DE19910650A1 - Auf HERV-LTR-Sequenzen basierende retrovirale Expressionsvektoren - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft retrovirale Expressionsvektoren mit zellspezifisch regulierbaren Promotoren. Die Vektoren sind beispielsweise zur zellspezifischen Expression therapeutisch wertvoller Gene im Rahmen einer Gentherapie einsetzbar. DOLLAR A Die Erfindung beschreibt retrovirale Expressionsvektoren, enthaltend zumindest die nachfolgenden Elemente in funktioneller Anordnung: DOLLAR A a) DNA-Sequenzen zur Verpackung der Vektor-RNA und zur zellspezifischen Expression von Proteinen oder Peptiden, die von heterologen DNA-Nukleotidsequenzen kodiert werden; DOLLAR A b) eine oder mehrere für ein Protein oder Peptid kodierende DNA-Nukleotidsequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzen zur zellspezifischen Expression eine zellspezifisch regulierbare Promotorregion aus einer humanen endogenen retroviralen DNA-Nukleotidsequenz (HERV) enthalten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft retrovirale Expressionsvektoren mit zellspezifisch regulier­ baren Promotoren. Die Vektoren sind beispielsweise zur zellspezifischen Expression thera­ peutisch wertvoller Gene im Rahmen einer Gentherapie einsetzbar.

Retroviren sind RNA-Viren, bei denen die viralen Gene von einem einzelsträngigen RNA- Molekül kodiert werden. Nach Eindringen der Viren in die Zelle wird die virale RNA in ein doppelsträngiges DNA-Molekül durch die reverse Transkription umgewandelt. Die DNA dringt in den Kern ein und integriert in das zelluläre Chromosom. Die integrierte virale DNA-Form, das sogenannte Provirus, bildet die Matrize zur Expression der viralen Gene.

Die Integration des viralen Genoms in das zelluläre Chromosom ist ein obligatorischer Teil der viralen Replikation und wird durch viral kodierte Enzyme vermittelt. Es scheint, daß, mit we­ nigen Ausnahmen, das Vorliegen des retroviralen Genoms in der Zelle, die Expression seiner Gene und die Bildung von Viruspartikeln die Lebensfähigkeit der infizierten Zelle nicht oder kaum beeinträchtigt.

Retroviraler Gentransfer wird dazu benutzt, funktionelle Gene, insbesondere therapeutisch wertvolle Gene, in die Zellen einzuführen, ohne die Proliferationsfähigkeit der Wirtszelle zu beeinflussen. Aufgrund ihres Replikationsmodus eignen sich Retroviren für eine derartigen Gentransfer. In der einfachsten Ausgestaltungsform wird zumindest ein Teil der viralen Gene durch ein Gen von Interesse ersetzt und, unter Zuhilfenahme des effizienten viralen Infekti­ onsprozesses, wird dieses Gen von Interesse in die Zielzelle transferiert.

Retrovirale Vektoren eignen sich deshalb zur Gentherapie, weil die Infektion durch Retroviren hocheffizient verläuft und die retroviralen Vektoren so modifizierbar sind, daß sie heterologe DNA aufnehmen und stabil in das Wirtszellgenom integrieren können. Eine Vielzahl von retroviralen Vektoren wurde in den letzten Jahren entwickelt, und nur beispielsweise wird hier auf die Übersichtsartikel von Günzburg et al. (1996) und Robbins et al. (1998) hingewiesen.

Eine mögliche bevorzugte Ausgestaltungsform für retrovirale Vektoren sind sogenannte ProCon-Vektoren, die zum ersten Mal in der WO 96/07748 beschrieben wurden. Zur Offen­ barung wird vollständig auf diese Druckschrift Bezug genommen.

ProCon-Vektoren tragen heterologe Promotor- und wahlweise weitere Regulationselemente in der 3'LTR, die, nach Infektion, dupliziert und an die 5'LTR in der Zielzelle transloziert werden und die befähigt sind, die Expression von Markergenen oder therapeutischen Genen zu regu­ lieren. Diese heterologen Gene sind nicht direkt mit dem Promotor verbunden, sondern werden in das Innere des Vektors inseriert.

ProCon-Vektoren umfassen einen 5'LTR-Abschnitt der Struktur U3, R, U5 sowie zumindest eine kodierende und/oder nicht-kodierende Sequenz sowie einen 3'LTR-Bereich, der einen vollständig oder teilweise deletierten U3-Abschnitt umfaßt, wobei der deletierte U3-Abschnitt durch eine Polylinker-Sequenz ersetzt wurde, worauf sich der R- und U5-Abschnitt an­ schließt.

Die Vermehrung dieser Vektoren erfolgt mit Hilfe einer Helferzellinie, die große Mengen der viralen Proteine produziert, die vom Expressionsvektor selbst nicht mehr synthetisiert werden. Die Helferzellinie ist jedoch nicht mehr in der Lage, ein replikationskompetentes Virus zu produzieren. Diese Zellinie wird auch als Verpackungszellinie bezeichnet und umfaßt eine mit mindestens einem zweiten Plasmid transfizierte Zellinie, das diejenigen Gene trägt, die eine Verpackung des modifizierten retroviralen Vektors ermöglichen.

Die für das modifizierte Retrovirus (Expressionsvektor) kodierende DNA wird in die Verpac­ kungszellinie transfiziert. Unter diesen Bedingungen wird das modifizierte retrovirale Genom einschließlich der inserierten therapeutischen Gene bzw. Markergene transkribiert und in die retroviralen Partikel verpackt (rekombinate virale Partikel). Dieses rekombinante Virus wird dann zur Infektion der Zielzellen eingesetzt; das Genom des modifizierten Retrovirus, d. h. des Expressionsvektors, wird in das Genom der Zielzellen integriert, und zwar zusammen mit den Markergenen bzw. den therapeutischen Genen. Eine mit den so erzeugten rekombinanten viralen Teilchen infizierte Zelle kann ein neues Vektorvirus nicht mehr produzieren, da in diesen Zellen keine weiteren viralen Proteine mehr vorliegen. Die in die Wirtszelle integrierte DNA des Expressionsvektors mit den therapeutisch wertvollen Genen bzw. den Markergenen liegt in der zellulären DNA integriert vor und kann nunmehr in der Zelle exprimiert werden.

Therapeutisch wertvolle Gene, die über derartige retrovirale Expressionsvektoren zur Ex­ pression gebracht werden, sollen bevorzugt in zell- und gewebespezifischer Form exprimiert werden. Hierzu werden zellspezifische Regulationssequenzen in der LTR-Sequenz des Ex­ pressionsvektors eingesetzt. Diese zellspezifischen Regulationssequenzen umfassen bei­ spielsweise zellspezifisch regulierbare Promotorabschnitte, zellspezifische Enhancerse­ quenzen sowie Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen. Die Promotoren liegen im U3-Abschnitt der LTR.

