JP2000509249A - シトクロムｐ４５０を形質導入するレトロウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはＸ線誘導性プロモーターの転写調節下にあるシトクロムＰ450遺伝子を担持する複製欠損レトロウイルスベクター。

Description

【発明の詳細な説明】 シトクロムＰ450を形質導入するレトロウイルスベクター 本発明は、無害な癌のプロドラッグを細胞毒性代謝物に転換することができる シトクロムＰ450遺伝子をコードする複製欠損レトロウイルスベクターに関する 。さらに本発明は、様々な癌を治療し、または腫瘍を除去するための医薬の調製 のためのこのようなレトロウイルスベクターの使用に関する。 発明の背景 腫瘍を治療するために用いられる抗癌剤は、多くの場合全身投与され、患者の 全身にわたって分布する。癌を治療するために必要とされるこのような薬物の大 量の全身投与は、患者にとって好ましくない副作用を伴う。 この問題を回避するために、細胞毒性になる前に、体内で代謝または活性化さ れなければならない癌のプロドラッグが用いられてきた。残念なことに、高レベ ルの適切な活性化酵素を含有するヒトの腫瘍は稀である。プロドラッグを活性化 する主要な部位は肝臓であり、離れた部位の腫瘍に十分な量の活性化された薬物 を確実に与えるためには、肝臓で産生される活性化されたプロドラッグの量を極 めて多量にしなければならず、結局患者に有害な副作用をもたらすことになる。 活性化された薬物の全身濃度が高いというこれらの問題を回避し得る戦略の一 つは、腫瘍部位中またはその近傍で直接プロドラッグを活性化する手段を供する ことであろう。該戦略では、腫瘍細胞または腫瘍部位の細胞を遺伝的に形質転換 して、癌のプロドラッグを代謝するために必要な大量の酵素を産生させる必要が あると思われる。レトロウイルスは、ＤＮＡの形態のレトロウイルスゲノムを宿 主細胞のゲノムに組み込むことができ、このため被感染細胞の全ての娘細胞は治 療用遺伝子を担持するレトロウイルスベクターを保有するので、レトロウイルス ベクターは遺伝子を安定に細胞に供給するのに最適である。さらなる利点は、ほ とんどのレトロウイルスが分裂中の細胞だけに感染するということであり、それ 故腫瘍細胞への理想的な遺伝子輸送担体である。 レトロウイルスベクターによって運ばれる様々な細胞毒性遺伝子が、これまで に試験されてきた。これらの遺伝子は、高用量レベルでも薬力学的且つ毒性学的 に不活性であるが、インビボで高度に活性な代謝物に転換され得る物質を変化さ せる酵素をコードする（Connors．T.A．(1995)，Gene Therapy 2:702-709)。 癌の化学療法において、適切にデザインされたプロドラッグが、高レベルの活 性化酵素を有する動物の腫瘍を治療するのに有効であることが見出されている（ Connors，T.およびWhisson，M．(1966)，Nature 210:866 867、およびCobb,L． ら,(1969)，Biochemical Pharmacology 18:1519-1527）。しかし、適切に高レベ ルの活性化酵素を含有するヒトの腫瘍は稀であることが分かったので（Connors ，T．(1986)，Xenobiotica 16:975-988）、臨床結果は芳しくなかった。ウイル スにより誘導された酵素によるプロドラッグ療法（ＶＤＥＰＴ;virally directe d enzyme prodrug therapy）、およびさらに一般的な遺伝子により誘導された酵 素によるプロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ;gene directed enzyme prodrug therap y）も、腫瘍特異的なプロドラッグの活性化によって腫瘍細胞を破壊することを 目的とする点で関連する。しかし、この場合には、酵素をコードする遺伝子は悪 性細胞に特異的に標的化されているか、または特異的なプロモーターの制御下に ある。 これまでプロドラッグ療法に対する努力の多くは、自殺遺伝子（suicide gene ）としてヒト単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ-tk）を用いるこ とに注力されてきた。プロドラッグであるガンシクロビル(ＧＣＶ;ganciclovir) とＨＳＶ-tk酵素との組み合わせが、ＧＤＥＰＴ用の好適なシステムとしてして 推奨されてきたが（Culver，K.ら，(1992)，Science 256:1550-1552、Ram，Z.ら ，(1993)，Cancer Research 53:83-88、およびChen，S．Shine，H.ら，(1994)， Proc．Natl．Acad．Sci．91:3054-3057）、決して最適な組み合わせではないこ とを示唆する理論的な考察が多数存在する。第一に、これはＳ期特異的な薬剤で あり、休止している細胞には何ら効果がない。これはＧＣＶ一リン酸は寿命が短 く、毒性効果を与えるためには細胞がＳ期に入る時点で存在していなければなら ないからである。ＨＳＶ-tkはＧＣＶをリン酸化して一リン酸型にし(哺乳類の酵 素によっては、行い得ない反応)、これはその後細胞の酵素によってリン酸化さ れて三リン酸型になり、ＤＮＡ中に取り込まれる。第二に、活性な薬物は三リン 酸であるため、自由に拡散してバイスタンダー効果を引き起こすとは思われない 。しかし、インビトロおよびインビボ（代謝協同が関与しているかもしれないが ）の両者でバイスタンダー効果 が観察されており、後者の場合、いくつかの効果は免疫成分が関与する間接的な ものかもしれない（Bi，W.，Parysek L.ら，(1993)，Human Gene Therapy 4:725 -731、Vile,R.およびHart，Ｉ．(1993)，Cancer Research 53:3860-3864,および Freeman，S.，Abboud，C．ら,(1993)，Cancer Research 53:5274-5283）。欠点 の一つは、バイスタンダー効果は細胞−細胞間接触に依存するということである 。これは、形質導入された細胞と周囲の細胞との間に存在する近接部によって形 成され、リン酸化されたガンシクロビルの輸送を可能にするギャップジャンクシ ョンの存在によるかもしれない。 最近、ラットシトクロムＰ450 2Ｂ1型をコードする遺伝子をトランスフェクト された後、シクロフォスファミドで処理された細胞を用いて、興味深い結果が報 告されている（Chen．S.，Shine．Hら，(1994)，Proc．Natl．Acad．Sci．91:30 54-3057）。 発明の目的 本発明の目的は、シトクロムＰ450をコードしている遺伝子を担持し、様々な 癌の標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはＸ線誘導性プロモ ーターの転写調節下にあるシトクロムＰ4遺伝子治療に有用な組換えレトロウイ ルス粒子を産生するためのパッケージング細胞株中にトランスフェクトすること ができる新規複製欠損レトロウイルスベクターを提供する。 発明の概要 それ故、本発明は、とりわけ以下のもの： 標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはＸ線誘導性プロモー ターの調節下にあるシトクロムＰ450遺伝子を担持する複製欠損レトロウイルス ベクター； ベクターがＵ3-Ｒ-Ｕ5構造の5'ＬＴＲ領域；コード配列および非コード配列か ら選択された一以上の配列；および完全または部分的に欠失したＵ3領域であっ て、標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはＸ線誘導性プロモ ーターを含有するポリリンカー配列によって置換され、ＲおよびＵ5領域が続い ているＵ3領域を具備する3'ＬＴＲ領域を具備し、少なくとも一つのコード配列 がシトクロムＰ450をコードしていることを特徴とする上記の複製欠損レトロウ イルス ベクター； 標的細胞特異的な制御要素またはプロモーターが、ＷＡＰ、ＭＭＴＶ、β−ラ クトグロブリンおよびカゼイン特異的制御要素およびプロモーター、炭酸脱水酵 素IIおよびβ−グルコキナーゼ制御要素およびプロモーターを含む膵臓特異的な 制御要素およびプロモーター、免疫グロブリンおよびＭＭＴＶリンパ球特異的制 御要素およびプロモーターを含むリンパ球特異的な制御要素およびプロモーター 