NO317731B1 - Ikke selvinaktiverende, malrettet retroviral ekspresjonsvektorer - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår retrovirale vektorer som inkluderer en vektor som gjennomgår promoterkonversjon (ProCon vektor). Vektorsystemet er nyttig som en geneoverføirngsbærer for målrettet genterapi.

Anvendelse av retrovirale vektorer i genterapi har blitt gjort til gjenstand for mye oppmerksomhet og er for tiden den valgte metoden til å overføre terapeutiske gener i et utvalg av godkjente protokoller både i USA og i Europa (Kotani et al. 1994). Flesteparten av disse protokollene krever imidlertid at infeksjonen av målceller med den retrovirale vektor som bærer det terapeutiske genet skjer in vitro, og vellykkede infiserte celler blir deretter returnert til det affiserte individ (Rosenberg et al., 1992; for oversikt se Anderson, 1992). Slik ex vivo genterapiprotokoller er ideelle for korreksjon av medisinske tilstander hvor målcellepopulasjonen lett kan isoleres (for eksempel lymfocytter). I tillegg tillater ex vivo infeksjon av målceller administrering av store mengder av konsentrert virus som kan grundig sikkerhetstestes før anvendelse.

Uheldigvis involverer bare en brøkdel av de mulige anvendelser for genterapi målceller som lett kan isoleres, dyrkes og deretter reinnføres. I tillegg forhindrer, den komplekse teknologien og tilstøtende høye kostnader ved ex vivo genterapi effektivt dens utbredte anvendelse i verden. Fremtidig lett og kostnadseffektiv genterapi vil kreve en in vivo tilnærming i hvilken den virale vektor, eller celler som produserer den virale vektor blir direkte administrert til pasienten i form av en injeksjon eller en enkel implantasjon av retrovirale vektorproduserende celler.

Denne type av in vivo tilnærming innfører selvfølgelig et utvalg av nye problemer. Først og viktigst må sikkerhetsbetraktninger vurderes. Virus vil produseres muligvis fra en implantering av virusproduserende celler og det vil ikke bli noen anledning til å forutkontrollere de produserte virus. Det er viktig å være klar over den endelige risiko involvert i anvendelse av slike systemer såvel som å forsøke og fremstille nye systemer som minimaliserer risikoen.

Retrovirale vektorsystemer består av to komponenter (fig. 1):

1) den retrovirale vektor er selv et modifisert retrovirus (vektorplasmid) i hvilke genene som koder for de virale proteiner er blitt erstattet av terapeutiske gener og markørgener som overføres til målcellen. Siden erstatningen av genene som koder for de virale proteiner effektivt ødelegger virus må den reddes ved en annen komponent i systemet som tilveiebringer de manglende virale proteiner til det modifiserte retrovirus.

Den andre komponent er:

2). en cellelinje som produserer store mengder av de virale proteiner, men som mangler evnen til å produsere replikasjonskompetente virus. Denne cellelinje er kjent som pakkecellelinje og består av en cellelinje transfisert med et annet plasmid som bærer genene som gjør det mulig for den modifiserte retrovirale vektor å bli pakket.

For å danne den pakkede vektor blir vektorplasmidet overført inn i pakkecellelinjen. Under disse betingelser blir det modifiserte retrovirale genomet inkludert de innskutte terapeutiske og markørgener transkribert fra vektorplasmidet og pakket inn i de modifiserte retrovirale partikler (rekombinante virale partikler). Dette rekombinante virus blir deretter brukt til å infisere målceller i hvilke vektorgenomet og enhver båret markør eller terapeutisk gen blir integrert i målcellens DNA. En celle infisert med en slik rekombinant viral partikkel kan ikke produsere nye vektorviruser siden intet virusprotein er tilstede i disse celler. DNA til vektoren bærer imidlertid de terapeutiske og markørgenene som er integrert i cellens DNA og kan nå uttrykke sine infiserte celler.

Den hovedsakelige tilfeldige integrasjon av den provirale form av det retrovirale genom i genomet til den infiserte celle (Varmus, 1988) førte til identifikasjon av et antall av cellulære protoonkogener på grunn av deres inskuddsaktivering (Varmus, 1988; vanLohuizen and Berns, 1990). Muligheten for at en lignende mekanisme kan forårsake kreft hos pasienter behandlet med retrovirale vektorer som bærer terapeutiske gener med den hensikt å behandle andre foruteksisterende medisinske tilstander har reist et tilbakevendende etisk problem. De fleste forskere er enige om at muligheten for en replikasjon av defekt retroviral vektor, slik som alle de som brukes nå, som integreres inn eller nær et cellulært gen som er involvert i å kontrollere celleproliferasjonen er i stor grad liten. Det er imidlertid også generelt antatt at den eksplosive ekspansjon av en populasjon av replikasjonkompetente retrovirus fra en enkel infeksjonshendelse vil til slutt tilveiebringe nok integrasjonshendelser til å gjøre en slik fenotypisk integrasjon til en meget reell mulighet.

Retrovirale vektorsystemer blir optimalisert for å minimalisere sjansene til at replikasjonskompetente virus er tilstede. Det er imidlertid godt dokumentert at rekombinasjonshendelser mellom komponenter av det retrovirale vektorsystemet kan føre til dannelsen av potensiell patogen replikasjonskompetent virus og et antall generasjoner av vektorsystemer er blitt konstruert for å minimalisere denne risiko for rekombinering (redegjort for i Salmons and Giinzburg, 1993).

En videre vurdering med betraktning av anvendelse av in vivo genterapi både fra et sikkerhetsstandpunkt og fra et rent praktisk standpunkt er målretting av retrovirale rektorer. Det er klart at terapeutiske gener båret av vektorer ikke ukritisk må utvikles i alle vev og celler men bare i de respektive målceller. Dette er spesielt viktig hvis genene som skal overføres er toksiske gener rettet mot fjerning av spesifikke tumorceller. Fjerning av andre ikkemålceller ville klart være meget uønsket.