Zur Zeit werden in retrovirale Vektoren zelluläre Promotorsequenzen oder Promotorsequenzen exogener Retroviren eingesetzt.

Zelluläre Promotoren sind häufig auf zusätzliche Signalstrukturen angewiesen, die in großer Distanz stromaufwärts oder stromabwärts des Promotors liegen können. Es hat sich deshalb immer wieder als schwierig erwiesen, starke, gewebespezifische zelluläre Promotorsequenzen zu isolieren und in retrovirale Vektoren zu klonieren. Promotoren exogener Retroviren haben den Vorteil, daß sie in der retroviralen LTR auf kleinem Raum alle benötigten regulativen Elemente enthalten und daher weitgehend unabhängig von den benachbarten DNA- Sequenzen des Integrationsortes transkribiert werden. Ein schwerwiegender Nachteil ist je­ doch, daß sie zwar sehr stark, aber nicht gewebespezifisch sind und in der Regel in allen Zelltypen gleich stark exprimiert werden.

Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue retrovirale Expressionsvektoren bereitzustellen, die zwar die Vorteile der retroviralen Promotoren nutzen, alle für die Trans­ kription erforderlichen Signalstrukturen auf engem Raum innerhalb der U3 und R-Region zu konzentrieren, die damit verbundenen Nachteile jedoch vermeiden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß in retrovirale Expressionsvektoren ein zellspezifisch regulierbarer Promotorabschnitt aus einer humanen endogenen retroviralen DNA-Nukleotidsequenz (HERV) eingesetzt wird. Diese Promotorsequenzen humaner en­ dogener retroviraler Viren liegen bereits in der Wirtszelle vor, und es wurde erfindungsgemäß gefunden, daß sie sich in hervorragender Weise zur Regulation der zellspezifischen Expres­ sion von Markergenen und therapeutisch wertvollen Genen eignen.

Endogene Retroviren (ERV) sind im Genom aller Zellen eines Organismus zu finden. Sie werden vertikal über Keimbahnzellen übertragen und können durch Umwelteinflüsse reaktiviert werden. Das menschliche Genom besteht zu etwa 2% aus endogenen Retroviren und retro­ viralen Sequenzen, wobei solitäre HERV-LTRs mit 20.000-40.000 Kopien pro Genom ver­ treten sind (Tab. 1) (Leib-Mösch et al., 1993; Wilkinson et al., 1994, Patience et al., 1997).

Da HERV-Sequenzen bereits vor 30-40 Millionen Jahren in das Genom von Primaten in­ tegriert sind, kann davon ausgegangen werden, daß im Verlauf der Evolution die meisten pathogenen Sequenzen durch Mutationen und Rearrangements aus dem Provirus eliminiert bzw. so verändert wurden, daß sie für den Organismus nicht mehr von Nachteil sind. Retrovi­ rale Vektoren, die aus derartigen Sequenzen konstruiert werden, haben gegenüber Vektoren aus animalen Viren den Vorteil, daβ keine neuen viralen Sequenzen in das Genom einge­ bracht werden müssen. Auch durch Rekombination mit bereits im Genom vorhandenen HERV-Sequenzen können keine neuartigen Retroviren entstehen, wie das z. B. der Fall wäre, wenn Retroviren anderer Spezies als Vektoren eingesetzt werden. Aus diesem Grund kann die Verwendung dieser Sequenzen zur Konstruktion retroviraler Vektoren das Sicherheitsrisiko minimieren. Desweiteren könnten im Genom enthaltene homologe Regionen für eine gewe­ bespezifische Integration der retroviralen Vektoren in bestimme Stellen eines Chromosoms genutzt werden.

HERV-Elemente haben während der Evolution eine Reihe zellulärer Funktionen übernommen. So werden Promotor- und Enhancer-Elemente von HERV-LTRs zur Steuerung der Trans­ kription zellulärer Gene benutzt (Kato et al., Feuchter-Murthy et al., 1993; Di Christofano et al., 1995). Ein Beispiel für die Verwendung von LTR-Regulationselementen zur gewebespezifi­ schen Expression eines zellulären Gens ist das Amylase-Gen des Menschen. Dieses Gen wird durch die LTR eines HERV-E-Elements kontrolliert und dadurch spezifisch nur in den Speicheldrüsen exprimiert (ring et al., 1992). Darüber hinaus haben Schulte und Mitarbeiter (1996) gezeigt, daß die Insertion eines endogenen Retrovirus in die 5' nicht translatierte Re­ gion des Pleiotrophin-Gens für dessen Trophoblasten-spezifische Aktivität verantwortlich ist (Schulte et al., 1996). In anderen Fällen können polyA-Signale von HERV-LTRs auch dazu dienen, zelluläre Transkripte zu polyadenylieren (Mager, 1989; Goodchild et al., 1992).

Der große Vorteil beim Einsatz retroviraler Promotoren liegt darin, daß, wie bereits oben ausgeführt, alle für die Transkription erforderlichen Signalstrukturen auf engem Raum inner­ halb des U3-Bereichs und des R-Bereichs der LTR lokalisiert sind, da Retroviren möglichst unabhängig von der Umgebung ihres Integrationsortes transkriptionsaktiv bleiben müssen. Da diese HERV-Promotoren seit Millionen Jahren im Primatengenom persistieren, haben sie sich im Laufe der Evolution so angepaßt, daß sie wie zelluläre Promotoren zelltyp-spezifisch aktiv sind, und somit die Vorteile zellulärer und retroviraler Promotoren in sich vereinen.

Die Transkription der HERVs wird von einem klassischen RNA-Polymerasell-Promotor aus gestartet (Wilkinson et al., 1994). Dieser Promotor ist innerhalb der LTR-Region lokalisiert. Das HERV-Transkript besteht daher nicht aus der vollständigen Kopie des Provirus. Um den Verlust der Transkriptionskontrollelemente zu kompensieren, haben diese Elemente den Mechanismus der reversen Transkription entwickelt, mit dem die verlorengegangenen Se­ quenzen an beiden Seiten der Elemente regeneriert werden, woraus wiederum die LTRs entstehen. Neben Promotorsequenzen enthalten HERV-LTRs noch eine Vielzahl verschie­ dener Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren (Seifarth et al., 1998), die für die Gewebe­ spezifität der Expression verantwortlich sind.

