PL184375B1 - Wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora, układ wektora retrowirusowego, sposób wytwarzania prowirusa retrowirusowego, sposób wytwarzania cząstki retrowirusa rekombinowanego, kompozycja farmaceutyczna, mRNA retrowirusowego prowirusa wytworzonego na drodze transkrypcji wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promatora, RNA wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promotora oraz sposóby wytwarzania kompozycji farmaceutycznej - Google Patents

Abstract

1 W ektor retrowirusowy podlegajacy konwersji promotora zawierajacy a ) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5, b) jed n a lub wiele sekwencji wybranych sposród sekwencji kodujacych i niekodujacych, przy czym sekwencje te wprowadzone sa do wektora, a sekwencja kodujaca jest wybrana sposród jednego lub wielu elementów grupy zawierajacej geny m arkerow e, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz c) obszar 3'LTR zawierajacy calkowicie lub czesciowo usuniety obszar U3, przy czym w usunietym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierajaca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny zas wymieniony prom otor ¡/lub element regulacyjny wybrany jest sposród jednego lub wielu elementów grupy zawierajacej kwasne bialko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MM TV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla ß-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki wlacznie z anhydraza weglowa II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla ß -glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów wlacznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla M M TV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujace ekspresje na gruczol sutkowy 9 Uklad wektora retrowirusowego, znam ienny tym, ze jako pierwszy skladnik zawiera wektor retrowirusowy podlegajacy konwersji promotora, zawierajacy a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5, b) jed n a lub wiele sekwencji wybranych sposród sekwencji kodujacych i niekodujacych, przy czym sekwencje te wprowadzone sa do wektora, a sekwencja kodujaca jest wybrana sposród jednego lub wielu elementów grupy zawierajacej geny m arkerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz c) obszar 3'LTR zawierajacy calkowicie lub czesciowo usuniety obszar U3. przy czym w usunietym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierajaca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zas wymieniony prom otor i/lub element regulacyjny wybrany jest sposród jednego lub wielu elementów grupy zawierajacej kwasne bialko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MM TV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla ß-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki wlacznie z anhydraza weglowa II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla ß-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów wlacznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MM TV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla M M TV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujace ekspresje na gruczol sutkowy, a jako drugi skladnik zawiera linie kom órkow a komórek upakowujacych zawierajaca konstrukt retrowirusa lub retrowirusa rekombinowanego kodujacy bialka potrzebne do upakowania wymie- nionego wektora retrowirusowego, przy czym linia komórkowa komórek upakowujacych wybrana jest z grupy zawierajacej psi-2, psi-Crypt, psi- AM, GP+E-86, PA317 oraz GP+envAM-12 PL

Description

Przedmiotem wynalazku są wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora, układ wektora retrowirus3wego, sposób wytwarzania prowirusa retrowirusowegu, sposób wytwarzania cząstki retrowirura rek3mbin3wabego, kompozycja farmaceutyczna, mRNA retrowirusoweg3 prowirusa wytworzonego na drodze transkrypcji wektora retrowirusoweg3 podlegającego konwersji promotora, RNA wektora retrowirur3weg3 podlegającego konwersji promotora oraz sposoby wytwarzania kompozycji farmaceutycznej.

W terapii genowej wiele uwagi poświęcono metodzie z zastosowaniem wektorów retrowirusowych, która obecnie stanowi zalecaną metodę przenoszenia genów terapeutycznych w licznych uznanych procedurach leczniczych zarówno w USA jak i w Europie (Kotani i inni, 1994). Jednak większość z tych procedur wymaga, aby zakażenie docelowych komórek wektorem retrowirur3wym przenoszącym gen terapeutyczny miało miejsce in vitro. W procedurach tych skutecznie zakażone komórki są następnie powtórnie wprowadzane do organizmu osobnika dotkniętego chorobą (Rosenberg i inni, 1992; patrz też publikacja Andersona, 1992). Tego typu genetyczne procedury lecznicze ex vivo sprawdzają się idealnie w leczeniu przypadków, w których populacja komórek docelowych może być łatwo izolowana i wydzielona (na przykład, limfocytów). Dodatkową korzyścią płynącą z zastosowania tej metody jest fakt, ze zakażenie komórek docelowych ex vivo pozwala na użycie dużych ilości stężonych roztworów wirusa, które przed użyciem można rygorystycznie przebadać pod kątem bezpieczeństwa.

Niestety, tylko niewielka część możliwych zastosowań terapii genowej dotyczy komórek docelowych, które dadzą się łatwo izolować, hodować, a następnie ponownie wprowadzić do organizmu. W dodatku, skomplikowana technologia oraz związane z nią wysokie koszty terapii genowej ex vivo skutecznie uniemożliwiają jej szerokie stosowanie w świecie. Przyszłe, łatwiejsze i tańsze metody terapii genowej będą musiały stosować rozwiązania in vivo, w których wektor retrowirusowy podawany będzie pacjentowi bezpośrednio w postaci zastrzyku łub też komórki wytwarzające wektor retrowirusowy będą bezpośrednio implantowane w organizmie pacjenta.

Oczywiście, tego typu rozwiązania in vivo niosą ze sobą całą gamę nowych problemów. Przede wszystkim i nade wszystko należy zająć się zagadnieniami związanymi z bezpieczeństwem. Wirusy będą najprawdopodobniej wytwarzane za pomocą implantacji komórek wytwarzających wirusy i w związku z tym nie będzie możliwości ich wstępnego przebadania. Jest przy tym istotne, aby zdawać sobie sprawę z określonego ryzyka związanego z użyciem takich układów jak również, aby pracować w kierunku wytwarzania takich układów, które zmniejszaj ą takie ryzyko.

Układy wektorów retrowirusowych składają się z dwóch komponentów (fig. 1):

1) sam wektor jest zmodyfikowanym retrowirurem (plazmidem wektorowym), w którym geny kodujące sekwencje białek wirusa zastąpione zostały genami terapeutycznymi oraz genami markerowymi, przeznaczonymi do przeniesienia do komórki docelowej. Ponieważ jednak zastąpienie genów kodujących sekwencje białek wirusa skutecznie unieruchamia ten wirus, należy go następnie uruchomić poprzez dodanie do układu drugiego komponentu, który zmodyfikowanemu retrowirusowi dostarczać będzie brakujących białek.

Drugim komponentem jest:

2) linia komórkowa produkująca duze ilości białek wirusa nie posiadająca jednak możliwości wytwarzania zdolnych do replikacji wirusów. Linia ta znana jest jako linia komórek upakowujących i składa się z komórek transfekowanych drugim plazmidem, który przenosi geny umożliwiające upakowanie zmodyfikowanego wektora retrowirurowego.

W celu wytworzenia wektora upakowanego, plazmid wektorowy transfekowany jest do linii komórek upakowujących. W tych warunkach zmodyfikowany genom retrowirusa zawie184 375 rający wprowadzone geny terapeutyczne oraz geny markerowe transkrybowany jest z plazmidu wektora i upakowany w zmodyfikowanych cząstkach retrowirusowych (wirusowe cząstki rekombinowane). Wirus rekombinowany jest następnie używany do zakażenia komórek docelowych, w których genom wektora wraz z przenoszonymi genami terapeutycznymi oraz genami markerowymi wbudowywany jest do DNA komórki docelowej. Ponieważ w komórce zakazonej takimi wirusowymi cząstkami rekombinantowymi nie są obecne białka wirusa wektorowego, nie jest ona w stanie wytworzyć nowych egzemplarzy tego wirusa. Jednak DNA wektora przenoszącego geny terapeutyczne oraz geny markerowe jest już teraz wbudowany do DNA komórki i może w komórce zakażonej podlegać ekspresji.

Zasadniczo przypadkowa integracja prowirusowej postaci genomu retrowirusa z genomem komórki zakażonej (Yarmus, 1988) prowadzi do identyfikacji sporej liczby komórkowych proto-onkogenów aktywowanych wskutek insercji genomu retrowirusa (Varmus, 1988; van Lohuizen i Berns, 1990). Potencjalna możliwość, że u pacjentów leczonych wektorami retrowirusowymi przenoszącymi geny terapeutyczne przeznaczone do leczenia innych, istniejących już stanów chorobowych podobny mechanizm może prowadzić do powstawania nowotworów złośliwych stanowi ciągle powracający problem natury etycznej. Większość badaczy jest zdania, ze prawdopodobieństwo, iż uszkodzony w zakresie replikacji wektor retrowirusowy (czyli taki, jak wszystkie stosowane obecnie) wbuduje się do genu komórkowego kontrolującego rozmnazanie komórki lub w jego bezpośrednie pobliże jest tak małe, ze można je pominąć. Jednak, uważa się także powszechnie, że w następstwie pojedynczego aktu zakażenia możliwy jest eksplozywny wzrost populacji zdolnego do replikacji retrowirusa. Taki wzrost może zapewnić wystarczającą ilość pojedynczych aktów integracji tak, aby integracja fenotypowa stała się całkiem realną możliwością.