、グルココルチコイドホルモンに対する応答性を与えるかまたは乳腺に対して発 現を指令するＭＭＴＶ特異的な制御要素およびプロモーターからなる群の一以上 の要素から選択される上記の複製欠損レトロウイルスベクター； 前記ＬＴＲ領域が、ＭＬＶ、ＭＭＴＶ、ＭＳＶ、ＳＩＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、 ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＢＬＶ、およびＭＰＭＶのＬＴＲからなる群の少なくとも一 つの要素から選択されている上記の複製欠損レトロウイルスベクター； 前記レトロウイルスベクターがＢＡＧベクターまたはｐＬＸＳＮベクターをベ ースとする上記の複製欠損レトロウイルスベクター； 前記レトロウイルスベクターが実施例１の記載のように調製されたｐＬＸ２Ｂ １である上記の複製欠損レトロウイルスベクター； 前記レトロウイルスベクターが実施例２の記載のように調製されたpc3/2Ｂ1で ある上記の複製欠損レトロウイルスベクター； レトロウイルスの組込みに関与するレトロウイルス配列が改変され、または少 なくとも部分的に欠失している上記の複製欠損レトロウイルスベクター； 前記制御要素またはプロモーターがトランス作用分子によって調節され得る上 記の複製欠損レトロウイルスベクター； 前記パッケージング細胞株が、前記レトロウイルスベクターをパッケージする ために必要なタンパク質をコードするレトロウイルスまたは組換えレトロウイル ス構造物を少なくとも一つ含有している上記の複製欠損レトロウイルスベクター をトランスフェクトされた前記パッケージング細胞株； パッケージング細胞株が編歯類、イヌ、ネコ、またはヒト由来の細胞株であり 、ヒト組織と組織適合性がある上記のパッケージング細胞株； パッケージング細胞株がpsi-2、psi-Crypt、psi-ＡＭ、ＧＰ+Ｅ-86、ＰＡ317 、およ びＧＰ+envＡＭ-12からなる群から選択される上記のパッケージング細胞株； 適切な条件下で上述した任意のパッケージング細胞株を培養した後、産生され た組換えレトロウイルス粒子を任意に単離することにより産生される組換えレト ロウイルス粒子； 上記の組換えレトロウイルス粒子、または上記のパッケージング細胞株を具備 する薬学的組成物； 前記パッケージング細胞株によって産生された組換えレトロウイルス粒子を通 過させることができる多孔性の膜に封入された上記のパッケージング細胞株； セルロース硫酸およびポリジメチルジアリルアンモニウムによって形成された 複合体中に封入されている上記のパッケージング細胞株； 上記の組換えレトロウイルス粒子、上記のパッケージング細胞株、または上記 の封入されたパッケージング細胞株、およびシトクロムＰ450によって活性化さ れ得る癌のプロドラッグを同時にまたは時間をおいて、本方法を必要としている 患者に治療的有効量投与することを具備する腫瘍細胞の除去法； 腫瘍細胞が乳癌または膵臓癌細胞である上記の方法； 組換えレトロウイルス粒子、パッケージング細胞株、もしくは封入されたパッ ケージング細胞株が注射によって投与され、または腫瘍中に、もしくは腫瘍部位 に移植することによって投与される上記の方法； 腫瘍細胞を除去するのに有用な薬学的組成物を調製するための上記の組換えレ トロウイルス粒子、上記のパッケージング細胞株、または封入されたパッケージ ング細胞株の使用； 標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはＸ線誘導性プロモー ターの転写調節下にあるシトクロムＰ450遺伝子を担持する、ヒトゲノム中に組 み込まれたレトロウイルスプロウイルス；および 標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはＸ線誘導性プロモー ターの転写調節下にあるシトクロムＰ450遺伝子を含有するヒト細胞 を単独で、または組み合わせて具備する。 発明の詳細な説明 シトクロムＰ450は、広範囲にわたる基質の酸化を触媒する広範なモノオキシ ゲナーゼ群を形成する。シトクロムＰ450は、ある種の細菌、酵母、および高等 生物によって産生され、生体異物、生物活性化反応、および種々の内在性化合物 の解毒において役割を果たしている。 シトクロムＰ450は、広く使用されている癌のプロドラッグであるシクロフォ スファミド（ＣＰＡ）およびイフォスファミド（ifosfamide）の水酸化を触媒し 、活性で毒性な型にする。通常、患者の内在性シトクロムＰ450遺伝子の発現は 肝臓に限局し、全身投与されたＣＰＡの抗腫瘍効果は、その後の肝臓からの毒性 薬物の代謝物の全身的な分布に依存する。活性化された薬物は、腫瘍だけでなく 、骨髄および腎臓などの患者の他の正常な組織にも影響を与えるので、毒性の問 題が生じる。 腫瘍細胞中にシトクロムＰ450遺伝子を選択的に直接導入し、該細胞中で過剰 発現させるという治療法によって、この問題を回避できるかもしれない。該形質 導入された腫瘍細胞から産生された毒性代謝物は、周囲の形質転換されていない 細胞に、濃度勾配依存的に影響を与える。シトクロムＰ450/ＣＰＡシステムのさ らなる利点は、周囲の細胞に対する細胞毒性効果が細胞の複製に依存しないとい うことである。これは、産生された活性な代謝物の一つが、細胞サイクルのフェ イズとは無関係に、ストランド間にクロスリンクを生じせしめるからである。そ の後、ＤＮＡ合成の間に、このストランド間のクロスリンクは細胞死をもたらす 。 レトロウイルスベクターは、今まで着手されてきた臨床試験で遺伝子輸送担体 として最も一般的に用いられてきたものである。しかし、これらの試験のほとん どは、患者の細胞を単離し、培養して改変した後、患者に戻すというエクスビボ （ex vivo）アプローチであった。 癌を治療するためには、患者から細胞（腫瘍細胞または正常細胞の何れか）を 単離し、それらをインビトロで、シトクロムＰ450をコードする遺伝子を担持す る組換えレトロウイルス粒子に感染させた後、患者の腫瘍の近傍にそれらを戻す ことが適当であろう。しかし、各患者の細胞を単離し、培養し、遺伝子構築物を 形質導入してから、偶発的な因子による感染を起こさずに、上手く戻さなければ ならないため、このアプローチは非常に手間がかかる。このようなアプローチに 要するコストおよび時間は、実用の妨げとなっている。 あるいは、Ｐ450をコードする遺伝子を担持する組換えレトロウイルス粒子で 、あるタイプの細胞を感染させた後、多くの異なる患者を治療するために、これ らを使用するという同種異系（allogenic）のアプローチも考えることができる 。このようなアプローチは、免疫拒絶の問題を克服することができるとすれば、 より実用的である。しかし、多くの腫瘍はエクスビボ遺伝子治療には適していな い。 理想的には、シトクロムＰ450をコードする遺伝子は、インビボで腫瘍細胞中 に、または腫瘍近傍の細胞に導入されなければならない。 インビボでの遺伝子の輸送は、新たな多くの問題をもたらす。まず、安全性に 関する問題点について、特に述べなければならない。 安全性および純粋な実用性という双方の見地から、最終的なインビボ遺伝子治 療における最大の関心事は、発現のターゲッティングである。ベクターが担持す る治療用遺伝子が、全ての組織および細胞で、無差別に発現されるべきでなく、 必要な標的細胞中でのみ発現されるべきことは明らかである。導入される遺伝子 が、特異的な腫瘍細胞を除去するようにデザインされた遺伝子を活性化するプロ ドラッグであるときには、このことは特に重要である。 このようなランダムな組込みは、原癌遺伝子（proto-oncogene）の活性化を引 き起こして、新たな癌を生じさせ得るので、プロウイルス型のレトロウイルスゲ ノムが被感染細胞のゲノム中へ実質的にランダムに組込まれることは、重大な倫 理的問題をもたらす。現在用いられているような全ての複製欠損レトロウイルス が、細胞増殖の制御に関与する細胞遺伝子中またはその近傍に取り込まれる確率 は、無視できるほど小さいことに、多くの研究者は賛同するであろう。しかし、 単一の感染事象から複製能をもったレトロウイルス群が爆発的に増大して、この ような表現型的な組込み（phenotypic integration）が十分現実的になるような 組込み現象を最終的に引き起こすことも一般的に仮定できる。 レトロウイルスベクターシステムは、複製能をもったウイルスが存在する可能 性が最小になるように最適化されている。