Obwohl eine gewisse strukturelle Ähnlichkeit zwischen HERVs und exogenen animalen Retroviren wie MLV oder MMTV besteht, wurden HERV-Sequenzen und insbesondere Promotoren von HERVs nie als mögliche Kandidaten für die Entwicklung retroviraler Expres­ sionsvektoren in Betracht gezogen. Sie wurden, ganz im Gegenteil, im Zusammenhang mit einer Gentherapie bisher ausschließlich als Störfaktoren betrachtet (Patience et al., 1997). Es wurde befürchtet, daß sie in der Zielzelle durch Rekombinationen aufgrund von Sequenz­ homologien mit dem therapeutischen Vektor interferieren könnten. Diese Befürchtungen konnten bislang zwar nicht experimentell bestätigt werden, jedoch mit der Entwicklung sehr effizienter humaner Verpackungszellinien tauchte das Problem des Mitverpackens und der ungewollten Übertragung möglicherweise infektiöser HERV-Sequenzen auf. Daher wurde die mögliche Verpackung exprimierter HERV-Sequenzen in Virionen, die auf MLV basieren, ausführlich untersucht. Patience et al. (1998) identifizierten mRNA-Transkripte mehrerer verschiedener HERV-Familien wie HERV-K und HERV-H in humanen Verpackungszellinien. Jedoch konnten selbst mit einem hochsensitiven RT-PCR-Test keine dieser Sequenzen in den von den Zellen freigesetzten MLV-Vektor-Partikeln nachgewiesen werden.

Nach diesen Befunden schien eine Verpackung und Übertragung von HERV-Sequenzen und damit schließlich auch HERV-basierender Vektoren in MLV-Verpackungssystemen ausge­ schlossen zu sein. Zwar weisen HERV-Gene eine Sequenzhomologie zu MLV-Genen von 50-65% auf, jedoch besitzen gerade die für die Verpackung und Infektion essentiellen Bereiche, insbesondere das zwischen der 5'-LTR- und der gag-Region lokalisierte Verpackungssignal und die LTR selbst, keine erkennbare Sequenzhomologie zu den entsprechenden MLV- Sequenzen. Effiziente HERV-Verpackungssysteme hingegen sind zur Zeit ebenfalls nicht vorstellbar, da bislang keine Ziellinien bekannt sind, die in ausreichenden Mengen HERV- Partikel produzieren.

Die vorliegende Erfindung löst somit das Problem von retroviralen Expressionsvektoren, die eine zell- und gewebespezifische Expression von Fremdgenen (Gen von Interesse) steuern, dadurch, daß Expressionsvektoren bereitgestellt werden, die, in funktioneller Anordnung, zumindest die nachfolgenden Elemente enthalten.

• a) DNA-Sequenzen zur Verpackung der Vektor-RNA und zur zelispezifischen Expression von Proteinen oder Peptiden, die von heterologen DNA-Nukleotidsequenzen kodiert werden;
• b) ein oder mehrere für ein Protein oder Peptid kodierende heterologe DNA- Nukleotidsequenzen (Transkriptionseinheit);

Die DNA-Sequenzen zur zellspezifischen Expression sind dadurch charakterisiert, daß sie eine zellspezifisch regulierbare Promotorregion umfassen, die aus einem humanen endogenen retroviralen Virus, insbesondere der LTR-Sequenz dieses Virus, stammen.

Der Promotorbereich aus einer HERV-Sequenz kann den gesamten LTR-Bereich des HERV umfassen. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung umfaßt der Promotorbereich jedoch nur den U3-Bereich oder den R-U3-Bereich der HERV-LTR. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird neben diesen Bereichen zusätzlich der nicht translatierte Bereich zwischen der 5' LTR und den gag-Genen vom Promotorabschnitt mit umfaßt. Erfin­ dungsgemäß wurde nämlich festgestellt, daß auch in diesem Bereich Sequenzen lokalisiert sind, die eine zellspezifische Expression von Proteinen bzw. Peptiden steuern, d. h. für diese zellspezifische Expression zumindest mit verantwortlich sind.

Die Promotoren sind Teilabschnitte der DNA, die für den Start der Transkription der zugeord­ neten Strukturgene notwendig ist. Der Promotor beinhaltet den Startpunkt der Transkription, die Erkennungs- und Bindungsstelle für die RNA-Polymerase. Der Promotor kann auch wei­ tere Sequenzen umfassen, an die regulatorische Proteine binden können und dadurch spezi­ fisch die Initiation der Transkription regulieren. Beispiele für derartige Proteine sind Transkrip­ tionsfaktoren und Repressoren. Beispiele für diese Regulationselemente der Transkriptions­ aktivität sind die CAAT-Box, die GC-Box und die TATA-Box. Die Promotoren werden von einer Polymerase des Typs II erkannt.

Die Promotorabschnitte zur zellspezifischen Expression von Fremdproteinen aus HERVs können wahlweise mit weiteren Sequenzen kombiniert werden, die aus exogenen Retroviren stammen und die zellspezifische Expression fördern. Auch eine Kombination mit Regulati­ onssequenzen aus zellulären Genen ist denkbar, um die zellspezifische Expression zu un­ terstützen.

Der erfindungsgemäße retrovirale Expressionsvektor enthält weiterhin zumindest DNA- Sequenzen zur Verpackung des Vektors durch eine Verpackungs-Helferzellinie. Die DNA- Sequenzen zur Verpackung sind zwischen der 5' LTR und dem gag-Gen lokalisiert. Der retrovirale Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung enthält ein oder mehrere Transkrip­ tionseinheiten, die für eine Aminosäuresequenz kodieren. Die Aminosäuresequenz steht für ein Protein oder Peptid. Es können beliebige Sequenzen in den Expressionsvektor inseriert werden, die für ein beliebiges Protein oder Peptid von Interesse kodieren. Derartige Proteine oder Peptide können beispielsweise von Markergenen, therapeutisch wertvollen Genen, an­ tiviral wirkenden Genen, Antitumorgenen und/oder Zytokingenen kodiert werden. Diese Liste ließe sich beliebig ergänzen. Die in den retroviralen Expressionsvektor einsetzbaren Gene sind dem Fachmann bekannt. Die Art der eingesetzten Gene hängt vom Anwendungszweck des erfindungsgemäßen Vektors ab.

Die erfindungsgemäßen Vektoren können beispielsweise in der Gentherapie eingesetzt werden, um heterologe DNA in Targetzellen zu transferieren, um Krankheiten einer spezifischen Therapie zugänglich zu machen. Die Vektor-DNA wird in die ausgewählten Targetzellen derart eingeführt, daß die heterologe DNA in der Zielzelle exprimiert und das durch die DNA kodierte Produkt produziert wird. Hierunter fallen insbesondere solche Gene zur Expression von Pro­ teinen, die in der Zielzelle nicht oder nicht mehr oder in nicht ausreichender Menge produziert werden, so daß sich ein Krankheitszustand einstellt. Die Erfindung umfaßt nicht nur solche Proteine bzw. Peptide, die natürlicherweise vorkommen, sondern auch solche, die in einer Weise abgeändert wurden, daß ein gewünschter Effekt erreicht wird, beispielsweise eine hö­ here Aktivität eines Enzyms, die Blockierung der Bindungsstelle von Viren, Zerstörung von Tumorzellen durch Suizidgene usw.

