NO325392B1 - Kapsel som innkapsler et cytokrom P450 uttrykkende gen, farmasoytisk preparat som inneholder kapselen og anvendelse av kapselen til fremstilling av et medikament - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører kapsel som innkapsler en celle som uttrykker et cytokrom P450-gen som er i stand til å omdanne uskadelige cancer promedikamenter til cytotoksiske metabolitter, farmasøytisk blanding som omfatter kapselen og anvendelse av kapselen til å fremstille en farmasøytisk sammensetning.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Anti-cancer medikamentene som anvendes til behandling av tumorer blir i de fleste tilfeller anvendt systemisk og sprer seg gjennom hele pasientens legeme. Den høye systemiske dose av slike medikamenter som kreves for kreftbehandling, medfører ubehagelige bivirkninger for pasienten.

I et forsøk på å omgå dette problem er det blitt anvendt cancer promedikamenter som må metaboliseres eller aktiveres i legemet før de blir cytotoksiske. Uheldigvis forekommer det sjeldent menneskelige tumorer som inneholder et hensiktsmessig høyt nivå av de aktiverende enzymer. Hovedsetet for aktivering av promedikamenter er leveren, og for å sikre at en tumor på et fjernt sted får en tilstrekkelig dose av det aktiverte medikament, må mengden av aktivert promedikament fremstilt i leveren være ganske høyt, og dette fører igjen til toksiske bivirkninger for pasienten.

En strategi hvorved disse problemer med høy systemisk konsentrasjon av aktiverte medikamenter kunne omgås, ville være å tilveiebringe midler for aktivering av promedikamentet direkte i eller nær setet for tumoren. Denne strategi ville kreve at tumorceller, eller celler på tumorstedet genetisk blir omdannet til å fremstille høye mengder av enzymene som kreves for metabolisering av cancer promedikamentene. Retrovirusvektorer er ideelt egnet for stabil avgivelse av gener til celler, siden retrovirus er i stand til å integrere DNA-formen av sitt genom i vertscellens genom, og således vil alle datterceller av en infisert celle bære den retrovirusvektor som har det terapeutiske gen. En ytterligere fordel er at de fleste retrovirus bare infiserer celler som deler seg, og de er derfor ideelle genavgivelsesbærere for tumorceller.

Flere forskjellige cytotoksiske gener som bæres av retrovirusvektoren er allerede blitt testet. Disse gener koder for enzymer som omdanner substanser som er farmakodynamisk og toksikologisk inerte endog ved høyt dosenivå, men som kan omdannes in vivo til svært aktive metabolitter (Connors, T.A. (1995), Gene Therapy 2: 702-709).

I kreftkjemoterapi er hensiktsmessige utformede promedikamenter blitt funnet å være effektive til behandling av dyretumorer som har høyt nivå av et aktiverende enzym (Connors, T. og Whisson, M. (1966), Nature 210: 866- 867 og Cobb, L. et al (1969), Biochemical Pharmacology 18: 1519-1527). Kliniske resultater var imidlertid skuffende, siden det ble funnet at humane cancere som inneholdt hensiktsmessig høyt nivå av aktiverende enzymer var sjeldne (Connors, T. (1986), Xenobiotica 16: 975-988). Viralt rettet enzym promedikamentterapi (VDEPT: Virally directed enzyme prodrug therapy) og den mer generelle genrettede enzym promedikamentterapi (GDEPT: gene directed enzyme prodrug therapy) er beslektet med hverandre ved at de også tar sikte på å ødelegge tumorceller ved den tumorspesifikke aktivering av et promedikament. I dette tilfellet vil imidlertid det gen som koder for enzymet, være enten spesifikt målrettet mot ondartede celler eller være under kontroll av en spesifikk promoter.

Inntil nå har det meste av anstrengelsene rettet mot promedikament-terapi vært konsentrert om anvendelse av human Herpes simplex virus tymidinkinase (HSV-tk) som selvmordsgen. Selv om HSV-tk enzymet i kombinasjon med promedikamentet ganciklovir (GSV) er blitt anbefalt som et godt system for GDEPT (Culver, K. et al., (1992), Science 256: 1550-1552, Ram, Z. et al., (1993), Cancer Research 53: 83-88 og Chen, S., Shine, H. et al., (1994), Proe. Nati. Acad. Sei. 91; 3054-3057) er det mange teoretiske betraktninger som ville antyde at det på ingen måte er den beste kombinasjon. For det første er det et S-fase spesifikt middel uten noen effekt på hvilende celler. Dette er fordi GCV monofosfatet er kortlivet og må være til stede når cellene kommer inn i S-fasen for å gi en toksisk effekt. HSV-tk vil fosforylere GCV til monofosfatformen (en reaksjon kan ikke gjennomføres av pattedyrenzymer) som deretter fosforyleres av cellulære enzymer til trifosfatformen og inkorporeres i DNA. For det andre vil det aktive medikament være et trifosfat og ville ikke bli ventet å diffundere fritt for å forårsake en tilskuereffekt. En tilstedeværeeffekt er imidlertid blitt observert både in vito og in vivo selv om metabolisk samarbeid synes å være involvert, og i sistnevnte tilfelle kan noe av effekten være en indirekte effekt som involverer en immun komponent (Bi, W., Parysek, L. et al., (1993), Human Gene Therapy 4: 725-731, Vile, R. og Hart, I.

(1993), Cancer Research 53: 3860-3864 og Freeman, S., Abboud, C. et al., (1993), Cancer Research 53: 5274-5283). En ulempe er at tilstedeværeeffekten er avhengig av celle-celle kontakt. Dette kan skyldes tilstedeværelsen av gapforbindelser dannet ved intim kontakt mellom de transduserte og de omgivende celler som muliggjør overføring av fosforylert ganciklovir.

Interessante resultater er nylig blitt rapportert med celler som er blitt transfektert med genet som koder for rotte cytokrom P450 formen 2B1 og deretter behandlet med cyklofosfamid (Chen. S., Shine. H. et al. (1994), Proe. Nati. Acad. Sei. 91: 3054-3057).

Det er derfor en hensikt å tilveiebringe nye promedikamenter uten ovennevnte ulemper. Denne hensikt er oppnådd ved foreliggende oppfinnelse, kjennetegnet av det som fremgår av de vedlagte krav.