しかし、レトロウイルスベクターシス テムの成分間の組換え現象によって、病原性の可能性があり、且つ複製能を有す るウイルスが発生し得るということは充分に実証されており、多くのベクターシ ステムの作成においては、組換えのリスクが最小になるように構築されている （Salmons B.およびGunzburg，W．H．(1993)，Human Gene Therapy 4(2):129-41 ）。 レトロウイルスベクターシステムは、二つの成分： (1)レトロウイルスベクター自身が、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子 が治療用遺伝子に置き換えられている改変されたレトロウイルス（ウイルス プラスミド）である。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の置換は、効 果的にウイルスの機能を喪失させるので、該喪失したウイルスタンパク質を 該改変されたレトロウイルスに提供する、システム中の第二の成分によって 、改変されたレトロウイルスを救出しなければならない。 (2)大量のウイルスタンパク質を産生するが、複製能をもったウイルスを産生 する能力が欠如した細胞株。該細胞株は、パッケージング細胞株として知ら れており、改変されたレトロウイルスベクターをパッケージングすることが できる遺伝子を担持する一以上のプラスミドでトランスフェクトした細胞株 からなる。 組換えレトロウイルス粒子を作成するために、レトロウイルスベクターをパッ ケージング細胞株にトランスフェクトする。これらの条件下で、挿入された治療 用遺伝子を含む改変されたレトロウイルスゲノムは、レトロウイルスベクターか ら転写され、改変されたレトロウイルス粒子にパッケージングされる。次に、こ れらの組換えレトロウイルス粒子は、腫瘍細胞に感染させるのに用いられ、その 間に、ベクターゲノムおよび全ての細胞毒性遺伝子は、標的細胞のＤＮＡ中に組 込まれる。細胞中にウイルスタンパク質が存在していないので、このような組換 えウイルス粒子に感染した細胞は、新しいベクターウイルスを産生することはで きないが、治療薬を担持するベクターのＤＮＡが細胞のＤＮＡ中に組込まれてい るので、感染された細胞中で発現することができる。 担持された細胞毒性遺伝子をターゲッティングさせ得る多数のレトロウイルス ベクターシステムが、これまで記載されてきた(Salmons B.およびGunzburg，W． H．(1993)，Human Gene Therapy 4(2):129-41)。これらのアプローチの多くは、 予め規定した細胞種のみで感染現象が起こるように限定すること、または特定の 腫瘍細胞種に対して、連結された異種性の治療用遺伝子の発現を誘導するための 異種性プロモーターを用いることの何れかを含む。プロモーターが通常活性で、 または／およびさらに制御可能であるような細胞の中だけで、連結された遺伝子 の発現を誘導しなければならない異種性プロモーターを用いる。これらのプロモ ーターは、予め、レトロウイルスベクターの本体に、治療用遺伝子とともに、ga g、polまたはenv遺伝子と置換して挿入される。 これらの遺伝子の両側に存在するレトロウイルスＬＴＲは、レトロウイルスプ ロモーターを担持し、これは多くの異なる細胞種の中で発現を誘導し得るという 点で、一般的に非特異的である（”Retroviruses-Strategies of replication(S wanstrom，R.およびVogt，P．K.，Eds.)の中のMajors，J.（1990）:Springer-Ve rlag，Berlin:49-92）。ＬＴＲプロモーターと組織特異的なプロモーターのよう な上述の異種性内部プロモーター間でのプロモーター干渉作用（interference） が報告されている。さらに、レトロウイルスのＬＴＲは、独立に、またはレトロ ウイルスプロモーターとともに、レトロウイルスの組込み部位近傍の細胞遺伝子 の発現に影響を与え得る強力なエンハンサーを有することが知られている。この 機構は、動物内での腫瘍生成に関与していることが示されている(vanLohulzen,M .およびBerns，A．(1990)，Biochim．Biophys．Acta 1032:213-235)。これら二 つの観察は、レトロウイルスプロモーターが、標的細胞中で機能的に不活性化さ れる自己不活性化ベクター(ＳＩＮ;Self-Inactivating-Vectors)の開発を促した (ＷＯ94/29437)。さらに、これらのベクターの改変には、ＬＴＲ領域内にプロモ ーター遺伝子カセットを挿入して、ダブルコピーベクター（ＷＯ89/11539）を作 り出すことが含まれる。しかし、これらの両ベクターでは、ベクター本体、また はＬＴＲ領域の何れかに挿入された異種性プロモーターは、治療用遺伝子に直接 連結されている。 欠失した3'ＬＴＲを担持する以前記載した上記のＳＩＮベクター(ＷＯ94/2943 7)では、さらにパッケージング細胞株中でベクター構築物の発現を誘導するレト ロウイルス5'ＬＴＲプロモーター（Ｕ3欠如5'ＬＴＲ）の代わりに、サイトメガ ロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターのような異種性プロモーターを用いている 。3'ＬＴＲには、異種性ポリアデニル化シグナルも含まれている（ＷＯ94/29437 ）。 本発明の目的は、治療成分としてシトクロムＰ450遺伝子を含有する安全なレ トロウイルスベクターを構築することである。該新規ベクターは、異種性の構成 的、誘導性、または組織特異的なプロモーターおよび／または、標的細胞内で、 感染後複製されて5'ＬＴＲに転移される(translocate)3'ＬＴＲ中の制御要素を 担持する。このため、感染細胞中では、導入されたプロモーターは、ベクターの 本体に挿入されているシトクロムＰ450遺伝子の発現を制御する。該ベクターは 、自己不活性化は行わないが、代わりにプロモーター・コンバージョンを行い、 プロモーター・コンバージョン・ベクター(Promoter Conversion vector)からPr oConベクターと名付けられている。ProConシステムの原理および利点は、ＷＯ96 07748に、より詳細に記載されている。 プロモーター・コンバージョンは自己不活性化を起こさないので、レトロウイ ルスベクターは、標的細胞内で転写活性を示す。さらに両ＬＴＲの多くは、標的 細胞中の異種性プロモーター／エンハンサー配列からなる。このため、標的細胞 に組み込まれたベクターが、従来のベクターに記載されているような（Ｘｕ，Ｌ .，Ｙｅｅ,J．K．ら、(1989)、Virology 171:331-341）長期間にわたる不活性化 を受ける可能性が少なくなり、内在性レトロウイルス配列との組換えによって、 複製能を有する病原性ウイルスが作り出される可能性も減少し、システムの安全 性が増加するであろう。 本発明によれば、レトロウイルスベクター構築物の5'ＬＴＲは改変されておら ず、パッケージング細胞中でのウイルスベクターの発現は、正常なレトロウイル スＵ3プロモーターによって誘導される。正常なレトロウイルスポリアデニル化 が起こり、3'ＬＴＲには異種性ポリアデニル化シグナルは含まれなくなる。パッ ケージング細胞が組み替えウイルスを産生している間、（おそらくウイルスによ る正常なポリアデニル化の制御も関与する）正常なウイルスプロモーターを通じ たウイルスの正常な生理的制御がインビボで長期間にわたって続くので、インビ ボ遺伝子治療法を開発する上で、このことは重要である。 上述した他の目的を達するために、本発明は、Ｕ3-Ｒ-Ｕ5構造の5'ＬＴＲ領域 ；シトクロムＰ450遺伝子として知られている遺伝子群から選択される一以上の コード配列；および完全または部分的に欠失したＵ3領域を具備する3'ＬＴＲで あって、該欠失したＵ3領域が異種性プロモーターによって置換され、その後に Ｒお よびＵ5領域が続いている3'ＬＴＲを具備するプロモーター・コンバージョンを 行うレトロウイルスベクターを提供する。 前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／ エンハンサーのように構成的、グルココルチコイドホルモン（例えば、ＭＭＴＶ プロモーター）または標的細胞特異的などのように誘導性であり得る。 