Bei den für ein Protein oder ein Peptid kodierenden DNA-Nukleotidsequenzen handelt es sich im allgemeinen um heterologe RNA, die für RNA und Proteine kodiert, die normalerweise in vivo von der Zelle, in der die Proteine bzw. Peptide exprimiert werden, nicht produziert werden. Sie kann auch als Fremd-DNA bezeichnet werden. Beliebige Proteine, beispielsweise En­ zyme, Hormone und Antikörper, fallen hierunter.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Promotorbereiche werden aus HERV-Sequenzen aus­ gewählt, die aus den bekannten HERV-Familien stammen. Beispiele hierfür sind HERV-K, HERV-H, HERV-E, HERV-L, HERV-T, HERV-R, HERV-I, HERV-P, ERV9.

Selbstverständlich können auch andere, zur Zeit noch nicht bekannte HERV-Familien gescreent werden, um noch unbekannte, die zellspezifische Expression steuernde Promo­ torsequenzen aufzufinden.

Erfindungsgemäß bevorzugte LTR-Sequenzen aus HERVs, die zur gewebespezifischen Expression von Proteinen und Peptiden von Interesse einsetzbar sind, werden im Anhang offenbart. Sie sind in retrovirale Expressionsvektoren einsetzbar, um die erfindungsgemäß gestellte Aufgabe zu lösen. Selbstverständlich können durch an sich bekannte Methoden auch nur Teile dieser LTRs ausgewählt werden, um die in den Vektor eingesetzten Sequenzen so klein wie möglich zu halten. Mit Hilfe verschiedener Deletionsmutanten können die geeigneten Fragmente ausgewählt werden. Auch weitere Abänderungen dieser LTR-Sequenzen sind möglich, z. B. Punktmutationen, Insertionen, Additionen, Austausch mehrerer Nukleotide etc., um die Effizienz der gewerbespezifischen Expression zu steigern und an die gewünschte Funktion anzupassen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die eingangs beschriebenen ProCon-Vektoren eingesetzt. Derartige ProCon-Vektoren umfassen einen 5' LTR-Abschnitt der Struktur U3-R-US, ein oder mehrere Sequenzen, die für ein Protein oder Peptid kodieren, und wahlweise nicht kodierenden Sequenzen, und einen 3' LTR-Abschnitt, umfassend einen teilweise oder vollständig deletierten U3-Abschnitt, wobei der deletierte U3-Abschnitt zu­ mindest die erfindungsgemäß eingesetzten HERV-LTR-Sequenzen umfaßt, gefolgt vom R- U5-Abschnitt. Nähere Einzelheiten sind beispielsweise in der WO 96/07748 und der WO 96/28564 beschrieben. Auf diese Schriften wird hier vollinhaltlich Bezug genommen.

Erfindungsgemäß wurde eine Strategie entwickelt, um zellspezifisch wirkende Promotorse­ quenzen aufzuspüren. Diese Strategie wird in der nachfolgenden Beschreibung näher erläu­ tert. Selbstverständlich sind grundsätzlich auch andere Methoden zum Auffinden von zell­ spezifisch wirksamen HERV-LTR-Sequenzen denkbar und anwendbar. Die Erfindung ist somit nicht auf die nachfolgenden Ausführungsbeispiele beschränkt.

Die erfindungsgemäßen retroviralen Expressionsvektoren sind verpackungsdefizient, d. h. sie sind nicht in der Lage, ohne Hilfe einer Verpackungs-Helferzellinie Viruspartikel zu produ­ zieren. Die Erfindung umfaßt deshalb auch ein retrovirales Vektorsystem, das einen retrovi­ ralen Expressionsvektor, wie er in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, und eine Verpackungszellinie mit zumindest einem retroviralen oder rekombinanten retroviralen Kon­ strukt enthält, das für die Verpackungsproteine des retroviralen Expressionsvektors kodiert. Derartige Verpackungszellinien sind an sich bekannt und beschrieben. Beispielsweise wird hier auf die murine Verpackungszellinie PA317 (Saller et al., 1998) hingewiesen.

Nachfolgend wird die Erfindung zunächst allgemein und dann anhand von Ausführungsbei­ spielen beschrieben.

Erfindungsgemäß wurde die Eignung humaner endogener Retroviren zur Entwicklung ge­ webespezifischer Vektoren für die Gentherapie untersucht. Dazu wurde zunächst die Gewe­ bespezifität der HERV pol Transkription in verschiedenen Zellinien wie T-Zellen, Keratinozyten und Brustkrebs-Zellen in einem "Reversen Dot Blot"-Verfahren überprüft. Die Expressi­ onsmuster der vierschiedenen HERV-Familien erwiesen sich dabei durchwegs als Zelltyp­ abhängig. Zur Isolierung der transkriptionsaktiven HERV-LTRs aus verschiedenen Zellinien und Geweben wurden Primer entwickelt, mit denen spezifisch die U3/R-Regionen aus mRNA- Präparationen amplifiziert werden können. Die isolierten LTR-Sequenzen sowie einzelne Vertreter bereits bekannter LTRs wurden in Expressionsvektoren eingebaut. Die Aktivität der LTR-Promotoren wurde nach transienten Transfektion der Reporterplasmide über Luzifera­ seaktivität bzw. über eGFP-Fluoreszenz in verschiedenen Zellinien getestet. Es zeigte sich, daß die Promotoraktivitäten der einzelnen HERV-LTRs deutlich in Abhängigkeit von der ge­ testeten Zellinie variieren. Die Promotorregion einer HERV-H LTR, die aus Astrozyten und Leberzellen isoliert worden war und sich in mehreren Versuchen als besonders aktiv in Lun­ genfibroblastenzellen (LC5) erwiesen hatten, wurden in zwei retrovirale Promotor­ konversionsvektoren (pLESN und PLX) eingebaut, in Verpackungszellinien getestet, die Verpackungseffizienz untersucht und überprüft, ob nach Infektion der Zielzellen eine Promo­ torkonversion stattgefunden hat. Zum Nachweis der Transkriptionsaktivität in den Zielzellen wurden FACS-Analysen durchgeführt.

Es wurde somit eine Methode beschrieben, mit der HERV-Promotorsequenzen (U3/R- Region), die eine gewebespezifische Expression vermitteln, identifiziert und isoliert werden können. Die Gewebespezifität und Promotoraktivität dieser Sequenzen wurde dann in einem transienten Transfektions-Assay in verschiedenen humanen Zellinien getestet. Schließlich wurden geeignete Sequenzen ausgewählt, in einen Promotorkonversionsvektor (ProCon- Vektor) kloniert und dabei ihre Eignung zur Konstruktion gewebespezifischer Vektoren für die Gentherapie überprüft.