Det er således et formål i følge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe kapsler som innkapsler en celle som uttrykker et gen som koder for cytokrom P450 under transkriptsjonskontroll av et målcellespesifikt regulatorisk element eller promoter, eller en røntgenstråle-induserbar promoter, og som transfekteres inn i pakningscellelinjer for de produserende rekombinante retroviruspartikler anvendelige for genterapi av forskjellige krefttyper.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse omfatter således blant annet følgende:

Kapsel som innkapsler en celle som uttrykker et cytokrom P450-gen overført inn i nevnte celle, som omfatter en porøs membran som omgir nevnte cytokrom P450 uttrykkende celle, hvor nevnte porøse membran er permeabelt for promedikamentmolekyler som passerer igjennom og inn i kapselen, hvor nevnte promedikamentmolekyler blir konvertert til den aktive metabolitt med cytokrom P450 uttrykt av nevnte celle;

Kapsel hvor kapselmateriale omfatter et kompleks dannet av cellulosesulfat og polydimetyldiallylammoniumklorid;

Kapsel hvor nevnte cytokrom P450-produserende celle er en stabil cellelinje som uttrykker cytokrom P450 konstitutivt;

Kapsel som angitt ovenfor til anvendelse ved behandling av en kreftsykdom;

Kapsel hvori en terapeutisk effektiv mengde av kapselen blir administrert, enten samtidig eller med en tidsforsinkelse, med et promedikament som blir aktivert av cytokrom P450;

Kapsel som blir administrert ved injeksjon og/eller ved implantering i målcellene og/eller på stedet derav, og at promedikamentet blir administrert systemisk og/eller lokalt;

Kapsel som angitt ovenfor hvor målcellene er celler av brysttumorer og/eller pankreastumorer;

Kapsel hvor promedikamentet er cyklofosfamid og/eller ifosfamid;

Farmasøytisk blanding som omfatter kapselen som angitt ovenfor;

Farmasøytisk sammensetning ytterligere omfatter et promedikament som blir aktivert av cytokrom P450;

Farmasøytisk sammensetning hvori kapslene og promedikamentet blir formulert i forskjellige former;

Farmasøytisk sammensetning som omfatter kapselen i formen som er egnet for injeksjon og/eller implantasjon i mål organene og/eller ved siden av nevnte målorgan, og promedikamentet i en form som er egnet for systemisk og/eller lokal administrering;

Farmasøytisk sammensetning som omfatter kapslene i en form som er egnet for innplantasjon i og/eller ved siden av brystkreftvev eller pankreatisk kreftvev;

Farmasøytisk sammensetning som omfatter cyklofosfamid og/eller ifosfamid som promedikament.

Kapsel som angitt ovenfor og et prolegemiddel som blir aktivert av cytokrom P450, for anvendelse til behandling av en kreftsykdom;

Anvendelse av kapselen som angitt ovenfor til å fremstille en farmasøytisk sammensetning som er nyttig for fjerning av tumorceller;

Anvendelse av kapselen som angitt ovenfor og et legemiddel som blir aktivert med cytokrom P450 til å fremstille en farmasøytisk sammensetning.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Cytokrom P450 danner en bred gruppe av monooksygenaser som katalyserer oksidasjonen av et bredt område av substrater. De produseres av noen bakterier, gjærtyper og av høyere organismer, hvor de spiller en rolle ved detoksifisering av xenobiotika, bioaktiveringsreaksjoner, og metabolisme av forskjellig endogene forbindelser.

Cytokrom P450 katalyserer hydroksylering av de vanlig anvendte cancer-promedikamenter cyklofosfamid (CPA) og ifosfamid til sine aktive toksiske former. Normalt vil ekspresjonen av pasientens endogene cytokrom P450-gen være begrenset til leveren, og antitumoreffekter av systemisk anvendte CPAer vil være avhengig av den påfølgende systemiske fordeling av toksiske medikamentmetabolitter fra leveren. Dette har ført til toksisitetsproblemer, siden det aktiverte medikament ikke bare påvirker tumoren, men også påvirker andre normale pasientvev så som benmarg og nyrer.

En terapeutisk tilnærming hvor cytokrom P450-genet blir selektivt innført direkte i tumorcellene, og overuttrykt i disse celler ville omgå dette problemet. Toksiske metabolitter fremstilt fra de transduserte tumorceller vil påvirke omgivende ikke-transduserte tumorceller på en måte avhengig av konsentrasjonsgradienten. En ytterligere fordel ved cytokrom P450/CPA- systemet er mangelen på avhengighet av cellereplikasjon for cytotoksiske effekter på de omgivende celler. Dette er fordi en av de aktive metabolitter som dannes vil forårsake tverrbindinger mellom trådene uten hensyn til cellesyklusfasen. Senere, under DNA-syntesen, vil disse tverrbindinger mellom trådene resultere i celledød.

Retrovirusvektorer er de mest vanlig anvendte genoverføringsbærere for de kliniske forsøk som er blitt foretatt til dato. De fleste av disse forsøk har imidlertid hatt en ex vivo tilnærming, hvor pasientens celler er blitt isolert, modifisert i kultur og deretter gjeninnført på nytt i pasienten.

For behandling av cancere ville det være mulig å isolere celler av en pasient (enten tumorceller eller normale celler) infisere dem in vitro med en rekombinant retroviruspartikkel som bærer et gen som koder for cytokrom P450, og deretter returnere dem til pasienten i nærheten av tumoren. Denne tilnærming er imidlertid ekstremt arbeidsintensiv, fordi hver pasients celler må isoleres, dyrkes, transduseres med genkonstruksjonen og med hell returneres uten infeksjon av tilfeldig tilførte midler. Kostnadene og tiden som involveres i en slik tilnærming,

begrenser dens praktiske anvendelighet.

Alternativt kunne man forestille seg en allogen tilnærming, hvor en type celler blir infisert med en rekombinant retroviruspartikkel som har et gen som koder for P450, og deretter anvendes for terapi av mange forskjellige pasienter. En slik tilnærming er mye lettere å gjennomføre idet det antas at problemer med immunavstøtning kan overvinnes. De fleste tumorer er imidlertid ikke egnet for ex vivo genterapi.

Ideelt bør genet som koder for cytokrom P450 innføres in vivo i tumorcellene, eller i celler i nærheten av tumoren.

Avgivelse av gener in vivo innfører flere forskjellige nye problemer. Først av alt, og frem for alt, må man ta fatt i sikkerhetsbetraktninger.

Et viktig anliggende for eventuell in vivo genterapi, både fra et sikkerhetssynspunkt og fra et rent praktisk synspunkt, er målsøkingen av ekspresjonen. Det er klart at terapeutiske gener som bæres av vektorer, ikke ukritisk bør uttrykkes i alle vev og celler, men heller bare i den nødvendige målcelle. Dette er spesielt viktig når genene som skal overføres, er slike promedikamentaktiverende gener som er utformet for å fjerne spesifikke tumorceller. Fjerning av andre, ikke-målceller ville åpenbart være svært uønsket.

Den i alt vesentlige vilkårlige integrering av den provirale form av retrovirus-genomet i genomet av infiserte celler har fremsatt et alvorlig etisk problem, fordi slik vilkårlig integrering kan føre til aktivering av protoonkogener og således føre til utvikling av en ny kreft. De fleste forskere ville være enig i at sannsynligheten for at et replikasjonsdefekt retrovirus, slik som alle de som for tiden anvendes, skulle integrere i eller nær et cellulært gen som involverer seg i kontroll av celleproliferasjon er forsvinnende liten. Det blir imidlertid også antatt at den eksplosive ekspansjon av en populasjon av replikasjonskompetente retrovirus fra en enkelt infeksjonshendelse, til slutt ville tilveiebringe nok integreringshendelser til å gjøre en slik fenotypisk integrering til en svært reell mulighet.

Retrovirusvektorsystemer blir optimalisert for å minimere sjansen for at replikasjonskompetente virus skal være til stede. Det er imidlertid blitt vel dokumentert at rekombinasjonshendelser mellom komponenter av retrovirusvektor systemet kan føre til dannelse av potensielt patogene replikasjonskompetente virus, og flere generasjoner av vektorsystemer er blitt konstruert for å minimere denne rekombinasjonsrisiko (Salmons, B. og Giinzburg, W. H. (1993), Human Gene Therapy 4(2): 129-41).