Et antall retrovirale vektorsystemer er tidligere blitt beskrevet som kunne tillate

målretting av de bårede terapeutiske gener (Salmons and Gunzburg, 1993). Mesteparten av disse tilnærmingene omfatter enten å begrense infeksjonshendelsen til forutbestemte celletyper eller å bruke heterologe promotorer for å styre ekspresjonen av koblede heterologe terapeutiske eller markørgener til spesifikke celletyper. Heterologe promotorer blir brukt som skulle drive ekspresjon av koblede gener bare i celletyper, i hvilke denne promotoren normalt er aktiv. Disse promotorer har tidligere blitt innskutt, i kombinasjon med markør eller det terapeutiske gen i kroppen til retrovirale vektorer isteden for gag, pol eller env-gener.

De lange terminal gjentagelser (LTR) som flankerer disse gener bærer den retrovirale promotor som generelt ikke er spesifikk ved at den kan drive ekspresjon i mange forskjellige celletyper (Major, 1990). Promoterinteferens mellom LTR promotoren og heterologe interne promotorer, så som de vevsspesifikke promotorer beskrevet ovenfor, er blitt rapportert. I tillegg er det kjent at retroviral LTR har sterke enhancere som kan, enten uavhengig eller i sammenheng med den retrovirale promoter, påvirke ekspresjon av cellulære gener nær integrasjonssetet til retrovirus. Denne mekanismen er blitt vist å bidra til tumorgenesitet i dyr (van Loohuizen og Berns). Disse to observasjoner har oppmuntret til utvikling av celleinaktiverende vektorer (SIN) i hvilke retrovirale promotorer er funksjonelt inaktivert i målcellen (PCT W094/29437). Ytterligere modifikasjoner av disse vektorer inkluderer innskudd av promotergenekasett i LTR regionen for å skape doble kopivektorer (PCT, WO 89/11539). 1 begge disse vektorer er det imidlertid de hetrologe promotere innskutt enten i vektorkroppen eller i LTR regionen som er direkte koblet til markørgenene/terapeutiske gener.

Den tidligere beskrevet SIN vektor nevnt ovenfor, som bærer en delert 3'LTR (PCT, "W094/29437) utnytter i tillegg en sterk heterolog promoter slik som den til Cytomegalovirus (CMV), istedenfor den retrovirale 5'LTR promoter (U3-fri 5'LTR) for å drive ekspresjon av vektorkonstruksjonen i pakkecellelinjen. Et heterologt polyadenyleringssignal er også inkludert i 3'LTR (PCT W094/29437).

Det er derfor en hensikt å konstruere en ny retroviral vektor uten ovennevnte ulemper. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Hensikten med den foreliggende oppfinnelsen er konstruksjonen av en ny retroviral vektor som kan anvendes som en sikker geneoverføirngsbærer for målrettet genterapi, med en redusert mulighet til å gjennomgå rekombinering med pakkekonstruksjonen. Denne nye vektor bærer heterologe promoter- og/eller regulatoriske elementer i 3'LTR som, etter infeksjon blir duplisert og flyttet til 5' LTR i målcellen, kontrollerer evt. ekspresjon av markør-terapeutiske gener, ikke direkte koblet til promotoren, men heller innskutt i vektorens kropp. Denne vektor gjennomgår ikke selvinaktivering men isteden promoterutveksling og gir opphav til navnet ProCon for Promoter Konversjon.

Siden Promoter Konversjon ikke resulterer i selvinaktivering vil den retrovirale vektor være transkripsjonelt aktiv i målcellen. Imidlertid vil begge LTR i stor grad bestå av en stor utstrekning av heterologe promoter/enhancersekvenser i målcellen. Dette vil redusere sansynligheten for at en integrert vektor i målcellen skal bli utsatt for samme inaktivering over lange perioder som er blitt beskrevet for konvesjonelle vektorer (Xu et al., 1989) og vil også redusere sjansen til rekombinering med endogene retrovirale sekvenser for å danne potensiell patogen replikasjonskompetent virus, og øke sikkerheten i systemet.

I den foreliggende oppfinnelse er 5'LTR i den retrovitrale vektorkonstruksjon ikke modifisert og ekspresjon av den virale vektor i pakkecellene bli drevet av den normale retrovirale U3 promoter. Normal retroviral polyadenylering er tillatt og ingen heterologe polyadenyleirngssignaler er inkludert i 3'LTR. Dette viktig for utvikling av in vivo genterapi-strategier siden den normale fysiologiske regulering av virus, gjennom den normale viruspromoter, og som evt. også involverer den normale virale kontroll av polyadenylering vil virke over lange perioder in vivo mens pakkecellene produserer rekombinant virus.

En ytterligere modifikasjon av denne nye retrovirale vektor forutser inklusjon av cellulære sekvenser istedenfor de heterologe promoter og/eller regulatoriske elementer. Dette skulle tillate høyere selektivitet for setespesifikk rekombinasjon med cellulære sekvenser for å målrette integrasjonen av retrovirale vektorer til spesielle seter i vertscellegenomet (Saller, 1994).

For å oppnå de ovennevnte og andre hensikter tilveiebringer oppfinnelsen en retroviral vektor som gjennomgår promoterkonversjon som omfatter en 5' LTR region i strukturen U3-R-U5; en eller flere sekvenser valgt fra kodede og ikkekodede sekvenser; og en 3' LTR region som omfatter en fullstendig eller delvis del ert stor U3 region hvori nevnte del erte U3 region blir erstattet med en polylinkersekvens etterfulgt av R og U5 region.