Układy wektorów retrowirusowych tak są konstruowane, aby zminimalizować szansę wystąpienia wirusa zdolnego do replikacji. Stwierdzono jednak ponad wszelką wątpliwość, że pojedyncze akty rekombinacji pomiędzy komponentami układu wektora retrowirusowego mogą prowadzić do generacji zdolnego do replikacji, potencjalnie patogennego wirusa, i w związku z tym, aby zminimalizować ryzyko takiej rekombinacji, tworzy się układy wektorów w oparciu o liczne generacje (problem ten omówiony został w publikacji Salmons'a i Gunzburg'a, 1993).

Kolejnym problemem związanym z dyskutowaną terapią genową in vivo, rozważanym zarówno ze względu na bezpieczeństwo jak i z czysto praktycznych powodów, jest problem naprowadzania wektorów retrowirusowych na docelowe komórki. Jest oczywiste, że geny terapeutyczne przenoszone za pomocą wektora nie powinny bez ograniczeń podlegać ekspresji we wszystkich tkankach czy komórkach, lecz tylko w wyznaczonych komórkach docelowych. Jest to szczególnie ważne w przypadku, gdy geny przeznaczone do przeniesienia są genami toksyn, których zadaniem jest unicestwienie specyficznych komórek nowotworowych. Niszczenie komórek innych niz docelowe byłoby oczywiście wysoce niepożądane.

Opisano do tej pory znaczną ilość układów wektorów retrowirusowych, które pozwalają ukierunkowywać przenoszone geny terapeutyczne (Salmons i Gunzburg, 1993). Większość z tych rozwiązań dotyczy albo ograniczenia aktu zakażenia do wcześniej określonych typów komórek albo tez użycia promotorów heterologicznych tak, aby ukierunkować ekspresję przyłączonych heterologicznych genów terapeutycznych lub markerowych na specyficzne typy komórek. Używa się takich promotorów heterologicznych, które pobudzają ekspresję przyłączonych genów wyłącznie w takich typach komórek, w których dany promotor sam jest aktywny. Promotory takie wprowadzone są wcześniej, w połączeniu z genami markerowymi i terapeutycznymi, do wektorów retrowirusowych w miejsce genów gag, pol lub env.

Retrowirusowa jednostka LTR (Long Terminal Repeat) flankująca powyższe geny przenosi promotor retrowirusowy, który jest generalnie niespecyficzny w tym sensie, że może wywołać ekspresję w wielu różnych typach komórek (Majors, 1990). Odnotowano także interferencję pomiędzy promotorem LTR a wewnętrznymi promotorami heterologicznymi takimi, jak opisane powyżej specyficzne promotory ukierunkowane na konkretną tkankę. Wiadomo poza tym, że jednostki retrowirusowego LTR są siedliskiem silnych enhancerów, które mogą, niezaleznie od siebie lub tez we współdziałaniu z promotorem retrowirusowym, wpły12

184 375 wać na ekspresję genów komórkowych w pobliżu miejsca integracji retrowirusa. Wykazano, że mechanizm ten przyczynia się do powstawania nowotworów u zwierząt (van Lohuizen i Berns). Obie powyższe obserwacje doprowadziły do opracowania wektorów samoinaktywujących się typu SIN (Self Inactivating Vectors), w których promotory retrowirusowe są funkcjonalnie zinaktywowany w komórce docelowej (PCT, WO 94/29437). Dalsze modyfikacje tych wektorów idą w kierunku wprowadzenia do obszaru LTR kaset genu promotora tak, aby utworzyć wektory podwójnej kopii (PCT, WO 89/11539). W obu jednak przypadkach promotory heterologiczne wprowadzone do substancji wektora lub tez do obszaru LTR są bezpośrednio powiązane z genami terapeutycznymi oraz markerowymi.

Wspomniany powyżej, a wcześniej opisany wektor SIN z usuniętą jednostką 3'LTR (PCT, WO 94/29437) w celu wywołania ekspresji w linii komórek upakowujących używa dodatkowo silnego promotora heterologicznego, takiego jak promotor Cytomegalowirusa (CMV) zamiast retrowirusowego promotora 5'LTR (jednostka 5'LTR pozbawiona W3). Sygnał heterologicznej poliadenylacji jest także zawarty w jednostce 3'LTR (PCT, WO 94/29437).

Celem niniejszego wynalazku jest wytworzenie nowego wektora retrowirusowego, którego można będzie używać jako bezpieczny nośnik genów w ukierunkowanej terapii genowej, i który będzie się charakteryzował obniżonym prawdopodobieństwem rekombinacji z konstruktem upakowującym. Taki nowy wektor w jednostce 3'LTR przenosi promotor heterologiczny i/lub elementy regulacyjne, które po infekcji są powielone i przeniesione do jednostki 5'LTR komórki docelowej. W ten sposób kontrolowana jest ekspresja genów markerowych/terapeutycznych, które nie są bezpośrednio związane z promotorem lecz wprowadzone do substancji wektora. Wektor taki nie podlega procesowi samoinaktywacji, bierze za to udział w wymianie promotora. Stąd bierze się jego nazwa ProCon (od słów Promoter Conversion - konwersja promotora).

Ponieważ konwersja promotora nie prowadzi do samoinaktywacji wektor retrowirusowy będzie w komórce docelowej transkrypcyjnie aktywny. W komórce tej jednak obie jednostki LTR będą w znacznym stopniu składały się z heterologicznej sekwencji promotor/enhancer. Ograniczy to prawdopodobieństwo takiego zdarzenia, w którym wektor zintegrowany w komórce docelowej poddany będzie tej samej inaktywacji w długich okresach czasu, tak jak zostało to opisane dla wektorów konwencjonalnych (Xu i inni, 1989). Jednocześnie zmniejszy to szansę rekombinacji z retrowirusowymi sekwencjami endogennymi, która mogłaby potencjalnie doprowadzić do utworzenia patogennego wirusa zdolnego do replikacji, przyczyniając się tym samym do podniesienia ogólnego bezpieczeństwa układu.

W niniejszym wynalazku sekwencja 5'LTR konstruktu wektora retrowirusowgo pozostaje niezmodyfikowana, zaś ekspresja wektora wirusowego w komórkach upakowujących zachodzi pod wpływem normalnego promotora retrowirusowego W3. Normalny proces poliadenylacji retrowirusowej jest dozwolony, i w jednostce 3'LTR nie są zawarte żadne heterologiczne sygnały poliadenylacji. Jest to istotne dla opracowania strategii terapii genowych in vivo, ponieważ w warunkach in vivo w długich okresach czasu będzie miał miejsce normalny fizjologiczny proces regulacji wirusa za pomocą normalnego promotora i prawdopodobnie przy udziale normalnego procesu wirusowej kontroli poliadenylacji, podczas gdy komórki upakowujące wytwarzać będą wirus rekombinowanego.

Następna modyfikacja nowego wektora retrowirusowego przewiduje włączenia sekwencji komórkowych na miejsce heterologicznych elementów promotora i/lub elementów regulacyjnych. Powinno to umożliwić wyzszą selektywność w odniesieniu do specyficznej rekombinacji z sekwencjami komórkowymi tak, aby integracja wektorów retrowirusowych zachodziła w określonych miejscach genomu komórki docelowej (Saller, 1994).

Zgodnie z wynalazkiem, wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora, zawiera

a) obszar 5'LTR struktury W3-R-W5,

b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

184 375

c) obszar STTR^Tderający cjąkowicie lub częściowo usuń i ęty obszar U3, przy czyni w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulckyJoo wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-lcktoglsbulioy i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokmazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukoksrtyksidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy.

Korzystnie, obszary LTR wybrane są spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV (wirus białaczki myszy), MMTV(wirus nowotworu sutka myszy), MSV (wirus mięsaka myszy), SIV (wirus braku odporności immunologicznej u małp), HIV (ludzki wirus niedoboru odporności), HTLV (ludzkie retrowiruso T-limfocytotropowe), FIV (wirus braku odporności u kotów), FeLV (wirus białaczki kociej), BLV (wirus białaczki bydlęcej) oraz MPMV (małpi wirus Masona-Pfitzera).

Korzystnie, wektor retrswirusowo jest wektorem BAG.

Korzystnie, w wektorze tym gen markerowy lub terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z genu β-galaktozydazy i genu neomycyny, wirusa opryszczki zwykłej (herpes-simplex) genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminazy cytozynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy foyforybozylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkohoilowej oraz genu foyforyCozylotrαoyferazy hipoksaotony (HpRt).

Korzystnie, w wektorze tym co najmniej jedna z sekwencji kodujących białka retrowirusa jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.

Korzystnie, w wektorze tym sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.

Korzystnie, w wektorze tym heterologiczny fragment DNA jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.

Korzystnie, w wektorze tym element regulacyjny regulowany jest przez cząsteczkę trans aktywującą, która wiąże się z tym elementem regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodującej regulowanej przez ten element regulakojny.

