ （ＭＬＶ由来ＢＡＧベクターＬＴＲのもの）(図２Ａ)内に位置するプライマーを 用いて、ＰＣＲ増幅を行なった。このＰＣＲ増幅は、500mＭ ＫＣl、10mＭ トリ ス-ＨＣl(pＨ8.3)、1.5mＭ ＭgＣl₂、0.01％（w/v）ゼラチンおよび100μＭの各 dＮＴＰ、40pＭの各プライマーおよび2.5単位Ｔaqポリメラーゼ（Ｐerkin Ｅlme r）よりなる100μlの反応混合物中で行なった。この反応は、パーキン・エルマ ー・シータス（Ｐerkin Ｅlmer Ｃetus）サーマルサイクラー9600中、以下の条 件下で行なった：94℃で１分、53℃で２分および72℃で３分の35サイクル。該Ｐ ＣＲ産物を、0.8％アガロースゲル上で分離し、ついでＺetaプローブ膜（ＢＩＯ ＲＡＤ）に移し、同じプライマーおよびpＢＡＧを鋳型として用いて得たＭＬＶ ゲノムの³²Ｐ標識された612bpのＰＣＲ 断片とハイブリダイズさせた[既に記載 されているとおりに行なった(Indraccoloら，1995)]。ＭＬＶ特異的配列を、Ｆu jiホスホイメージング系（ＢＡＳ1000）を用いて可視化した。 Ｄ）ＰＣＲ分折 ＢＡＧベクターの残留env配列内に位置する第１プライマー、および該レトロ ウイルスベクター配列の外部のプラスミドのポリオーマ領域中の第２プライマー を用いるＰＣＲ（図3Ｂ）により、ゲノムＤＮＡ（１μg）を増幅した。以下の反 応条件を用いて前記のとおりにＰＣＲ反応を行なった：94℃で１分間、50℃で２ 分間および68℃で３分間の35サイクル。該ＰＣＲ産物を、該ポリオーマ配列に特 異的なpＢＡＧからの³²Ｐ標識された 1.5kbのＸbaI ＤＮＡ断片とハイブリダイ ズさせ た。 Ｆ）電子顕微鏡検査 走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）検査のための 標本を、ＰＢＳ（pＨ7.35）中で洗浄し、ＰＢＳ中の１％グルタルアルデヒド中 で15分間前固定した後、２％Ｏ_SＯ₄中で15分間後固定した。該サンプルを等級化 系列のエタノールで脱水し、ついで２つの群に分けた。a）ＳＥＭサンプルを、 ＣＯ₂を用いて臨界点乾燥し、１〜３nmの白金（Ｅmscope ＳＣ500; Ａshford， Ｅngland）でコーティングした。このコーティングされた標本を、二次モードで ５〜10kvの加速電圧の10kv電界放出走査型電子顕微鏡（Joel ＪＳＭ-6300F; 東 京、日本）で検査 びクエン酸鉛で二重染色し、Ｚeiss ＥＭ-10Ｃ(Ｏberkochen，Ｇermany)透過型 電子顕微鏡で観察した。 結果 マイクロカプセルからのウイルス放出のインビトロ研究 実施例２で得たマイクロカプセル中の細胞を、前記試験で記載したとおり基質 Ｘ-galを用いてβ−ガラクトシダーゼ活性に関して染色したところ、該細胞は、 非カプセル化ベクター産生細胞と同様(示されていない)、pＢＡＧ（図１）によ ってコードされるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現することが示された。 該マイクロカプセル中の細胞から細胞培養培地中へウイルス粒子が放出される ことを確認するために、培養後の種々の時点でカプセル上清から収穫されたペレ ット化ビリオンからＲＮＡを調製した。前記ＲＴ-ＰＣＲ分析において記載され ているとおり、ウイルスenvおよびＲ領域に相補的なプラマーを用いるＲＴ-ＰＣ Ｒにより、このＲＮＡを分析した。ＭＬＶに特異的な予想されるサイズ（612bp ）のＰＣＲ産生断片が、マイクロカプセル培養培地中で少なくとも６週間認めら れ(図2Ｂ、レーン１〜４)、この時点で分析を中断した。ＲＴ-ＰＣＲ前のＲＮア ーゼによるウイルスＲＮＡの前処理ではシグナルが全く生成しなかったため（図 2Ｃ、１〜４）、この断片は、混入ＤＮＡによるものではない。 該カプセルからの感染性ウイルスの産生および放出は、感染試験において前記 したとおり、それを標的細胞、例えば、ＮＩＨ3Ｔ3(Ｊainchillら,1969)または ＣＲＦＫ （Crandellら，1973）細胞と共培養することにより確認できた。