Nevnte polylinkersekvens bærer minst et unikt restriksjonssete og inneholder fortrinnsvis minst et innskudd av et heterologt DNA fragment. Nevnte heterologe DNA fragment blir fortrinnsvis valgt fra regulatoriske elementer og promotere, som fortrinnvis er mål cel lesp esi fikke i sin ekspresjon men kan også være et DNA fragment uten noen regulatorisk funksjon.

Nevnte heterologe DNA fragment er fortrinnsvis homologt i en eller flere cellulære sekvenser. De regulatoriske elementene og promotorene er fortrinnsvis regulerbare ved utførende molekyler.

Ytterligere hensikter, trekk og fordeler vil være klart fra det følgende beskrivelse av foretrukne utforminger av oppfinnelsen.

De målcellespesifikke regulatoriske elementer og promotere blir valgt fra en eller flere elementer i gruppen som består av Whey Acidic Protein (WAP), Mus brystkreftvirus (MMTV), p-lactoglobulin og kaseinspesifikke regulatoriske elementer og promotere, pankreasspesifikke regulatoriske elementer og promotere inkludert karbonanhydrase II og |3-glukokinase regulatoriske elementer og promotere, lymfocyttspesifikke regulatoriske elementer og promotere inkludert immunoglobulin og MMTV lymfocyttspesifikk regulatoriske elementer og promotere og MMTV spesifikke regulatoriske elementer og promotere som gir respons ovenfor glucokorticoidhormoner og styrer ekspresjonen til brystkjertelen. Nevnte regulatoriske elementer og promotere regulerer fortrinnsvis ekspresjon av minst en av de kodende sekvenser av nevnte retrovirale vektor. LTR regionene er valgt fra minst et element i gruppen som består av LTR fra Murine Leukemivirus (MLV), mus brystkreftvirus (MMTV), murin sarkomvirus (MSV), apeimmunosviktvirus (SIV), human immunosviktvirus (HIV), human T-celleleukemivirus (HTLV), fel in immunosviktvirus (FIV), felin leukemivirus (FELV), bovin leukemivirus (BLV) og Mason-Pfizer-Monkeyvirus (MPMV).

Den retrovirale vektor er basert fortrinnsvis enten på en BAG vektor (Price et el. 1987) eller en LXSN vektor (Miller and Rosman, 1989).

Den kodende sekvens er fortrinnsvis valgt fra en eller flere elementer i gruppen

. som består av markørgener, terapeutiske gener, antivirale gener, antitumorgener, cytokingener.

Nevnte markør og terapeutiske gener er fortrinnsvis valgt fra en eller flere elementer i gruppen som består av p-galaktosidasegen, neomycingen, Herpes simplex vkus tymidinkinase gen, puromycingen, cytosindeaminasegen, hygromycingen, sekrert alkalisk fosfatasegen, guaninfosforibosyltransferase (gpt) gen, alkoholdehydrogenasegen og hypoxantinfosforibosyltransferase (HPRT) gen. En annen utforming av oppfinnelsen omfatter forandring eller delvis delesjon av minst en retroviral sekvens nødvendig for integrasjon av retrovirus.

I en ytterligere utforming av oppfinnelsen er det tilveiebrakt et retroviralt vektorsystem som omfatter en retroviral vektor som beskrevet ovenfor som en første komponent og en pakkecellelinje som har minst en retroviral eller rekombinant retroviral konstruksjon kodene for proteiner som er nødvendig for nevnte retrovirale vektor å bli pakket.

Pakkecellelinjen har retrovirale eller rekombinante retrovirale konstruksjoner som koder for de retrovirale proteiner som ikke er kodet i nevnte retrovirale vektor. Pakkecellelinjen er fortrinnsvis valgt fra et element i gruppen som består av psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 og GP+envAM-12, eller enhver av disse superoverført med rekombinante konstruksjoner som tillater ekspresjon av overflateproteiner fra andre kappeviruser.

En annen utforming av oppfinnelsen omfatter bruk av pakkecellelinjen som har en rekombinant retroviral konstruksjon som er defekt i integrerende funksjon.

Etter innføring av den retrovirale vektor i henhold til oppfinnelsen som beskrevet ovenfor i en retroviral pakkecellelinje og infeksjon av en målcelle som beskrevet ovenfor, blir det tilveiebrakt en retroviral provirus hvori nevnte polylinker og alle sekvenser innskutt i nevnte polylinker i 3'LTR blir duplisert under prosessen reversert transkripsjon i den infiserte målcelle og kommer til syne i 5'LTR såvel som i 3'LTR i den resulterende provirus.

Oppfinnelsen inkluderer også mRNA til en retroviral provirus i henhold til oppfinnelsen og enhver RNA som resulterer fra en retroviral-vektor i henhold til oppfinnelsen.

En ytterligere utforming av oppfinnelsen tilveiebringer ikketerapeutisk framgangsmåte for å innføre homologe og/eller heterologe nukleotidsekvenser i humane eller dyreceller in vitro og in vivo som omfatter å overføre i en pakkecellelinje for et retroviralt vektorsystem i henhold til oppfinnelsen en retroviral vektor i henhold til oppfinnelsen og infisere en målcellepopulasjon med rekombinante retrovirus produsert av pakkecellelinjen. Nukleotidsekvensene er valgt fra en eller flere elementer i gruppen som består av gener eller deler av gener som kode for proteiner, regulatoriske sekvenser og promotere.

Den retrovirale vektor, det retrovirale vektorsystem og den retrovirale provirus såvel som RNA derav blir brukt til å produsere en farmasøytisk sammensetning for genterapi hos pattedyr, inkludert mennesker. Videre er de brukt for målrettet integrering i homologe cellulære sekvenser.