Z kolei układ wektora retrowirusowego charakteryzuje się tym, że jako pierwszy składnik zawiera wektor retrswirusswo podlegający konwersji promotora, zawierający

a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterslogiczoy promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktsglsbulino i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla im14

184 375 munoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy, a jako drugi składnik zawiera linię komórkową komórek upakowujących zawierającą konstrukt retrowirusa lub retrowirusa rekombinowanego kodujący białka potrzebne do upakowania wymienionego wektora retrowirusowego, przy czym linia komórkowa komórek upakowujących wybrana jest z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 oraz GP+envAM-12.

Korzystnie, w układzie tym obszary LTR wybrane są spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.

Korzystnie, w układzie tym wektor retrowirusowy jest wektorem BAG.

Korzystnie, w układzie tym gen markerowy lub terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z genu β-galaktozydazy i genu neomycyny, wirusa opryszczki zwykłej (herpes-simplex) , genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminazy cytozynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy fosforybozylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fosforybozylotransferazy hipoksantyny (hpRt).

Korzystnie, w układzie tym co najmniej jedna z sekwencji kodujących białka retrowirusa jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.

Korzystnie, w układzie tym sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.

Korzystnie, w układzie tym heterologiczny fragment DNA jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.

Korzystnie, w układzie tym element regulacyjny regulowany jest przez cząsteczkę transaktywującą, która wiąże się z tym elementem regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodującej regulowanej przez ten element regulacyjny.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania prowirusa retrowirusowego, charakteryzuje się tym, że wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora, który zawiera

a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinaz.y, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy, replikuje się w układzie wektora retrowirusowego, który jako pierwszy składnik zawiera wyżej zdefiniowany wektor retrowirusowy, a jako drugi składnik zawiera linię komórkową komórek upakowujących zawierającą konstrukt retrowirusa lub retrowirusa rekombinowanego kodujący białka potrzebne do upakowania wymienionego wektora retrowirusowego, przy czym linia komórkowa komórek upakowujących wybrana jest z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psiAM, GP+E-86, PA317 oraz GP+envA.M-12, a wymieniony polilinker i każda sekwencja

184 375 wprowadzona do struktury tego nalillakftα w abtzptzf /'LTR duplikują się nadbzαt nrabftu transkrypcji odwrotnej w zpiafyCawanej komórce dabflawej i najpwiαju się w obszarze 5'LTR jak i w obszarze 3'LTR atrzompyfga ntayitpta.

KarzyttyJf, w sposobie tym stosuje się obszary LTR wybrane spośród co ιΌ^ιζΟ jednego elemento grupy składającej się z obszarów LTR pabhaezubobh z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.

Katzotlyif, w tpatabif tym jpko wektor rftrawirptawo statujf się wektor BAG.

Korzystnie, w tym ttasujy się gen markerowy lub tfranfptobzyo wybrany z grupo składającej się z genu β-galpCtazydpzo i genu nfamobono, wirusa aproszbzki zwykłej (herpes-simplex), genu kinazy tomidoaawej, genu npramnbyny, genu dyptyinazo cytazynowej, genu hngtamyryay, genu tfkrfbojnrj fosfatazy zasadowej, genu ttantferazo fatfarobazylowej gupniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fasfarobazylatrpytffrαzo hjnaktpytyno (HpRT).

Korzystnie, w tpatabif tym stasujy się co najmniej jedną z tfkwfncji kodujących białka retrowirusa, która jest zmjfyiayp lub co npjmaJfj częściowo usunięta w ttannjp pniemażliwipjąbnm typlikαcję wektora rftrawirutawfga.

Karzottyjf, w tnatabif tym stosuje się sekwencje rfttowirptp adnawjfezlplnf zw ιιΙζgrację rfltawitptów, które są zmifnianf lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemażliwipjąbom integrację wektora rftrawirutawfgo do genomu gospodarza.

Korzystnie, w tpatabie tym ttatujf się wektor tftrawirutawo zpwietpjąbo heteralagiczny fragment DNA, który jest hamalagibzno z tfkweybją CaoórC(a^yg z częścią tekwfybji komórkowej lub z większą liczbą tfCwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do akreślanobh tfkweycji w komórce lfbzayfga atabnjCp.

Korzystnie, w sposobie tym stosuje się ζ1ζοζι1.ο regulacyjne regulowane przez cząsteczki ttpntpktywująbe, który wiążą się z tymi ζΙζοπΙροι regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodujących regulowanych przez tr ζΙζοζίΙο regulacyjny.

Natomiast, sposób wytwarzania cząstki tflrawjrusp rekambjnawpyega charakteryzuje się tym, że linię komórkową komórek uppkawującobh wybraną z grupy zawierającej psi-2, nsi-Crynt, psi-AM, GP+E-86, PA317 oraz GP+fyvAM-12 trpytffkuje się wektorem rytrowirptawym nadlygpjącom konwersji promotora, zpwiyrpjąbom

р) abszpt 5'lTR struktury U3-R-U5,

b) jedną lub wiele sykwyycji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekadująbobh, przy czym sykwyncjr te wnrawpezany są do wektora, w sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przybiwwirusawy, geny przybiwraCawy i geny botakin, oraz

с) obszar ^LaR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wttawianp jest sykwyycjα paliliaCetp zpwiyrająbp heteralagibzno promotor i/lub flginym regulacyjny, zaś womieaJayo nramatat i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu ylymyntów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotwora sutka myszy (MMTV), ylymyrur regulacyjny i nramotary specyficzny dla β-laktaglabuliao i Cpzyiny, ζΙζοζιΙο regulacyjny i promotory specyficzny dla trzustki włączmy z anhodrazą węglową II oraz flemyntami regulacyjnymi i promotorami φζbofibznymJ dla β-glpCaCinazo, elementy regulacyjne i promotory spfbofibzye dla limfocytów włączmy z limfocytowymi ζΙζοζιΙροΙ regulacyjnymi i nramatorami specyficznymi dlw immpnaglabplin i MMTV oraz elementy regulacyjny i promotory specyficzne dla MMTV reρΗ,οπκ’ na hormony glukaCartykaidawf lub kierujący ekspresję na gruczoł sutkowy, a wyoieyiayy komórki hoduje się w ζιριοίΗ yptpaCpbh.

Korzystnie, w snasable tym stosuje się obszary LTR wybrany spośród co ιροοιΙζΟ jednego ζΊπο^^ι grupy składającej się z obszarów LTR nachadząbobh z MLV, MMT'V, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FfLV, BLV oraz MPMV.

Korzystnig, w spasably tym jako wektor rylrawlrutawo stosuje się wektor BAG.

Korzystnig, w spasably tym stosuje się grn mprCyrawo lub tyrapyutybzyo wybrany z grupy składającej się z genu β-gplpktozydpzo i genu ayaoorony, wirusa anryszczCl zwykłej

184 375 (herpes-simplex), genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminazy cytozynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy fosforybozylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fosforybozylotransferazy hipoksantyny (HpRT).

Korzystnie, w sposobie tym stosuje się co najmniej jedną z sekwencji kodujących białka retrowirusa, która jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.

Korzystnie, w sposobie tym stosuje się sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów, które są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.

Korzystnie, w sposobie tym stosuje się wektor retrowirusowy zawierający heterologiczny fragment DNA, który jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.

Korzystnie, w sposobie tym stosuje się elementy regulacyjne regulowane przez cząsteczki transaktywujące, które wiążą się z tymi elementami regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodujących regulowanych przez te elementy regulacyjne.

Zgodnie z wynalazkiem kompozycja farmaceutyczna zawierająca mieszaninę farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub rozcieńczalnika z substancją, czynną, charakteryzuje się tym, że jako substancję czynną zawiera terapeutycznnie skuteczną ilość rekombinowanego wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promotora, zawierającego

a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy.

Korzystnie, w kompozycji tej obszary LTR wybrane są spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.

Korzystnie, w kompozycji tej wektor retrowirusowy jest wektorem BAG.

Korzystnie, w kompozycji tej gen markerowy lub terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z genu β-galaktozydazy i genu neomycyny, wirusa opryszczki zwykłej (herpes-simplex) genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminazy cytozynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy fosforybozylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fosforybozylotransferazy hipoksantyny (HPRT).

Korzystnie, w kompozycji tej co najmniej jedna z sekwencji kodujących białka retrowirusa jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.

Korzystnie, w kompozycji tej sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.

184 375

Korzystnie, w kompozycji tej heterologiczny fragment DNA jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.

Korzystnie, w kompozycji tej elementy regulacyjne regulowane są przez cząsteczki transaktywujące, które wiążą się z tymi elementami regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodujących regulowanych przez te elementy regulacyjne.

Przedmiotem wynalazku jest też mRNA retrowirusowego prowirusa wytworzonego na drodze transkrypcji wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promotora, który zawiera

a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy'.

Korzystnie, w tym mRNA obszary LTR wybrane są spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV, MMTv, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.

Korzystnie, w tym mRNA wektor retrowirusowy jest wektorem BAG.