Retrovirusvektorsystemer består av to komponenter:

1. Retrovirusvektoren selv er et modifisert retrovirus (vektorplasmid) hvori genene som koder for virusproteinene er blitt erstattet av terapeutiske gener. Siden erstatningen av genene som koder for virusproteinene effektivt vil forkrøple viruset, må det bli reddet av den andre komponent i systemet som fremskaffer de manglende yirusproteiner til det modifiserte retrovirus.

Den andre komponent er:

2) En cellelinje som produserer store mengder av virusproteiner, men som imidlertid mangler evnen til å frembringe replikasjonskompetente virus. Denne cellelinjer er kjent som pakningscellelinjen og består av en cellelinje transfektert med et eller flere plasmider som har de gener som muliggjør pakning av den modifiserte retrovirusvektor.

For å danne en rekombinante retroviruspartikkel blir retrovirusvektoren transfektert inn i pakningscellelinjen. Under disse betingelser blir det modifiserte retrovirusgenom innbefattet det innsatte terapeutiske gen, transkribert fra retrovirusvektoren og innpakket i de modifiserte retroviruspartikler. Disse rekombinante retroviruspartikler anvendes deretter til å infisere tumorceller hvorunder vektorgenomet og et eventuelt cytotoksisk gen blir integrert i målcellens DNA. En celle infisert med en slik rekombinant viruspartikkel kan ikke frembringe en ny vektorvirus, siden ingen virusproteiner er tilstede i disse celler, men DNA i vektoren som har det terapeutiske gen, blir integrert i cellens DNA og kan nå uttrykkes i den infiserte celle.

Et antall retrovirusvektorsystemer er tidligere blitt beskrevet, og som skulle tillate målsøking av de bårne cytotoksiske gener (Salmons, B. og Gunzburg, W. H.

(1993), Human Gene Therapy 4(2): 129-41). De fleste av disse tilnærminger involverer enten begrensning av infeksjonshendelsen til på forhånd definerte celletyper eller anvendelse av heterologe promoterer til å styre ekspresjonen av sammenbundede heterologe terapeutiske gener til spesifikke tumorcelletyper. Det anvendes heterologe promoterer som burde drive ekspresjonen av sammenbundede gener bare i den celletype hvori denne promoter normalt er aktiv eller/og dessuten kontrollerbare. Disse promoterer er tidligere blitt innsatt, i kombinasjon med det terapeutiske gen, i kroppen til retrovirusvektorene, isteden for gag, pol eller env-genene.

Den retrovirale lange terminale repeat (LTR) som flankerer disse gener, bærer retroviruspromoteren, som generelt er ikke-spesifikk ved at den kan drive ekspresjonen i mange forskjellige celletyper (Majors, J. (1990) i «Retroviruses - Strategies of replication (Swanstrom, R. og Vogt, P.K., redaktører): Springer-Verlag, Berlin: 49-92). Promoterinterferens mellom LTR promoteren og heterologe interne promoterer, slik som de vevspesifikke promoterer, beskrevet ovenfor, er blitt rapportert. Dessuten er det kjent at retrovirale LTR har kraftige enhansere som kan, enten uavhengig, eller i forbindelse med retroviruspromoteren, påvirke ekspresjon av cellulære gener nær integreringsstedet for retrovirus. Denne mekanisme er blitt vist å bidra til tumorigensitet hos dyr (an Lohuizen, M. og Berns, A. (1990), Biochim. Biophys.Acta 1032: 213-235). Disse to observasjoner har oppmuntret utvikling av selv-inaktiverende vektorer (SIN) hvori retroviruspromoterer funksjonelt blir inaktivert i målcellen (WO 94/29437). Ytterligere modifikasjoner av disse vektorer inkluderer innsetting av promotergenkassetter i LTR regionen for å skape dobbeltkopivektorer (WO 89/11539). I begge disse vektorer er imidlertid de heterologe promoterer innsatt enten i vektorens kropp, eller i LTR regionen, direkte bundet til det terapeutiske gen.

Den tidligere beskrevne SIN vektor nevnt ovenfor som har en deletert 3'LTR (WO 94/29437) anvender dessuten en heterolog promoter så som den av Cytomegalovirus (CMV) i steden for den retrovirale 5'LTR promoter (U3-fri 5'LTR) til å drive ekspresjon av vektorkonstruksjonen i pakningscellelinjen. Et heterologt polyadenyleringssignal er også inkludert i 3'LTR (WO 94/29437).

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er konstruksjonen av en sikker retrovirusvektor, som har et cytokrom P450-gen som terapeutisk prinsipp. Denne nye vektor bærer heterologe konstitutive, induserbare eller vev-spesifikke promoterer og/eller regulatoriske elementer i 3'LTR som, etter infeksjon blir duplisert og translokert til 5'LTR i målcellen. I den infiserte celle vil den innførte promoter således kontrollere ekspresjonen av cytokrom P450-genet, som er innsatt i vektorens kropp. Denne vektor vil ikke undergå selvinaktivering - men i steden promoterutveksling, hvilket gir opphav til navnet ProCon vektor for Promoter Conversion vectors. Prinsippene og fordelene ved ProCon-systemet er beskrevet i større detalj i WO 96/07748.

Siden Promoter Conversion ikke vil resultere i selv-inaktivering vil retrovirusvektoren være transkripsjonelt aktiv i målcellen. I tillegg vil begge LTR i høy grad bestå av heterologe promoter/enhansersekvenser i målcellen. Dette vil redusere sannsynligheten for at den integrerte vektor i målcellen blir underkastet den samme inaktivering over lengre tidsrom som er blitt beskrevet for konvensjonelle vektorer (Xu, L., Yee, J.K. et al., (1989), Virology 171: 331-341) og vil også redusere sjansen for rekombinasjon med endogene retrovirussekvenser til å danne potensielt patogene replikasjonskompetente virus, og således øke sikkerheten av systemet.

I følge denne oppfinnelse blir 5'LTR i retrovirusvektorkonstruksjonen ikke modifisert, og ekspresjon av virusvektoren i pakningscellene blir drevet av den normale retrovirale U3 promoter. Normal retroviral polyadenylering er tillatt, og

ingen heterologe polyadenyleringssignaler er inkludert i 3'LTR. Dette er viktig for utvikling av in vivo genterapistrategi siden den normale fysiologiske regulering av viruset, gjennom den normale viruspromoter, og som også muligens involverer den normale virale kontroll av polyadenyleringen, vil være overveiende over lange tidsrom in vivo mens pakningscellene frembringer rekombinante virus.

For å oppnå de foregående og andre formål vil denne oppfinnelse tilveiebringe en retrovirusvektor som undergår promoter omdanning omfattende en 5' LTR region av strukturen U3-R-U5; en eller flere kodende sekvenser valgt fra gruppen av gener kjent som cytokrom P450-gener; og en 3' LTR region omfattende en fullstendig eller delvis deletert U3 region hvori nevnte deleterte U3 region er erstattet en heterolog promoter, etterfulgt av R og U5 regionen.

Nevnte promoter kan enten være konstitutiv som den Cytomegalovirus (CMV) umiddelbart tidligere promoter/enhanser induserbar så som ved glukokortikoidhormoner (for eksempel MMTV promoteren) eller målcelle-spesifikk.