４日の共培養の 後、該標的細胞および該カプセル化パッケージング細胞のアリコートを、前記の とおり、β−ガラクトシダーゼ活性に関して染色した。残りの標的細胞を、Ｇ41 8耐性に関して選択した。共培養されたＮＩＨ3ＴおよびＣＲＦＫ細胞の多くがβ -gal遺伝子を発現することを示すことができた（図3Ａ）。 感染により標的細胞がβ-gal遺伝子を獲得していることを確認するために、標 的細胞をＰＣＲにより試験した。ＢＡＧを産生するパッケージング細胞系は、Ｐ Ａ317細胞系（ＭillerおよびＢuttimore，1986）に基づくものであり、単純ヘル ペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ-ＴＫ）を保持しており、その 産物により、プロドラッグであるガンシクロビルが細胞傷害性薬に変換される。 標的ＮＩＨ3Ｔ3またはＣＲＦＫ細胞は、通常はこの遺伝子を保持しない。β-gal を発現する共培養ＮＩＨ3Ｔ3およびＣＦＲＫ標的細胞がＧＣＶに耐性であること を示すことができた実験では(これは、ＢＡＧ産生細胞の流出が全く生じていな かったことを示すものである)、ゲノムＤＮＡを該標的細胞から抽出し、該ベク ター外部のプラスミド配列の存在に関してＰＣＲ（前記のＰＣＲ分析）により分 析した。ＢＡＧベクターをプラスミドpＢＡＧの形態でパッケージング細胞中に リポフェクションしたため、これらの配列はパッケージング細胞中には存在する 。しかしながら、該パッケージング細胞から産生されたウイルスは、これらのプ ラスミド配列を保持しないため、該標的感染細胞中に存在するはずがない。図3 Ｂは、そのようなプラスミド配列がいずれも検出不可能であったことを示し、こ のことは、これらの細胞がＢＡＧベクターに感染したことと一致する。 マイクロカプセルの構造 該マイクロカプセルの切片を調製し、その構造を電子顕微鏡により分析した。 該カプセルの内部は、細胞で満たされた海綿状様マトリックスよりなる(図４)。 該マイクロカプセルの表面の走査型電子顕微鏡検査（図４）においては、白色の 棒がレトロウイルス粒子の平均直径を表すため、該カプセルからレトロウイルス ベクター粒子を通過させるのに十分な大きさの孔の存在が示されている。 免疫適格マウスにおけるインビボ安定性 該マイクロカプセルのインビボ安定性、および該マイクロカプセルまたはそれ が産生するウイルスが有意な免疫応答を惹起するか否かを示すために、それを２ 月齢の雌ＢＡＬＢ/cマウスの乳腺中に移植した。該マウスを、移植後の種々の時 点で犠牲にして、該マイクロカプセルの運命と、感染性ウイルスが産生されるか 否かとを評価した。移植されたマイクロカプセルは、移植後少なくとも６週間、 乳脂肪パッド内に包埋されていることが明らかに認められた(図5Ａ)。興味深い ことに、分析したすべての動物において該マイクロカプセルの付近で血管新生が 生じた(図5Ａ)。これはおそらく、パッケージング細胞による脈管形成性または 増殖性因子の産生の結果であろう。 マイクロカプセルおよび周囲の乳房組織を通過するよう作製した切片から、血 管はカプセルに直接隣接して見出されることが確認された(図5Ｂ)。また、これ らの切片は、マイクロカプセルと乳房組織との間に位置する結合組織の層を示し た。マイクロカプセルまたはそれが含有するウイルス産生細胞に対する有意な炎 症応答または免疫応答の証拠はなかった。 感染性レトロウイルスベクター粒子が該カプセルから放出され、周囲の乳房組 織に感染したことを示すために、いくつかの切片をβ-galの発現に関してＸ-gal 染色により分析した。β-gal遺伝子を発現する細胞が、マイクロカプセルの外部 に明らかに認められた(図5Ｃ)。 実施例４ 本実施例は、ラットシトクロムP450 2Ｂ1の遺伝子を含有する腫瘍内感染用レ トロウイルス発現ベクターの構築を記載する。 図６に示す発現ベクターpＬＸ2Ｂ1は、プラスミドpＬＸ125およびpＳＷ1(Ｋed zieら，1991)から得た断片を連結することにより構築した。プラスミドpＬＸ125 をＨpaIで線状化し、得られた平滑末端を、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱 リン酸化した。