標的細胞特異的な制御要素およびプロモーターは、任意の遺伝子の一以上の要 素から選択されるが、本実施態様では、炭酸脱水酵素IIおよびβ−グルコキナー ゼ制御要素およびプロモーターを含むプロモーター、炭酸脱水酵素IIおよびβ− グルコキナーゼ制御要素およびプロモーターを含むリンパ球特異的制御要素およ びプロモーター、乳漿酸性タンパク質（ＷＡＰ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴ Ｖ）、β−ラクトグロブリンおよびカゼイン特異的制御要素およびプロモーター のリンパ球特異的制御要素、免疫グロブリンおよびＭＭＴＶリンパ球特異的制御 要素およびプロモーターを含む膵臓特異的な制御要素およびプロモーター、グル ココルチコイドホルモンに対する応答性を与えるか、または乳腺に対する発現を 誘導するＭＭＴＶ特異的な制御要素およびプロモーターから選択され得る。他の プロモーターには、例えばＣＤ4、ＣＤ34およびＩＬ2プロモーターが含まれる。 前記制御要素およびプロモーターは、好ましくは前記レトロウイルスベクターの 発現を制御する。 乳腺への特異性を与えるのに必要なＷＡＰプロモーターの領域は、320bpのＸ ｈｏＩ/ＸｂａＩ制限断片（-413〜-93）であるように思われる（Kolb，A．F.，G unzburg，W．H.，Albang，R．Brem，G.，Erfle，V.,およびSalmons，B．(1995) ，Biochem．Bihphys．Res．Commun．217，1045-1052）。さらにある実験は、Ｍ ＭＴＶが示す乳腺特異的な発現(Kolb，A．F.，Gunzburg，W．H.，Albang，R.，B rem，G．Erfle，V.，およびSalmons，B.(1995)，Biochem．Bihphys．Res．Commu n．217，1045-1052)の制御に、0.6KbのPStI ＭＭＴＶプロモーター断片（Salmon s，B.，Groner，B.，Calberg Baca，C.M.,およびPonta，H.(1985)，Virology 14 4:101-114）が役割を果たしているらしいということを示している。 LTR領域は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴ Ｖ）、マウス肉腫ウイルス（ＭＳＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト 免疫不全ウ イルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ネコ免疫不全ウイ ルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＥＬＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬ Ｖ）およびメイソン−ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）のＬＴＲからなる群 の少なくとも一つの要素から選択される。 レトロウイルスベクターは、ＬＸＳＮベクター（Miller，A.D.およびRosman， G.J.(1989)，Biotechniques 7:980-990）,pBAG（Price，J.，Turner，D.ら，(19 87)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:156-160）、または両者のハイブリッドの 何れかをベースにすることが好ましい。 治療用遺伝子のコード配列は、任意のシトクロムＰ450遺伝子であり得るが、 最も好ましいのは、Fuji-Kuriyama，Y.，Mizukami，Y．ら(1982)Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 79:2793-2797に明記されている2Ｂ1型ラットシトクロムＰ450であ る。 本発明のさらなる実施態様では、第一の成分として上記のレトロウイルスベク ター、および該レトロウイルスベクターをパッケージングするのに必要なタンパ ク質をコードするレトロウイルスまたは組換えレトロウイルス構築物を少なくと も一つ含有するパッケージング細胞株を具備するレトロウイルスベクターシステ ムが与えられる。 パッケージング細胞株は、好ましくはΨ-2、Ψ-Crypt、Ψ-ＡＭ、ＧＰ+Ｅ-86 、ＰＡ317、およびＧＰ+envＡＭ-12、または他のエンベロープに被覆されたウイ ルスの表面タンパク質を発現させ得る組換え構築物がさらにトランスフェクトさ れた任意のこれらの細胞株からなる群の一要素から選択される。 本発明には、本発明のレトロウイルスベクターから得られるｍＲＮＡも含まれ る。 パッケージング細胞株では、レトロウイルスベクターの発現は、Ｕ3領域に含 有される正常な非選択的レトロウイルスプロモーターによって制御される。しか し、ベクターが標的細胞に侵入するとすぐにプロモーター・コンバージョンが起 こり、ProConベクター中に挿入された組織特異的または誘導性の好ましいプロモ ーターから、Ｐ450遺伝子が発現される。様々な異なる細胞種の選択的なターケ ッティングを与えるならば、システムには実質的に任意の組織特異的プロモータ ーを含有させ得るのみならず、さらに、コンバージョン現象後のレトロウイル スベクターの構造および特性は、ウイルスのものとは全く似ていない。もちろん 、これは安全性の見地から非常に重要なことである。 これらのベクターシステムは、インビトロまたはインビボの何れかで、腫瘍ま たは正常細胞を感染させるのに用いることができる組換えウイルスを作成するの に使用し得るであろう。 精製または濃縮された組換えレトロウイルスは、まず組換えレトロウイルスを 含有する培地に、十分な量の調剤用緩衝液を添加することによって保存して、水 性懸濁液を形成させることができる。調剤用緩衝液は、水の中に糖質、高分子量 の構造添加物（structural additive）、および緩衝成分を含有する水溶液であ る。該水溶液は、一以上のアミノ酸を含有してもよい。 組換えレトロウイルスは、精製した形態で保存することもできる。より具体的 には、調剤用緩衝液を添加する前に、濾紙を通過させることによって上記の未精 製組換えレトロウイルスを清澄にした後、クロスフロー濃縮システム（Filtron Technology Corp.，Nortborough，MA）等によって濃縮してもよい。ある実施態 様では、該濃縮物にＤＮアーゼを添加して、外来ＤＮＡを消化する。次に、該消 化物を分別濾過（diafiltrate）して過剰な培地成分を除去し、より好ましい緩 衝化された溶液中に組換えレトロウイルスを確立させる。次に、該分別濾過物を セファデックスＳ-500ゲルカラムに通し、精製された組換えレトロウイルスを溶 出させる。成分が所望の最終濃度になり、且つ組換えレトロウイルスの希釈が最 小限になるように、該溶出液に十分な量の調剤緩衝液を加えた後、好ましくは-7 0℃で、または即座に乾燥させて水性懸濁液を保存する。上述したように、調剤 用緩衝液とは、水の中に糖質、高分子量の構造添加物、および緩衝成分を含有す る水溶液である。該水溶液は、一以上のアミノ酸も含有し得る。 未精製組換えレトロウイルスは、イオン交換カラムクロマトグラフィーによっ ても精製し得る。一般的には、未精製組換えレトロウイルスは、フィルターを通 過させることによって清澄にして、高度にスルホン化されたセルロースマトリッ クスを含有するカラムに該濾過液をかける。高い塩濃度の緩衝液を使用すること によって、組換えレトロウイルスをカラムから精製された型で溶出させる。次に 、分子排除カラムに該溶出液を通過させることによって、該高い塩濃度の緩衝液 を より好ましい緩衝液に交換する。次に、上述のように、精製された組換えレトロ ウイルスに十分量の調剤用緩衝液を添加し、水性懸濁液を即座に乾燥させるか、 または好ましくは-70℃で保存する。 未精製または精製された型の水性懸濁液は、凍結乾燥によって、または室温で の蒸発によって乾燥させることができる。具体的には、凍結乾燥にはガラス転移 温度以下、または該水性懸濁液の共融温度以下に水性懸濁液を冷却し、該冷却し た懸濁液から昇華によって水を除去して凍結乾燥したレトロウイルスを形成させ るステップが含まれる。一度凍結乾燥すれば、組換えレトロウイルスは安定であ り、以下でより詳細に議論されているように、-20℃〜25℃で保存し得る。 蒸発法では、水は室温で蒸発によって、水性懸濁液から除去される。水は、噴 霧乾燥によって除去することもできる。 前述したように、調剤に用いられる水溶液は、糖質、高分子量の構造添加物、 緩衝成分および水から構成されている。該溶液は、一以上のアミノ酸も含有し得 る。