De målcellespesifikke regulatoriske elementer og promotere er valgt fra et eller flere elementer av hvilken som helst gen, men kan i denne utførelse være fra promotere innbefattet karbonsyreanhydrase II og fi-glukokinase regulatoriske elementer og promotere, lymfocytt-spesifikke regulatoriske elementer og promotere innbefattet karbonsyreanhydrase II og B-glukokinase regulatoriske elementer og promotere, lymfocytt-spesifikke regulatoriske elementer av Whey surt protein (WAP), mus brystkjerteltumorvirus (MMTV), B-laktoglobulin og kaseinspesifikke regulatoriske elementer og promotere, bukspyttkjertelspesifikke regulatoriske elementer og promotere innbefattet immunoglobulin og MMTV lymfocyttspesifikke regulatoriske elementer og promotere og MMTV-spesifikke regulatoriske elementer og promotere som gir mottakelighet for glukokortikoide hormoner eller som styrer ekspresjonen til brystkjertelen. Andre promotere inkluderer for eksempel CD4, CD34, og IL2 promoterene. Nevnte regulatoriske elementer og promotere regulerer fortrinnsvis ekspresjonen av nevnte retrovirusvektorer.

Det synes som om regionen av WAP-promoteren som er nødvendig for å formidle brystkjertelspesifisiteten er et 320 bp Xhol/Xbal restriksjonsfragment (-413 til -93)

(Kolb, A. F., Gunzburg, W.H., Albang, R., Brem, G., Erfle, V., og Salmons, B.

(1995), Biocehm. Biophys. Res. Commun. 217, 1045-1052). I tillegg indikerer

visse eksperimenter at et 0,6 Kb Pstl MMTV promoterfragment (Salmons, B., Groner, B., Calberg Baca, C.M., og Ponta, H. (1985), Virology 144: 101-114) kan spille en rolle ved regulering av brystkjertelspesifisiteten av ekspresjon som utvises av MMTV (Kolb, A.F., Giintzburg, W.H., Albang, R., Brem, G., Erfle, V., og Salmons, B. (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 217, 1045-1052).

LTR regionene er valgt fra minst et element av gruppen bestående av LTR av murint leukemivirus (MLV), mus brysttumorvirus (MMTV), murint sarcom virus (MS), ape immunodefekt virus (SIV), humant immunsviktvirus (HIV), humant T-celle leukemi virus (HTLV), katt immunsviktvirus (FIV), katt leukemivirus (FELV), bovint leukemivirus (BLV) og Mason-Pfizer apekattvirus (MPMV).

Retrovirusvektoren er fortrinnsvis basert på enten en LXSN vektor (Miller, A.D. og Rosman, G.J., (1989), Biotechniques 7: 980-990), pBAG (Price, J., Turner, D. et al., (1987). Proe. NAtl. Acad. Sei. USA 84; 156-160) eller et hybrid av begge.

Den kodende sekvens av det terapeutiske gen kan være hvilket som helst cytokrom P450-gen, men mest fortrinnsvis vil det være rottecytokrom P450 formen 2B1 definert av Fuji-Kuriyama, Y., Mizurkami, Y., et al., (1982) Proe. Nati. Acad. USA 79: 2793 - 2797.

I en ytterligere utførelse av denne oppfinnelse tilveiebringes et retrovirusvektor-system omfattende en retrovirusvektor som beskrevet ovenfor som en første komponent og en pakningscellelinje som har minst en retrovirus eller rekombinant retroviruskonstruksjon som koder for proteiner som er nødvendige for pakking av nevnte retrovirusvektor.

Pakningscellelinjen er fortrinnsvis valgt fra et element av gruppen bestående av y-2, y-Crypt,\|/-AM, GP+E-86, PA317 og GP+envAM-12, eller av hvilket som helst av disse supertransfektert med rekombinante konstruksjoner som tillater ekspresjon av overflateprbteinet av andre omhyllede virus.

Oppfinnelsen inkluderer også mRNA som resulterer fra en retrovirus vektor i følge denne oppfinnelse.

I pakningscellelinjen blir ekspresjonen av retrovirusvektoren regulert av den normale ikke-selektive retroviruspromoter som inneholdes i U3 regionen. Så snart som vektoren kommer inn i målcellen vil imidlertid promoteromdanningen foregå, og P450-genet blir uttrykt fra en vevspesifikk eller induserbar promoter etter valg innsatt i ProCon vektoren. Ikke bare kan faktisk hvilken som helst vevspesifikk

promoter inkluderes i systemet, og sørge for den selektive målsøking av en lang rekke celletyper, men i tillegg, etter omdanningshendelsen, vil strukturen og egenskapene til retrovirusvektoren ikke lenger ligne tilsvarende for et virus. Dette har naturligvis ekstremt viktige konsekvenser ut fra et sikkerhetssynspunkt.

Disse vektorsystemer vil bli anvendt til å danne rekombinante virus som kan anvendes til å infisere tumor eller normale celler enten in vitro eller in vivo.

Rekombinante retrovirus som er blitt renset eller konsentrert, kan konserveres ved først å tilsette en tilstrekkelig mengde av en formuleringsbuffer til det medium som inneholder det rekombinante retroviruset, for å danne en vandig suspensjon. Formuleringsbufferen er en vandig løsning som inneholder et sakkarid, et høy molekylært strukturelt additiv, og en bufringskomponent i vann. Den vandige løsning kan også inneholde en eller flere aminosyrer.

Det rekombinante retrovirus kan også konserveres i renset form. Nærmere bestemt, før tilsettingen av formuleringsbufferen, kan det rå rekombinante retrovirus beskrevet ovenfor bli klaret ved å lede det gjennom et filter, og deretter konsentrert, så som ved et tverrstrømskonserveringssystem (Filtron Technology Corp., Nortborough, MA). Innenfor en utførelse blir DNase tilført til konsentratet for å spalte eksogent DNA. Det spaltede produkt blir deretter diafiltrert for å fjerne overskudd av mediakomponenter og etablere rekombinante retrovirus i en mere ønskelig bufret løsning. Diafiltratet ledes deretter over en Sephadex S-500 gelkolonne, og det elueres et renset rekombinant retrovirus. En tilstrekkelig mengde av formuleringsbuffer blir tilsatt til dette eluat for å nå en ønsket sluttkonsentrasjon av bestanddelene og for å fortynne minimalt det rekombinante retrovirus, og den vandige suspensjon blir deretter lagret, fortrinnsvis ved -70°C eller tørket umiddelbart. Som bemerket ovenfor vil formuleringsbufferen være en vandig løsning som inneholder et sakkerid, et høymolekylært strukturelt additiv, og en bufringskomponent i vann. Den vandige løsning kan også inneholde en eller flere aminosyrer.

Det rå rekombinante retrovirus kan også renses ved ionebyttekromatografi. Vanligvis blir det rå rekombinante retrovirus klaret ved å lede det gjennom et filter og filtratet påsatt på en kolonne inneholdende en høyt sulfonert cellulosematriks. Det rekombinante retrovirus blir eluert fra kolonnen i renset form ved anvendelse av en buffer med høyt saltinnhold. Bufferen med høyt saltinnhold blir deretter byttet ut med en mer ønskelig buffer ved å lede eluatet over en molekulær eksklusjonskolonne. En tilstrekkelig mengde av formuleringsbuffer blir deretter tilsatt, som diskutert ovenfor, til det rensede rekombinante retrovirus, og den vandige suspensjonen blir enten tørket umiddelbart eller lagret, fortrinnsvis ved - 70°C.