Korzystnie, w tym mRNA gen markerowy lub terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z genu β-galaktozydazy i genu neomycyny, wirusa opryszczki zwykłej (herpes-simplex) genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminazy cytozynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy fosforybozylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fosforybozylotransferazy hipoksantyny (HpRT).

Korzystnie, w tym mRNA co najmniej jedna z sekwencji kodujących białka retrowirusa jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.

Korzystnie, w tym mRNA sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.

Korzystnie, w tym mRNA heterologiczny fragment DNA jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią, sekwencji komórkowej lub z większa liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.

Korzystnie, w tym mRNA element regulacyjny regulowany jest przez cząsteczkę transaktywującą, która wiąże się z tym elementem regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodującej regulowanej przez ten element regulacyjny.

Przedmiotem wynalazku jest tez RNA wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promotora, zawierającego

a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybra18

184 375 na spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

c) obszar 3'LTR zawie ratacy adkowacie lub ezęśc iowś usuń i ęty oiszar U3, prWy c/.ym w usuniętym obszarze W3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca hete^^^ny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-lαktogloCulioy i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokmado, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy.

Korzystnie, w tym RNA obszary LTR wybrane są spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.

Korzystnie, w tym RNA wektor retrowirusowy jest wektorem BAG.

Korzystnie, w tym RNA gen markerowy lub terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z genu β-gαlτktozodazo i genu neomycyny, wirusa opryyzczki zwykłej (herpessimplex) genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminady cytozonowej, genu ho^;gromo^;cyoo'. genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy foyforoCozylowej guτοϊοο (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu foyforyCodylotraoyferazy hipokyaotyny (HPRT).

Korzystnie, w tym RNA co najmniej jedna z sekwencji kodujących białka retrowirusa jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.

Korzystnie, w tym RNA sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.

Korzystnie, w tym RNA heterologiczny fragment DNA jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.

Korzystnie, w tym RNA element regulacyjny regulowany jest przez cząsteczkę transaktywującą, która wiąże się z tym elementem regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodującej regulowanej przez ten element regulτco·'jn\^;.

Zgodnie z wynalazkiem, sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej mieszaninę farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub rozcieńczalnika z substancją czynną, charakteryzuje się tym, ze jako substancję czynną stosuje się wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora, zawierający

a) obszar 5'LTR struktury W3-R-W5,

b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar W3, przy czym w usuniętym obszarze W3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-lτktogloCulino i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficdoymi dla β-glueoeinado'. elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla im184 375 munoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy.

Z kolei inny sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej mieszaninę farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub rozcieńczalnika z substancją czynną, charakteryzuje się tym, że jako substancję czynną stosuje się cząstkę wirusa rekombibowabego otrzymywaną na drodze transfekowania linii komórkowej komórek upakowujących wybranej z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 oraz GP+envAM-12, przy czym transfekowanie prowadzi się wektorem retrowirusowym podlegającym konwersji promotora, zawierającym

a) obszar 5'LTr struktury U3-R-U5,

b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i mekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeoiwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokim oraz

c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy, zawierającą wyżej zdefiniowany wektor retrowirusowy.

Korzystnie, w sposobie tym stosuje się cząstkę retrowirura rekombmowanego otrzymaną na drodze transfekowania linii komórkowej komórek upakowujących wektorem retrowirusowym i komórki te hoduje się w znanych warunkach.

Zgodnie z wynalazkiem jeszcze inny sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej mieszaninę farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub rozcieńczalnika z substancją czynną, charakteryzuje się tym, ze jako substancję czynną stosuje się układ wektora retrowirusowego, który jako pierwszy składnik zawiera wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora, zawierający

a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja p3lilinkera zawierająca heterologiczby promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktogloSuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MmTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy, a jako drugi składnik zawiera linię komórkową komórek upakowujących zawierającą konstrukt retrowirusa lub retrowirura rekombinowanego kodujący białka potrzebne do upakowania wymienionego wektora retrowirurowego, przy czym linia komórkowa komórek upako20

184 375 wujących wybrana jest z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 oraz GP+envAM-12.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej mieszaninę farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub rozcieńczalnika z substancją czynną, charakteryzujący się tym, że jako substancję czynną stosuje się prowirus retrowirusowy otrzymywany na drodze replikacji wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promotora, zawierającego

a) obszar 5'LtR struktury U3-R-U5,

b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-lakkoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy, przy czym replikację prowadzi się w układzie wektora retrowirusowego, który jako pierwszy składnik zawiera wyżej zdefiniowany wektor retrowirusowy, a jako drugi składnik zawiera linię komórkową komórek upakowujących zawierającą konstrukt retrowirusa lub retrowirusa rekombinowanego kodujący białka potrzebne do upakowania wymienionego wektora retrowirusowego, przy czym linia komórkowa komórek upakowujących wybrana jest z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 oraz GP+envAM-12, a wymieniony polilinker i każda sekwencja wprowadzona do struktury tego polilinkera w obszarze 3'LTR duplikują się podczas procesu transkrypcji odwrotnej w zainfekowanej komórce docelowej i pojawiają się w obszarze 5'LTRjak i w obszarze 3'LTR otrzymanego prowirusa.

Konwersja promotora

Niniejszy wynalazek stosuje zasadę konwersji promotora, charakterystyczną dla retrowirusów.

Genom retrowirusa składa się z cząsteczki RNA o następującej strukturze:

R-U5-gag-pol-env-U3-R (fig. 2). W procesie odwrotnej transkrypcji obszar U5 jest zdublowany i umieszczony na prawym końcu wytworzonej cząsteczki DNA podczas, gdy obszar U3 jest zdublowany i umieszczony na lewym końcu wytworzonej cząsteczki DNA (fig. 2). Wytworzona struktura U3-R-U5 nazywana jest LTR (Long Terminal Repeat), i jest tym samym identyczna i powtórzona na obu końcach DNA prowirusa (Varmus, 1988). Obszar U3 z lewego końca prowirusa zawiera promotor (patrz poniżej). Promotor ten steruje syntezą transkryptu RNA zapoczątkowaną na linii granicznej pomiędzy obszarem U3, leżącym po lewej stronie oraz obszarem R, a zakończoną na linii granicznej pomiędzy obszarem R oraz obszarem U5 leżącym po prawej stronie (fig. 2). Taki RNA upakowany jest w cząstkach retrowirusowych i przetransportowany do komórek docelowych w celu zainfekowania. W komórce docelowej genom RNA jest ponownie odwrotnie transkrybowany w sposób opisany powyżej.

Zgodnie z wynalazkiem wektor retrowirusowy skonstruowany jest w ten sposób, że jego prawostronny obszar U3 jest zmodyfikowany (fig. 3), a struktura normalnego lewostronnego obszaru U3 pozostawiona jest w stanie nienaruszonym (fig. 3). Taki wektor może być normalnie transkrybowany do RNA przy użyciu zwykłego promotora retrowirusowego zlokalizowanego w lewostronnym obszarze U3 (rys 3). Wytworzony RNA będzie jednak zawierał wyłącznie zmodyfikowaną strukturę prawostronnej jednostki U3. Po odwrotnej transkryp184 375 cji w zainfekowanej komórce docelowej ta zmodyfikowana jednostka U3 będzie znajdowała się na obu końcach struktury retrowirusa (fig. 3).

Jeżeli zmodyfikowany fragment zamiast obszaru U3 zawierać będzie polilinker, wtedy łatwo dołączyć można jakikolwiek promotor włącznie z tymi, które kontrolują specyficzną ekspresję tkankową, takimi jak, na przykład, promotor WAP (patrz poniżej). Promotor ten będzie następnie używany wyłącznie w komórkach docelowych w celu wywołania ekspresji przyłączonych genów przeniesionych przez wektor retrowirusowy. Jako sposób alternatywny można w strukturę polilinkera wprowadzić segmenty DNA homologiczne z jedną lub z większą ilością sekwencji komórkowych w celu nakierowania genu na drodze homologicznej rekombinacji (patrz poniżej).

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem określenie „polilinker” stosowane jest do opisu krótkiego odcinka sztucznie zsyntetyzowanego DNA, posiadającego pewną ilość unikalnych miejsc restrykcyjnych, które pozwalają na łatwe wprowadzenie jakiegokolwiek promotora czy też innego segmentu DNA. Określenie „heterologiczny” stosowane jest do opisu jakiejkolwiek kombinacji sekwencji DNA, które normalnie nie występują razem w naturze.

Ekspresja genów regulowana jest za pomocą promotorów. Pod nieobecność promotora funkcja genu nie będzie podlegała ekspresji. Normalny promotor retrowirusowy MLV jest w dużym stopniu nieselektywny, to znaczy jest on aktywny dla większości typów komórek (Majors, 1990). Nie mniej jednak, istnieje spora liczba promotorów; które wykazują aktywność tylko w specyficznych typach komórek. Ograniczając ekspresję genów do specyficznych komórek docelowych takie tkankowo-specyficzne promotory są idealnymi kandydatami do regulacji ekspresji genów w przypadku wektorów retrowirusowych.