これらの成分の組み合わせは、凍結および凍結乾燥、または蒸発による乾燥 時に、組換えレトロウイルスの活性を保持するように作用する。 高分子量の構造添加物は、凍結時にウイルスが凝集するのを防ぐのに役立ち、 凍結乾燥または乾燥した状態において構造的な支持を与える。本発明においては 、構造添加物は、分子量が5,000を超える場合「高分子量」であると考える。好 適な高分子量構造添加物は、ヒト血清アルブミンである。アミノ酸が存在する場 合、さらに水性懸濁液の冷却および融解時に、ウイルスの感染性を保持するよう に機能する。またアミノ酸は、冷却した水性懸濁液を昇華する間および凍結乾燥 状態の間に、ウイルスの感性性が、さらに保持されるように機能する。 緩衝成分は、ｐＨを比較的一定に維持することによって、溶液を緩衝化するよ うに作用する。所望のｐＨ範囲（好ましくは7.0と7.8の間）によって、様々な緩 衝液を使用し得る。 組換えレトロウイルスを調剤するための水溶液は、ＷＯ-A2-96121014に詳細に 記載されている。 さらに、該水溶液は、調剤された最終的な組換えレトロウイルスを適切な等浸 透圧塩濃度に調節するために用いられる中性の塩を含有することが好ましい。 凍結乾燥された、または脱水されたレトロウイルスは、様々な物質を用いて、 再び溶液に戻すことができるが、水を用いて溶液に戻すことが好ましい。ある実 施例では、最終調剤を等張にする薄い塩溶液も用い得る。さらに、溶液に戻され たレトロウイルスの活性を増大させることが知られている成分を含有する水溶液 を用いることも有用であるかもしれない。このような成分には、ＩＬ-2のような サイトカイン、プロタミンサルフェートのようなポリカチオン、または該溶液に 戻されたレトロウイルスの形質導入効率を増加させる他の成分が含まれる。凍結 乾燥もしくは脱水された組換えベクターは、任意の適量の水で、または該凍結乾 燥もしくは脱水されたサンプルを実質的に、好ましくは完全に可溶化させること ができる、溶液に戻すための因子で溶液に戻してもよい。 組換えレトロウイルス粒子は、例えば、臓器などの部位中、または腫瘍部位を 含むきわめて様々な部位に投与し得る。他の実施態様では、組換えレトロウイル スは、経口、静脈内、頬／舌下、腹腔内、または皮下に投与し得る。一日の投与 量は、正確な投与様式、投与される形態、投与がなされる適応症、対象となる患 者、対象となる患者の体重、さらに担当医の選択および経験による。 本明細書に記載した投与経路は、針、カテーテル、または関連用具を用いる直 接的な投与によって、簡単に達成し得る。特に、ある本発明の実施態様では、一 以上の調剤を直接投与してもよい。 本発明のある実施態様では、パッケージング細胞は、カプセル内に封入されて いる。効果的な治療のためには、ウイルスを産生する細胞は、移植後、標的臓器 中で長期間生存しなければならず、この期間中ウイルスが製造されて、パッケー ジング細胞から放出されなければならない。それによって、ウイルスを産生する パッケージング細胞は、実際に、投与部位に位置する小さなウイルス産生工場に なるであろう。これによって、インビボで組み替えウイルスは効率的に供給され 得るであろう。あるいは、ヒト由来または他の動物種由来の正常な感染細胞を封 入または移植してもよく、腫瘍魂の近傍または内部に位置し得る小さなプロドラ ッグ変換工場となる。 該アプローチが長期間効率的であるためには、(1)（特に細胞が異なる種のも のである場合（レトロウイルスベクター産生細胞の場合には通常異なるが）には ） 通常ウイルス産生細胞または被感染細胞を除去するであろう宿主の免疫系から細 胞を保護すること、および(2)長期間、細胞がインシチュで生存すること（血管 形成が必要であろう）に依存する。 移植の前に、ウイルスを産生するパッケージング細胞を適切にカプセル化（半 透膜のミクロカプセル中に）することによって、移植されたパッケージング細胞 からベクターウイルスを継続的に産生することができることが見出された。さら に、このようなカプセルは宿主に良好に移植、血管形成され、宿主の免疫反応ま たは炎症反応を惹起しないことが見出された。カプセル膜の半透性とともに、こ れらの発見により、長期間レトロウイルスベクターをインビボで供給することが 可能となった。 ウイルスを産生するパッケージング細胞、およびウイルスに感染した細胞また は正常な細胞をセルロースベースの素材中にカプセル化するためのカプセル化技 術が開発されてきた。この技術を用いると、10¹⁰個の細胞、但し好ましくは10⁵ 〜10⁷個の細胞を電解質複合体（例えば、アルギネートおよびポリリシン、また はより好ましくは、セルロース硫酸およびポリジメチルジアリル塩化アンモニウ ム）、または他の多孔性構造物（ポリアミド、ポリスルホンなど）の中にカプセ ル化される。得られたカプセルは、0.01〜5mmの間の異なる直径を有し得るが、 好ましくは0.1〜1ｍｍである。従って、カプ七ルは異なる数の細胞を含有するよ うに作ることができる。カプセルは半透性で、ウイルスまたはプロドラッグ分子 を通過させ得る程度には大きいが、免疫系の細胞が前記細胞に近づくのを防ぐこ とによって、これらの細胞に対する免疫応答を著しく減らす程度には小さい孔を 有する。標準条件の湿度、温度、および二酸化炭素濃度で、通常の細胞培養液（ その性質は、カプセル化した細胞に依存する）中に、該カプセルおよびカプセル 化した細胞を採集する。 適切な期間培養した後（通常１時間以上で、30日を超えない）、カプセルを含 有している細胞は、直接またはシリンジを用いる注射の何れかによって、様々な 領域中に、外科的に移植することができる。 カプセル化した細胞を移植した後、種々の時間において、宿主をシクロフォス ファミドまたはイフォスファミドで、局所的または全身的に処置し得る。シトク ロムＰ450を発現するウイルスに感染した細胞は、これらのプロドラッグを、Ｄ ＮＡのアルキル化およびクロスリンクを生じせしめる活性な代謝物に転換する。 シトクロムＰ450遺伝子を担持し、発現している細胞（カプセル化された感染し た細胞、またはカプセル化されたパッケージング細胞など）もこの転換を触媒す るであろう。本発明のある実施態様では、これらのカプセル化された被感染細胞 またはパッケージング細胞は、ゆっくり分裂している細胞、またはマイトマイシ ンＣ、低量の放射線、もしくは細胞の複製を阻止する他の手段で処理された細胞 の何れかであり、それ故細胞がプロドラッグの毒性効果の影響を受けるのを防ぐ 。 以下の実施例では、本発明をさらに説明する。しかし、当業者には自明な変更 、およびさらに他の修飾および置換が明らかであろうが、これらの実施例は本発 明の範囲を限定することを意図するものではない。 実施例１ 本実施例は、ラットシトクロムＰ450 2Ｂ1遺伝子を含有する腫瘍内感染用のレ トロウイルス発現ベクターの構築を記載する。 図１に示されている発現ベクターｐＬＸ2Ｂ1は、プラスミドｐＬＸ125および ｐＳＷ1（Kedzie，K．M.，Escobar，G．Y.，Grimm，S．W.，He，Y．A.，Pepperl ，D．J.，Regan，J．W.，Stevens，J．C.，およびHalpert，J．R．(1991)，J．B iol．Chem．266(33):2215-2）から得られた断片を連結することによって構築し た。ｐＬＸ125は、ＰＣＴ/ＥＰ96/04447に記載されているように調製した。 ＨｐａＩでプラスミドｐＬＸ125を直鎖状にして、ウシ腸フォスファターゼを 用いて、生じた平滑末端を脱リン酸化した。１％のアガロースゲル上で分離して 、切りだし、Qiaquickプロトコール（Qiagen）を用いて調製することによって該 ＤＮＡを精製した。エタノールで沈殿させた後、ＤＮΛを再び水に戻した。 SmaIおよびHincIIでクローニングベクターｐＳＷ1を消化して、平滑末端化さ れた二つの断片を得た。消化混合物は、１％のアガロースケル上で分離した。ラ ットシトクロムＰ450 2Ｂ1 ｃＤＮＡ（FuJi-KurIyama，Y，Mizukaml，Y．et al( 1982)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79:2793-2797）を含有する最も短い断片（ 1.5kb）を切りだし、Qiaquick ＤＮＡ抽出プロトコールを用いて溶出し、エタノ ール沈殿して、再び水に戻した。 7.6fmolのｐＬＸ125、および24fmolのｐＳＷ1のＳｍａＩ/ＨｉｎｄＩＩ断片を 混合して、Ｔ4リガーゼ（Boehringer）を用いて、12℃で３日間ライゲーション を行った。65℃でリガーゼを10分間不活性化させ、10倍量のブタノールでＤＮＡ をブタノール沈殿させた。