Den vandige suspensjon i rå eller renset form kan tørkes ved lyofilisering eller inndamping ved omgivende temperatur. Spesifikt vil lyofilisering involvere et trinn for avkjøling av den vandige suspensjon under glasstemperaturen eller under temperaturen ved det eutektiske punkt for den vandige suspensjon, og fjerning av vannet fra den avkjølte suspensjonen ved sublimasjon under dannelse av et lyofilisert retrovirus. Når det er lyofilisert vil det rekombinante retrovirus være stabilt og kan lagres ved -20°C til 25°C som diskutert i større detalj nedenfor.

Ved fordampningsmetoden blir vann fjernet fra den vandige suspensjonen ved omgivende temperatur ved fordampning. Vann kan også fjernes ved forstøvningstørkning.

De vandige løsninger anvendt for formulering er, som tidligere beskrevet, sammensatt av et sakkarid, høymolekylært strukturelt additiv, en bufringskomponent og vann. Løsningen kan også inkludere en eller flere aminosyrer. Kombinasjonen av disse komponenter virker til å bevare aktiviteten av det rekombinante retrovirus ved frysing og lyofilisering, eller tørking ved inndamping.

Det høymolekulære strukturelle additiv hjelper til å forhindre virusaggregering under frysing, og gir strukturell understøttelse i lyofilisert eller tørket tilstand. Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse blir strukturelle additiver ansett å være «høymolekylære» dersom de har en molekylvekt høyere enn 5000. Et foretrukket høymolekylært strukturelt additiv er humant serum albumin.

Aminosyrene, dersom de er tilstede, virker til ytterligere å bevare virussmitte-

evnen ved avkjøling og tining av den vandige suspensjon. I tillegg virker aminosyrene til ytterligere å bevare virussmitte-evnen under sublimering av den avkjølte suspensjon og i lyofilisert tilstand.

Bufringskomponenten virker til å bufre løsningen ved å holde i en relativt konstant pH. Flere buffere kan anvendes, avhengig av de ønskede pH-områder, fortrinnsvis mellom 7,0 og 7,8.

Vandige løsninger for formulering av rekombinante retrovirus er beskrevet i detalj i WO A2-96/121014.

I tillegg blir det foretrukket at den vandige løsning inneholder et nøytralt salt som anvendes til å justere det endelig formulerte rekombinante retrovirus til en hensiktsmessig isoosmotisk saltkonsentrasjon.

Lyofiliserte eller dehydrerte retrovirus kan rekonstitueres ved anvendelse av flere forskjellige substanser, men blir fortrinnsvis rekonstituert ved anvendelse av vann.

I visse tilfeller kan det også anvendes fortynnede saltoppløsninger som bringer den endelige formulering til isotonisitet. Dessuten kan det være fordelaktig å anvende vandige løsninger inneholdende komponenter kjent for å øke aktiviteten av det rekonstituerte retrovirus. Slike komponenter inkluderer cytokiner, slik som IL-2, polykationer, så som protaminsulfat, eller andre komponenter som øker transduseringsaktiviteten av det rekonstituerte retrovirus. Lyofilisert eller dehydrert rekombinant retrovirus kan rekonstitueres med hvilket som helst beleilig volum av vann eller de rekonstitueringsmidler som tillater vesentlig, og fortrinnsvis total solubilisering av den lyofiliserte eller dehydrerte prøve.

Rekombinante retroviruspartikler kan administreres til en rekke forskjellige lokasjoner innbefattet for eksempel i slike steder som et organ eller til et tumorsete. Innenfor andre utførelser kan det rekombinante retrovirus administreres oralt, intravenøst, bukalt/sublingualt, intraperitonealt eller subkutant. Den daglige dosering avhenger av den nøyaktive administreringsmåte, formen som de administreres i, den indikasjon som administreringen er rettet mot, det involverte . individ og kroppsvekten av det involverte individ og videre preferansen og erfaringen til den ansvarlige lege.

Administreringsveiene beskrevet heri kan gjennomføres ganske enkelt ved direkte administrering ved anvendelse av en nål, kateter, eller beslektede anordninger. Spesielt innenfor visse utførelser i følge denne oppfinnelse, kan en eller flere doseringer administreres direkte.

I en utførelse i følge denne oppfinnelse vil pakningscellene være innelukket i kapsler. For effektiv behandling vil de virusproduserende celler måtte overleve lange perioder i målorganet etter implantering, og virus må produseres i løpet av dette tidsrom og avgis fra pakningscellene. Pakningscellene som produserer viruset ville derved i virkeligheten utgjøre en liten virusproduserende fabrikk, plassert på oppføringsstedet. Dette vil tillate effektiv avgivelse av det rekombinante virus in vivo. Alternativt vil infiserte normale celler, enten av human opprinnelse, eller de som skriver seg fra andre arter, bli innkapslet og implantert, og tilveiebringe en liten promedikamentomdanningsfrabrikk som kan plasseres nær eller i tumormassen.

Langtidseffektiviteten av denne tilnærming avhenger av 1) beskyttelse av cellene mot vertens immunsystem, som normalt ville eliminere virus-produserende eller infiserte celler, spesielt dersom cellene er fra en annen art som vanligvis er tilfelle for retrovirusvektorproduserende celler og 2) overleving av cellene in situ i utstrakte perioder, hvilket kan kreve vaskularisering.

Det er blitt funnet at den kontinuerlige produksjon av et vektorvirus fra implanterte pakningsceller kan oppnås ved hensiktsmessig innkapsling, i mikrokapsler med halvt gjennomtrengelige membraner, av de virusproduserende pakningsceller før implantering. I tillegg er det blitt funnet at slike kapsler blir godt innpodet i verten, blir vaskularisert, og ikke vil fremkalle noen vertsimmun eller imflammatorisk respons. Disse funn, sammen med semipermiabiliteten av kapselmembranen, tillater langtids retrovirusvektoravgivelse in vivo.

Det er blitt utviklet en innkapslingsteknologi som sørger for innkapsling av virusproduserende pakningsceller, og av virusinfiserte eller normale celler i et cellulosebasert materiale. Ved anvendelse av denne teknikk blir opptil IO10, men fortrinnsvis IO<5->IO<7>celler innkapslet i elektrolyttkompleks (for eksempel fra alginat og polylysin eller mer fortrinnsvis cellulosesulfat og polydimetyldiallylammoniumklorid) eller andre porøse strukturer (slik som polyamider, polysulfoner). De resulterende kapsler kan ha en variabel diameter mellom 0,01 og 5 mm, men fortrinnsvis mellom 0,1 og 1 mm. Det kan derfor lages kapsler som inneholder et variabelt antall celler. Kapselen er halvt gjennomtrengelig med porer som er store nok til å tillate virus eller promedikamentmolekyler å passere gjennom, men små nok til å forhindre celler av immunsystemet fra å få adgang til cellen, og derved signifikant redusere en immunrespons på disse celler. Kapslene og de innkapslede celler blir dyrket i normalt cellekulturmedium (karakteren av dette vil avhenge av den innkapslede cellelinjen) ved standard betingelser av fuktighet, temperatur og CO2-konsentrasjon.