１％アガロースゲル上での分離、切り出しおよびＱiaquickプロ トコール（Ｑiagen）を用いる調製により、該ＤＮＡを精製した。該ＤＮＡを、 エタノール沈殿の後、水に再懸濁した。 クローニングベクターpSＷ1をＳmaＩおよびＨincIIで消化して、２つの平滑末 端化断片を得た。該消化混合物を、１％アガロースゲル上で分離した。ラットシ トクロムＰ450 2Ｂ1 cＤＮＡ（Ｆuji-Ｋuriyamaら，1982）を含有する最も短い 断片（1,5kb）を切り出し、Ｑiaquick ＤＮＡ抽出プロトコールを用いて溶出し 、エタノール沈殿し、水に再懸濁した。 pＬＸ125の7,6fＭolsおよびpSＷ1のＳmaＩ/ＨindII断片の24fＭolsを共に混合 し、Ｔ4リガーゼ（Ｂoehringer）を用いて12℃で３日間連結した。該リガーゼを 65℃で10分間不活性化し、該ＤＮＡを、10倍容量のブタノールでブタノール沈殿 させた。その沈殿したＤＮＡを水に再懸濁し、ＤＨ10Ｂ細菌（Ｇibco）中にエレ クトロポレーションした。アンピシリン耐性コロニーを選択し、ＤＮＡを調製し 、SspＢＩ/ＳalI、ＢamＨI/ＳspＢＩ、ＰvuＩおよびＢamＨＩで試験消化した。 最終的な正しいプラスミドをpＬＸ2Ｂ1と称することにした。 リポフェクション リポフェクションの１日前に、３×10⁵個のレトロウイルスパッケージング細 胞ＰＡ317（ＭillerおよびＢuttimore,1986）を６cmペトリまたは培養皿中にま いた。感染の当日、２μgのpＬＸ2Ｂ1を100μlの無血清培地と混合した。平行し て、15μlのLipofectamine（Ｇibco ＢＲＬ）を100μlの無血清培地と混合した 。該プラスミド含有溶液を、該Ｌipofectamine混合物に加え、45分間インキュベ ートした。35分後、該細胞を２mlの無血清培地で１回洗浄した。800μlの無血清 培地を該リポフェクション混合物に加え、得られた１mlを、その調製された細胞 上に加えた。６時間後、10％ＦＣＳを含有する１mlのダルベッコの改変イーグル 培地を加えた。翌日、該細胞をトリプシン処理し、１：10希釈し、100mm皿上に まいた。24時間後、該培地を、ネオマイシン類似体Ｇ418を含有する培地と取り 換えた。単細胞クローンまたは細胞集団を単離し、シトクロムＰ450の発現に関 して分析した。 カプセル化 得られたレトロウイルスベクター産生パッケージング細胞を、前記実施例２に 記載のとおりにカプセル化する。 移植 得られたカプセルを、「鍵穴（key hole）」手術により、ＢＡＬＢ/cまたはＧＲ マウスの移植性または自発性腫瘍の付近またはその中に導入する。直径１mmの約 ６個のカプセルを各手術部位に挿入する。その手術部を１縫合により閉じる。つ いで該マウスを、シクロホスファミドまたはイフォスファミドで処理した。これ は、20mg/mlの100μlの直接的な腫瘍内注入により局所的に、あるいは130mg Ｃ ＰＡ/kg体重（i.p.）および40〜60mg ＩＦＯ/kg体重（i.p.）の全身濃度で、最 大10週まで行なった。この期間中、腫瘍サイズおよび肉眼による外観を毎日モニ ターする。ついで該マウスを犠牲にし、挿入されたカプセルおよび腫瘍を含有す る組織を取り出し、光学および電子顕微鏡検査用の組織切片を調製する。これら の切片は、カプセルの良好な移植、血管新生を明らかに示し、細胞性免疫応答を 示すリンパ球の存在の証拠を示さない。これらの切片はまた、カプセル内での細 胞死または壊死の徴候を示さない。これに対して、該腫瘍は壊死を示し、試験期 間中に腫瘍サイズの明らかな減少が生じたことが肉眼的に示された。 実施例５ 本実施例は、ラットシトクロムＰ450 2Ｂ1を構成的に発現する安定な細胞系の 構築を記載する。 発現ベクターpc3/2Ｂ1は、ブラスミドpcＤＮＡ3（Ｉnvitrogen）およびpＳＷ1 （Ｋedzieら，1991）から得た断片を連結することにより構築した。 プラスミドpcＤＮＡ3をＸhoＩ/ＸbaＩで消化し、得られた付着末端化断片を、 仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。