Promoterkonversjon

Den foreliggende oppfinnelse bruker prinsippet for promoterkonversjon som er typisk for retrovirus.

Det retrovirale genom består av et RNA molekyl med strukturen R-U5-gag-pol-env-U3-R (figur 2). I løpet av prosessen reversert transkripsjon blir U5 regionen duplisert og plassert i den høyre enden av det dannede DNA- molekyl, mens U3 regionen blir duplisert og plassert i venstre ende av det dannede DNA-molekyl (figur 2). Den resulterende struktur U3-R-U5 er kalt LTR (Long Terminal Repeat) og er således identisk og repetert i begge ender av DNA-strukturen eller provirus (Varmus, 1988). U3 regionen på venstre ende av provirus har promoteren (se nedenfor). Promoteren driver syntesen av et stort RNA transkript som er initiert ved grensen mellom de venstre U3 og R regioner og avsluttes på grensen mellom de høyre R og U5 regioner (figur 2). Denne RNA blir pakket inn i retrovirale partikler og transportert inn i målcellen som skal infiseres. I målcellen blir RNA-genomét igjen reverst transkribert som beskrevet ovenfor.

I henhold til oppfinnelsen blir det konstruert en retroviral vektor i hvilken den høyre U3 regionen er forandret (figur 3), men den normale venstre U3 struktur blir opprettholdt (figur 3); vektoren kan normalt transkriberes til RNA ved å utnytte den normale retrovirale promoter lokalisert i venstre U3 regionen (figur 3). Det dannede RNA vil imidlertid bare inneholde den forandrede høyre U3 struktur. I den infisere målcelle vil, etter revers transkripsjon, denne forandrede U3 struktur plasseres i begge ender av den retrovirale struktur (figur 3).

Hvis den forandrede region bærer en polylinker (se nedenfor) isteden for U3 regionen kan enhver promoter, inkludert de som styrer vevspesifikk ekspresjon, såsom WAP promoter (se nedenfor), lett innskytes. Promoteren vil deretter utnyttes eksklusivt i målcellen for ekspresjon av koblede gener båret av den retrovirale vektor. Alternativt eller i tillegg kan DNA-segmenter homologe til en eller flere cellulære sekvenser innskytes i polylinkeren med den hensikt å målrettes til et gen, ved homolog rekombinasjon (se. nedenfor).

I henhold til oppfinnelsen er betegnelsen "polylinker" brukt for en kort utstrekning av kunstig syntetisert DNA som bærer et antall unike restriksjonsseter som tillater lett innskudd av enhver promoter eller DNA- segment. Betegnelsen "heterolog" blir brukt for enhver kombinasjon av DNA-sekvenser som ikke er normalt funnet tett assosiert i naturen.

Genekspresjon er regulert av promotere. I fravær av promoterfunksjon vil et gen ikke uttrykkes. Den normale MLV retrovirale promoter er rimelig uselektiv ved at den er aktiv i de fleste celletyper (Major, 1990). Det eksisterer imidlertid et antall promotere som viser aktivitet bare i meget spesifikke celletyper. Slike vevsspesifikke promotere vil være ideelle kandidater for regulering av genekspresjon i retrovirale vektorer idet de vil begrense ekspresjon av de terapeutiske gener til spesifikke målceller.

I pakkecellelinjen blir ekspresjon av den retrovirale vektor regulert ved den normalt uselektive retrovirale promotor inneholdt i U3-regionen (figur 3). Imidlertid så snart som vektoren innføres i målcellen skjer promoterkonversjon og det terapeutiske eller markørgenet, for eksempel P-galactosidase blir uttrykt fra en valgt vevsspesifikk promotor innført i polylinkeren (figur 3). Ikke bare kan generelt enhver spesifikk promoter inkluderes i systemet, og forutsette den selektive målretting av en stor variasjon av forskjellige celletyper, men i tillegg etter konvérsjonshendelsen ligner hverken strukturen eller egenskapene til den retrovirale vektor på de til en virus. Dette har selvfølgelig ytterst viktige konsekvenser fra et sikkerhetssynspunkt, siden normale eller retrovirale vektorer i henhold til kjent teknikk lett gjennomgår genetisk rekombinasjon med den retrovirale pakkekonstruksjon og/eller endogene retrovirus for å fremstille potensielt patogene viruser. Promoterkonversjon (ProCon) vektorer ligner ikke retroviruser fordi de ikke lenger bærer U3 retrovirale promotere etter konversjon for således å redusere muligheten av genetisk rekombinasjon.

Den retrovirale promoterstruktur blir båret i U3 regionen til LTR. LTR bærer signaler som tillater dem å integreres i genomet til målcellen. Integrasjon av retrovirale proviruser kan også bidra til patogene forandringer (van Lohuizen and Berns, 1990). I en utforming av oppfinnelsen kan Procon-vektorer bære modifisert LTR som ikke lenger bærer signalene som er nødvendig for integrasjon. Igjen øker dette den potensielle sikkerhet til disse vektorsystemer.

Genmålretting

I henhold til en annen side av den foreliggende oppfinnelse blir den retrovirale vektor brukt til å målrette integrering i målcellen. Integreringen av den provirale DNA versjon av det retrovirale genomet inn i målcellen er en viktig fordel ved anvendelse av retroviruser som vektorer sammenlignet med andre viruser, såsom adenoviruser, siden den tillater lang tids stabil ekspresjon av overførte gener. Deri tilfeldig natur til denne integrasjonshendelse gir også imidlertid opphav til viktige ulemper vedrørende bruk av retrovirale vektorer siden det øker muligheten av innskudds (in)aktivering av cellulære tumor suppressorgener eller proto-oncogener og således tumorinduksjon (van Luhuizen and Berns, 1990).