3. Ergebnisse 3.1 Analyse der HERV-Transkription in unterschiedlichen Zelltypen

Zur Untersuchung der HERV Transkription in unterschiedlichen Zellen wurde im ersten Schritt eine Methode (Reverse Dot-Blot Hybridisierung) eingesetzt, die ursprünglich zum Nachweis der HERV-Expression in mononukleären Zellen des peripheren Bluts entwickelt worden war (Herrmann und Kalden, 1994). Dabei wurden klonierte und charakterisierte HERV pol- Genfragmente aus humaner genomischer DNA auf einer Membran fixiert und mit radioaktiven HERV-pol Gensonden hybridisiert. Die Sonden wurden mittels RT-PCR aus mRNA ver­ schiedener Zellen unter Verwendung degenerierter Oligonukleotide amplifiziert, die zu einem hochkonservierten Bereich retroviraler pol-Gene homolog sind (Shih et al., 1989; Donehower et al., 1990). Mit dieser Methode erhielten wir mit jeder bisher untersuchten Zellinie ein cha­ rakteristisches Hybridisierungsmuster, was einen ersten Hinweis auf eine gewebespezifische Expression der HERV Elemente darstellte.

3.2 Isolierung von LTR U3-Regionen exprimierter HERVs

Die gewebespezifische Expression eines Retrovirus ist vor allem durch ihre U3-Region fest­ gelegt. In diesem Bereich sind alle regulatorischen Sequenzen wie Promotor, Enhancer und die Bindungsstellen für verschiedene zelluläre Transkriptionsfaktoren lokalisiert. Aus diesem Grund wurden Primer entwickelt, mit denen diese HERV-Sequenzen durch eine RT-PCR aus mRNA unterschiedlicher Zellinien gezielt isoliert werden konnten (Tab. 2; Abb. 1). Auf diese Weise wurden ca. 30 verschiedene HERV-LTRs kloniert. Ein Teil dieser Sequenzen wurde in einem Reporterplasmid auf Promotoraktivität und Gewebespezifität getestet.

Im ersten Ansatz wurde für die PCR ein polydT-Primer mit einem Primer kombiniert, der komplementär zum Polypurin Trakt (PPT) der retroviralen RNA ist (Abb. 1). Der PPT-Trakt ist eine konservierte Region im nicht translatierten Bereich zwischen dem env Gen und der U3- Region der 3'-LTR. Die PPT-Region wird während der reversen Transkription des Retrovirus als Primerbindungsstelle für die Synthese des Plus-Stranges genutzt (Sorge und Hughes, 1982).

Durch Datenbankanalysen wurden PPT-Sequenzen unterschiedlicher HERV-Familien iden­ tifiziert und durch Vergleich ihrer Homologien in verschiedene Gruppen eingeteilt. Aus den Konsensussequenzen der einzelnen Gruppen wurden Oligonukleotide als Primer für die RT- PCR synthetisiert. Die mRNA wurde aus verschiedenen Zellinien präpariert: Epithelzellen (HeLa, HaCaT), Fibroblastenzellen (LC5), T-Zellen (H9, HUT78), Lymphoblasten (CML), Gliomzellen (85HG66, U373), Pancreaszellen (MiaPaCa2, Panc1), Leberzellen (Chang Liver) und Brustkrebszellinien (T47-D, MCF7). Darüber hinaus wurden zusätzlich cDNA-Genbanken (Clontech) verschiedener menschlicher Gewebe (Gehirn, Herz, Leber, Niere, Lunge, Pan­ kreas, Plazenta, Skelettmuskel) für die RT-PCR eingesetzt.

Die erhaltenen Fragmente wurden anschließend kloniert, sequenziert und mittels Datenbank­ vergleichen analysiert. Von denn PCR-Fragmenten, die mit den PPT- und den polydT-Primern erhalten wurden, konnten zwei LTRs über Homologievergleiche der HERV-H- und der HERV-K- Familie zugeordnet werden. Durch die Verwendung von polydT-Primern in diesen PCR- Ansätzen wurden zahlreiche Sequenzen amplifiziert, die keine Homologien zu bekannten retroviralen LTRs und darüber hinaus auch keine Promotorstrukturelemente enthielten. Aus diesem Grund wurden weitere Sequenzen aus konservierten Bereichen der U3-Region und aus der R-Region von HERV-K und HERV-H Familien zur Primersynthese ausgesucht (Mold et al., 1997), (Abb. 1, Tab. 1). Die resultierenden PCR-Produkte wurden nach Auftrennung im Agarosegel auf Nitrozellulosefilter transferiert und mit Sonden hybridisiert, die aus den LTR- Regionen verschiedener HERV-LTRs (HERV-K-p1167, HERV-H-H6, HERV-E, HERV-L) präpariert wurden. Die hybridisierenden Fragmente wurden anschließend in einen Vektor (pZERO, Invitrogen) kloniert und sequenziert. Mit dieser Methode konnten verschiedene HERV-LTRs isoliert werden, die in Tabelle 3 aufgelistet sind.

Die HERV-K-LTRs, die aus menschlichem Gehirn und Herzgewebe sowie aus T47-D Zellen isoliert wurden, zeigen sehr hohe Sequenzhomologien zu der 3'LTR von HERV-K10. Die HERV-H LTRs zeigen dagegen sehr viel höhere Sequenzvariabilitäten. HERV-H31, HERV- H3, HERV-HCM1, HERV-HCM4, HERV-HMP23 sind homolog zu der von Mager et al. iso­ lierten HERV-H-H6 LTR, die anderen HERV-H Sequenzen zeigen Homologien zu den von Anderssen et al. (1997) isolierten HERV-H LTRs aus Meerkatze, Krallenaffe und Mensch.

3.3 Analyse der Expression von HERV-Promotoren in einem transienten Luziferase-Assay

Zur Analyse der Promotoraktivität und der Gewebespezifität der isolierten HERV-LTRs wurden diese zunächst in ein Luziferasereporterplasmid (pBL, Butz, K., DKFZ, Heidelberg) kloniert. Dieser Vektor enthält das Photinus pyralis Luziferasegen, fusioniert an das SV40 polyA Signal von pBLCAT2 (Hoppe-Seyler et al., 1991).