W linii komórkowej komórek upakowujących ekspresja wektora retrowirusowego regulowana jest za pomocą normalnego, nieselektywnego promotora retrowirusowego zawartego w obszarze U3 (fig. 3). Jednak, gdy wektor dotrze do komórki docelowej zachodzi konwersja promotora i gen terapeutyczny lub markerowy taki jak, na przykład, gen β-galaktozydazy, wyrażany jest za pomocą promotora tkankowo-specyficznego takiego, jaki został wprowadzony w strukturę polilinkera (fig. 3). A więc nie tylko można dołączyć do układu praktycznie każdy promotor tkankowo-specyficzny zapewniając w ten sposób selektywne nakierunkowania na liczne i różne typy komórek, ale dodatkowo, na skutek konwersji, struktura i własności wektora retrowirusowego nie przypominają juz struktury i własności wirusa Z punktu widzenia bezpieczeństwa ma to oczywiście wyjątkowo ważne konsekwencje ponieważ naturalne lub sztucznie wytwarzane wektory retrowirusowe łatwo poddają się rekombinacji genetycznej z retrowirusowym materiałem upakowującym prowadząc do utworzenia potencjalnie patogennych wirusów. Wektory wytworzone na drodze konwersji promotora (ProCon) nie przypominają retrowirusów ponieważ po konwersji nie posiadają promotorów retrowirusowych U3 znacznie zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo rekombinacji genetycznej.

Struktura promotora retrowirusowego przenoszona jest w jednostce LTR, w obszarze U3. Jednostki LTR przenoszą także sygnały pozwalające im integrować się z genomem komórki docelowej. Integracja retrowirusowych prowirusów może także przyczyniać się do powstawania zmian patogennych (van Lohuizen i Berns, 1990). W jednym z przykładów wykonania niniejszego wynalazku wektory ProCon mogą przenosić zmodyfikowane jednostki LTR, które nie zawierają sygnałów potrzebnych do integracji. Podnosi to dodatkowo potencjalny stopień bezpieczeństwa przedstawionych układów wektorów.

Nakierowywanie genów

Zgodnie z innym aspektem niniejszego wynalazku wektor retrowirusowy jest stosowany w celu ukierunkowania integracji w komórce docelowej. Ponieważ pozwala ona na długotrwałą ekspresję przeniesionych genów integracja DNA prowirusowej wersji genomu retrowirusowego w komórce docelowej stanowi znaczny postęp w zastosowaniu retrowirusów jako wektorów w porównaniu z innymi wirusami, takimi jak, na przykład, adenowirusy. Przypadkowa natura tych aktów integracji stanowi jednak zasadniczą wadę stosowania wektorów retrowirusowych ponieważ podnosi ona prawdopodobieństwo aktywacji lub inaktywacji genu

184 375 komórkowego supresora nowotworów lub prstsonksgeoów i w konsekwencji prawdopodoCieństwo indukcji nowotworu (van Lohrazen i Berns, 1990).

Rekombinacja homologiczna została z sukcesem zastosowana do nakierowania integracji DNA transfekowanego lub wprowadzonego na drodze mikroiniekcji ze specyficznymi pozycjami DNA oraz jest rutynowo stosowana do konstruowania nokautowanych transgenicznych myszy i innych zwierząt (prace przeglądowe Capecchi, 1989; Bradley i inni, 1992; Morrow i Kucherlapati, 1993) Niestety, wydajność przeniesienia DNA za pomocą takich, czysto fizycznych metod jest ekstremalnie mała. Dla porównania transfer genu przy użyciu retrowirusa jest bardzo wydajny, bez mała 100% populacji komórek jest w tym procesie zainfekowana. Połączenie przeniesienia genu retrowirusowego z rekombinacją homologiczną powinno umożliwić skonstruowanie układu idealnego do procesów integracji nakierowanych na konkretne pozycje w genach.

Zgłaszający badali możliwość wprowadzenia długich homologicznych odcinków DNA w różne pozycje wektorów retrowirusa tak, aby promować integrację za pomocą rekombinacji homologicznej (Saller, 1994). Oszacowano obie techniki:

konwersję genów oraz rekombinację homologiczną. Przy użyciu linii komórek zawierającej pojedynczą kopię genu HSV-tk jako komórek docelowych udało się zgłaszającym zmodyfikować cel z częstotliwością piętnaście razy wyższą niż w dotychczas publikowanych wynikach badań (Ellis i Bernstein, 1989). Klonowanie zrekomCinswanych fragmentów DNA wykazało obecność zarówno sekwencji tk komórki docelowej jak i wektora retrowirusa (Saller, 1994).

W celu ukierunkowanej integracji fragmenty DNA homologiczne z sekwencjami komórkowymi wprowadzone są do struktury polilinkera w wektorze ProCon. Po zainfekowaniu komórek docelowych i następującej po nim odwrotnej transkrypcji sekwencje te pojawią się na końcowym odcinku 5' prowirusa. Zostało wykazane, że homologie terminalne faworyzują recomCinacJę homologiczną z izogeoiczoymi sekwencjami komórkowymi (Bradley, 1991). Infekcja komórek docelowych zawierających zmutowane wersje sekwencji homologicznych powinna prowadzić do naprawy zmutowanych sekwencji, i wtedy albo z genomem komórkowym zrekombinują sekwencje homologiczne albo też zostanie wprowadzony do niego cały wektor (Saller, 1994). Nie tylko więc wektor ten posiada potencjalne własności naprawy genu, ale także może być użyty w celu ukierunkowania integracji wektorów retrowirusa przenoszących geny terapeutyczne w specyficznych pozycjach genomu, o których wiadomo, ze nie zawierają aktywnych genów. Obniży to znacznie możliwość aktywacji lub inaktywacji związanej z wprowadzeniem genu, zgodnej z powyższym opisem, a więc przyczyni się do poprawienia bezpieczeństwa przy stosowaniu wektorów retrowirusowych.

Podane niżej przykłady bliżej zilustrują niniejszy wynalazek. Przykłady te jednak w żadnym stopniu nie mają na celu ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku, w ramach którego można wprowadzać modyfikacje oraz zmiany oczywiste dla każdego specjalisty w tej dziedzinie.

Metody postępowania z rekomCinantswom DNA zastosowane w niniejszym wynalazku stanowią standardowe procedury, dobrze znane każdemu specjaliście z tej dziedziny, które są opisane szczegółowo w takich publikacjach jak, na przykład, „Molecular Cloning” (Sambrook i inni, 1989) i „Practical Guide to Molecular Cloning” (Perbal, 1984).

Przedmiot wynalazku przedstawiony zostanie w przykładach wykonania na rysunku, na którym przedstawione są odpowiednio, fig. 1 - układ wektora retrowirusowego, fig. 2 - genom retrowirusa (odwrotna transkrypcja), fig. 3 - zasada ProCon, fig. 4 - analiza PCR, sonda MLV, fig. 5 - analiza PCR, sonda MMTV, fig. 6 - ekspresja β-galaktozydazy w zainfekowanych komórkach NIH i EF43, fig. 7 - ekspresja β-galaktozydazy w zainfekowanych pierwotnych komórkach gruczołu sutkowego ciężarnej myszy, fig. 8 - ekspresja β-galaktozydazy po wstrzyknięciu wirusa do gruczołu sutkowego oraz, skóry ciężarnej myszy Balb/c, fig. 9 - ekspresja e-galaktozydazy w zainfekowanych komórkach nowotworowych gruczołu sutkowego, a fig. 10 - integracja wektora retrowirusowego nakierowana za pomocą rekombinacji homologicznej .

184 375

Przykład 1

Ekspresja specyficzna w gruczole sutkowym po infekcji wektorem ProCon zawierającym promotory specyficzne dla komórek gruczołu sutkowego.

W przypadku wektora retrowirusowego wirusa białaczki myszy (MLV), znanego jako BAG (Price, i inni, 1987) gen β-galaktozydazy jest kierowany przez promotor promiskwicyjny (czyli nietkankospecyficzny) do obszaru U3 jednostki LTR (fig. 3). Według niniejszego wynalazku skonstruowano wektor BAG, w którym usunięto promotor MLV (U3) umiejscowiony w jednostce 3'LTR (fig. 3) i zastąpiono sekwencją polilinkera, który to polilinker pozwala na proste wprowadzenie promotorów heterologicznych. Po wprowadzeniu do linii komórkowej komórek upakowujących, wektor BAG, z brakującą sekwencją U3, poddany jest ekspresji za pomocą promotora MLV (U3) umiejscowionego w jednostce 5’LTR. W wyniku przegrupowań zachodzących w genomie retrowirusa w trakcie jego cyklu życiowego poprzedzających zainfekowanie komórki docelowej sekwencja polilinkera będzie powielona na obu końcach genomu retrowirusa tak, jak zostało to opisane powyżej. W ten sposób można skonstruować wektor retrowirusa, w którym ekspresja genu β-galaktozydazy BAG będzie kontrolowana za pomocą dowolnego promotora heterologicznego wprowadzonego do obszaru polilinkera w komórce docelowej (fig. 3).