Homolog rekombinasjon er blitt med hell brukt til å målrette integrering av transfiserte eller mikroinjisert DNA til spesifikke DNA steder og blir rutinemessig brukt i konstruksjon av "knock-out" transgene mus eller dyr (oversikt hos Capecchi, 1989; Bradley et al., 1992; Morrow and Kucherlapati, 1993). Uheldigvis er effektiviteten av DNA overføring ved slike rene fysiske fremgangsmåter ekstremt lav. I motsetning er retroviralt mediert genoverføring meget effektiv, nesten 100% av en populasjon av celler blir infiserbare. En kombinasjon av retroviral genoverføring med homolog rekombinasjon burde tillate konstruksjon av et ideelt system for locusmålrettet integrering.

Vi har undersøkt hvor lett det var å introdusere lange homologe stykker av DNA i retrovirale vektorer på forskjellige steder for å påvirke integrering av homolog rekombinasjon (Saller, 1994). Både genkonversjon og homolog rekombinasjon er blitt evaluert. Ved å bruke en cellelinje som bærer en enkel kopi av HSV-tk genet som et mål, har vi vært i stand til å avbryte målet i frekvenser 15 ganger høyere enn tidligere rapportert av andre (Ellis and Bernstein, 1989). Kloning av de rekombinrete fragmenter av DNA har vist nærvær av både mål tk-sekvens og retroviral vektor (Saller, 1994).

For målrettet integrasjon blir DNA-segmenter homologe til cellulære sekvenser innskutt i polylinkeren til ProCon vektorene. Etter infeksjon av målcellen og revers transkripsjon , vil disse sekvenser komme til syne i 5' terminalen av provirus. Terminale homologier er blitt vist å favorisere homolog rekombinasjon (Bradley, 1991) til isogene cellulære sekvenser (Bradley, 1991). Infeksjon av målcellen som bærer muterte versjoner av den homologe sekvensen skulle resultere i rekombinasjon og således reparasjon av den muterte sekvens. Enten vil bare de homologe sekvensene rekombineres i det cellulære genomet, eller den fullstendige vektor vil innskytes (Saller, 1994). Ikke bare har denne vektorklasse potensiale for anvendelse i genreparasjon, men den kan også utnyttes for å styre integrasjon av retrovirale vektorer som bærer terapeutiske gener til spesifikke steder i genomet som er kjent ikke å ha aktive gener. Dette vil i betydelig grad redusere muligheten av innskuddsaktivering eller inaktivering som beskrevet ovenfor, og vil således bidra til sikkerhet ved anvendelse av retrovirale vektorer.

De følgende eksempler vil illustrere oppfinnelsen videre. Disse eksempler er ikke på noen måte ment å begrense omfanget av den foreliggende oppfinnelse idet fagmessige modifikasjoner vil være klare og enda andre modifikasjoner og substitusjoner vil være kjent for de med kunnskap på området.

De rekombinante DNA fremgangsmåtene anvendt ved praktisering av forliggende oppfinnelse er standard fremgangsmåte, vel kjent for de med kunnskap på området og beskrevet i detalj for eksempel i "Molecular Cloning" (Sambrook et al. 1989) og i "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal, 1984).

Kort beskrivelse av tegningene referert til i de følgende eksempler:

Fig. 1: Retroviralt vektorsystem

Fig. 2: Retroviralt genom, revers transkripsjon

Fig. 3: ProCon prinsipp

Fig. 4: PCR analyse, ML V probe

Fig. 5: PCR analyse, MMTV probe

Fig. 6: P-galactosidaseekspresjon i infisert NIH- og EF43-celler

Fig. 7: p-galactosidaseekspresjon i infiserte primære brystkjertelceller

fra gravide mus.

Fig. 8: P-galactosidaseekspresjon etter virusinjeksjon i brystkjertel og

hud til gravid Balb/c mus.

Fig. 9: p-galactosidaseekspresjon i infiserte brystkreftceller.

Fig. 10: . Målrettet integrasjon av en retroviral vektor ved homolog rekombinasjon.

Eksempel 1

Brystkjertelspesifikk ekspresjon etter infeksjon med ProCon vektorer som bærer brystspesifikke promotere.

I den murine leukemivirus (MLV) retrovirale vektor kjent som BAG (Price et al., 1987) er p-galactosidasegenet drevet av den promiskuøse (dvs. ikke vevsspesifikke) MLV promoter i U3 regionen til LTR (figur 3). I henhold til foreliggende oppfinnelse er et derivat av BAG vektoren blitt konstruert i hvilken MLV promotoren (U3) lokalisert i 3'LTR (figur 3) er blitt deletert og erstattet med en polylinker, hvor nevnte polylinker tillater lett innføring av heterologe promotere. BAG vektoren som mangler U3 blir uttrykt fra MLV promotoren (U3) i 5'LTR når den innføres i en pakkecellelinje. Som et resultat av de rearrangementer som skjer i det retrovirale genom i løpet av livssyklus etter infeksjon av målcellen vil polylinkeren bli duplisert i begge ender av det retrovirale genom som beskrevet ovenfor. Derved kan en retroviral vektor konstrueres i hvilken ekspresjonen av p-galactosidasegenet til BAG vil kontrolleres ved enhver heterolog promoter innskutt i polylinkeren i målcellen (figur 3).

I henhold til prinsippet fremsatt ovenfor har de følgende spesifikke promotere blitt innskutt i polylinkerregionen eller den modifiserte BAG vektor: Flere subregioner av musbrystkreftvirus (MMTV) promoter inkluderert en region som gir respons til glucokorticoidhormoner og en region som inneholder et element som styrer ekspresjon til brystkjertelen.

Whey Acidic Protein (WAP) promoter. Denne promoter kontrollerer ekspresjon av WAP slik at det bare produseres i brystkj erti ene til gravide og lakterende gnagere.