１％アガロースゲル上での分 離、切り出しおよびＱiaquickプロトコール（Ｑiagen）を用いる調製により、該 ベクターバックボーンのＤＮＡを精製した。該ＤＮＡを、エタノール沈殿の後、 水に再懸濁した。 クローニングベクターpＳＷ1をＸhoＩおよびＸbaＩで消化して、２つの断片を 得た。該消化混合物を、１％アガロースゲル上で分離した。ラットシトクロムＰ 4502Ｂ1 ｃＤＮＡ（Ｆuji-Ｋuriyamaら，1982）を含有する最も短い断片（1,5kb ）を切り出し、Ｑiaquick ＤＮＡ抽出プロトコールを用いて溶出し、エタノール 沈殿させ、水に再懸濁した。 pcＤＮＡ3バックボーンの8,3fＭolsおよびpＳＷ1のＸhoＩ/ＸbaＩ断片の24,8f Ｍolsを共に混合し、Ｔ4リガーゼ（Ｂoehringer）を用いて12℃で１日間連結し た。該 リガーゼを65℃で10分間不活性化し、該ＤＮＡを、10倍容量のブタノールでブタ ノール沈殿させた。その沈殿したＤＮＡを水に再懸濁し、ＤＨ10Ｂ細菌（Ｇibco ）中にエレクトロポレーションした。アンピシリン耐性コロニーを選択し、ＤＮ Ａを調製し、ＥcoＲＩ、ＢamＨＩ、ＥcoＲＶおよびＸhoＩで試験消化した。最終 的な正しいプラスミドをpc3/2Ｂ1と称することにした。 リポフェクション リポフェクションの前日に、3×10⁵個のＮＩＨ3Ｔ3細胞を35mm皿中にまいた。 感染の当日、２μgのpc3/2Ｂ1を100μlの無血清培地と混合した。平行して、15 μlのＬipofectamine を100μlの無血清培地と混合した。該プラスミド含有溶液 を、該Lipofectamine 混合物に加え、45分間インキュベートした。35分後、該細 胞を２mlの無血清培地で１回洗浄した。800μlの無血清培地を該リポフェクショ ン混合物に加え、得られた１mlを、その調製された細胞上に加えた。６時間後、 10％ＦＣＳを含有する１mlのＤＭＥＭ（Ｇlutamax）を加えた。翌日、該細胞を トリプシン処理し、10倍希釈し、100mm皿上にまいた。24時間後、該培地を、ネ オマイシン培地と取り換えた。14日後、ネオマイシン耐性クローンを単離し、該 ベクターの存在および活性に関して試験した。 これらの細胞を含有するカプセルを、実施例２に記載のとおりに製造し、マウ スの腫瘍部位付近に移植した。シクロホスファミドまたはイフォスファミドでの 処理の後、前記のとおり、処理の効力を評価した。 図面 図１：β−ガラクトシダーゼ発現を示すための、pＢＡＧで安定にトランスフ ェクションされたカプセル化ＰＡ317細胞の組織染色。 図２：該カプセルにより放出されたウイルス粒子のＲＴ-ＰＣＲ分析(2Ｂ；レ ーン１〜４：カプセルの培養の２、３、５および６週間後に採取された培地)。 非カプセル化ＢＡＧウイルス産生細胞からの細胞培養培地を陽性対照（レーン５ ）として、非トランスフェクション化ＰＡ317からの培地を陰性対照（レーン６ ）として使用した。増幅されるバンドがウイルスＲＮＡに由来することを保証す るためにＲＴ-ＰＣＲ分析を行なう前に該ウイルスサンプルをＲＮアーゼで消化 した場合は、 シグナルは認められなかった(2Ｃ；レーン１〜４)。ＲＮアーゼ処理なしの非カ プセル化ＢＡＧウイルス産生細胞から調製されたウイルスＲＮＡを、ＲＴ-ＰＣ Ｒ反応において陽性対照として使用した(レーン７)。 図３：カプセル化ウイルス産生細胞とＮＩＨ3Ｔ3細胞との共培養。 （Ａ）パッケージング細胞を産生するレトロウイルスベクターを含有するカプセ ルを加える１日前に、標的細胞を低密度でまいた。数日後、細胞およびカプセル を共に、β−ガラクトシダーゼ活性に関して組織染色した。 （Ｂ）Ａにおいてβ−ガラクトシダーゼを発現する標的細胞が、ウイルス産生細 胞の流出によるものではなく、感染事象に由来することを確認するために、細胞 からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ分析を行なった。 図４：カプセルの表面を示す走査型電子顕微鏡検査。この場合、孔様構造は、 高倍率（×75000）で検出可能となる。