Zgodnie z przedstawioną powyżej zasadą do obszaru polilinkera zmodyfikowanego wektora BAG wprowadzone zostały następujące promotory specyficzne:

Kilka podobszarów promotora wirusa nowotworu sutka myszy (MMTV) włącznie z obszarem, który wywołuje reakcję na hormony glukokortykoidowe oraz obszarem kierującym ekspresję do komórek gruczołu sutkowego.

Promotor Kwaśnego Białka Serwatki (WAP). Promotor ten kontroluje ekspresję kwaśnego białka serwatki w taki sposób, że jest ono wytwarzane wyłącznie w gruczołach sutkowych ciężarnych lub karmiących samic gryzoni.

Kontrola ekspresji genu β-galaktozydazy przy użyciu promotorów wprowadzonych do obszaru polilinkera testowana była za pomocą badań infekcji, w których do zakażenia różnych komórek stosowano wektory retrowirusowe MMTV oraz WAP.

W celu wytworzenia cząstek wektora retrowirusowego do linii komórkowej komórek upakowujących GP+E86 transfekowano wektory MMTV oraz WAP (Markowitz i inni, 1988). Po selekcji względem odporności na neomycynę, która jest zakodowana za pomocą tego wektora otrzymano stabilne populacje oraz klony wytwarzających rekombinantowy wirus ProCon. Supernatant z tych populacji, zawierający wirus, użyto do zakazenia linii komórkowej EF 43 sutka myszy (Gunzburg i inni, 1988) oraz linii komórkowej fibroblastów myszy (Jainchill i inni, 1969). Po upływie czterech dni od infekcji komórki docelowe zostały poddane analizie, w której ilościowy test na β-galaktozydazę wykazał brak ekspresji w obu typach komórek zainfekowanych wektorami WAP ProCon oraz wysoką ekspresję w obu typach komórek zainfekowanych wektorami MMTV ProCon (fig. 6). Wynik ten pozostaje w zgodzie z faktem, że promotor WAP funkcjonuje wyłącznie in vivo w okresie późnej ciąży oraz laktacji, a nie w najprostszych kulturach komórek sutkowych in vitro, reprezentowanych przez takie komórki jak EF 43. W celu zbadania, czy wektory ProCon zawierające WAP będą aktywne w układzie kompleksowej, pierwotnej kultury komórek pochodzącej z sutka do wzrostu pobrano pierwotne organoidy pochodzące od 8-10 dniowej ciąży u myszy (fig. 7) lub tez komórki pochodzące z nowotworu sutka (fig. 9), które następnie zainfekowano supematantem z tej samej stabilnie transfekowanej populacji transfekowanej linii komórkowej. Jak wykazano na drodze badania aktywności β-galaktozydazy obydwa wektory ProCon, to znaczy zarówno te zawierające fragmenty promotora WAP, jak i te zawierające fragmenty promotora MMTV, były aktywne w obydwu kulturach, to znaczy zarówno w komórkach pierwotnych (fig. 7) jak i w komórkach rakowych sutka (fig. 9).

W celu zbadania czy wektory ProCon przenoszące WAP oraz MMTV są aktywne in vivo oraz czy ekspresja β-galaktozydazy jest ograniczona do gruczołu sutkowego in vivo, medium zawierające rekombinantowy wirus ProCon zostało wstrzyknięte in situ do gruczołu sutkowego lub skóry myszy w 8-10 dniu ciąży. Po upływie pięciu dni myszy uśmiercono, wypreparowano ekstrakty komórkowe i poddano je oznaczeniu β-galaktozydazy. Stwierdzono

184 375 ekspresję obydwu wektorów ProCon, zarówno tego zawierającego fragmenty promotora WAP jak i tego zawierającego fragmenty promotora MMTV, ale tylko w gruczole sutkowym ciężarnej myszy; nie zaobserwowano jej natomiast w komórkach skóry tej myszy (patrz fig. 8, obszary M oraz S). Tak więc, in vivo elementy regulacyjne obydwu promotorów ograniczają ekspresję do gruczołu sutkowego podczas, gdy in vitro elementy regulacyjne promotora WAP zachowują swoją bezwzględną tkankospecyficzbość, a elementy regulacyjne promotora MMTV nie zachowuj ą takiej właściwości.

Powyższe wektory ProCon przenoszące promotory tkabkospecyficzne oraz elementy regulacyjne będą użyteczne w procesie kierowania genów terapeutycznych do wcześniej określonych typów komórek, tkanek oraz organów. Potencjalne geny terapeutyczne obejmują gen meRtymy, która posiada działanie przeciwrakowe oraz skierowane przeciw wirusowi HIV, geny przygotowujące komórki do obumarcia takie, jak gen kinazy tymidyny, gen fosforybosylotrabrferazy guaniny, gen deaminazy cytozyny, cytochrom P450, a także geny biorące udział w regulacji cyklów takie, jak na przykład, gen SDI/WAF-1/CIP-1.

Przykład 2

Określenie konwersji promotora w komórkach zainfekowanych wektorem ProCon, który pierwotnie przenosił promotor MMTV w jednostce 3^—.

Wektor ProCon przenoszący obszar promotora wirusa nowotworu sutka myszy (MMTV) został transfekowany do lmii komórkowej komórek upakowujących, a powstałe w ten sposób cząstki wektora rekombibabtowego użyto do zainfekowania linii komórkowej ludzkich komórek nowotworu pęcherza (EJ). Zakażone klony komórek przebrano w medium zawierającym analog neomycyny G418 (ponieważ wektor zawiera gen odporności na neomycynę pod kontrolą promotora wewnętrznego SV40). Z jednego z zakażonych klonów oraz nietrabsfekowabych macierzystych komórek EJ wypreparowano DNA, który użyto w reakcjach łańcucha polimerazy (PCR). Reakcje te prowadzono przy użyciu jednego lub dwóch primerów, które rozpoznają i wiążą się specyficznie z sekwencjami MMTV (A i B na fig. 4 i 5) lub z obszarem R MLV (C na fig. 4) jednostki LTR razem z primerem umiejscowionym w genie markerowym (fig. 4 i 5). Ponieważ, w przypadku, gdy zaszła konwersja promotora, primer genu markerowego mógł być umiejscowiony wyłącznie poniżej sekwencji MMTV (lub obszaru R MLV) pozytywny sygnał PCR, otrzymany w przypadku użycia primerów MMTV w połączeniu z primerem genu znaczącego, uznany będzie za dowód na taką właśnie kolejność. Produkty PCR otrzymane przy użyciu primerów A, B oraz C, pokazane na fig. 4, przedstawione są po hybrydyzacji do znakowanego fragmentu sekwencji MLV, dowodząc tym samym, ze wszystkie trzy produkty PCR są pochodzenia MLV. Wielkość tych fragmentów dowodzi, że zaszła konwersja promotora. Figura 5 przedstawia produkty PCR przy użyciu primera A oraz B i hybrydyzowane do specyficznej sekwencji MMTV dowodząc po raz koleiny, że zaszła konwersja promotora.

Przykład 3

Konstrukcja wektorów ProCon przeznaczonych do integracji nakierowanej.

Przy użyciu tego samego wektora BAG, który jest opisany w powyzszym przykładzie 1 skonstruować można wektor retrowirusowy, w którym do jednostki LTR wprowadzona jest sekwencja DNA homologiczna do sekwencji komórkowej. Otrzymany wektor może być użyty do kierowania integracji sekwencji homologicznej wprowadzonej do wektora albo też całości lub części wektorów do sekwencji homologicznej obecnej w genomie komórki żywiciela.

Zgodnie z powyższą zasadą do obszaru polilibkera zmodyfikowanego wektora BAG wprowadzono fragment genu kinazy tymidyny (tk) wirusa Herpes Simplex (HSV) (mutant tk na fig. 10, Saller, 1994).

Otrzymano także linię komórkową, która nie zawiera żadnej funkcjonalnej kopii genu tk ssaka, a w zamian za to przenosi jedną kopię genu tk HSV (Saller, 1994). Tę linię komórkową zakażono wektorem BAG przenoszącym gen tk, po czym wyselekcjonowano komórki, w których gen tk HSV został zakłócony (fig. 10).

Powyższe przykłady ilusίr^^j^k zasady działania wektorów wykorzystujących konwersję promotora, będących przedmiotem niniejszego wynalazku, a także konsekwencje tego działania.

184 375

Literatura

Anderson, W.F. 1992. Human gene therapy. Science 256: 808-813.

Bradley, A. 1991. Modifying the mammalian genome by gene targeting. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829.

Bradley, A., P. Hasty, A. Davis, and R. Ramirez-Solis. 1992. Modifying the mouse: design and desire. Biotechnology 10: 534-539.

Capecchi, M.R. 1989. Altering the genome by homologous recombination. Science 244:1288-1292. '

Ellis, J. and A. Bernstein. 1989. Gene Targeting with Retroviral Vectors Recombination by Gene Conversion into Regions of Nonhomology. Mol. Celi. Biol. 9: 1621-1627.