Kontroll av p-galactosidasegenekspresjon ved promotere innskutt i polylinkeren er blitt validert ved infeksjonstudier ved å bruke de konstruerte MMTV og WAP

retroviral vektorer for å infisere forskjellige celler.

For å produsere retrovirale vektorpartikler har MMTV og WAP ProCon vektorer blitt transfisert inn i pakkecellelinjen GP+E86 (Markowitz et al., 1988). Etter seleksjon for neomycinmotstandsevne som blir kodet av vektoren ble det oppnådd stabile populasjoner og kloner av rekombinant ProCon virus produserende celler. Virus som inneholdt supernatant fra disse populasjonene ble brukt til å infisere en musebrystcellelinje EF43 (Giinzburg et al., 1988) såvel som en musfibroblastcellelinje (Jainchill et al., 1969). Fire dager etter ble målcellen lysert og kvantitativt p-galactosidaseassay ga ingen ekspresjon i noen celletype infisert med WAP som bærer ProCon vektorer og god ekspresjon i begge celletyper fra MMTV som bærer ProCon vektor (figur 6). Dette resultatet er i overensstemmende med WAP promotoren som bare fungerer in vivo i sen graviditet og laktasjon og ikke i de enkleste in vitro brystcellekultursystemer som representert av EF43 cellene. For å undersøke i hvilken grad WAP bærende ProCon vektorer ville være aktive i et komplekst primært brystavledet cellekultursystem, ble primære organer fra 8-10 dager gravide mus (figur 7) eller fra brystkreft (figur 9) tatt i kultur og infisert med supernatanten fra den samme stabile transfiserte populasjon av transfiserte cellelinjer. Begge ProCon vektorer som bar WAP og MMTV promoterfragmanter var aktive i disse primære celler (figur 7) og brystkreftavledende celler (figur 9) som demonstrert ved

P-gal actosidaseakti vitet.

For å undersøke i hvilken grad WAP og MMTV som bærer ProCon vektorer var aktive in vivo og i hvilken grad ekspresjon av p-galactosidase var begrenset til kjønnskjertler in vivo ble rekombinant ProCon virus som inneholder medium

injisert in situ i brystkjertelen eller hud til 8-10 dager gravide mus. 5 dager senere ble musene ofret, celleekstrakter preparert og et p-galactosidaseassay utført. Både . WAP og MMTV fragment som bærer ProCon vektorer ble uttrykt bare i den gravide bryskjertel og ikke i huden, (cf M og S i figur 8). Således begrenser de regulatoriske elementer fra begge promotorer ekspresjon til brystkjertelen mens in vitro vedlikeholder de regulatoriske elementene fra WAP promotoren sin strenge vevsspesifisitet men de fra MMTV gjør det ikke.

Disse ProCon vektorer som bærer vevsspesifikke promotere og regulatoriske elementer vil være nyttige for å styre ekspresjon av terapeutiske gener til forutdefinerte celletyper, vev og organer. Potensielle terapeutiske gener inkluderer melittin, som har anti-HIV og anti-tumorvirkninger og gener som forbereder celler for død, inkludert tymidinkinase, guaninfosforibosytransferase og cytosindeaminasegener, cytokrom P450 såvel som gener involvert i cellesyklusregulering, såsom SDI/WAF-l/CIP-1.

Eksempel 2

Validering av promoterkonversjon i celler infisert med en ProCon vektor som opprinnelig var MMTV promoteren i 3'LTR.

En ProCon vektor som bærer promotorregionen fra mus brystkreftvirus (MMTV)

ble transfisert inn i en pakkecellelinje og de resulterende rekombinante vektorpartikler brukt til å infisere en etablert human blærekarsinomcellelinje (EJ). Infiserte cellekloner ble selektert i medium som bærer neomycinanalogen G418 (siden vektoren bærer et neomycinmotstandsdyktig gen drevet fra en indre SV40 promoter). DNA ble fremstilt fra en av de infiserte kloner og ikketransfiserte parenterale EJ celler og brukt til polymerasekjedereaksjon (PCR). PCR ble utført ved å bruke en av to primære som spesifikt gjenkjenner og bindes til MMTV sekvenser (A, B i fig. 4 & 5) eller MLV R region (C i fig. 4) i LTR sammen med en primer lokalisert i markørgenet (figur 4 og 5) . Siden markørgenprimeren bare er lokalisert nedstrøms for MMTV (eller MLV R region) sekvensen hvis promoterkonvensjon har skjedd, er et positivt PCR signal oppnådd med MMTV primere i kombinasjon med markørgenprimeren indikativt på dette. I figur 4 er PCR produktene ved å bruke primere A, B eller C vist etter hybridisering til et merket fragment fra MLV sekvensen, å verifisere at alle tre PCR produkter er av MLV opprinnelse. Størrelsen av fragmentene verifiserer at promoterkonversjon har skjedd. Figur 5 viser PCR produktene ved å bruke primer A eller B og hybridisert til MMTV spesifikk probe, og verifiserer igjen at promoterkonversjon har skjedd.

Eksempel 3

Konstruksjon av ProCon vektorer for målrettet integrasjon.

Ved å bruke' en samme BAG vektor beskrevet i eksempel 1 ovenfor, kan en

retroviral vektor konstrueres i hvilken en DNA-sekvens med homolog til en

cellulær sekvens kan innskytes i LTR. Den resulterende vektor kan anvendes til å målrette integrasjon av enten den homologe sekvens innskutt i vektoren eller hele eller deler av vektorene i den homologe sekvens tilstede i vertscellegenomet.

I henhold til prinsippet fremsatt ovenfor har et fragment av tymidinkinase (tk)

genet i Herpes simplex virus (HSV) blitt innskutt i polylinker regionen til den modifisere BAG vektor (tk mutant i figur 10, Saller, 1994).