白色の棒は100nm（レトロウイルス粒子の 直径）を表しており、これらの構造が表す孔を通って、該ウイルスが該カプセル から放出されることが示されている。 図５：マウスの乳腺内に移植されたカプセルの組織学的分析(Ａ)。 （Ｂ）マウス乳腺中に４週間移植した後のカプセルを通る切片の光学顕微鏡検査 (133倍の倍率)。 （Ｃ）ＢＡＧベクター産生ＰＡ317細胞含有カプセルの移植後のマウス乳房細胞 への感染。 図６：プロモーター変換の後にＵ3-ＭＭＴＶプロモーターにより制御されるこ ととなるラットシトクロムＰ450 2Ｂ1の遺伝子を含有する発現ベクターpＬＸ2Ｂ 1の構造。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 サラー、ロベルト・ミヒャエル ドイツ連邦共和国、デー−80636 ミュン ヘン、ユータシュトラーセ 22 (72)発明者 ギュンツブルク、ヴァルター・ハー ドイツ連邦共和国、デー−85229 アイン ホーフェン、ミッターフェルトシュトラー セ 11 (72)発明者 サルモンズ、ブライアン ドイツ連邦共和国、デー−85229 アイン ホーフェン、ミッターフェルトシュトラー セ 11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞を含有するコアと該コアを包囲する多孔性カプセル壁とを含んでなる 、ウイルス粒子を産生するカプセル化細胞であって、該多孔性カプセル壁が該ウ イルス粒子を透過しうることを特徴とするカプセル化細胞。 ２．該多孔性カプセル壁が、対荷電高分子電解質から形成される高分子電解質 複合体よりなる、請求項１に記載のカプセル化細胞。 ３．該多孔性カプセル壁が、硫酸基含有多糖もしくは多糖誘導体またはスルホ ナート基含有合成ポリマーと第四級アンモニウム基を有するポリマーとから形成 される高分子電解質複合体よりなる、請求項１または２に記載のカプセル化細胞 。 ４．該硫酸基含有多糖もしくは多糖誘導体が硫酸セルロース、酢酸硫酸セルロ ース、カルボキシメチルセルロース硫酸、デキストラン硫酸またはデンプン硫酸 であり、該スルホナート基含有合成ポリマーがポリスチレンスルホナートである 、請求項３に記載のカプセル化細胞。 ５．第四級アンモニウム基を有するポリマーが、ポリジメチルジアリルアンモ ニウムまたはポリビニルベンジル−トリメチルアンモニウムである、請求項３に 記載のカプセル化細胞。 ６．該多孔性カプセル壁が、硫酸セルロースおよびポリジメチルジアリルアン モニウムから形成される複合体よりなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の カプセル化細胞。 ７．0.01〜５mm、好ましくは0.1〜１mmの直径を有するマイクロカプセルの形 態を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のカプセル化細胞。 ８．該カプセルが、孔を含有するカプセル表面に包囲される該カプセル壁の内 部を形成する海綿状硫酸セルロースマトリックスよりなり、該海綿状マトリック スが細胞で満たされている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のカプセル化細 胞。 ９．該多孔性カプセル壁の表面孔径が、80〜150nm、好ましくは100〜120nmで ある、請求項１〜８のいずれか１項に記載のカプセル化細胞。 10．該カプセル化細胞により産生されるウイルス粒子が、レトロウイルスベク ターのゲノムを含有するレトロウイルス粒子である、請求項１〜９のいずれか１ 項に記載のカプセル化細胞。 11．レトロウイルス粒子を産生するカプセル化細胞が、発現ベクターでトラン スフェクションされたパッケージング細胞系であり、該発現ベクターが、レトロ ウイルスベクターコンストラクトを保持し、該レトロウイルスベクターコンスト ラクトが、標的細胞に感染し該標的細胞中で該レトロウイルスベクターコンスト ラクトに保持された１以上のコード配列の発現を指令する能力を有し、該パッケ ージング細胞系が、該レトロウイルスベクターコンストラクトのゲノムがパッケ ージングされるのに必要なタンパク質をコードする遺伝子を保持する少なくとも １つの発現ベクターを含む、請求項10に記載のカプセル化細胞。 