該沈殿させたＤＮＡを水に戻して、ＤＨ10Ｂ-bacteri a（Gibco）中へエレクトロポレーションを行った。アンピシリン耐性コロニーを 選択して、ＤＮＡを調製し、ＳｓｐＢＩ/ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ/ＳｓｐＢＩ,Ｐ ｖｕｌおよびＢａｍＨＩで試験消化した。正しい最終のプラスミドをｐＬＸ2Ｂ1 と名付けた（図１参照）。 リポフェクション リポフェクションの一日前に、3×10⁶個のレトロウイルスパッケージング細胞 ＰＡ317（Miller，A.D.およびButtlmore，C.(1986)，Mol．Cell．Biol．6:2895- 2902）を10cmのペトリ皿または培養皿に播種した。感染の日に、４μｇのｐＬＸ 2Ｂ1を300μＬの無血清培地と混合した。平行して、45μＬのリポフェクタミン （Lipofectamine；Gibco BRL）を300μＬの無血清培地に混合した。プラスミド を含有する該溶液をリポフェクタミン−ミックスに添加して、45分間インキュベ ートした。35分後、細胞を6ｍＬの無血清培地で一度洗浄し、2.4ｍＬの無血清培 地をリポフェクタミン−ミックスに添加し、得られた1ｍＬを調製した細胞上に 加えた。５時間後、20％のＦＣＳを含有する3.5ｍＬのダルベッコの修正イーグ ル培地を添加した。次の日、該細胞をトリプシン消化して、1:20に希釈し、100 ｍｍの皿に播種した。24時間後、該培地をネオマイシン類縁体Ｇ418を含有する 培地に代えた。細胞群を単離して、シトクロムＰ450の発現を分析した。 これらの細胞群の上清を用いて、標的ＣＫ細胞に感染させた。5×10⁶個の細胞 からの上清を含有する1ｍＬのウイルスを0.45μｍのフィルターを通して濾過し 、８μｇ/ｍＬのポリブレン（polybrene）存在下で、1×10⁶個の標的ＣＫ細胞に 添加した。４時間後、10％のウシ胎児血清を含むダルベッコの修正イーグル培地 ｍＬを添加した。 翌日細胞をトリプシン処理して、希釈し、24時間後に、さらに400μｇ/ｍＬの Ｇ418を含有する選択培地中に加えた。２週間後、Ｇ418耐性コロニーを単離して 、シトクロムＰ450 2Ｂ1活性の試験を行った。2×10⁴個の細胞を3ｃｍの皿の上 に播種して、0〜5ｍＭの異なる濃度のイフォスファミドに晒した。対照、非感染 細胞 に比べて、シトクロムＰ450 2Ｂ1レトロウイルスに感染した細胞の感度が高いこ とが観察された。 カプセル化 得られたレトロウイルスベクターを産生するパッケージング細胞をＷＯ97/013 57の実施例２に記載されているようにカプセル化する。 移植 得られたカプセルは、「鍵穴（"key hole"）」手術によって、移植した、また は自然発生したＢＡＬＢ/cまたはＧＲマウスの腫瘍の近傍または腫瘍中に導入す る。直径1ｍｍの約６個のカプセルを各手術部位に挿入する。手術部位を一縫合 によって閉じる。次に20mg/mLを100μＬ直接腫瘍内に注射することによって局所 的に、または全身濃度がkg体重当たり130mgのCPAおよびkg体重当たり40〜60mgの ＩＦＯを腹腔内に注射することによって、最長10週間シクロフォスファミドまた はイフォスファミドでマウスを処置する。この間、腫瘍のサイズおよび肉眼的な 外観を毎日モニターする。その後、マウスを殺して、挿入したカプセルを含有す る組織および腫瘍を取り出し、光学顕微鏡および電子顕微鏡用の組織学的切片を 調製する。これらの切片は、カプセルが良好に移植され、血管が形成されている ことを明確に示し、細胞性免疫応答の指標であるリンパ球が存在している様子は 全くない。これらの切片は、カプセル中の細胞が死亡または壊死している徴候も 示さない。対照的に腫瘍は壊死を示し、試験期間後、明らかに肉眼的にサイズが 縮小していた。 実施例２ 本実施例は、構成的にラットシトクロムＰ450 2Ｂ1を発現する安定な細胞株の 構築について記載する。 プラスミドｐｃＤＮＡ3(Invitrogen)およびｐＳＷ1(Kedzie，K．M.，Escobar ，G．Y.，Grimm，S．W.,He，Y．A.，Pepperl，D．J.，Regan，J．W.，Stevens， J．C.，およびHalpert，J．R．(1991)，J．Biol．Chem．266(33):2215.21)から 得られた断片を連結することによって発現ベクターpc3/2Ｂ1を構築した。 ＸｈｏＩ/ＸｂａＩでプラスミドｐｃＤＮＡ3を消化して、ウシ腸フォスファタ ーゼを用いて、生じた付着末端化された断片を脱リン酸化した。1％のアガロー スゲル上で分 離して、切りだし、Qiaquickプロトコール（Qiagen）を用いて調製することによ って該ベクターバックボーンのＤＮＡを精製した。エタノールで沈殿させた後、 ＤＮＡを再び水に戻した。 ＸｈｏＩおよびＸｂａＩでクローニングベクターｐＳＷ1を消化して二つの断 片を得た。消化混合物を1％のアガロースゲル上で分離した。ラットシトクロム Ｐ450 2Ｂ1ｃＤＮＡ(Fuji-Kuriyama，Y，Mizukami，Y．et al(1982)，Proc．Nat l．Acad．Sci．ＵＳＡ79:2793-2797)を含有する最も短い断片（1.5kb）を切りだ し、Qiaquick ＤＮＡ抽出プロトコールを用いて溶出し、エタノール沈殿して、 再び水に戻した。 8.3fmolのｐｃＤＮＡ3バックボーン、および24.8fmolのｐＳＷ1のＸｈｏＩ/Ｘ ｂａＩ断片を混合して、Ｔ4リガーゼ（Boehringer）を用いて、12℃で１日間、 ライゲーションを行った。65℃でリガーゼを10分間不活性化させ、10倍量のブタ ノールでＤＮＡをブタノール沈殿させた。該沈殿させたＤＮＡを水に戻して、Ｄ Ｈ10Ｂ-bacteria（Gibco）中へのエレクトロポレーションを行った。アンピシリ ン耐性コロニーを選択して、ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｅｃｏ ＲＶおよびＸｈｏＩで試験消化した。正しい最終プラスミドをpc3/2Ｂ1と名付け た。 リポフェクション リポフエクションの日の前に、3×10⁶個のネコの腎臓細胞を100ｍｍの皿に播 種した。トランスフェクションの日に、４μｇのpc3/2Ｂ1を100μＬの無血清培 地と混合した。平行して、15μＬのリポフェクタミンを100μＬの無血清培地に 混合した。プラスミド含有溶液をリポフェクション−ミックスに添加して、45分 間インキュベートした。35分後、細胞を2ｍＬの無血清培地で一度洗浄し、800μ Ｌの無血清培地をリポフェクタミン−ミックスに添加し、得られた1ｍＬを調製 した細胞上に加えた。６時間後、10％のＦＣＳを含有する1ｍＬのＤＭＥＭ（Glu tamax）を添加した。次の日、該細胞をトリプシン消化して、10倍希釈し、100mm の皿に播種した。24時間後、該培地をネオマイシン培地に代えた。14日後、ネオ マイシン耐性クローンを単離して、ベクターの存在および活性について試験した 。 シトクロムＰ450を発現しているネコの腎臓細胞は、野生型細胞に比べて、イ フォスファミドまたはシクロフォスファミドに対して10倍高い感度を示した。 ネコの腎臓野生型細胞のみならず、膵臓腫瘍由来のＲｉｎ5細胞に対するバイ スタンダー効果を実証することができた。これは、シトクロムＰ450 2Ｂ1ネコ腎 臓細胞クローンを非産生ネコ腎臓野生型細胞またはＲｉｎ5ラット膵臓腫瘍由来 細胞の何れかとともに共培養し、イフォスファミドを添加することによって示さ れた。非生産ＣＫおよびＲｉｎ細胞は、シトクロムＰ450 2Ｂ1ネコ腎臓細胞によ って産生され、放出されるイフォスファミドの毒性代謝物によって死滅する。あ るシトクロムＰ450 2Ｂ1ネコ腎臓細胞クローンを用いる滴定実験により、0.25ｍ Ｍという低量のイフォスファミドがこれらの細胞に特異的な毒性効果を引き起こ し、1〜2ｍＭで全ての細胞が死滅することが示された。PCR分析によって、シト クロムＰ450 2Ｂ1ネコ腎臓細胞クローンがＰ450 2B1遺伝子構築物ＤＮＡを獲得 したことが示された。さらに、シトクロムＰ450 2Ｂ1による7-ペントキシレゾル フィン（7-pentoxyresorufin）の酵素的脱アルキル化を用いて、さらに該クロー ンの生化学的分析を行ったところ、該遺伝的に改変された細胞がシトクロムＰ45 0 2Ｂ1を産生していることが明らかとなった。 これらの細胞を含有するカプセルは、実施例１に記載したように、マウスの腫 瘍部位の近傍に移植した。