En cellelinje er også blitt etablert som ikke har noen funksjonell kopi av pattedyr tk gen og bærer isteden et kopi av HSV-tk genet (Saller, 1994). Denne cellelinje er blitt infisert med den tk bærende BAG vektor og celler som har gjennomgått ødeleggelse av HSV-tk genet er blitt selektert (figur 10).

De ovenstående eksempler .illustrere prinsippene og konsekvensene til promoterkonversjonsvektorene tilveiebrakt ved den foreliggende oppfinnelse.

" Referanser

Anderson, W.F. 1992. Human gene therapy. Science 256: £03-313.

Bradley, A. 1991. Modifytng the mammsJian genome by gene targeting. Curr. Opin. Biotechnol. 2: S23:829.

Bradley, A., P. Hasiy, A. Davis, and R. Ramiraz-Solis. 1992. Mcdifying the mouse: design and desire. Bio/technology 10: 534-539.

Capecchi, M.R. 1989. AJtsring the genome by homologous rscombination. Science 244:1288-1292.

Hlis, J. and A. Bernstein. 1989. Gene Targeting with Retroviral Vectors Recombinatian by Gene Conversion into- Regions of Nonhcmology. Mol. Cell. Biol. 9: 1621-1627.

Emerman, M. and H.M. Temin. 1986. Cornparison of promoter suppression ih avian and murine retrovirus vectors. Nud. Acids Res. 14: 9381-9396.

Gunzburg, W.H., B. Saimons, A. Schlaeffli, S. Moritz-Legrand, W. Jones, N.H..

Sårkar, and R. Ullrich. 1988. Expression of the oncogenes mil and ras abolishes the in vivo differentiation of mammary epitheliaj cells. Carcinogenesis 9:1849-1856.

Jainchill, J.L., S.A Anderson, and G.J. Todaro. 1969. Murine sarcoma and (eukaemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells. J. Virol 4: 549-553.

Kota/ii, H., P.B. Newton, S. Zhang, Y.L Chiang, E. Otto, L Weaver, R.M. Blaese, W.F. Anderson, and G.J. McGamry. 1994. Improved methods of retroviral vector transduction and production for gene therapy. Human Gene Therapy 5: 19-28.

Majors, J. 1990. Tne structure and function of retroviral long terminal repeats, Curr.

Tops. ln Micro, fmmunol. 157:49-92.

Markowitz, D., S. Goff, and A. Bank. 1983. A safe packaging fine for gene transfer separating viral genes on two different plasmids. J. Virol. 62:1120-1124.

Miller, A.D. and G.J. Rossman. 1989. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. Biotechniques 7: 980-990.

Morrow, B. and R. Kucherfapati. 1993. Gene targeting in mammalian cells by homologous recombination. Current Opinion in Biotechnology 4: 577-582.

Perbal, B. 1984. A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiiey å Sons.

Price, J., D. Turner, and C. Cepko. 1987. Lineage anaiysis in the vsrtebrate nervous system by retrovirus-mediated gene transfer. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:156-160.

Rosenberg, S.AV Anderson, W.F.,' Biaese, R.M. et al. 1992. Immunization of cancer patients using autologous cancer cells modified by insertion of the gene for interieukin-2. Hum. Gene Ther. 3: 75-90.

SaJler, R.M. 1994 Design von locus- und gewebespezischen retroviralen Vektoren fuer eine in vivo Gentherapie. Doctora! thesis, Ludwigs-Maximilians University Munich, Germany.

Saimons, B. and W.H. Gunzburg. 1993. Targeting of retroviral vectors for gene therapy. Human Gene Therapy 4:129-141.

Sambrook; J., EF. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Låboratory Press, New York, USA

van Lohuizen and Berns. 1990. Tumorigenests by siow-transforming retroviruses - an update. Biochim. Biophys. Ada, 1032: 213-235.

Varmus, H. 1988. Retroviruses. Science 240:1427-1435.

Xu, L, J.-K. Yee, J.A. Wolff and T. Friedmann. 1989. Factors A/ferting Long-Term Stability of Moloney Murine Leukemia Virus-Based Vectors. Virology 171: 331-341.

Claims (29)

1. -Retroviral vektor som gjennomgår promoterkonversjon, karakterisert ved at den omfatter en 5 'lang terminal gjentagelsesregion i strukturen U3-R-U5, én eller flere sekvenser valgt fra kodende og ikkekodende sekvenser, og en 3' lang terminal gjentagelsesregion som omfatter en fullstendig eller delvis delert U3 region hvori nevnte delerte U3 region er erstattet av en sekvens som omfatter en heterolog promoter som ikke er beslektet med den retrovirale vektor, hvor nevnte promoter regulerer, etter infeksjon av målceller, ekspresjon av minst én av de kodende sekvensene hvor nevnte kodende sekvenser er innsatt i kroppen av vektoren.

2. Retroviral vektor som angitt i krav 1, karakterisert ved at det den delerte U3-regionene omfatter et regulatorisk element.

3. Retroviral vektor som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte regulatoriske element og/eller promoter er målcellespesifikke i sin ekspresjon.

4. Retroviral vektor som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte målcellespesifikke regulatoriske element og promoter er valgt fra én eller flere elementer i gruppen som består av WAP, MMTV, b-laktoglobulin og kasein-spesifikke regulatoriske elementer og promotere, pankreasspesifikke regulatoriske elementer og promotere inkludert karbon anhydrase II og b-glukokinase regulatoriske elementer og promotere, lymfocytt-spesifikke regulatoriske elementer og promotere inkludert immunoglobulin og MMTV lymfocytt-regulatoriske elementer og promotere og MMTV-spesifikke regulatoriske elementer og promotere som gir mottakelighet til glukokortikoid-hormoner eller styrer ekspresjonen til brystkjertelen.