Die einzelnen Vektorkonstrukte wurden transient in verschiedene Zellinien transfiziert. Nach 48 h wurde die Luziferaseaktivität aus dem Zellysat mit dem Luziferase-Assay Kit von Pro­ mega gemessen und nach Abgleichen der β-Galaktosidaseaktivität bzw. der Renilla- Luziferaseaktivität als relative Luziferaseaktivität bestimmt. Die Promotoraktivitäten der LTRs wurden in Epithelzellen (HeLa, HaCaT), Fibroblastenzellen (LC5), T-Zellen (H9, HUT78), Gliomzellen (85HG66, U373), Leberzellen (Chang Liver), Pancreaszellen (MiaPaCa2, Panc1) und Brustkrebszellinien (T47-D, MCF7) bestimmt.

Die Ergebnisse sind in den Abb. 2a-2f dargestellt. Die HERV-H-H6 LTR besitzt demnach von allen untersuchten endogenen LTRs den stärksten Promotor. Die HERV-K LTR aus Plazenta ist in HeLa-Zellen (besonders aktiv. In allen anderen Zellinien ist diese LTR nur sehr schwach aktiv. Ebenfalls eine starke Aktivität in HeLa Zellen zeigte HERV-K-T47-D, diese LTR war auch in HaCat-Zellen und Pankreaszellen aktiv. Die HERV-L LTR besizt in Leberzellen eine starke Promotoraktivität und ist in T-Zellen und Pankreaszellen schwach aktiv. Die HERV-T-S71A und HERV-E LTRs waren in keiner getesteten Zellinie aktiv. Ebenso konnte bisher keinerlei Aktivität einer HERV-LTR in CML-Zellen beobachtet werden.

Die klonierten HERV-H LTRs (HERV-H1, HERV-H8, HERV-H13, HERV-H19, HERV-H-H6, Tab. 3) waren fast alle in 85HG66 Zellen aktiv, wobei HERV-H1 und HERV-H8 in dieser Zel­ linie die höchste Aktivität zeigten (ohne Abbildung). HERV-H19 war in HeLa-Zellen sehr aktiv. Die HERV-HCM1 LTR zeigte in allen Zellinien die höchste Promotoraktivität und war besonders in Lungenfibroblasten (LC5) aktiv (Abb. 3).

3.4 Konstruktion von HERV-Hybrid-Vektoren und Überprüfung der Aktivitäten von HERV-Promotoren in diesen Vektoren

Die Funktionsfähigkeit menschlicher endogener retroviraler LTR Sequenzen in retroviralen Vektoren wurde in zwei unterschiedlichen Promotorkonversionsvektoren (ProCon) ausgete­ stet. Dazu wurden hybride HERV/MLV Vektoren unter Verwendung zweier auf MLV basie­ render Vektoren pLESN-MMTV (Abb. 7) und pLX-MMTV (Abb. 8) konstruiert. Diese Vektoren enthalten das EGFP Gen als Reportergen, das von der 5' LTR (unterschiedlich, je nachdem ob vor oder nach der Promotorkonversion) aus exprimiert wird, sowie ein Neomycingen, das von einem SV40 Promotor aus exprimiert wird. Darüberhinaus enthält der Vektor pLX-MMTV einen prokaryotischen Replikationsorigin, der die Reklonierung des Provirus für weitere mo­ lekulare Charakterisierungen erlaubt.

Zur Konstruktion der HERV-Hybrid Vektoren wurde jeweils die MMTV-LTR durch die HERV- HCM1 LTR ersetzt (Abb. 7). Dazu wurde die LTR zunächst mittels PCR aus dem Vektor pBL- HERV-H mit spezifischen Primern amplifiziert, die zusätzliche Sequenzen für die Restrikti­ onsenzyme MluI und SacII enthielten. Diese Fragmente wurden anschließend in die 3'U3 de­ letierten Vektoren eingebaut. Das Reportergen EGFP wird nach der Transfektion in die Ver­ packungszellinie zunächst vonn MLV Promotor aus exprimiert (Abb. 9a). Nach Infektion der Zielzellen und erfolgreicher Promotorkonversion durch die reverse Transkription in den Ziel­ zellen liegt das Reportergen unter der Transkriptionskontrolle der HERV LTR vor.

Die HERV-Hybrid Vektorkonstrukte pLESN-HERV-H (Abb. 7) und pLX-HERV-H (Abb. 8), sowie die Ursprungsvektoren pLESN-MMTV und pLX-MMTV wurden in die amphotrophe Verpackungszellinie PA317 transfiziert. Die resultierenden retroviralen Vektorpartikel wurden anschließend benutzt, um die Zellinien CrfK und LC5 zu infizieren.

Die infizierten Zellinien wurden kloniert und die selektionierten Zellklone daraufhin untersucht, ob sie die Vektorkonstrukte enthielten und ob die Promotorkonversion stattgefunden hatte. Dazu wurde aus infizierten und nicht infizierten Zellen chromosomale DNA präpariert und mit­ tels PCR analysiert. Die Primer wurden aus der MLV U3 (P5) und R (P2) Region sowie aus der HERV-H Region (P1) ausgesucht und in Kombination mit einem Primer aus der EGFP Region für eine PCR eingesetzt (Abb. 9a). Die PCR-Produkte wurden mit HERV-H spezifischen Sonden hybridisiert (Abb. 9b). Dabei ergab die DNA, die mit den pLX HERV-H Partikeln infi­ ziert wurden, nach Amplifikation mit den Primern P1 und P3 ein PCR Produkt von 1,1 kb, das mit der HERV-H-Sonde hybridisierte. Die Amplifikation mit den MLV U3 spezifischen Primern (P2/P3) ergab mit DNA von Zellen, die mit pLX und mit pLX HERV-H infiziert waren, PCR Produkte mit einer Größe von etwa 900 bp, die nicht mit der HERV-H Sonde hybridisierten. Aus der Amplifikation mit den MLV R Primern (P5/P3) wurde kein PCR-Produkt erhalten, das mit der HERV-H Sonde hybridisierte. Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Promotorkonversion stattgefunden hat und der MLV Promotor der 5'LTR durch den HERV-Promotor ersetzt worden war.

Die Promotoraktivität der HERV LTR in den retroviralen Vektoren wurde nach Integration in die DNA der Zielzellen mittels FACS-Analysen über die Messung der EGFP Fluoreszenz be­ stimmt (Abb. 10). Die Aktivität des Ausgangsvektors pLX-MMTV wurde dabei mit dem HERV- Vektor pLX-HERV-H (H6) vor und nach Induktion mit Dexamethason verglichen. Der Vektor mit der MMTV LTR ist durch Dexamethason aktivierbar. Der Vektor mit der HERV LTR wird durch Dexamethason nicht aktiviert, er ist jedoch um etwa den Faktor 10 aktiver als der Dex­ amethason-stimulierte MMTV-Hybrid-Vektor.