Etter et egnet tidsrom i kultur (vanligvis ikke mindre enn 1 time og mer enn 30 dager) kan cellen inneholdende kapsler kirurgisk implanteres enten direkte, eller ved injeksjon ved anvendelse av en sprøyte i forskjellige områder.

Til forskjellige tidspunkter etter implanteringen av de innkapslede celler kan verten behandles med cyklofosfamid eller ifosfamid enten lokalt eller systemisk. Celler infisert med det cytokrom P450-uttrykkende virus vil omdanne disse promedikamenter til de aktive metabolitter som forårsaker alkylering og tverrbinding av DNA. Også celler som bærer og uttrykker cytokrom P450 genet (så som innkapslede infiserte celler, eller inkapslede pakningsceller) vil også katalysere denne omdanning. I en utførelse av denne oppfinnelse vil disse innkapslede infiserte eller pakningsceller være enten celler som deler seg langsomt, eller celler som er blitt behandlet med mitomysin C, lave doser av stråling, eller andre midler for å forhindre cellereplikasjon, og således forhindre cellene fra selv å bli påvirket av de cytotoksiske effekter av promedikamentene.

Følgende eksempler vil illustrere oppfinnelsen ytterligere.

Eksempel 1

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av en retrovirusekspresjonsvektor for intratumoral infeksjon og som inneholder genet for rotte cytokrom P450 2B1.

Ekspresjonsvektor plX2Bl, vist i fig. 1, ble konstruert ved legering av fragmenter oppnådd fra plasmid pLX125 og pSWl (Kedzie, K.M., Escobar, G.Y., Grimm, S.W., He, Y.A., Pepperl, D.J., Regan, J.W., Stevens, J.C., og Halpert, J.R. (1991), J.R. (1991), J. Biol. Chem. 266(33): 2215-21). pLX125 ble fremstilt som beskrevet i PCT/EP/04447.

Plasmidet pLX125 ble linearisert med Hpal, og de resulterende butte ender defosforylert ved anvendelse av kalvetarmfosfatase. DNA ble renset ved separasjon på en 1% agarose gel, utskjæring og preparering ved anvendelse av Qiaquick protokollen (Qiagen). Etter etanolutfelling ble DNA slemmet opp igjen på nytt i vann.

Kloningsvektoren pSWl ble spaltet med Smal og HincII under dannelse av to fragmenter med butte ender. Spaltingsblandingen ble separert på en 1 % agarose gel. Det korteste fragment (1,5 kb) inneholdende rotte cytokrom P450 2B1 cDNA (Fuji-Kuriyama, U. Mizukami, Y. et al (1982), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79: 2793-2797) ble utskåret og eluert ved anvendelse av Qiaquick DNA ekstraksjonsprotokollen, etanolutfelt og slemmet opp igjen i vann.

7,6 fMol av pLX125 og 24 fMol av Smal/Hindll-fragmentet av pSWl ble blandet sammen og ligert i 3 dager ved 12°C ved anvendelse av T4-ligase (Boehringer).

Ligasen ble inaktivert ved 65 °C i 10 minutter, og DNAet butanolutfelt med et 10 gangers volum av butanol. Det utfelte DNA ble slemmet opp igjen i vann, og elektroporert over i DHlOB-bakterier (Gibco). Ampicillinresistante kolonier ble utvalgt, DNA fremstilt og testspaltet med SspBI/Sall, BamHI/SspBI, PPvuI og BamHI. Det endelige korrekte plasmid ble betegnet pLX2Bl.

Lipofeksjon

En dag før lipofeksjon ble 3x10<6>retroviruspakningsceller PA 317 (Miller, A.D. og Buttimore, C. (1986), Mol.Cell.Biol.6: (2895-2902) utsådd i 10 cm petriskåler eller dyrkingsskåler. På dagen for infeksjon ble 4 ug av pLX2Bl blandet med 300ul serumfritt medium. Parallelt ble 45 ul av lipofektamin (Gibco BRL) blandet med 300 (il serumfritt medium. Den plasmidholdige løsning ble tilsatt til lipofektaminblandingen og inkubert i 45 minutter. Etter 35 minutter ble cellene vasket en gang med 6 ml serumfritt medium. 2,4 ml av serumfritt medium ble tilsatt til lipofeksjonsblandingen, og den resulterende 1 ml ble helt over i preparerte celler. Etter 5 timer ble tilsatt 3,5 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium inneholdende 20% FCS. Den neste dag ble cellene tripsinisert og 1:20 fortynnet og utsådd på en 100 mm skål. Etter 24 timer ble mediet erstattet med medium inneholdende neomysinanalogen G418. Cellepopulasjoner isolert og analysert for ekspresjon av cytokrom P450.

Supernatant fra disse cellepopulasjoner ble anvendt til å infisere Ck-målceller. 1 ml virus inneholdende supernatant fra 5x10<6>celler ble filtrert gjennom et 0,45 um filter og tilsatt til lxl06 CK-målceller i nærvær av 8 ug/ml polybren. Etter 4 timer ble tilsatt x ml av Dulbeccos modifiserte Eagles medium med 10% føtalt kalveserum.

Cellene ble trypsinisert neste dag, fortynnet og 24 timer senere plassert i seleksjonsmedium inneholdende ytterligere 400 ug/ml G418. Etter 2 uker ble G418-resistente kolonier isolert og testet for cytokrom P450 2B1 aktivitet. 2xl0<4>celler ble plantet ut på en 3 cm skål og eksponert for en konsentrasjon av ifosfamid varierende mellom 0 og 5 mM. En høyere følsomhet av de cytokrom P450 2B1 retrovirusinfiserte celler ble observert sammenlignet med kontroll, ikke-inflserte celler.

Innkapsling

De oppnådde retrovirusvektor-produserende pakningsceller blir innkapslet som beskrevet i eksempel 2 i WO 97/01357.

Implantering

De oppnådde kapsler blir innført ved «nøkkelhull »-kirurgi nær eller i enten transplanterte eller spontane tumorer i BALB/c eller GR mus. Ca. 6 kapsler 1 mm diameter blir innsatt på hvert operasjonssted. Kirurgistedet blir lukket med et sting. Musene blir deretter behandlet med cyklofosfamid eller ifosfamid lokalt, ved direkte intratumoralt injeksjon av 100 ul av 20 mg/ml eller systemisk konsentrasjoner på 130 mg CP A/kg legemsvekt i.p. og 40-60 mg IFO/kg legemsvekt i.p. i opptil i et maksimum på 10 uker. I løpet av denne periode blir tumorstørrelse og mikroskopisk utseende overvåket daglig. Musene blir deretter avlivet, vevet inneholdende de innsatte kapsler og tumorer blir fjernet og histologiske snitt fremstilt for lys og elektronmikroskopi. Disse snitt viser klart god innpoding av kapslene, vaksularisering og intet tegn på tilstedeværelse av lymfocytter som indikasjon på en cellulær immunrespons. Disse snitt viser heller ingen tegn på celledød eller nekrose i kapselen. Derimot viste tumoren nekrose, og makroskopisk var det en klar reduksjon i størrelse over testperioden.