Emerman, M. and H.M. Temin. 1986. Comparison ofpromoter suppression in avian and murine retrovirus vectors. Nuci. Acids Res. 14: 9381-9396.

Gunzburg, W.H., B. Salmons, A. Schlaeffli, S. Moritz-Legrand, W. Jones, N.H. Sarkar and R. Ulirich. 1988. Expression of the oncogenes mil and ras abolishes the in vivo differentiation of mammary epithelial cells. Carcinogenesis 9: 1849-1856.

Jainchill, J.L., S.A. Anderson, and G.J. Todaro. 1969. Murine sarcoma and leukaemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells. J. Virol. 4:

549-553.

Kotani, H., P.B. Newton, S. Zhang, Y.L. Chiang, E. Otto, L. Weaver, R.M. Blaese, W.F. Anderson and G.J. McGarrity. 1994. Improved methods of retroviral vector transduction and production for gene therapy. Human Gene Therapy 5: 19-28.

Majors, J. 1990. The structure and function of retroviral long terminal repeats. Curr. Tops. In Micro. Immunol. 157: 49-92.

Markowitz, D., S. Goff, and A. Bank. 1988. A safe packaging line for gene transfer: separating viral genes on two different plasmids. J. Virol. 62: 1120-1124.

Miller, A.D. and G.J. Rossman. 1989. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. Biotechniques 7: 980-990.

Morrow, B., and R. Kucherlapati. 1993. Gene targeting in mammalian cells by homologous recombination. Current Opinion in Biotechnology 4: 577-582.

Perbal. B. 1984. A Practical Guide to Molecular Cloning. John Wiley & Sons.

Price, J., D. Turner, and C. Cepko. 1987. Lineage analysis in the vertebrate nervous system by retrovirus-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 156-160.

Rosenberg, S.A., Anderson W.F., Blaese, R.M., et al. 1992. Immunization of cancer patients using autologous cancer cells modified by insertion of the gene for interleukin-2. Human Gene Ther. 3: 75-90.

Saller, R.M. 1994. Design von locus-und gewebespezischen retroviralen Vektoren fuer eine in vivo Gentherapie. Doctoral thesis, Ludwigs-Maximilians University, Munich, Germany.

Salmons, B., and W.H. Gunzburg. 1993. Targeting of retroviral vectors for gene therapy. Human Gene Therapy 4: 129-141.

Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork, USA.

van Lohuizen and Berns, 1990. Tumorigenesis by slow-transforming retroviruses - an update. Biochim. Biophys. Acta, 1032: 213-235.

Varmus, H. 1988. Retroviruses. Science 240: 1427-1435.

Xu, L., J.-K. Yee, J.A.. Wolff and T. Friedmann. 1989. Factors Affecting Long-Term Stability of Moloney Murine Leukemia Virus-Based Vectors. Virology 171: 331-341.

184 375

184 375

184 375

U5|P!q §ιω/ΐ8ρκΐΜ§ pj^soupaf 3op3|3zM

184 375

8'Sy-T

R5|fBiq Sui/si

184 375

©ΛΑ©«8ΟΡ8©ΛΛ Apsnj$suo>{|

184 375

Eig.

o	o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o
	(O	in	'C	co	CM	T—

8ui/BflBIA\S rąjsoupsf

184 375 gen terapeutyczny promotor SV40 neomycyna źródło pBR

184 375

184 375

Konstrukcja wektora U3 minus BAG (MLV)

184 375

>» c

ce £

O c

-Q

E o

jse

Q>

184 375

wektor retrowirusowy

B

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (61)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora zawierający

   a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

   b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

   c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy.
2. 2. Wektor według zastrz. 1, w którym obszary LTR wybrane są spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.
3. 3. Wektor według zastrz. 1, w którym wektor retrowirusowy jest wektorem BAG.
4. 4. Wektor według zastrz. 1, w którym gen markerowy lub terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z genu β-galaktozydazy i genu neomycyny, wirusa opryszczki zwykłej (herpes-simplex) genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminazy cytozynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy fosforybozylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fosforybozylotransferazy hipoksantyny (HpRT).
5. 5. Wektor według zastrz. 1, w którym co najmniej jedna z sekwencji kodujących białka retrowirusa jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.
6. 6. Wektor według zastrz. 1, w którym sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.
7. 7. Wektor według zastrz. 1, w którym heterologiczny fragment DNA jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.
8. 8. Wektor według zastrz. 1, w którym element regulacyjny regulowany jest przez cząsteczkę transaktywującą, która wiąże się z tym elementem regulacyjnym, w ten sposób włą184 375 czając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodującej regulowanej przez ten element regulacyjny.
9. 9. Układ wektdra retrowirusowego, znamienny tym, zej^o pit^ikvszy składnik zawiera wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora, zawierający

   a) obszar 5'LTR struktury W3-R-W5,

   b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

   c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar W3, przy czym w usuniętym obszarze W3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinady, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy, a jako drugi składnik zawiera linię komórkową komórek upakowujących zawierającą konstrukt retrowirusa lub retrowirusa rekombinowanego kodujący białka potrzebne do upakowania wymienionego wektora retrowirusowego, przy czym linia komórkowa komórek upakowujących wybrana jest z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 oraz GP+envAM-12.
10. 10. Wkład według zastrz. 9, zmamiemmy tym, że obszary LTR wybrane są spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.
11. 11. Wkład według zastrz. 9, zmamiemmy tym, ze wektor retrowirusowy jest wektorem

    BAG.
12. 12. Wkład według zastrz. 9, zmamiemmy tym, że gen markerowy lub terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z genu β-galaetozydady i genu neomycyny, wirusa opryszczki zwykłej (herpes-simplex), genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminaz.y cytozynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy fosforybozylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fosforybozylotransferazy hipoksantyny (HPRT).
13. 13. Wkład według zastrz. 9, zmamiemmy tym, że co najmniej jedna z sekwencji kodujących białka retrowirusa jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.
14. 14. Wkład według zastrz. 9, zmamiemmy tym, że sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.
15. 15. Wkład według zastrz. 9, zmamiemmy tym, że heterologiczny fragment DNA jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.
16. 16. Wkład według zastrz. 9, zmamiemmy tym, że element regulacyjny regulowany jest przez cząsteczkę transaktywującą, która wiąże się z tym elementem regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodującej regulowanej przez ten element regulacyjny.
17. 17. Sposób wytwarzania prowirusa retrowirusowego, zmamiemmy tym, że wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora, który zawiera

    a) obszar 5'LTR struktury W3-R-W5,

    b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybra4

    184 375 na spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

    c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lut) ceęściowo usunięty obszar I^ł3, przy c zym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobulmy i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immun3gl3bulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony gluk3kurtykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy, replikuje się w układzie wektora retrowirusuwego, który jako pierwszy składnik zawiera wyżej zdefiniowany wektor retrowirusowy, a jako drugi składnik zawiera linię komórkową komórek upakowujących zawierającą konstrukt retrowirusa lub retrowirusa rekombin3wabego kodujący białka potrzebne do upakowania wymienionego wektora retrowirus3wego, przy czym linia komórkowa komórek upakowujących wybrana jest z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psiAM, GP+E-86, PA317 oraz GP+envAM-12, a wymieniony polilibeer i każda sekwencja wprowadzona do struktury tego polilinkera w obszarze 3'LTR duplikują się podczas procesu transkrypcji odwrotnej w zainfekowanej komórce docelowej i pojawiają się w obszarze 5'LTR jak i w obszarze 3'LTR otrzymanego prowirusa.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się obszary LTR wybrane spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.
19. 19. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako wektor retrowirusowy stosuje się wektor BAG.
20. 20. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się gen markerowy lub terapeutyczny wybrany z grupy składającej się z genu β-galaktozydazy i genu neomycyny, wirusa optyszc/ki zwykłej (herpes-simplex), genu kinazy tymidyn^ej, genu puromycyny, genu deaminazy cytrynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy fosforyb3τylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fosforyb3zylotransferaτy hipoksantyny (HPRT).
21. 21. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się co najmniej jedną z sekwencji kodujących białka retrowirusa, która jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirus3wego.
22. 22. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów, które są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirus3wegu do genomu gospodarza.
23. 23. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się wektor retrowirusuwy zawierający heterologiczny fragment DNA, który jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.
24. 24. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się elementy regulacyjne regulowane przez cząsteczki transaktywujące, które wiążą się z tymi elementami regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodujących regulowanych przez te elementy regulacyjne.
25. 25. Sposób wytwarzania cząstki retrowirusa rekombin3wanego, znamienny tym, ze linię komórkową komórek upakowujących wybraną z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psiAM, GP+E-86, PA317 oraz GP+envAM-12 transfekuje się wektorem retrowirusowym podlegającym konwersji promotora, zawierającym