3.5 Einfluß von Regulationselementen in R- und U5-Region auf die Promotoraktivität von HERV-Sequenzen

Um auszutesten, welcher Sequenzbereich für einen funktionsfähigen HERV-Promotor erforder­ lich ist, wurde an einigen Beispielen der Einfluß von zusätzlichen LTR-Sequenzen, die außer­ halb der U3-Region in der LTR lokalisiert sind, untersucht. Dazu wurde von 7 HERV-K LTRs (HERV-K-T47D, L5, L50, L8, L9, L48 und L20/49) die Aktivität der U3-Region mit der Aktivität der entsprechenden U3-R-Fragmente im Luziferase-Assay verglichen. Überraschenderweise zeigte sich, daß die verschiedenen R-Regionen den Promotor in der U3-Region sehr unter­ schiedlich beeinflussen können. Bei LTRs der Gruppe 1 (L5, L50, L8, L9) führt die Anwesenheit von R-Sequenzen in allen getesteten Zellinien zu einem deutlichen Anstieg der Promotoraktivität (Abb. 4a). Bei LTRs der Gruppe 2 (L20/L49) hingegen wird die Aktivität des HERV-Promotors durch die R-Region reduziert (Abb. 4b). Der HERV-K-T47D-Promotor (Abb. 5) und der L48- Promotor (ohne Abbildung) werden durch die entsprechenden R-Sequenzen nicht wesentlich beeinflußt. Interessanterweise haben jedoch im Falle der HERV-K-T47D-LTR Sequenzbe­ reiche, die downstream der U3-R-Region lokalisiert sind und die US-Region, sowie den 3' nicht translatierten Bereich und den Beginn des gag-Gens umfassen, einen deutlich aktivierenden Effekt (Abb. 5).

Die Sequenzanalyse der verschiedenen getesteten R-Regionen zeigte, daß LTRs der Gruppe 1 in der R-Region eine Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor SP1 aufweisen, die in der R-Region der Gruppe 2 LTR fehlt (Abb. 6). Dagegen enthält die Gruppe 2 R-Region eine potentielle Bindungsstelle für den Faktor TFS3, der als Transkriptionsrepressor wirkt. Dies zeigt, daß die Aktivität von HERV-Promotoren durch den Einbau zusätzlicher Regulationse­ lemente wie Transkriptionsfaktorbindungsstellen, Enhancer-Sequenzen oder negativ regu­ lierende Elemente modifiziert werden kann.

5. Literatur

Anderssen, S., Sjottem, E., Svineng, G., Johansen, T. (1997). Comparative analyses of LTRs of the ERV-H family of primate-specific retrovirus-like elements isolated from marmo­ set, african green monkey, and man. Virology 234. 14-30
Di Christofano, A., Strazzullo, M., Longo, L., La Mantia, G. (1995). Characterization and ge­ nomic mapping of the ZNF80 locus: expression of this zinc-finger gene is driven by a solitary LTR of ERV9 endogenous retroviral family. Nucl. Acid. Res. 23. 2823-2830
Donehower L. A., Bohannon, R. C., Ford, R. A. (1990). The use of primers from highly con­ served pol regions to identify uncharacterized retroviruses by the polymerase chain re­ action. J. Virol. Methods 28. 33-46
Emmerman, M., Temin, M. H. (1986). Comparision of promotor suppression in avian and mu­ rine retrovirus vectors. Nucl. Acid. Res. 14. 9381-9396
Feuchter, A., Mager, D. (1990). Functional heterogeneity of a large family of human LTR-like promoters and enhancers. Nucl. Acid. Res. 18. 1261-1270
Feuchter-Murthy, A. E., Freeman, J. D., Mager, D. L. (1993). Splicing of a human endogenous retrovirus to a novel phospholipase A2 related gene. Nucl. Acid. Res. 21. 135-143
Goodchild N. L., Wilkinson, D. A., Mager, D. L. (1992). A human endogenous long terminal repeat provides a polyadenylation signal to a novel, alternatively spliced transcript in normal piacenta. Gene, 121. 287-294
Herrmann, M., Kalden, J. R. (1994). PCR and reverse dot hybridisation for the detection of endogenous retroviral transcripts. J. Virol. Methods 46. 333-348
Hoppe-Seyler, F., Butz, K., zur Hausen, H. (1991). Repression of the Human Papillomavirus Type 18 Enhancer by the Cellular Transcription Factor Oct-1. J. Virol. 65. 5613-5618
Kato-N., Shimotohno, K., VanLeeuwen, D., Cohen, M. (1990). Human proviral mRNAs downregulated in choriocarcinoma encodes zinc finger protein related to Kruppel. Mol. Cell. Biol. 10. 4401-4405
Leib-Mösch, C., Haltmeier, M., Werner, T., Geigl, E.-M., Brack-Werner, R., Francke, U., Erfle, V., Hehlmann, R. (1993). Genomic distribution and transcription of solitary HERV-K LTRs. Genomics 18. 261-269
Mager, D. L. (1989). Polyadenylation Function and Sequence Variability of the Long Terminal Repeats of Human Endogenous Retrovirus-like Family RTVL-H. Virology 173. 591-599
Mold, D. E., Wu, T., Askin, F., Hu,ang, R. C. (1997). Four classes of HERV-K long terminal repeats and their relative promoter strengths for transcription. Biomed. Science 4. 78-82
Price, J., Turner, D., Cepko, C. (1987). Lineage analysis in the vertebrate nervous System by retrovirus-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. 89. 9237-9241
Saller, R. M., Öztürk, F., Salmons, B., Günzburg, W. (1998). Construction and characterization of a hybrid mouse mammary tumor virus/murine leukemia virus-based retroviral vector. J. Virol. 2. 1699-1703
Salmons, B., Günzburg, W. H. (15193). Targeting of retroviral vectors for gene therapy. Human Gene Therapy 4. 129-141
Schulte, A. M., Lai, S., Kurtz, A., Czubayko, F., Riegel, A. T. (1996). Human trophoblast and choriocarcinoma expression of the growth factor pleiotrophin attributable to germ-line Insertion of an endogenous retrovirus. Proc. Natl. Acad. Sci. 93. 14759-14764
Seifarth, W., Baust, C., Murr, A., Skladny, H., Krieg-Schneider, F., Blusch, J., Werner, T., Hehlmann. R., Leib-Mösch, C., (1998). Proviral Structure, chromosomal location and expression of HERV-K-T4'7D, a novel human endogenous retrovirus derived from T47-D particles. J. Virol. 72. In press
Shih, A., Misra, R., Rush, M. G. (1989). Detection of multiple, novel reverse transcriptase co­ ding sequences in human nucleic acids: relation to primate retroviruses. J. Virol. 63. 64-75
Sorge, J., Hughes, S. H. (1982). Polypurine tract adjacent to the U₃

region of the Rous sar­ coma virus genome provides a cis-acting function. J. Virol. 43. 482-488
Ting, C.-N., Rosenberg, M. P., Snow, C. M., Samuelson, L. C., Meisler, M. H. (1992). Endo­ genous retroviral sequences are required for tissue-specific expression of a human sa­ livary amylase gene. Genes Dev. 6. 1457-1465
Wilkinson, D. A., Mager, D. L., Leong, J.-A. (1994). Endogenous human retroviruses. In "The retroviridae" Vol. 3 (J. Levy, ed.), pp. 465-535, Plenum Press, NY.
Patience, C., Wilkinson, D. A., Weiss, R. A. (1997). Our retroviral heritage. Trends Genet. 13, 116-120.
Patience, C., Takeuchi, Y., Cosset, F.-L., Weiss, R. A. (1998). Packaging of endogenous retroviral sequences in retroviral vectors produced by murine and human packaging cells. J. Virol. 72, 2671-2676.