Eksempel 2

Dette eksempel beskriver konstruksjon av en stabil cellelinje som uttrykker rotte cytokrom P450 2B1 konstitutivt.

Ekspresjonsvektor pc3/2Bl ble konstruert ved ligering av fragmenter oppnådd fra plasmid pcDNA3 (Invitrogen) og pSWl (Kedzie, K.M., Escobar, G.Y., Grimm, S.W., He, Y.A., Pepperl, D.J., Regan, J.W., Stevens, J.C., og Halpert, J.R. (1991), J.R. (1990), J. Biol. Chem. 266(33): 2215-21).

Plasmidet pcDNA3 ble spaltet med Xhol/Xbal og de resulterende fragmenter med klebrige ender ble defosforylert ved anvendelse av kalvetarmfosfatase. DNA'et fra vektorhovedkjeden ble renset ved separasjon på en 1% agarose gel, utskjæring og preparering ved anvendelse av Qiaquick protokollen (Qiagen). Etter etanolutfelling ble DNA slemmet opp på nytt i vann. Kloningsvektoren pSWl ble spaltet med Xhol og Xbal under dannelse av to fragmenter. Spaltingsblandingen ble separert på en 1% agarose gel. Det korteste fragment (1,5 kb) inneholdende rotte cytokrom P450 2B1 cDNA (Fuji-Kuriyama, Y., Mizukami, Y.et al., (1982), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79: 2793-2797) ble utskåret og eluert ved anvendelse av Qiaquick DNA ekstrasjonsprotokollen, etanolutfelt og slemmet opp igjen på nytt i vann.

8,3 fMol av pcDNA3 hovedkjeden og 24,8 fMol av XhoI/Xbal-fragmentet av pSWi ble blandet sammen og ligert i en dag ved 12°C ved anvendelse av T4-ligase (Boehringer). Ligasen ble inaktivert ved 65°C i 10 minutter og DNA ble butanolutfelt med et 10 gangers volum av butanol. Det utfelte DNA ble slemmet opp igjen på nytt i vann og elektroporert over i DHlOB-bakterier (Gibco).

Amipicillin-resistente kolonier ble utvalgt, DNA fremstilt og testspaltet med EcoRI, BamHI, EcoRV og Xhol. Det endelige korrekte plasmid ble betegnet pc3/2Bl.

Lipofeksjon

Før dagen for transfeksjon ble 3xl0<6>kattenyreceller utsådd i 100 mm skåler. På transfeksj onsdagen ble 4 ug av pc3/2Bl blandet med 100 ul serumfritt medium. Parallelt ble 15 ul Lipofectamin blandet med 100 ul serumfritt medium. Den plasmidholdige løsning ble tilsatt til Lipofectaminblandingen og inkubert i 45 minutter. Etter 35 minutter ble cellene vasket en gang med 2 ml serumfritt medium. 800 ul av serumfritt medium ble tilsatt til lipofeksjonsblandingen, og den resulterende 1 ml ble helt over de preparerte celler. Etter 6 timer ble tilsatt 1 ml DMEM (Glutamax) med 10% FCS. Den neste dag ble cellene tripsinisert og fortynnet med faktor 10 og utsådd på en 100 mm skål. Etter 24 timer ble mediet erstattet med neomycinmedium. Etter 14 dager ble neomycinresistente kloner isolert og testet for tilstedeværelse og aktivitet av vektoren.

Cytokrom P450-uttrykkende kattenyreceller viste en 10 ganger så høy følsomhet for ifosfamid eller cyklofosfamid sammenlignet med celler av villtypen.

En tilskuereffekt kunne demonstreres på kattenyre-villtypeceller, men også på bukspyttkjerteltumoravledere Rin5 celler. Dette ble vist ved ko-dyrking av cytokrom P450 2B1 at nyrecellekloner med enten ikke-produserende kattenyre-villtypeceller eller Rin5 rottebukspyttkjerteltumoravlederceller og tilsetting av ifosfamid. De ikke-produserende CK og Rin celler blir avlivet av de toksiske metabolitter av ifosfamidet som fremstilles og frigis av cytokrom P450 2B1 kattenyrecellene. Titreringsstudier ved anvendelse av en cytokrom P450 2B1 kattenyrecelleklon viste at så lite som 0,25 mM ifosfamid vil forårsake spesielle toksiske effekter på disse celler, og 1 -2 mM resulterer i død av alle celler. Cytokrom P450 2B1 kattenyrecellekloner ble vist ved polymerasekjedereaksjonsanalyse og har fått P450 2B1 genkonstruksjonen DNA. Ytterligere biokjemisk analyse av klonene ved anvendelse av den enzymatiske dealkylering av 7-pentoksyresorufin med cytokrom P450 2B1 åpenbarte at de genetisk modifiserte celler produserer cytokrom P450 2B1.

Kapsler inneholdende disse celler ble produsert som beskrevet i eksempel 1 og implantert ut i mus nær tumorsetet. Etter behandling med cyklofosfamid eller ifosfamid ble effektiviteten av behandlingen evaluert som beskrevet ovenfor.

En retrovirusekspresjonsvektor som inneholder genet som koder for rottecytokrom P450 2B1 kan også fremstilles som beskrevet i eksempel 4 nedenfor.

Eksempel 3

Plasmidet pLX125 ble først delvis spaltet med restriksjonsenzymet Xhol under dannelse av en vektor som lineæriseres i stilling 3547. Dette lineære plasmid ble ytterligere spaltet med restriksjonsenzymet SspBI for å fjerne et kort fragment i polylinkeren av pLX125.1 en preparativ gel fremkom det korrekt utskårne vektorfragment som det største bånd. Ved anvendelse av Quiaex protokollen (Qiagen) ble DNA i dette bånd eluert og renset fra gelen.

For å gi rottecytokrom P450 2B1-genet ble celler av rottehepatom cellelinje HTC lyset med løsning D (4M guanidiumtiocyanat, 25mM natriumsitrat pH7, 0,5% N-laurylsarkosinnatrium, 0,1M 2-merkaptoetanol) og total RNA ekstrahert ved tilsetting av 1/15 volum av 3 M natriumacetat, i det samme volum av vannmettet fenol, og 1/5 volum av kloroformisoamyalkohol (49:1) ble tilsatt, og hele blandingen omrørt kraftig. Etter 15 minutter på is ble ekstraktet sentrifugert i 20 minutter ved 4°C ved 10 000 g. RNA i den vandige fase ble utfelt med 1 volum av isopropanol i 30 minutter ved -20°C og sentrifugert ved 10 000 g ved 4°C. Pelleten ble vasket i 70% etanol og etterlatt ved romtemperatur i 15 minutter. Etter 5 minutter sentrifugering ved 4°C og 10 000 g ble pelleten tørket i en vakuumtørker og løst på nytt i 0,5% SDS løsning.