シクロフォスファミドまたはイフォスファミドで処理 した後、上述のように処置の効力を評価した。 ラットシトクロムＰ450-2B1をコードする遺伝子を含有するレトロウイルス発 現ベクターは、以下の実施例４に記載されているように調製することもできる。 実施例３ まず、制限酵素ＸｈｏＩで、プラスミドｐＬＸ125を部分消化して、3547位で 直鎖状になっているベクターを作る。該直鎖状のプラスミドをさらに、制限酵素 ＳｓｐＢＩで消化して、ｐＬＸ125のポリリンカー中の短い断片を除去した。調 製用ゲルでは、正しく切断されたベクター断片は、最大のバンドとして現れた。 Quiaex protocol（Qiagen）を用いて、該バンド中のＤＮＡをゲルから溶出して 、精製した。 ラットシトクロムＰ450 2Ｂ1遺伝子を作成するために、溶液Ｄ（4Ｍグアニジ ウムチオシアナート、25ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ7、0.5％Ｎ-ラウリルサル コシンナトリウム、0.1Ｍ 2-メルカプトエタノール）で、ラット肝臓癌細胞株Ｈ ＴＣの細胞を溶解させ、水を飽和させた同量のフェノールおよび1/5量のクロロ フォ ルム／イソアミルアルコール（49:1）中の1/15量の3Ｍ酢酸ナトリウムを添加す ることによって抽出した全ＲＮＡを加えて、混合物全体を激しく混ぜ合わせた。 15分氷上に置いた後、該抽出物を20分、4℃、10,000gで遠心した。等量のイソプ ロパノールにより、水相中のＲＮＡを-20℃で30分間沈殿させ、4℃、10,000gで 遠心した。該沈殿を70％エタノール中で洗浄し、15分間室温に放置した。4℃、1 0,000gで５分遠心した後、沈殿を真空乾燥機中で乾燥して、0.5％のＳＤＳ溶液 中に再び溶解させた。 ｃＤＮＡ合成のプロトコール（Pharmacia）を用いて、抽出したＲＮＡを逆転 写した。生じたｃＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして用いた。プライマーは、 左側のプライマー（5'-ＡＡＧＣＣＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＧＣＡ Ｃ-3'）中にＳｓｐＢＩ制限部位(下線)が含まれ、右側のプライマー(5'-ＣＧＡ ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＡ-3')中にＸｈｏＩ部位（下線 ）が含まれるようにデザインした。両プライマーには、適切な制限酵素によって 高い効率で切断されるように、5'末端に塩基を付加した。1562bpの産物をＸｈｏ ＩおよびＳｓｐＢＩで消化して、三つの断片を得た。 シトクロムＰ450の遺伝子を含有する該最長の断片（1545bp）をＸｈｏＩ/Ｓｓ ｐＢＩで消化したプラスミドｐＬＸ125に連結した。 2Ｂ1型ラットシトクロムＰ450を構成的に発現する安定な細胞系は、以下の実 施例５に記載されているように調製することもできる。 実施例４ 2Ｂ1型ラットシトクロムＰ450からｍＲＮＡを作成するために、４週齢の雌の ラットを殺して、肝臓を取り出し、液体窒素に入れて即座に凍結させた。凍結さ せた肝臓を、滅菌、濾過したＧＴＣ緩衝液（6Ｍグアニジウムイソチオシアナー ト、5ｍＭクエン酸ナトリウム、0.1Ｍ 2-メルカプトエタノール、0.5％Ｎ-ラウ リルサルコシルナトリウム）中に入れ、室温でホモゲナイズした。ＲＮＡを単離 するために、肝臓抽出物を塩化セシウム（5.7Ｍ塩化セシウム、0.1Ｍ ＥＤＴＡ ）のクッション上に置いて、20℃、32,000rpmで一晩スウィング−アウトロータ ーの中で遠心した。上清を完全に除去した後、沈殿したＲＮＡを氷冷した10ｍＭ Tris ｐＨ7.5の中に再溶解し、-20℃で一晩、1/15倍量の3Ｍ酢酸ナトリウムお よび2.5倍量のエタノールで沈殿させた。ＲＮＡを8000rpm、４℃で40分間回転し て沈降させ、乾燥した 沈殿を滅菌した水に再懸濁した。 ｃＤＮＡ合成のプロトコール（Pharmacia）を用いて、該抽出したＲＮＡを逆 転写した。得られたｃＤＮＡを以下のＰＣＲのテンプレートとして用いた。プラ イマーは、左側のプライマー（5'-ＣＧＴＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＴＴ ＣＡＧＣＡＴ-3'）中にＥｃｏＲＩ制限部位(下線)が含まれ、右側のプライマー( 5'-ＡＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＡ-3')にＥｃｏＲＶ Ｉ部位が含まれるようにデザインした。両プライマーには、切断酵素が高い効率 となるように、5'末端に塩基を付加した。1588bpの増幅産物をＥｃｏＲＩおよび ＥｃｏＲＶで消化して、三つの断片を得た。 シトクロムＰ450の遺伝子を含有する該最長の断片（1572bp）をＥｃｏＲＩお よびＥｃｏＲＶで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ3（Invitrogen）に連結した。 実施例５ ＷＡＰプロモーターの転写制御下にあるラットシトクロムＰ450遺伝子を含有 するProConベクターの構築 ｃＤＮＡ合成のプロトコール（Pharmacia）を用いて、実施例４で調製された 抽出したＲＮＡを逆転写した。得られたｃＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして 用いる。プライマーは、左側のプライマー（例えば、5'-ＡＡＧＣＣＧＧＡＴＣ Ｃ ＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＧＣＡＣ-3'）中にＢａｍＨＩ制限部位（下線）が含 まれ、右側のプライマー（例えば5'-ＣＧＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣ Ａ-3'）にＢａｍＨＩ部位（下線）が含まれるようにデザインした。適切な制限 酵素によって高い効率で切断されるように、両プライマーには5'末端に塩基を付 加した。1562bpの産物をＢａｍＨＩで消化して、シトクロムＰ450の遺伝子を含 有する得られた断片をＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＷＡＰ.6に連結した（ ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ/ＥＰ96/03922参照）。 シトクロムＰ450の遺伝子を含有する該最長の断片（1572bp）をＥｃｏＲＩお よびＥｃｏＲＶで消化した1588bpの増幅産物に連結した

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年４月１６日（１９９８．４．１６） 【補正内容】 請求の範囲 １．シトクロムＰ450産生細胞を封入しているカプセルであって、前記細胞に よって産生されたシトクロムＰ450を通過させ得る多孔性の膜を具備するカプセ ル。 ２．請求項１に記載のカプセルであって、カプセル素材がセルロース硫酸およ びポリジメチルジアリルアンモニウムによって形成された複合体から構成されて いるカプセル。 ３．請求項１または２に記載のカプセルであって、前記シトクロムＰ450産生 細胞が実施例２で記載したように調製されたベクターを具備するカプセル。 ４．請求項１または２に記載のカプセルであって、前記シトクロムＰ450産生 細胞がシトクロムＰ450遺伝子を担持するレトロウイルスベクターを具備するパ ッケージング細胞株であって、該パッケージング細胞株が前記レトロウイルスベ クターをパッケージするのに必要なタンパク質をコードするレトロウイルスまた は組換えレトロウイルス構築物を少なくとも一つ含有するカプセル。 ５．請求項４に記載のカプセルであって、前記レトロウイルスベクターが複製 欠損であるカプセル。 ６．請求項４または５に記載のカプセルであって、前記レトロウイルスベクタ ーがＵ3-Ｒ-Ｕ5構造の5'ＬＴＲ領域；少なくとも一つのコード配列がシトクロム Ｐ450をコードしているコード配列および非コード配列から選択された一以上の 配列；および完全または部分的に欠失したＵ3領域であって、ポリリンカーによ って置換され、ＲおよびＵ5領域が続いている欠失したＵ3領域を具備する'LTR領 域を具備するカプセル。 ７．請求項４〜６の何れか１項に記載のカプセルであって、前記シトクロムＰ 450遺伝子が標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーターまたはＸ線誘導性 プロモーターの転写調節下にあるカプセル。 ８．請求項４〜７の何れか１項に記載のカプセルであって、前記レトロウイル スベクターが実施例１または３に記載されているように調製されたベクターであ るカプセル。 ９．請求項１〜８の何れか１項に記載のカプセルを具備する薬学的組成物。 １０．癌疾患または他の任意の適当な疾患または疾病を治療するために使用さ れる請求項１〜８の何れか１項に記載のカプセル。 １１．腫瘍細胞を除去するのに有用な薬学的組成物を産生するための請求項１ 〜８の何れか１項に記載のカプセルの使用。 １２．癌疾患または他の任意の適当な疾患または疾病を治療する方法であって 、治療的有効量の請求項１〜８の何れか１項に記載のカプセルおよびシトクロム Ｐ450によって活性化されるプロドラッグを同時にまたは時間を隔てて、本法を 必要とする患者に投与することを具備する方法。 １３．請求項１２に記載の方法であって、標的細胞内および／または標的細胞 部位に注射および／または移植することによって前記カプセルを投与し、プロド ラッグを全身および／または局所的に投与する方法。 １４．請求項１２または１３に記載の方法であって、前記標的細胞が乳癌およ び／または膵臓癌の細胞である方法。 １５．請求項１２〜１４の何れか１項に記載の方法であって、前記プロドラッ グがシクロフォスファミドおよび／またはイフォスファミドである方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/50 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ギュンツブルク、バルター・ハー オーストリア国、アー―2340 メートリン ク、ベイプレヒトガッセ 10 (72)発明者 カルレ、ペーター ドイツ連邦共和国、デー―90425 ニュル ンベルク、レルヒェンシュトラーセ 115 (72)発明者 ザラー、ローベルト・ミヒャエル ドイツ連邦共和国、デー―80636 ミュン ヘン、ユーラシュトラーセ 22

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはＸ線誘導性プロ モーターの転写調節下にあるシトクロムＰ450遺伝子を担持する複製欠損レトロ ウイルスベクター。 ２．請求項１に記載の複製欠損レトロウイルスベクターであって、該ベクター がＵ3-Ｒ-Ｕ5構造の5'ＬＴＲ領域；コード配列および非コード配列から選択され た一以上の配列；および完全または部分的に欠失したＵ3領域であって、標的細 胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはＸ線誘導性プロモーターを含 有するポリリンカー配列によって置換され、ＲおよびＵ5領域が続いている3'Ｌ ＴＲ領域を具備し、少なくとも一つのコード配列がシトクロムＰ450をコードし ていることを特徴とする複製欠損レトロウイルスベクター。 ３．請求項１または２に記載の複製欠損レトロウイルスベクターであって、標 的細胞特異的な制御要素またはプロモーターが、ＷＡＰ、ＭＭＴＶ、β−ラクト グロブリンおよびカゼイン特異的制御要素およびプロモーター、炭酸脱水酵素II およびβ−グルコキナーゼ制御要素およびプロモーターを含む膵臓特異的な制御 要素およびプロモーター、免疫グロブリンおよびＭＭＴＶリンパ球特異的制御要 素およびプロモーターを含むリンパ球特異的な制御要素およびプロモーター、グ ルココルチコイドホルモンに対する応答性を与えるかまたは乳腺に対して発現を 指令するＭＭＴＶ特異的な制御要素およびプロモーターからなる群の一以上の要 素から選択される複製欠損レトロウイルスベクター。 ４．請求項１〜３の何れか１項に記載の複製欠損レトロウイルスベクターであ って、前記ＬＴＲ領域が、ＭＬＶ、ＭＭＴＶ、ＭＳＶ、ＳＩＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬ Ｖ、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＢＬＶ、およびＭＰＭＶのＬＴＲからなる群の少なくと も一つの要素から選択されている複製欠損レトロウイルスベクター。 ５．請求項１〜４に記載の複製欠損レトロウイルスベクターであって、前記レ トロウイルスベクターがＢＡＧベクターまたはｐＬＸＳＮベクターをベースとす る複製欠損レトロウイルスベクター。 ６．請求項５に記載の複製欠損レトロウイルスベクターであって、前記レトロ ウイルスベクターが実施例１の記載のように調製されたｐＬＸ2Ｂ1である複製欠 損 レトロウイルスベクター。 ７．請求項５に記載の複製欠損レトロウイルスベクターであって、前記レトロ ウイルスベクターが実施例２の記載のように調製されたpc3/2Ｂ1である複製欠損 レトロウイルスベクター。 ８．請求項１〜５の何れか１項に記載の複製欠損レトロウイルスベクターであ って、レトロウイルスの組込みに関与するレトロウイルス配列が改変され、また は少なくとも部分的に欠失している複製欠損レトロウイルスベクター。 ９．請求項１に記載の複製欠損レトロウイルスベクターであって、前記制御要 素またはプロモーターがトランス作用分子によって調節され得る複製欠損レトロ ウイルスベクター。 １０．請求項１〜９に記載の複製欠損レトロウイルスベクターをトランスフェ クトしたパッケージング細胞株であって、該パッケージング細胞株が、前記レト ロウイルスベクターをパッケージするために必要なタンパク質をコードするレト ロウイルスまたは組換えレトロウイルス構造物を少なくとも一つ含有しているパ ッケージング細胞株。 １１．請求項１０に記載のパッケージング細胞株であって、該パッケージング 細胞株が謡歯類、イヌ、ネコ、またはヒト由来であり、ヒト組織と組織適合性が あるパッケージング細胞株。 １２．請求項１０に記載のパッケージング細胞株であって、パッケージング細 胞株がpsi-2、psi-Crypt、psi-ＡＭ、ＧＰ+Ｅ-86、ＰＡ317、およびＧＰ+envＡ Ｍ-12からなる群から選択されるパッケージング細胞株。 １３．請求項１０〜１２の何れか１項に記載のパッケージング細胞株を適切な 条件下で培養した後、産生された組換えレトロウイルス粒子を任意に単離するこ とにより産生される組換えレトロウイルス粒子。 １４．請求項１３に記載の組換えレトロウイルス粒子を具備する薬学的組成物 。 １５．請求項１０〜１２の何れか１項に記載のパッケージング細胞株を具備す る薬学的組成物。 １６．パッケージング細胞株によって産生された組換えレトロウイルス粒子 を通過させることができる多孔性の膜に封入された請求項１０〜１２の何れか１ 項に記載のパッケージング細胞株。 １７．セルロース硫酸およびポリジメチルジアリルアンモニウムによって形成 された複合体中に封入されている請求項１６に記載のパッケージング細胞株。 １８．請求項１３に記載の組換えレトロウイルス粒子、請求項１０〜１２に記 載のパッケージング細胞株、または請求項１６〜１７の何れか１項に記載の封入 されたパッケージング細胞株、およびシトクロムＰ450によって活性化される癌 のプロドラッグを同時にまたは時問を隔てて、本方法を必要としている患者に治 療的有効量投与することを具備する腫瘍細胞の除去法。 １９．前記腫瘍細胞が乳癌または膵臓癌細胞である請求項１８に記載の方法。 ２０．癌のプロドラッグがシクロフォスファミドまたはイフォスファミドであ る請求項１８に記載の方法。 ２１．組換えレトロウイルス粒子、パッケージング細胞株、もしくは封入され たパッケージング細胞株を注射によって、または腫瘍中もしくは腫瘍部位に移植 することによって投与し、且つ癌のプロドラッグを全身または局所的に投与する 請求項１８〜２０に記載の方法。 ２２．腫瘍細胞を除去するのに有用な薬学的組成物を調製するための請求項１ ３に記載の組換えレトロウイルス粒子、請求項１０〜１２の何れか１項に記載の パッケージング細胞株、または請求項１６〜１７の何れか１項に記載の封入され たパッケージング細胞株の使用。 ２３．標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはＸ線誘導性プ ロモーターの転写調節下にあるシトクロムＰ450遺伝子を担持する、ヒトケノム 中に組み込まれたレトロウイルスプロウイルス。 ２４．標的細胞特異的な制御要素もしくはプロモーター、またはＸ線誘導性プ ロモーターの転写調節下にあるシトクロムＰ450遺伝子を含有するヒト細胞。