Tab. 1: Humane endogene retrovirale Elemente

Tab. 2: Verwendete Primer zur Amplifikation der HERV-LTR-Regionen

Tab. 3: Untersuchte HERV-LTRs

A: exprimierte HERV-LTRs aus verschiedenen Zellinien und Geweben

B: bereits publizierte HERV-LTRs

Anhang

HERV-LTR-Sequenzen

Claims (21)

1. Retroviraler Expressionsvektor, enthaltend zumindest die nachfolgenden Elemente in funktioneller Anordnung

• a) DNA-Sequenzen zur Verpackung der Vektor-RNA und zur zellspezifischen Expression von Proteinen oder Peptiden, die von heterologen DNA-Nukleo­ tidsequenzen kodiert werden;
• b) ein oder mehrere für ein Protein oder Peptid kodierende DNA-Nukleotidse­ quenzen,

dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzen zur zellspezifischen Expression eine zellspezifisch regu­ lierbare Promotorregion aus einer humanen endogenen retroviralen DNA-Nukleotid­ sequenz (HERV) enthalten.

2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzen zur zellspezifischen Expression aus dem LTR-Bereich und wahlweise dem nicht translatierten Bereich zwischen der 5' LTR und dem gag- Bereich von HERVs stammen.

3. Vektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der gesamte LTR-Bereich, der U3-Bereich oder der R- und U3-Bereich aus einer humanen endogenen retroviralen Nukleotidsequenz stammt.

4. Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein oder mehrere Proteine oder Peptide kodierenden Nukleotidsequenzen ausgewählt werden aus einem oder mehreren Elementen der Gruppe, bestehend aus Markergenen, therapeutischen Genen, antiviralen Genen, Antitumorgenen und Zytokingenen.

5. Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zellspezifisch regulierbare Promotorregion aus dem LTR-Bereich einer zell­ spezifisch exprimierten endogenen humanen retroviralen Nukleotidsequenz stammt.

6. Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die humanen endogenen retroviralen zellspezifisch regulierbaren Promotorse­ quenzen ausgewählt werden aus einem oder mehreren Promotorsequenzen von HERV-Familien der Gruppe, bestehend aus HERV-K, HERV-H, HERV-E, HERV-L, HERV-T, HERV-R, HERV-I, HERV-P, ERV9.

7. Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Promotorregion neben der TATA-Box weitere Erkennungs- und Bindungs­ stellen für regulatorische Proteine umfaßt.

8. Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungs- und Bindungsstellen für regulatorische Proteine die GC-Box, die CAAT-Box, Enhancersequenzen und Repressorsequenzen sowie Hormon-re­ sponsible Sequenzmotive umfassen und daß wahlweise zusätzlich Erkennungs- und Bindungsstellen für regulatorische Proteine aus der LTR-Region exogener Re­ troviren und/oder aus zellulären Genen enthalten sind.

9. Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Promotor-Konversionsvektor ist, umfassend einen 5' LTR-Ab­ schnitt der Struktur U3-R-U5, ein oder mehrere Sequenzen, ausgewählt aus kodie­ renden und nicht kodierenden Sequenzen, und einen 3' LTR-Abschnitt, umfassend einen teilweise oder vollständig deletierten U3-Abschnitt, wobei der deletierte U3- Abschnitt durch eine zelllspezifisch regulierbare Promotorregion aus einer HERV- LTR-Sequenz ersetzt ist, gefolgt vom R-U5-Abschnitt.

10. mRNA oder RNA eines retroviralen Expressionsvektors nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.

11. Prokaryontenzelle oder Eukaryontenzelle, enthaltend einen retroviralen Expres­ sionsvektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.

12. Eukaryontenzelle, enthaltend einen retroviralen Expressionsvektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in integrierter Form.

13. Verwendung eines zellspezifisch regulierbaren Promotorabschnitts aus einer huma­ nen endogenen retroviralen DNA-Nukleotidsequenz zur Steuerung der Expression von Fremdgenen in retroviralen Expressionsvektoren, bevorzugt ProCon-Vektoren.

14. Verwendung eines Expressionsvektors nach einem oder mehreren der vorherge­ henden Ansprüche zur Expression von Fremdgenen in der Gentherapie.

15. Virion, enthaltend eine retrovirale Expressionsvektor-RNA, abgeleitet von einer Ex­ pressionsvektor-DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.

16. Verfahren zur Herstellung eines Virions nach Anspruch 15 zum Einführen einer oder mehrerer für ein Protein oder Peptid kodierender Nukleotidsequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß der retrovirale Expressionsvektor nach einem oder mehreren der vorhergehen­ den Ansprüche in eine geeignete Verpackungszellinie unter solchen Bedingungen eingebracht wird, daß das Virion ausgebildet wird und von der Verpackungszellinie freigesetzt wird.

17. Verfahren zum Einführen von Nukleotidsequenzen, die für ein oder mehrere Protei­ ne oder Peptide kodieren, in eine Eukaryontenzelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit einem Virion nach Anspruch 15 unter solchen Bedingungen infi­ ziert wird, daß die für das Protein oder Peptid kodierenden Nukleotidsequenzen in die chromosomale DNA der Eukaryontenzelle inseriert wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Eukaryontenzelle eine Säugerzelle ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Säugerzelle eine menschliche Zelle ist.

20. Retrovirales Vektorsystem, umfassend einen retroviralen Expressionsvektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche und eine Verpackungszellinie mit zumindest einem retroviralen oder rekombinanten retroviralen Konstrukt, das für die Verpackungsproteine des retroviralen Expressionsvektors kodiert.

21. Retrovirales Vektorsystem nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Verpackungszellinie retrovirale oder rekombinante retrovirale Konstrukte enthält, die für solche retroviralen Proteine kodieren, die vom retroviralen Expres­ sionsvektor nicht kodiert werden.