5. Retroviral vektor som angitt i ett av kravene 2-4, karakterisert ved at nevnte regulatoriske element og promoter regulerer ekspresjonen av minst én av de kodende sekvensene i nevnte retrovirale vektor.

6. Retroviral vektor som angitt i ett av kravene 1-5, karakterisert ved at nevnte LTR regioner er valgt fra minst ett element fra gruppen som består av LTR fra MLV, MMTV, MS V, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV og MPMV..

7. Retroviral vektor som angitt i ett av kravene 1-6, karakterisert ved at nevnte retrovirale vektor er en BAG-vektor.

8. Retroviral vektor som angitt i et av kravene 1-7, karakterisert ved at nevnte kodende sekvenser valgt fra én eller flere elementer fra gruppen som består av markørgener, terapeutiske gener, antivirale gener, antitumorgener, cytokingener.

9. Retroviral vektor som angitt i et av krav 8, karakterisert ved at nevnte markør eller terapeutisk gen er valgt fra én eller flere elementer i gruppen som består av b-galactosidasegen og neomicingen, Herpes Simplex Virus, tymidin kinase-gen, puromicyn-gen. cytosindeaminase-gen, hygromycingen, sekrert alkalisk fosfatasegen, guanin-fosforibocyl transferase (gpt) gen, alkohol dehydrogenase-gen og hypoxantin fosforibosyl transferase (HPRT) gen.

10. Retroviral vektor som angitt i krav 1-9 , karakterisert ved at nevnte kodende sekvensene for et retroviralt protein er forandret eller i det minste delvis delert.

11. Retroviral vektor som angitt i et av kravene 1-10, karakterisert ved at de retrovirale sekvenser involvert i integrasjon av retrovirus blir forandret eller i det minste delvis delert.

12. Retroviral vektor som angitt i ett av kravene 1-11, karakterisert ved, at nevnte heterologisk DNA fragment er homologt til en eller flere cellulære sekvenser eller en del derav.

13. Retroviral vektor som angitt i et av kravene 1-12, karakterisert,ved at nevnte regulatoriske elementer er regulerbare ved utførende molekyler.

14. Retroviral vektorsystem karakterisert ved at det omfatter en retroviral vektor som angitt i ett av kravene 1-13, som en første komponent og en pakkecellelinje som har minst ett retroviralt eller rekombinant retroviralt konstrukt som koder for proteiner nødvendig for at nevnte retrovirale vektor skal bli pakket.

15. Retroviral vektorsystem som angitt i krav 14, karakterisert ved at pakkecellelinjen har retrovirale eller rekombinante retrovirale konstrukter som koder for de retrovirale proteiner som ikke er kodet for i nevnte retrovirale vektor som angitt i ett av kravene 1-13.

16. Retroviral vektorsystem som angitt i krav 14 eller 15, karakterisert ved at pakkecellelinjen er valgt fra gruppen som består av psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 og GP+envAM-12.

17. Anvendelse av et retroviralt vektorsystem som angitt i krav 14-16, til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for å innføre homologe eller heterologe nukleotidsekvenser i human- eller dyreceller in vitro og in vivo som omfatter å transfisere en pakkecellelinje av et retroviralt vektorsystem som angitt i ett av kravene 14-16, med en retroviral vektor som angitt i ett av kravene 1-13, og infisere en målcellepopulasjon med nevnte rekombinante retroviruser produsert av pakkecellelinjen.

18. Anvendelse som angitt i krav 17, hvori nukleotidsekvensen er valgt fra én eller flere elementer i gruppen som består av gener eller deler av gener som koder for proteiner, regulatoriske sekvenser og promotere.

19. Retroviral provirus fremstilt ved replikasjon av den retrovirale vektor som angitt i ett av kravene 1-13 i et retroviralt vektorsystem, som angitt i ett av kravene 14-16, karakterisert ved at nevnte heterologe promoter innsatt i nevnte delerte U3-region blir duplisert under prosessen for revers transkripsjon i den infiserte målcelle og kommer til syne i 5' LTR så vel som i 3 'LTR i det resulterende provirus.

20. Anvendelse av en retroviral vektor som angitt i ett av kravene 1-13, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for genterapi hos pattedyr inkludert mennesker.

21. Anvendelse av et retroviralt vektorsystem som angitt i et av kravene 14-16, til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for genterapi hos pattedyr, inkludert mennesker.

22. Anvendelse av en retroviral provirus som angitt i krav 19, til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for genterapi i pattedyr, inkludert mennesker.

23. Anvendelse av en retroviral vektor som angitt i et av kravene 1 til 13, til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for målrettet integrasjon i nevnte homologe cellulære sekvenser.

24. Anvendelse av et retroviralt vektorsystem som angitt i et av kravene 14 til 16, til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for målrettet integrasjon i nevnte homologe cellulære sekvenser.

25. Anvendelse av en retroviralt provirus som angitt i krav 19, til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for målrettet integrasjon i nevnte homologe cellulære sekvenser.

26. mRNA, karakterisert ved at det kommer fra et retroviralt provirus som angitt i krav 19.

27. RNA, karakterisert ved at det kommer fra-en retroviral vektor som angitt i et av kravene 1 til 13.

28. Rekombinant retroviral partikkel, karakterisert ved at det er oppnådd ved transfeksjon av en pakkecellelinje, et retroviralt vektorsystem som angitt i et av kravene 14 til 16, med en retroviral vektor som angitt i ett av kravene 1 til'13, og dyrking av cellene under egnede betingelser.

29. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at det inneholder en terapeutisk effektiv mengde av en rekombinant retroviral partikkel som angitt i krav 28.