12．該コード配列の少なくとも１つが、マーカー遺伝子、治療用遺伝子、抗ウ イルス遺伝子、抗腫瘍遺伝子およびサイトカイン遺伝子から選ばれる異種ペプチ ドをコードする、請求項11に記載のカプセル化細胞。 13．該マーカー遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン、アルコール デヒドロゲナーゼ、ピューロマイシン、ヒポキサンチンホスホリボシルトランス フェラーゼ(ＨＰＲＴ)、ハイグロマイシンおよび分泌アルカリホスファターゼな どのタンパク質をコードするマーカー遺伝子よりなる群から選ばれ、該治療用遺 伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グア ニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)、シトクロムＰ450などのタンパク 質をコードする遺伝子、ＳＤＩなどの細胞周期調節遺伝子、p53などのタンパク 質をコードする癌抑制遺伝子、メリチン、セクロピンまたはサイトカイン（例え ば、ＩＬ-2）などのタンパク質をコードする抗増殖遺伝子から選ばれる、請求項 12に記載のカプセル化細胞。 14．該パッケージング細胞系が、psi-2、psi-crypt、psi-ＡＭ、ＧＰ+Ｅ-86、 ＰＡ317およびＧＰ+envＡＭ-12から選ばれる、請求項11に記載のカプセル化細胞 。 15．該発現ベクターが、pＢＡＧ、pＬＸＳＮ、p125ＬＸ、pＬＸ2Ｂ1またはpc3 /2Ｂ1またはそれらの誘導体である、請求項11に記載のカプセル化細胞。 16．ウイルス粒子を産生する細胞を高分子電解質の水溶液に懸濁し、ついで前 形成粒子形態の該懸濁液を、対荷電高分子電解質の水溶液を含有する沈殿浴中に 導入することを含んでなる、請求項１〜15のいずれか１項に記載のカプセル化細 胞の製造法。 17．該粒子形成が噴霧により生じる、請求項16に記載の製造法。 18．該細胞を、硫酸基含有多糖もしくは多糖誘導体またはスルホナート基含有 合成ポリマーの水溶液に懸濁する、請求項16または17に記載の製造法。 19．該硫酸基含有多糖もしくは多糖誘導体が、硫酸セルロース、酢酸硫酸セル ロース、カルボキシメチルセルロース硫酸、デキストラン硫酸またはデンプン硫 酸であり、該スルホナート基含有合成ポリマーがポリスチレンスルホナートであ る、請求項18に記載の製造法。 20．該沈殿浴が、第四級アンモニウム基を有するポリマーの水溶液を含有する 、請求項16または17に記載の製造法。 21．第四級アンモニウム基を有するポリマーが、ポリジメチルジアリルアンモ ニウムまたはポリビニルベンジル−トリメチルアンモニウムである、請求項20に 記載の製造法。 22．該細胞を、硫酸セルロースナトリウムの水溶液に懸濁し、ポリジメチルジ アリルアンモニウムクロリドの水溶液を含有する沈殿浴中に導入する、請求項16 または17に記載の製造法。 23．該硫酸セルロース水溶液が、緩衝食塩水中の0.5〜50％、好ましくは２〜 ５％の硫酸セルロースナトリウムおよび２〜10％、好ましくは５％のウシ胎児血 清よりなる、請求項22に記載の製造法。 24．該沈殿浴中の水溶液が、緩衝食塩水中の0.5〜50％、好ましくは２〜10％ 、より好ましくは３％のポリジメチルジアリルアンモニウムクロリドよりなる、 請求項22に記載の製造法。 25．請求項16〜24のいずれか１項に記載の製造法により製造される、請求項１ 〜15のいずれか１項に記載のカプセル化細胞。 26．標的器官／細胞へ遺伝子を輸送するための、請求項１〜15のいずれか１項 に記載のカプセル化細胞の使用であって、 a）適当な培地中で該カプセル化細胞を培養し、そして b）ヒトを含む生きた動物の体内へ該カプセル化細胞を移植することを含んで なる使用。 27．該標的器官／細胞が乳腺または膵臓である、請求項26に記載の使用。 28．該標的器官／細胞が、動脈を包囲する平滑筋細胞である、請求項26に記載 の使用。