Det ekstraherte RNA ble revers transkribert ved anvendelse av protokollen for cDNA syntese (Pharmacia). Det resulterende cDNA ble anvendt som templat for en PCR. Primerne ble utformet slik at de inneholdt et SspBI-restriksjonssete (understreket) i venstrehåndsprimeren

(5'-AAGCCTCTACACTGGAGAGCATGCAC-3') og et Xhol-sete (understreket) i høyrehåndsprimeren

(5'-CGATTACTCGAGACCTGGCTGCCTCA-3'). Begge primere hadde ytterligere baser i 5'-ende for høyere effektivitet av spalting med det relevante restriksjonsenzym. Det 1562 bp-produkt ble spaltet med Xhol og SspBI under dannelse av tre fragmenter.

Dette lengste fragment (1545 bp), inneholdende genet for cytokrom P450, ble ligert inn i det XhoI/SspBI-spaltede plasmid pLX125.

En stabil cellelinje som uttrykker rottecytokrom P450 form 2B1 konstitutivt, kan også fremstilles som beskrevet i eksempel 5 nedenfor.

Eksempel 4

For å gi mRNA fra rottecytokrom P450 formen 2B1, ble en 4 uker gammel hunnrotte avlivet, leveren tatt ut og umiddelbart frosset i flytende nitrogen. Den frosne lever ble plassert i sterilisert, filtrert GTC-buffer (6 M guanidium- isotiocyanat, 5 mM natriumsitrat, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,05% natrium N-laurylsarkosyl) og homogenisert ved romtemperatur. For RNA separasjon ble leverekstraktet plassert på en pute av cesiumklorid (5,7 M cesiumklorid, 0,1 M EDTA) og sentrifugert i en svingut-rotor ved 20°C og 32 000 rpm over natten. Etter fullstendig fjerning av supernatanten, ble det pelleterte RNA løst på nytt igjen i iskald 10 mM tris pH 7k,5 og utfelt over natten ved -20°C med 1/15 volum av 3 M natriumacetat og 3,5 volumer etanol. RNA ble sentrifugert ned i 40 minutter ved 8 000 opm og 4°C og den tørkede pellet slemmet opp igjen på nytt i sterilt vann.

Det ekstraherte RNA ble revers transkribert ved anvendelse av protokollen for cDNA syntese (Pharmacia). Det resulterende cDNA ble anvendt som templat for den følgende PCR. Primerne var utformet slik at de inneholdt et EcoRI restriksjonssete i venstrehåndsprimeren

(5'-CGTGCGGAATTCGGCGGATTCAGCAT-3') og et EcoRVI-sete i høyrehåndsprimeren (5' - AT AACGG AT ATC ACCTGGCTGCCTC A-3'). Begge primere hadde ytterligere baser på 5'-enden for høyere effektivitet av det kuttende enzym. 1588 bp-amplifikatet ble spaltet med EcoRI og EcoRV under dannelse av 3 fragmenter.

Dette lengste fragment (1572 bp), inneholdende genet for cytokrom P450 2B1, ble ligert til det EcoRI/EcoRV-spaltede plasmid pcDNA3 (Invitrogen).

Eksempel 5

Konstruksjon av en ProCon vektor inneholdende rotte-cytokrom P450-genet under transkripsjonskontroll av WAP promoteren.

Det ekstraherte RNA fremstilt i eksempel 4 ble revers transkribert ved anvendelse av protokollen for cDNA-syntese (Pharmacia). Det resulterende cDNA anvendes som templat for en PCR. Primerne er utformet slik at de inneholder BamHI restriksjonssete (understreket) i venstrehåndsprimeren (f.eks. 5'-AAGCCGGATCCCTGGAGAGCATGCAC-3') og et BamHI sete (understreket) i høyrehåndsprimeren

(f.eks. 5'-CGATTA GGATCCCTGCCTCA-3'). Begge primere har ytterligere baser på 5'-enden for høyere effektivitet av spalting med det relevante friksjonsenzym. 1562 bp produktet blir spaltet med BamHI, og det oppnådde fragment inneholdende genet for cytokrom P450 blir ligert inn i det BamHI-spaltede plasmid pWAP.6 (se PCT-søknad nr. PCT/EP96/03922).

Claims (17)

1. Kapsel som innkapsler en celle som uttrykker et cytokrom P450-gen overført inn i nevnte celle, karakterisert vedat den omfatter en porøs membran som omgir nevnte cytokrom P450 uttrykkende celle, hvor nevnte porøse membran er permeabelt for promedikamentmolekyler som passerer igjennom og inn i kapselen, hvor nevnte promedikamentmolekyler blir konvertert til den aktive metabolitt med cytokrom P450 uttrykt av nevnte celle.

2. Kapsel i følge krav 1, karakterisert vedat kapselmateriale omfatter et kompleks dannet av cellulosesulfat og polydimetyldiallylammoniumklorid.

3. Kapsel i følge krav 1 eller 2, karakterisert vedat nevnte cytokrom P450-produserende celle er en stabil cellelinje som uttrykker cytokrom P450 konstitutivt.

4. Kapsel som angitt i ethvert av de foregående krav 1-3 for anvendelse ved behandling av en kreftsykdom.

5. Kapsel som angitt i krav 4, karakterisert vedat en terapeutisk effektiv mengde av kapselen blir administrert, enten samtidig eller med en tidsforsinkelse, med et promedikament som blir aktivert av cytokrom P450.

6. Kapsel ifølge krav 5, karakterisert vedat kapselen blir administrert ved injeksjon og/eller ved implantering i målcellene og/eller på stedet derav, og at promedikamentet blir administrert systemisk og/eller lokalt.

7. Kapsel ifølge ethvert av de foregående krav 4-6, karakterisert vedat målcellene er celler av brysttumorer og/eller pankreastumorer.

8. Kapsel ifølge ethvert av kravene 5-7, karakterisert vedat promedikamentet er cyklofosfamid og/eller ifosfamid.

9. Farmasøytisk blanding, karakterisert vedat den omfatter kapselen i følge hvilket som helst av kravene 1 til 8.

10. Farmasøytisk sammensetning som angitt i krav 9, •karakterisert vedat den ytterligere omfatter et promedikament som blir aktivert av cytokrom P450.

11. Farmasøytisk sammensetning som angitt i krav 10, karakterisert vedat kapslene og promedikamentet blir formulert i forskjellige former.

12. Farmasøytisk sammensetning som angitt i krav 11, karakterisert vedat den omfatter kapselen i formen som er egnet for injeksjon og/eller implantasjon i målorganene og/eller ved siden av nevnte målorgan, og promedikamentet i en form som er egnet for systemisk og/eller lokal administrering.

13. Farmasøytisk sammensetning som angitt i krav 10-12,karakterisert vedat den omfatter kapslene i en form som er egnet for innplantasjon i og/eller ved siden av brystkreftvev eller pankreatisk kreftvev.

14. Farmasøytisk sammensetning som angitt i krav 10-13,karakterisert vedat den omfatter cyklofosfamid og/eller ifosfamid som promedikament.

15. Kapsel som angitt i ethvert av de foregående krav 1-8 og et prolegemiddel som blir aktivert av cytokrom P450, for anvendelse til behandling av en kreftsykdom.

16. Anvendelse av kapselen i henhold til ethvert av kravene 1-8 til å fremstille en farmasøytisk sammensetning som er nyttig for fjerning av tumorceller.

17. Anvendelse av kapselen som angitt i ethvert av de foregående krav 1-8 og et legemiddel som blir aktivert med cytokrom P450 til å fremstille en farmasøytisk sammensetning.