    a) ooszza 5'LTR Rtruutury UU-R-UU,

    184 375

    b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

    c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MmtV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy, a wymienione komórki hoduje się w znanych warunkach.
26. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się obszary LTR wybrane spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.
27. 27. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że jako wektor retrowirusowy stosuje się wektor BAG.
28. 28. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się gen markerowy lub terapeutyczny wybrany z grupy składającej się z genu β-galaktozydazy i genu neomycyny, wirusa opryszczki zwykłej (herpes-simplex) genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminazy cytozynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy fosforybozylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fosforybozylotransferazy hipoksantyny (HPRT).
29. 29. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się co najmniej jedną z sekwencji kodujących białka retrowirusa, która jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.
30. 30. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów, które są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.
31. 31. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się wektor retrowirusowy zawierający heterologiczny fragment DNA, który jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.
32. 32. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się elementy regulacyjne regulowane przez cząsteczki transaktywujące, które wiązą się z tymi elementami regulacyjnymi, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodujących regulowanych przez te elementy regulacyjne.
33. 33. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca mieszaninę farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub rozcieńczalnika z substancją czyńmy, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera terapeutycznie skuteczną ilość rekombinowanego wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promotora, zawierającego

    a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

    b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

    c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wy6

    184 375 brany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy.
34. 34. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, ze obszary LTR wybrane są spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.
35. 35. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że wektor retrowirusowy jest wektorem BAG.
36. 36. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że gen markerowy lub terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z genu β-galaktozydazy i genu neomycyny, wirusa opryszczki zwykłej (herpes-simplex), genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminazy cytozynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy fosforybozylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fosforybozylotransferazy hipoksantyny (HPRT).
37. 37. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że co najmniej jedna z sekwencji kodujących białka retrowirusa jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.
38. 38. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.
39. 39. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że heterologiczny fragment DNA jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.
40. 40. Kompozycja według zastrz. 33, znamienna tym, że elementy regulacyjne regulowane są przez cząsteczki transaktywujące, które wiążą się z tymi elementami regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodujących regulowanych przez te elementy regulacyjne.
41. 41. mRNA retrowirusowego prowirusa wytworzonego na drodze transkrypcji wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promotora, który zawiera

    a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

    b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

    c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokin^az^y, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy.
42. 42. mRNA według zastrz. 41, w którym obszary LTR wybrane są spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.

    184 375
43. 43. mRNA według zastrz. 41, w którym wektor retrowirusowy jest wektorem BAG.
44. 44. mRNA według zastrz. 41, w którym gen markerowy lub terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z genu β-galaktodydady i genu neomycyny, wirusa opryszczki zwykłej (herpes-simplex), genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminazy cytozynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy fosforybozylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fosforybozylotransferady hipoksantyny (HpRT).
45. 45. mRNA według zastrz. 41, w którym co najmniej jedna z sekwencji kodujących białka retrowirusa jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.
46. 46. mRNA według zastrz. 41, w którym sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.
47. 47. mRNA według zastrz. 41, w którym heterologiczny fragment DNA jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.
48. 48. mRNA według zastrz. 41, w którym element regulacyjny regulowany jest przez cząsteczkę transaktywującą, która wiąże się z tym elementem regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodującej regulowanej przez ten element regulacyjny.
49. 49. RNA wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promotora, zawierającego

    a) obszar 5'LTR struktury W3-R-W5,

    b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

    c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar W3, przy czym w usuniętym obszarze W3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinady, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy.
50. 50. RNA według zastrz. 49, w którym obszary LTR wybrane są spośród co najmniej jednego elementu grupy składającej się z obszarów LTR pochodzących z MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV oraz MPMV.
51. 51. RNA według zastrz. 49, w którym wektor retrowirusowy jest wektorem BAG.
52. 52. RNA według zastrz. 49, w którym gen markerowy lub terapeutyczny wybrany jest z grupy składającej się z genu β-galaktozydady i genu neomycyny, wirusa opryszczki zwykłej (herpes-simplex) genu kinazy tymidynowej, genu puromycyny, genu deaminazy cytozynowej, genu hygromycyny, genu sekrecyjnej fosfatazy zasadowej, genu transferazy fosforybozylowej guaniny (gpt), genu dehydrogenazy alkoholowej oraz genu fosforybozylotransferazy hipoksantyny (HPRT).
53. 53. RNA według zastrz. 49, w którym co najmniej jedna z sekwencji kodujących białka retrowirusa jest zmieniona lub co najmniej częściowo usunięta w stopniu uniemożliwiającym replikację wektora retrowirusowego.
54. 54. RNA według zastrz. 49, w którym sekwencje retrowirusa odpowiedzialne za integrację retrowirusów są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte w stopniu uniemożliwiającym integrację wektora retrowirusowego do genomu gospodarza.

    184 375
55. 55. RNA według zastrz. 49, w którym heterologiczny fragment DNA jest homologiczny z sekwencją komórkową, z częścią sekwencji komórkowej lub z większą liczbą sekwencji komórkowych, umożliwiający wbudowanie się do określonych sekwencji w komórce leczonego osobnika.
56. 56. RNA według zastrz. 49, w którym element regulacyjny regulowany jest przez cząsteczkę transaktywującą, która wiąże się z tym elementem regulacyjnym, w ten sposób włączając albo wyłączając transkrypcję sekwencji kodującej regulowanej przez ten element regulacyjny.
57. 57. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej mieszaninę farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub rozcieńczalnika z substancją czynną, znamienny tym, że jako substancję czynną stosuje się wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora, zawierający

    a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

    b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

    c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy.
58. 58. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej mieszaninę farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub rozcieńczalnika z substancją czynną, znamienny tym, ze jako substancję czynną stosuje się cząstkę wirusa rekombinowanego otrzymywaną na drodze transfekowania linii komórkowej komórek upakowujących wybranej z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 oraz GP+envAM-12, przy czym transfekowanie prowadzi się wektorem retrowirusowym podlegającym konwersji promotora, zawierającym

    a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

    b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

    c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-laktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy, zawierającą wyżej zdefiniowany wektor retrowirusowy·.

    184 375
59. 59. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że stosuje się cząstkę retrowirusa rekombinowanego otrzymaną na drodze transfekowania linii komórkowej komórek upakowujących wektorem retrowirusowym i komórki te hoduje się w znanych warunkach.
60. 60. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej mieszaninę farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub rozcieńczalnika z substancją, czynną, znamienny tym, że jako substancję czynną stosuje się układ wektora retrowirusowego, który jako pierwszy składnik zawiera wektor retrowirusowy podlegający konwersji promotora, zawierający

    a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

    b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

    c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla p-kiktoglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe łub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy, a jako drugi składnik zawiera linię komórkową komórek upakowujących zawierającą konstrukt retrowirusa lub retrowirusa rekombinowanego kodujący białka potrzebne do upakowania wymienionego wektora retrowirusowego, przy czym linia komórkowa komórek upakowujących wybrana jest z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317 oraz GP+envAM-l2.
61. 61. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej mieszaninę farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i/lub rozcieńczalnika z substancją czynną, znamienny tym, że jako substancję czynną stosuje się prowirus retrowirusowy otrzymywany na drodze replikacji wektora retrowirusowego podlegającego konwersji promotora, zawierającego

    a) obszar 5'LTR struktury U3-R-U5,

    b) jedną lub wiele sekwencji wybranych spośród sekwencji kodujących i niekodujących, przy czym sekwencje te wprowadzone są do wektora, a sekwencja kodująca jest wybrana spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej geny markerowe, geny terapeutyczne, geny przeciwwirusowe, geny przeciwrakowe i geny cytokin, oraz

    c) obszar 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty obszar U3, przy czym w usuniętym obszarze U3 wstawiona jest sekwencja polilinkera zawierająca heterologiczny promotor i/lub element regulacyjny, zaś wymieniony promotor i/lub element regulacyjny wybrany jest spośród jednego lub wielu elementów grupy zawierającej kwaśne białko serwatki (WAP), wirus nowotworu sutka myszy (MMTV), elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla β-^-ldk^oglobuliny i kazeiny, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla trzustki włącznie z anhydrazą węglową II oraz elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla β-glukokinazy, elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla limfocytów włącznie z limfocytowymi elementami regulacyjnymi i promotorami specyficznymi dla immunoglobulin i MMTV oraz elementy regulacyjne i promotory specyficzne dla MMTV reaktywne na hormony glukokortykoidowe lub kierujące ekspresję na gruczoł sutkowy, przy czym replikację prowadzi się w układzie wektora retrowirusowego, który jako pierwszy składnik zawiera wyżej zdefiniowany wektor retrowirusowy, a jako drugi składnik zawiera linię komórkową komórek upakowujących zawierającą konstrukt retrowirusa lub retrowirusa rekombinowanego kodujący białka potrzebne do upakowania wymienionego wektora retrowirusowego, przy czym linia komórkowa komórek upakowujących wybrana jest z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA3l7 oraz GP+envAM-12, a wymieniony polilinker i każda sekwencja wprowadzona do struktury tego polilinkera w obszarze 3'LTR dupli10

    184 375 kują się podczas procesu transkrypcji odwrotnej w zainfekowanej komórce docelowej i pojawiają się w obszarze 5'LTR jak i w obszarze 3'LTR otrzymanego pr3wirura.